ISO LASI, PEMURNIAN DAN PENENTUAN BEBERAPA SIFAT PROTEASE-SH DARI BAKTERI BONGKREK PSEUDOMONAS COCOVENENANS X-128
ABSTRAK DISERTASI
dan
Maksud
tujuan
penelitian ini adalah
untuk
mengisolasi, memurnikan protease sulfhidril (protease-SH) dari
Pseudomonas
cocovenenans
X-128
dan
menetapkan
beberapa sifat-sifatnya sebagai langkah pertama untuk mengungkapkan enzimologi bakteri bongkrek. Hingga kini orang memperhatikan bakteri bongkrek hanya aspek kedua racunnya saja yaitu toksoflavin dan asam bongkrek. Aspek enzimologi bakteri yang sering menimbulkan keracunan, sepanjang pengetahuan kami belum banyak diungkapkan orang kecuali dalam penelitian ini. Dalam penelitian pendahuluan kami menemukan bahwa bakteri ini memproduksi protease-SH intraselular.
Adanya
protease-SH dalam bakteri bongkrek sangat menarik perhatian, karena in vitro asam bongkrek menghambat protease -SH,
sedangkan in vivo senyawa ini tidak mematikan
bakteri tersebut. Pada umumnya protease-SH hanya banyak ditemukan
dalam tumbuh-tumbuhan dan jarang ditemukan
dalam mikroorganisme. Seperti diketahui, protease juga memegang peran penting dalam metabolisme,ilmiah_d-anindustri.. Dengan alasan ini,
maka
disini
protease-SH
dari
Pseudomonas cocovenenans X-128 diisolasi, dimurnikan dan ditetapkan sifat-sifatnya. Untuk cocovenenans
mengisolasi
enzim ini,
maka
Pseudomonas
X-128 dibiakkan dalam media cair menurut
N.A Azis ditambah 0,2 % b/v pepton. Semula pembiakan bakteri dilakukan dengan cara mengocok biakan lebih dari
48 jam, pada suhu kamar sampai mencapai serapan 3,0 pada X 650 nm. Kemudian protease-SH diekstraksi dengan cara sonikasi suspensi bakteri dalam larutan 1 % NaCl pada suhu
2°C
selama 15 menit, lalu disentrifugasi pada
2950 x g dan suhu 4°C. Uji aktifitas protease-SH dilakukan menurut metode Kunitz dan kadar protein ditetapkan menurut metode Lowry. Ekstrak kasar protease-SH dari biakan bakteri ini (FEKB) mempunyai aktifitas spesifik 369 unit per mg protein dan disimpan pada -15°C dalam lemari pembeku untuk percobaan selanjutnya. Aktifitas spesifik adalah jumlah unit aktifitas per mg protein. Satu unit aktifitas didefinisikan sebagai kenaikan serapan hasil reaksi enzim selama 30 menit sebesar
0,001
di
atas
serapan kontrol reagen
pada
X 276 nm. Setelah X-128 banyak
diketahui
bahwa
memproduksi
Pseudomonas
protease-SH
pada
cocovenenans akhir
fasa
pertumbuhan eksponensial, maka pada eksperimen selanjutnya pengocokan dilakukan selama 20 jam. Ekstrak kasar protease-SH dari biakan ini (FEKB') ternyata mempunyai aktifitas spesifik lebih tinggi dari pada FEKB yaitu 503 unit per mg protein. Pemurnian FEKB dilakukan setelah FEKB didialisis dengan air kemudian difraksinasi dengan cara pengendapan bertahap dengan aseton dingin (-15°C) sampai konsentrasi akhir 30 %, 50 %, dan 70 % v/v aseton. Semua fraksi didialisis dengan 2,5 mM Tris-HC1 pH 8,0 pada 4°C. Hasil uji
aktifitas
menunjukkan
bahwa
fraksi
endapan
pada
tas protease-SH terbesar dengan aktifitas spesifik 457 unit per mg protein. Fraksi ini disimpan pada -15°C untuk percobaan selanjutnya. FEKB' yang masih segar tidak disimpan dalam lemari pembeku
tetapi
langsung
difraksinasi
dengan
aseton.
Ternyata fraksi endapan pada aseton 50 % v/v (FEnA'-50) mempunyai
aktifitas
spesifik
lebih
tinggi
dari
pada
FEnA-50, yaitu 1.213 unit per mg protein. Selanjutnya
FEnA-50
difraksinasi
dengan
kolom
Sephadex G-150 dalam bufer Tris-HC1 pH 8,2 sebagai eluen pada suhu 4°C. Fraksinasi ini menghasilkan 13 fraksi protease-SH, antara lain FS-1, FS-9, dan FS-11, berturutturut mempunyai aktifitas spesifik 1.166 unit, 8.974 unit dan 15.172 unit per mg protein dengan tingkat kemurnian 3,24, dan 41 kali FEKB. Hasil uji kemurnian dengan cara elektroforesis disk gel poliakrilamida dengan pewarnaan amido hitam, ternyata FS-9 sudah murni terdiri atas satu pita protein. Karena jumlah unit aktifitas fraksi ini sangat sedikit, maka FS-1 yang masih terdiri atas 7 pita protein difraksinasi lagi dengan kolom DEAE Sephacel dalam gradien eluen 0 - 0,5 M NaCl pH 7,2 pada 4°C. Fraksinasi ini menghasilkan 19 fraksi antara lain FD-5 dan FD-6 yang mempunyai aktifitas spesifik sangat tinggi yaitu 79.797 dan 34.065 unit per mg protein dengan tingkat kemurnian 216 dan 92 kali
FEKB.
kromatografi
Kadar
protein
semua
fraksi
ditetapkan dengan cara
hasil
kolom
spektrofotometri
sinar ultraviolet. Ternyata FD-5 dan FD-6 jumlahnya juga sangat
sedikit
sehingga
sifat-sifatnya
belum
dapat
ditetapkan. Setelah diketahui baik FEKB maupun FEnA-50 tidak stabil jika disimpan dalam keadaan beku, maka untuk maksud fraksinasi, FEnA'-50 yang masih segar juga lang
-
sung difraksinasi dengan kolom Sephadex G-150 dengan cara yang sama. Fraksinasi dengan cara ini menghasilkan 17 fraksi protease-SH, antara lain FS'-1, FS'-2, FS'-3, FS'-4, dan FS'-6 yang mempunyai aktifitas spesifik sangat tinggi, berturut-turut adalah 18.557 unit, 22.686 unit, 21.838 unit, 56.068 unit dan 62.941 unit per mg protein dengan tingkat kemurnian 36, 45, 43, 111 dan 65 kali FEKB'. Hasil uji kemurnian secara elektroforesis disk gel poliakrilamida
menunjukkan
bahwa
FS'-1
sudah
murni.
FS'-1 mengandung 92.600 unit aktifitas protease-SH atau 53 kali FS-9 dan 39 kali FD-5 sehingga fraksi ini dapat ditetapkan sifat-sifatnya dengan bermacam-macam perco
-
baan. Hasil percobaan menunjukkan bahwa: Enzim murni yang diperoleh mempunyai pH optimum 8,0 untuk substrat kasein dan pada pH 9,2 masih tetap aktif. Suhu optimum enzim ini adalah 35°C dan masih tetap aktif walaupun sudah disimpan selama 10 menit pada 70°C dan 98°C. Atas dasar aktifitas pada berbagai pH dan suhu ini, maka enzim tersebut dapat digolongkan sebagai proteaseSH basa yang termostabil.
Sepanjang
pengetahuan
kami,
yang
enzim
telah
berhasil kami murnikan ini belum pernah ada yang mengungkapkan.
Maka
kami
mengusulkan
nama
cocovenein
untuk
menyebutnya. Aktifitas cocovenein dihambat oleh beberapa pengham-
bat protease -SH
sebagai
berikut:
CuSO4,
HgClz,
pCMB,
K3Fe(CN)6 dan Iodoasetat pada konsentrasi akhir yang 1,4 x 10- 4 M, berturut-turut sebesar 48 %,
sama
72 %, 23
b,
12 %, dan 17 %. Penghambatan ini menunjukkan dengan jelas bahwa
cocovenein
murni
dari
Pseudomonas
cocovenenans
X-128 adalah protease -SH. Cocovenein diaktifkan oleh MnSO4 dan ZnSO4 pada konsentrasi akhir
1 x 10- 3 M sebesar 40 % dan 94 %
tetapi
enzim ini dihambat oleh 1 x 10- 4 M NaEDTA sebesar 100
%.
Oleh karena itu cocovenein diduga sebagai enzim logam. Asam bongkrek yang sudah diketahui menghambat papain, bromelin, dan fisin serta protease -SH dari sperma sapi Friesian Holstein ternyata pada cocovenein mempunyai dua efek yaitu penghambatan dan pengaktifan. Pada konsentrasi akhir substrat yang tinggi
di
atas
0,375
%
b/v
kasein, asam bongkrek menghambat aktifitas cocovenein. Sebaliknya pada konsentrasi akhir substrat
yang
rendah
di bawah 0,375 % b/v kasein, asam bongkrek mengaktifkan cocovenein. Toksoflavin juga menghambat aktifitas cocovenein secara tak bersaing dengan Ki = 7,7 x 10- 6
M.
Cocovenein dihambat oleh substrat kasein, secara bersaing dengan a = 3,0 dan Ks
=
0,83
%.
substrat ini menunjukkan bahwa cocovenein
Penghambatan mempunyai
beberapa sub-bagian aktif pada bagian aktifnya. Fenomena dari bakteri bongkrek tersebut di atas belum pernah diungkapkan orang dan baru pertama kali ini kami temukan pada Pseudomonas cocovenenans X-128. BM
cocovenein
adalah
620.000
ditetapkan
dengan
cara elektroforesis gel poliakrilamida tak terdenaturasi, karena penetapan secara elektroforesis SDS-gel poliakrilamida enzim ini terurai menjadi 3 subunit protein dengan BM 450.000,
320.000 dan 47.000.
Spesifitas cocovenein telah diuji terhadap 0,001 M substrat
sintetik
Hipuril-L-Arginin
Na-Benzoil-Arginin dan
Etil
Glisin-4-Nitroanilida
25°C serta Benzoil-Arginin-Amida pada suhu
Ester,
Na-
pada
suhu
35°C
dalam
bufer Tris-HC1 pH 8,0. Enzim ini berturut-turut mempunyai aktifitas sebesar 0,18 %,
0,26 %, 6,9 % dan 0 ~. Dengan
alasan ini cocovenein kami duga mempunyai spesifitas yang tinggi dengan aktifitas aminopeptidase. Dari hasil-hasil penelitian di atas dapat disimpulkan bahwa cocovenein merupakan protease-SH baru yang belum pernah diungkapkan peneliti lain. Diharapkan basil penelitian ini dapat mengungkapkan lebih lanjut mengenai enzimologi bakteri bongkrek,
kelak
dapat memberikan sumbangan dalam mencegah pertumbuhan bakteri yang sering menimbulkan keracunan. Disamping itu diharapkan pula protease-SH
dari
bakteri bongkrek dapat berguna untuk keperluan ilmiah, industri dan farmasi seperti halnya papain, bromelin, dan fisin.
ABSTRACT
The purpose of this research is to isolate, purify and characterize sulfhydryl protease (SH-protease) Pseudomonas cocovenenans X-128,
as
the
first
step
from to
reveal the enzymology of bongkrekic bacterium. Most of the work which have been done so far deal with the two toxic substances toxoflavin and bongkrekic acid
produced
by
this
bacterium.
Where
as
to
our
knowledge no work on the enzymology of this bacterium which often causes poisoning has been carried out except for this research. In the preliminary study we found that the bongkrekic
bacterium produced intracellular
SH-protease.
The existence of this enzyme in this bacterium has attracted attention because in vitro bongkrekic acid inhibits the 8H-protease while in vivo does not kill bongkrekic bacterium.
Generally SH-proteases are only
found in certain plants and are rarely found in microorganism. Protease is also known to play an important role in metabolism, scientific and industry. reason SH-protease from
Pseudomonas
For
this
cocovenenans X-128
was isolated, purified and characterized. To isolate this enzyme the bacteria were grown in the liquid media according to N.A. Azis and this was added with pepton of 0,2
%
w/v.
Firstly the cultured
bacteria were incubated and shaken for a few hours every day totalling up to 48 hours at the room temperature until the absorption of the culture reached 3,0 at X650 nm. Then. the SH-protease was extracted by sonication of the bacteria suspension in 1 % NaCl solution at 2°C for 15 minutes, then centrifuged at 2950
x
g at 4°C. The
activity tests of SH-protease were carried out according to Kunitz's method and the protein content was determined according to Lowry's method. The crude extract of the SH-protease from the culture which was shaken (FEKB) had specific activity of 369 units per mg ofprotein. Finally it was stored at -15°C for subsequent experiment. The specific activity is the amount of units activity per mg of protein. One unit acitivity of SH-protease . is defined as the increase in absorption of 0,001 of the
product for 30 minutes which is corrected by the reagent blank and measured at X 276 nm. After it had been known that
Pseudomonas
cocove-
nenans X-128 produced SH-protease abunddantly at the end of the exponential phase of the bacterial growth, the bacteria were grown by shaking
continously for 20
hours. The crude extract of SH-protease obtained in this way (FEKB') appeared to have higher specific activity than FEKB viz. 503 units per mg of protein. The purification of FEKB was carried out after it was dialysed with water, then was fractionized using the gradual precipatation method with aceton at very
low temperature (-15°C) until reaching the final concentration of 30 %, 50 %, 70 % v/v of aceton respectively. All of those fractions were dialysed with 2,5 mM Tris-HC1 pH 8,0. The result of the acitivity tests showed the precipitated fraction at the final concentration of 50 % of aceton (FEnA-50) contained the
,
highest
total
units
activity and specifik activity of 457 units per mg protein. Then it was stored at -15°C for subsquent experiment. The fresh FEKB' was not stored in the freezer but was fractionized directly with aceton in the same manner. The obtained precipitated fraction at 50 % v/v of aceton ( FEnA'-50) had higher sepecific activity then FEnA-50, that is 1213 units per mg of protein. FEnA-50
was
fractionized
further
on
column
of
Sephadex G-150 with Tris-HC1 buffer pH 8,2 as the eluent at
4°C.
This
fractionation
produce
13
fractions
of
SH-protease, especially FS-1, FS-9 and 15172 units per mg of protein respectively with the purity of 3,24 and 41 folds of FEKB. The result of the purity test on disk gel polyacrylamide electrophoresis with amido black staining showed that FS-9 was pure because it consisted only one protein band. The amount
of
this
fraction
was
very small,
therefore FS-1 which still consisted of 7 protein bands was
fractionized
again
with
column
of
DEAE-Sephacel
in 0 - 0,5 M NaCl solution pH 7,2 as the gradient eluent at 4°C. This fractionation produced 19 fractions of
SH-protease. Two of them were FD-5 and FD-6 had very high specific activity that were 79797 units and 34065 units per mg of protein reprectively with the purity 216 and 92 folds of FEKB. The protein content of all obtained fractions from column chromatography were determined by means of the UV light spectrophotometry method. Unfortunately the amounth FS-9, FD-5 and FD-6 were so small that the properties of these enzymes could not be determined Because of the fact that either FEKB or FEnA-50 were unstable if they were stored in the frezeer, for the
characterization
purpose
the
fresh
was
FEnA'-50
fractionized directly with column of Sephadex G-150 in the same manner. This fractionation produced 17 fractions. Some of them were FS'-1, FS'-2, FS'-3, FS'-4 and FS'-6 having specific activity of 18557 units, 22686 units, 21838 units, 50668 units and 62941 units per mg protein respectively with purity of 36, 45, 43, 111, and 65 folds of FEKB'. The result of the purity test on disk gel polyacrylamide elektrophoresis showed thas FS'-1
was
a
pure
fraction. FS'-1 contained 92600 units activity or 53 folds of units activity of FS-9 and 39 folds of units activity of FD-5,
which
enzyme
characterized
could
be
was
sufficient by
means
so
that of
this
several
kinds of experiments. The result of those showed that: The obtained pure enzyme had a optimum pH of 8,0 for casein as the subtrate and at pH 9,2 it remained active.
The optimum temperature of this enzyme appeared to be 35°C and it remained active although it had been stored at 70°C and 98°C for 10 minutes. For this reason the above mentioned enzyme could be grouped as the alkaline thermostable SH-protease. To our knowledge the pure enzyme as obtained above has never been described before, so we propose the name cocovenein for it. Cocovenein
acitivity
was
inhibited
by
some
of
SH-protease inhibitors viz._ CuSO4,_ HgClz, pCMB, KaFe(CN)s and Iodoasetat at the same consentration of 1,4 x 10-4
M,
up to 48 %, 72 %, 23 %, 12 %, and 17 % respectively. This inhibition
showed
that
the
pure
cocovenein
from
Pseudomonas cocovenenans X-128 was truly SH-protease. Cocovenein was activated by MnSO4 and ZnSO4 at the final concentration of 1 x LO-3 M, up to 40 % and
94
%
respectively but this enzyme was inhibited by NaEDTA at the final concentration of 1
x 10-4
M,
up
to
100
%
therefore cocovenein was presumed to be metalloenzyme. Bongkrekic acid that had been known to inhibit papain, bromelin and ficin activity and also SH-protease from bull sperm of Friesian Holstein, was found to have two effects of inhibition and activation on cocovenein. At high concentration of casein substrate above 0,375 % w/v,
bongkrekic
acid
inhibited
cocovenein
activity.
Contrary to the low concentration of casein substrate below 0,375 % w/v, bongkrekic acid increased the activity
of cocovenein.
Toksoflavin inhibited the activity of
cocovenein noncompetitively with Ki = 7,7 x 10Cocovenein
was
also
inhibited
by
6
M.
its
casein
substrate competitively with a = 3,0 and Ks = 0,83 %. This substrate inhibition showed that cocovenein had two or more subactive sites on its active site. The
above
mentioned
phenomena
from
bongkrekic
bacterium had never been described befor, and we found those
phenomena firstly on
Pseudomonas
cocovenenans
X-128. Molecular weight of cocovenein was 620000 which was determined by using nondenaturation gel polyacrylamide electrophoresis in Tris-Glycine buffer pH 8,3 and amido black staining. The determination by means of SDS-gel polyacrylamide
electrophoresis
showed
that
enzyme
dissociated into three protein subunits with molecular weight of 450000, 320000 and 47000 respectively. The specivity of cocovenein had been tested on 0,001 M of synthetic substrate viz. Na-Benzoyl-L-Arginine -Ethyl Ester,
Na-Hypuryl-L-Arginine,
Glycine-4-
Nitro-
anilide at 25°C and Benzoyl-Arginine Amide at 35°C in Tris-HC1 buffer pH 8,0. This enzyme had the activity of 0,18 %, 0,26 %, 6,9 % and 0 % respectively. For this reason we pressumed that cocovenein have high specivity with aminopeptidase activity. It can be concluded that cocovenein investigated in this research is a new kind of SH-protease not yet
previously studied. The result of this research are expected to be able to further reveal the enzymology of bongkrekic bacterium so that in the future they will be to contribute to the prevention of the bacterial growth which often causes poisoning. Besides, SH-protease
from
they are also expected that the bongkrekic
bacterium be useful for
scientific and industrial purpose as papain, bromelin and ficin are.
