J. Sains Tek., Agustus 2006, Vol. 12, No. , Hal.: 78 - 82 ISSN 0853-733X
PEMURNIAN DAN KARAKTERISASI PROTEASE INTRASELULER DARI BAKTERI Pseudomonas cocovenenans B 154 Wawan Agustina dan Zusfahair Jurusan Kimia, Program Sarjana MIPA, Universitas Jenderal Soedirman Kampus Unsoed Karangwangkal Jl. dr Soeparno Telp / Fax. (0281) 638793 Purwokerto 53123 Diterima 10 September 2005, perbaikan 4 September 2006, disetujui untuk diterbitkan 12 September 2006
ABSTRACT Pseudomonas cocovenenans B 154 is one of bacteria that able to produce intracellular protease. Intracellular protease produced from media with peptone as inducer has an activity of 3.01 times higher than from media without inducer. The bacterial crude extract fraction has an activity of 1232 U/ml with specific activity of 1.056 U/µg protein. The highest activity protease produced from fractionation with acetone 50%, i.e. 815 U/ml with specific activity of 1.206 U/µg protein. Purity degree of protease on this fraction is 1.14 times than crude extract. Gel filtration using sephadex G-100 resulted the highest activity on Fraction-25, i.e. 72 U/ml with specific activity of 12.00 U/µg protein. Purity degree of protease on this fraction is 11.80 times. Fraction-25 has optimum activity at pH 8.0 and optimum temperature 30oC. Activity of this fraction protease is inhibited by the addition of cystein, metal ions Ag+, Cu2+, Hg2+ and Zn2+. Keywords: intracellular protease, Pseudomonas cocovenenans B 154, Purification, Characterization
1. PENDAHULUAN Protease merupakan salah satu enzim yang mempunyai peranan penting dalam bidang industri, baik industri pangan maupun non pangan. Protease merupakan salah satu enzim komersial yang telah ditemukan secara luas aplikasinya dalam berbagai bidang industri mulai dari pengolahan kulit, industri deterjen, pembuatan roti, pengempukan daging sampai pada pembuatan bir1). Selain untuk industri-industri tersebut protease bakteri telah ditemukan aplikasinya dalam industri farmasi, hidrolisat protein, dan pengolahan limbah2). Protease dapat juga digunakan untuk mencuci pakaian untuk melarutkan darah, coklat, lendir dan noda-noda protein lainnya 3). Ditinjau dari segi ekonomi protease menjadi sangat penting, karena secara komersial enzim tersebut menduduki urutan tertinggi diantara enzim-enzim lainnya dan mencakup lebih dari 60 % total penjualan enzim di dunia atau sekitar 600 juta US$6). Untuk memenuhi tingginya tingkat kebutuhan protease perlu dilakukan penelitian untuk mendapatkan sumbersumber protease baru. Sumber-sumber baru protease yang ditemukan kebanyakan berasal dari jenis bakteri dan kapang. Salah satu jenis bakteri yang pernah diteliti ialah jenis Pseudomonas cocovenenans (P. cocovenenans) X-1284). Bakteri tersebut mampu menghasilkan protease intraseluler yang aktivitasnya ditingkatkan oleh sistein dan diketahui sebagai golongan protease-SH. Salah satu strain lain dari bakteri P. cocovenenans yang
78
diyakini mampu menghasilkan protease adalah P. cocovenenans B 154. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memurnikan dan mengkarakterisasi protease intraseluler dari bakteri P. cocovenenans B 154.
2. METODE PENELITIAN 2.1. Organisme Bakteri P. cocovenenans B 154 yang digunakan merupakan kultur murni koleksi Laboratorium Mikrobiologi ITB yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi ITB. 2.2. Pembuatan inokulum dan produksi protease : Inokulum dibuat dengan memindahkan bakteri dari media pertumbuhan agar miring menggunakan jarum ose ke dalam 25 ml media inokulum dan disimpan dalam inkubator bergoyang pada suhu kamar sampai inokulum menjadi keruh selama 21 jam. Media inokulum dan produksi dibuat dua macam yaitu dengan induser (pepton) dan tanpa induser. Media inokulum dan produksi protease induktif dari P. cocovenenans B 154 dibuat dengan komposisi : 20 g gliserin; 5 g KH2PO4; 10 g Na2HPO4; 4 g (NH4)2HPO4; 0,2 g ekstrak ragi; 2 g pepton dan 0,25 g MgSO4.7H2O yang dilarutkan dalam akuades sampai 1 liter 5. Produksi protease dilakukan dengan memindahkan 24 ml biakan bakteri dari kultur inokulum ke dalam 800 ml media produksi. Selanjutnya disimpan dalam inkubator bergoyang pada suhu kamar selama 21 jam dan setelah itu bakteri dipanen.
2006 FMIPA Universitas Lampung
J. Sains Tek., Agustus 2006, Vol. 12
2.3. Ekstraksi protease Biakan bakteri dari media produksi disentrifugasi pada 1500 g selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh merupakan fraksi ekstrak kasar ekstraseluler media cair (FEKMC). Endapan bakteri yang diperoleh dicuci dengan air dingin dan disentrifugasi lagi. Pelet disuspensikan dalam 12 ml larutan 1% NaCl. Suspensi ditambah 5 tetes lisozim, didiamkan dalam air dingin selama 10 menit dan disonikasi pada suhu dingin (12oC) selama 3 menit, kemudian disentrifugasi selama 3 menit. Supernatan yang diperoleh merupakan fraksi ekstrak kasar bakteri (FEKB). Fraksi ekstrak kasar diukur volumenya, diuji aktivitasnya dan ditetapkan kadar proteinnya. 2.4. Fraksinasi protease Fraksi ekstrak kasar yang memiliki aktivitas tertinggi difraksinasi dengan pengendapan secara bertahap menggunakan aseton pada suhu dingin (-12oC) dengan konsentrasi akhir aseton 30%, 50% dan 70%. Endapan protein yang diperoleh dipisahkan dengan cara sentrifugasi pada 1500 g selama 5 menit. Semua endapan fraksi dilarutkan dalam larutan 1% NaCl berturut-turut diberi nama fraksi endapan pada aseton 30%, 50% dan 70% disingkat FA-30%, FA-50% dan FA70%. Semua fraksi selanjutnya didialisis, diuji aktivitas protease dan ditetapkan kadar proteinnya. 2.5. Filtrasi gel Fraksi aseton yang mempunyai aktivitas tertinggi selanjutnya dimurnikan dengan metode kromatografi penyaring molekul (Filtrasi gel) menggunakan kolom sephadex G-100 dalam ruang dingin (19°C). Larutan yang digunakan sebagai eluen adalah bufer Tris-HCl pH 7,5. Eluat ditampung setiap 5 ml dan filtrasi dilakukan sampai diperoleh 100 tabung eluat. Setiap tabung eluat diuji aktivitas protease dan ditetapkan kadar proteinnya. 2.6. Uji aktivitas protease dan penetapan kadar protein Aktivitas protease diuji menggunakan metode Kunitz yang telah dimodifikasi4) dengan cara 0,5 ml substrat (0,5% kasein hammerstein dalam bufer Tris-HCl pH 8,0), ditambah 0,1 ml akuades, diinkubasi selama 5 menit pada suhu 35 oC, ditambah 0,1 ml sampel enzim dan inkubasi diteruskan selama 30 menit. Inkubasi dihentikan dengan menambahkan 4,3 ml larutan TCA sampai konsentrasi akhir 3% (TCA 3,5%), didinginkan dalam air es selama 30 menit kemudian disentrifugasi selama 3 menit. Untuk kontrol dilakukan penambahan larutan TCA selanjutnya larutan enzimnya. Aktivitas enzim ditetapkan dengan mengukur serapan supernatan (produk reaksi) menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 275 nm. Aktivitas enzim dinyatakan dalam unit aktivitas dan
2006 FMIPA Universitas Lampung
aktivitas spesifik. Satu unit aktivitas protease (U) didefinisikan sebagai jumlah enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1 µg tirosina (ekuivalen)/menit/ml larutan enzim dari substrat kasein pada kondisi pengujian6), sedangkan aktivitas spesifik dinyatakan sebagai jumlah unit aktivitas enzim per µg protein. Kadar protein seluruh fraksi pemurnian protease ditetapkan dengan metode Lowry 5 dengan larutan standar protein kasein Hammerstein. 2.7. Penentuan beberapa sifat protease hasil pemurnian. Penentuan pH optimum protease dilakukan dengan uji aktivitas pada berbagai pH bufer yaitu bufer fosfat pH 6,0 dan 7,0, bufer Tris-HCl pH 8,0 dan 9,0 serta bufer borat-NaOH pH 10,0. pada suhu 35°C. Penentuan suhu optimum protease dilakukan dengan uji aktivitas pada berbagai suhu yaitu 20, 25, 30, 35, dan 40 oC pada pH optimum. Pengaruh penambahan sistein dan ion logam ditentukan dengan menambahkan 0,1 ml sistein dan ion-ion logam menggantikan 0,1 ml akuades sampai konsentrasi akhir 1 x 10-4.
3. HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1. Ekstraksi dan penentuan sifat induktif enzim Hasil uji aktivitas fraksi ekstrak kasar protease bakteri P. cocovenenans B 154 dari dua macam media diperoleh data unit aktivitas dan aktivitas spesifik yang berbeda (Tabel 1). Fraksi ekstrak kasar bakteri P. cocovenenans B 154 yang ditumbuhkan dalam media yang mengandung induser (pepton) memiliki unit aktivitas tiga kali lebih besar daripada yang ditumbuhkan dalam media tanpa induser. Hal ini menunjukkan bahwa adanya induser dalam media dapat meningkatkan produksi protease, sehingga dapat ditetapkan bahwa pepton dapat menginduksi protease intraselular yang dihasilkan oleh bakteri P. cocovenenans B 154. 3.2. Pemurnian enzim Hasil uji aktivitas protease terhadap fraksi-fraksi hasil dialisis diketahui FA-50% mempunyai unit aktivitas dan aktivitas spesifik tertinggi yaitu aktivitas sebesar 815 U/ml, aktivitas spesifik 1,206 U/µg protein dengan tingkat kemurnian 1,14 kali serta hasil akhir yang diperoleh (recovery yield) adalah 45,76 %. Protease-SH yang dihasilkan dari P. cocovenenans X-128 juga mempunyai aktivitas spesifik tertinggi pada fraksi Aseton 50% 4). Data hasil fraksinasi dan dialisis (Tabel 2). Tahap fraksinasi ini menghasilkan endapan protein enzim pada masing-masing fraksi. Terjadinya pengendapan protein enzim pada fraksi-fraksi tersebut disebabkan oleh perbedaan kelarutan protein dalam pelarut aseton.
79
W. Agustina dan Zusfahir…Pemurnian dan Karakterisasi Protease Intraseluler
Tabel 1. Unit aktivitas dan aktivitas spesifik protease intraseluler dari media dengan induser (MI) dan tanpa induser (MTI) Fraksi Enzim kasar MI MTI
Kadar protein (µg/ml)
Unit aktivitas/ml
1167 338
1232 410
Aktivitas spesifik U/µg protein 1,056 1,213
Tabel 2. Ringkasan aktivitas protease intraseluler dari ekstrak kasar dan dua tahap pemurnian
Fraksi enzim
12,0 6,1 8,3 6,6 5,0 5,0 5,0
Akt. Unit /ml
Total aktivitas
Protein (µg/ml)
1232 90 815 10 61 56 72
14784 549,0 6764,6 66,0 305,0 280,0 360,0
1167 116 676 34 9,7 5,4 6
Aktivitas (Unit/ml)
FEKB FA-30% FA-50% FA-70% FT-8 FT-24 FT-25
Vol. (ml)
Akt. Spesifik (U/µg) 1,056 0,776 1,206 0,298 6,289 10,370 12,000
75
Total protein (µg)
Tingkat kemurnian
14004,0 707,6 5610,8 224,4 48,5 27,0 30,0
1,00 0,74 1,14 0,28 5,96 9,82 11,80
Perolehan (%)
3,71 45,76 0,45 2,06 1,89 2,43
72
60
59 52
45 34
30 15 0 6
7
8 pH
9
10
Gambar 1. Pengaruh pH terhadap aktivitas protease 160
Aktivitas (U/ml)
138
120
117
80
74 52
40
33
0 20
25
30
Suhu
35
40
(oC)
Gambar 2. Pengaruh suhu terhadap aktivitas protease
80
2006 FMIPA Universitas Lampung
J. Sains Tek., Agustus 2006, Vol. 12
120
aktivitas relatif (%)
100 80 60 40 20 0 Tanp a
Sistein
Ag+
Cu 2+
H g2+
Zn2+
Ag+ + Sistein
zat yang ditambahkan
Gambar 3. Pengaruh penambahan sistein dan ion logam terhadap aktivitas protease Fraksinasi dilakukan pada suhu -12°C. Hal ini karena pelarut organik pada suhu yang tinggi cenderung mendenaturasi protein7). Proses fraksinasi dilanjutkan dengan dialisis, dialisis bertujuan untuk menghilangkan ion pengganggu atau pengotor enzim lainnya yang mempunyai ukuran molekul lebih kecil dari protein. Ionion pengganggu dalam enzim dapat mempengaruhi kestabilan molekul protein enzim selama penyimpanan. Pada tahap fraksinasi dengan aseton sebagian protease intraseluler terendapkan pada pada fraksi 50%. Indikasi yang diberikan adalah nilai aktivitas spesifik dan hasil akhir yang diperoleh relatif tinggi. Setelah dilakukan pemurnian dengan metode kromatografi penyaring molekul (Filtrasi gel) menggunakan kolom sephadex G-100 diperoleh 3 fraksi yang aktif dan FT-25 mempunyai aktivitas paling tinggi sebesar 72 U/ml dengan aktivitas spesifik 12,00 U/µg protein dengan tingkat kemurnian enzim 11,80 kali ekstrak kasar serta hasil akhir yang diperoleh adalah 2,43 % (Tabel 2). FT 25 ini mempunyai aktivitas spesifik lebih tinggi dibandingkan aktivitas spesifik pada tahap-tahap fraksinasi dengan aseton. Meningkatnya aktivitas spesifik enzim setelah melalui tahap-tahap pemurnian menunjukkan bahwa enzim tersebut semakin murni. Namun, hasil akhir yang diperoleh cukup rendah yaitu 2,43 %. Masalah ini kemungkinan terjadi karena FA-50 % selama disimpan dalam freezer cenderung mengendap yang sukar dilarutkan lagi setelah membeku dan menyulitkan proses pemurnian selanjutnya.
2006 FMIPA Universitas Lampung
3.3. Penentuan pemurnian
beberapa
sifat
enzim
hasil
Protease yang dihasilkan bakteri P. cocovenenans B 154 memiliki pH optimum 8,0 (Gambar 1). Pada pH 6,0 tidak menunjukkan adanya aktivitas protease, pada pH 7,0 protease masih aktif, pada pH 9,0 dan 10,0 aktivitas protease masih relatif tinggi meski berada di bawah pH optimumnya. Hal ini berarti bahwa protease tersebut bersifat alkali dan tidak tahan dalam suasana asam. Protease dari bakteri P. cocovenenans B 154 memiliki pH optimum yang sama seperti protease-SH yang dihasilkan oleh bakteri P. cocovenenans X-128 4). Suhu optimum protease dari bakteri P. cocovenenans B 154 adalah 30°C (Gambar 2). Protease pada suhu 20, 35 dan 40°C masih aktif. Aktivitas protease pada suhu 40 oC relatif rendah. Hal ini berarti bahwa protease yang dihasilkan oleh P. cocovenenans B 154 tidak tahan terhadap panas. Hasil penentuan pengaruh penambahan sistein dan beberapa ion logam terhadap aktivitas protease dapat dilihat pada Gambar 3. Penambahan beberapa ion logam dan sistein ternyata menghambat aktivitas protease. Penghambatan tertinggi terjadi dengan penambahan AgNO3. Sistein menghambat aktivitas protase sebesar 95,77%, ini berarti bahwa sistein termasuk inhibitor kuat bagi aktivitas protease yang dihasilkan oleh P. cocovenenans B 154. Efek penghambatan akibat penambahan sistein dan AgNO3 secara bersamaan lebih rendah diduga karena
81
W. Agustina dan Zusfahir…Pemurnian dan Karakterisasi Protease Intraseluler
terjadinya ikatan Ag-sistein, adanya ikatan ini mengurangi penghambatan terhadap aktivitas protease. AgNO3, CuSO4 dan HgCl2 memberikan efek penghambatan terhadap aktivitas protease. Hal yang sama terjadi pada cocovenein yaitu protease alkali yang dihasilkan oleh bakteri P. cocovenenans X-1288). Penghambatan aktivitas protease akibat penambahan CuSO4 dan HgCl2 juga dilaporkan pada protease alkali dari Alcaligenes facialis9). Penambahan ZnSO4 menghambat aktivitas protease, hal ini terjadi pula pada protease yang dihasilkan oleh bakteri Clostridium bifermentans R14-1-b10).
DAFTAR PUSTAKA
4. KESIMPULAN DAN SARAN
1.
Suhartono M. T., Suwanto, A. dan Likumahua, M. Y. 1995. Identification of Protease-Producing Bacteria Isolated From Liquid Tofu Waste by Pulse-Field Gel Electrophoresis. Acta Biochim Indon. 19:60-68
2.
Pastor, M.D., Lorda, G. S. and Balatti, A. 2000. Protease Obtention Using Bacillus subtilis 3411 and Amaranth Seed Meal Medium at Differents Aeration Rates. Braz. J. Microbial 32:
3.
Kane, L. Mc.and Kandel, J. 1996. Microbiology Essential and Application. Mc Graw-Hill Book Company, New York.
4.
Subardjo, B. dan Soedigdo, P. 1992. Ekstraksi, Isolasi dan Pemurnian Protease-SH dari Bakteri Bongkrek Pseudomonas cocovenenans X-128. Majalah Ilmiah Unsoed. 18: 87-99.
5.
Bollag, D. M., Rozicky, M.D. and Edelstein, S. J. 1996. Protein Methods 1st edition. John Willey and Sons, Inc., New York.
6.
Fuad, M. A., R. Rahmawati dan N. R. Mubarik. 2004. Produksi dan Karakterisasi Parsial protease Alkali Termostabil Bacillus thermoglucosidasius AF-01. J. Mikrobiol Indones 9:29-35.
7.
Voet, D. and Voet, J.G. 1990. Biochemistry. John Willey and Sons. New York.
8.
Subardjo, B. dan Soedigdo, P. 1993. Penentuan beberapa sifat Cocovenein. Suatu protease-SH dari Bakteri Bongkrek Pseudomonas cocovenenans X-128. Majalah Ilmiah Unsoed. 19: 98-107.
9.
Thangam E. B., and G. S. Rajkumar. 2002. Purification and Characterization of Alkaline Protease from Alcaligenes facialis. Biotechnol Appl. Biochem 35:149-154.
4.1. Kesimpulan Dari hasil penelitian ini diketahui bahwa P. cocovenenans B 154 dapat memproduksi protease intraseluler, dan produksinya dapat ditingkatkan dengan menggunakan pepton. Aktivitas tertinggi hasil fraksinasi diperoleh pada fraksi aseton dengan konsentrasi akhir 50% yaitu 815 U/ml, aktivitas spesifik 1,206 U/µg dengan tingkat kemurnian 1,14 kali ekstrak kasar. Hasil pemurnian dengan kromatografi filtrasi gel menggunakan kolom sephadex G-100 diperoleh aktivitas protease tertinggi pada FT-25 yaitu 72 U/ml, aktivitas spesifik 12,00 U/µg dengan tingkat kemurnian 11,80 kali ekstrak kasar. Fraksi FT-25 memiliki pH optimum 8,0, suhu optimum 30 oC. Aktivitas protease fraksi ini dihambat oleh keberadaan sistein dan beberapa ion logam seperti Ag+, Cu2+, Hg2+ dan Zn2+ yang ditambahkan ke dalam substrat. 4.2. Saran Perlu dilakukan penelitian mengenai uji kemurnian protein enzim FT-25 hasil filtrasi gel sephadex G-100 dan aplikasi enzim tersebut dalam dunia industri.
UCAPAN TERIMA KASIH Terima kasih disampaikan kepada Prof. Dr. Ir. Bambang Subardjo, M.S atas saran-sarannya selama penelitian sampai penulisan hasil penelitian ini.
82
10. Enggel, J., A. Meryandini dan Natalia, L. 2004. Karakterisasi Protease Ekstraseluler Clostridium bifermentans R14-b. J. Mikrobiol Indones 9:9-12.
2006 FMIPA Universitas Lampung
