Lampiran 1. Skema Kerja Penelitian Pengambilan sampel tanah dari lahan tambang timah di Belitung
Isolasi bakteri pengoksidasi besi dan sulfur
Pemurnian isolat bakteri
Karakteriasi isolat bakteri pengoksidasi besi dan sulfur
Pengamatan makro morfologi
Pengamatan mikro morfologi
Pewarnaan Gram
Seleksi Bakteri Pengoksidasi Besi dan Sulfur Berdasarkan Kemampuan Tumbuh pada Medium Yang Mengandung Fe dan S
Identifikasi Isolat Bakteri Terpilih Secara Molekuler
Sekuensing
Analisis urutan sekuen gen 16S rRNA
25
Lampiran 2. Spesifikasi Alat dan Bahan No.
Merk/Type
Kegunaan
Tempat
1.
Autoklaf
HL36AE (Hirayama Manufacturing Corp.)
Sterilisasi alat dan bahan
Lab. Mikrobiologi
2.
pH meter
Mengukur pH medium
Lab. Mikrobiologi
3. 4.
Shaker Inkucator Alat elektroforesis
Thermo Electron Corporation (RL060P) Lab Companion SI-600 CBS Scientific EPS – 300X
5. 6.
Nanophotometer Alat PCR
Menginkubasi biakan bakteri Memisahkan DNA berdasarkan berat molekul Mengukur kemurnian DNA Perbanyakan DNA tempat
Lab. Mikrobiologi Lab. Genetika dan Molekuler Lab. Riset Lab. Riset
7.
Gel Doc
Visualisasi DNA
8. 9.
Mikroskop UV-Vis Spektrophotometer
Lab. Genetika dan Molekuler Lab. Mikrobiologi Lab. Lingkungan
10.
Sentrifuge
No.
Nama Alat
Nama Bahan
Implen Thermal Cycler Techne (TC-5000) UVP MultiDoc-It Olympus CO11 Shimadzu UV mini 1240
Mengamati sel bakteri Mengukur nilai OD
Eppendorf Centrifuge 5415R
Memisahkan supernatan
Spesifikasi
Kegunaan
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Alkohol SDS Tenderizer Alkohol absolut TE TAE Primer 27F dan 1540R
70% 10% 30% 99% 1x 1x 100 pm
Sterilisasi permukaan Lisis sel bakteri Lisis sel bakteri Pencuci DNA Larutan Buffer Larutan Buffer Templat replikasi DNA genom
8. 9.
Agarose HCl
1,5% 10 M
Running DNA saat elektroforesis Menurunkan pH medium
26
Lab. Genetika dan Molekuler
Lampiran 3. Gambar Hasil Isolasi dan Pemurnian Isolat Bakteri Pengoksidasi Besi dan Sulfur
Hasil isolasi bakteri pengoksidasi besi dan sulfur
Hasil pemurnian isolat bakteri pengoksidasi besi dan sulfur
27
Lampiran 4. Gambar Hasil Pewarnaan Gram
28
Lampiran 5. Komposisi dan Pembuatan Medium Pertumbuhan Bakteri a.
Medium Cair dari Dunger and Fielder (1989) dengan garam ferro Komposisi : K2HPO4
0,05 gram
(NH4)2SO4
0,15 gram
Ca(NO3)2
0,01 gram
MgSO4. 7H2O
0,50 gram
KCl
0,05 gram
FeSO4. 7H2O
1,00 gram
Akuades
1000 ml
pH
3,5
Cara Pembuatan Medium : Semua bahan tersebut dicampurkan ke dalam akuades sebanyak 800 ml kecuali FeSO4.7H2O, diaduk dan disterilkan pada suhu 121˚C dan didinginkan. FeSO 4. 7H2O, dilarutkan dalam 200 ml akuades yang telah steril dan telah ditetapkan pHnya, sebesar 3,5 dan dipanaskan sampai suhu 50˚C, lalu didinginkan. Kedua larutan tersebut kemudian dicampur secara apsetik. Media ini kemudian dibagi ke dalam tabung yang telah steril.
29
b.
Medium Padat 9K (Silverman and Lundgreen, 1959) Komposisi : K2HPO4
0,05 gram
(NH4)2SO4
0,15 gram
Ca(NO3)2
0,01 gram
MgSO4. 7H2O
0,50 gram
KCl
0,05 gram
FeSO4. 7H2O
1,00 gram
Agar
15 gram
H2SO4 1 N
10 ml
Akuades
1000 ml
pH
3,5
Cara Pembuatan Medium : Semua bahan tersebut dicampurkan ke dalam akuades sebanyak 800 ml kecuali FeSO4.7H2O, diaduk dan disterilkan pada suhu 121˚C kemudian didinginkan. FeSO4. 7H2O dilarutkan dalam 200 ml akuades yang telah steril dan telah ditetapkan pHnya sebesar 3,5 dengan H2SO4 1 N, dan dipanaskan sampai suhu 50˚C, lalu didinginkan. Kedua larutan tersebut kemudian dicampur secara apsetik. Media ini kemudian dibagi ke dalam cawan petri yang telah steril.
30
Lampiran 6. Kromatogram Urutan Basa Gen 16S rRNA a.
Isolat L2K5
b.
Isolat L2K3
31
c.
Isolat L1K1
32
Lampiran 7. Hasil Alignment Sekuen Forward dan Reverse Urutan Basa Gen 16S rRNA dengan Program BioEdit a.
Isolat L2K5 AATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAG TAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGG ATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGA CCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGAC CTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGC AGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAG GCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACC TTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAG GTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGAT GTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAG AGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGG CGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGG ATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCC TTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAAC TCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGC GAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGA GCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCC CGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGC CGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGC TACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCA TAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGT AATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACAC CACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCTAAGGT GGGACAGATGA
b.
Isolat L2K3 GTCGAGCGAACAGATGAGAAGCTTGCTTCTCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACG TGGGTAACCTACCTATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAATATT TTGAACCGCATGGTTCAATAGTGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTATAGATGGACCCGCGCC GTATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGACGATACGTAGCCGACCTGAGAGG GTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGA ATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTCTTCGGA TCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAATTTGTTAGTAACTGAACAAGTCTTGACGGTAC CTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCG TTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCC ACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGG AATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGC TCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAAGCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCT GGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCA GCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTG ACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTAC CAAATCTTGACATCCTTTGACCGCTCTAGAGATAGAGTCTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGAC AGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGC GCAACCCTTAAGCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAGGTTGACTGCCGGTGACAAA CCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTG CTACAATGGATAATACAAAGGGCAGCGAATCCGCGAGGCCAAGCAAATCCCATAAAATTATTC TCAGTTCGGATTGTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATC AGCATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTT 33
GTAACACCCGAAGCCGGTGGAGTAACCTTTTAGGAGCTAGCCGTCGAAGGTGGGACAAATGA T c.
Isolat L1K1 GAACGATGAAGCCCAGCTTGCTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTA ACCTGCCCTTAACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGAGCGTCCAC CGCATGGTGGGTGTTGGAAAGATTTATCGGTTTTGGATGGACTCGCGGCCTATCAGCTTGTTG GTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACA CTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATG GGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTT TCAGTAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTACGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCG TAGGCGGTTTGTCGCGTCTGTCGTGAAAGTCCGGGGCTTAACCCCGGATCTGCGGTGGGTAC GGGCAGACTAGAGTGCAGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGA TATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGAGCG AAAGCATGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGTTGGGCACT AGGTGTGGGGACCATTCCACGGTTTCCGCGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGG GAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGC ATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATGTTCTCGATCGCCG TAGAGATACGGTTTCCCCTTTGGGGCGGGTTCACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTG TCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCCATGTTGCCAGCACGTC GTGGTGGGGACTCATGGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGAGGACGACGTCAA ATCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAATGGGTTGCG ATACTGTGAGGTGGAGCTAATCCCAAAAAGCCGGTCTTAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCG ACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCG GGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCACGAAAGTTGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAAC CCTTGTGGGGGGAGCCGTCGAAGGTGGGACCAGCGATT
34
Lampiran 8. Hasil Analisis Sekuen 16S rRNA dengan Program BLASTN NCBI a.
Isolat L2K5
d.
Isolat L2K3
35
e.
Isolat L1K1
36
