ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS BAKTERI UNGU SULFUR PENURUN KADAR SENYAWA HIDROGEN SULFIDA DI PERIRAN TAWAR 1
Fajar Firmansyah 1, Nina Hermayani Sadi M.Si 2, Dr. Oom Komala 3, Mahasiswa Peneliti, 2 Pembimbing PUSLIT Limnologi LIPI, 3Dosen Pembimbing, Program Studi Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Pakuan
ABSTRAK Hidrogen Sulfida merupakan salah satu masalah di perairan tawar karena dapat mengakibatkan kematian pada biota air. Gas H2S di perairan sangat beracun untuk biota air meski dalam konsentrasi sangat rendah 0,1 mg/L. Oleh karena itu perlu adanya perombakan dengan cara metode bioremediasi. Bioremediasi senyawa H2S dilakukan dengan menggunakan bakteri ungu sulfur yang dapat menyisihkan sulfida dan mengubahnya menjadi sulfur kembali. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan isolat bakteri ungu sulfur yang potensial untuk penurunan H2S. Penelitian ini dilakukan dengan 3 tahap antara lain 1) isolasi bakteri ungu sulfur, 2) identifikasi bakteri ungu sulfur 3) pengujian penyisihan sulfida. isolat diambil dari enam tempat perairan yang diduga terdapat bakteri ungu sulfur, yaitu kolam sidat, kolam lele, Situ Cibuntu, Situ Cilalay, Situ Pasar dan Situ Gedong. Sebanyak 7 isolat bakteri didapatkan dari metode pengenceran, yaitu L1, L2, CU1, CU2, GO, PS dan SD. Ke tujuh isolat termasuk Gram negatif dengan bentuk morfologi L1, L2, CU1 dan CU2 berbentuk basil, GO berbentuk cocobasil, PS dan SD berbentuk spiral. Uji pola spektral memperlihatkan ke tujuh isolat memiliki bakteriklorofil a dan karotenoid dengan fase eksponensial pada 10 jam setelah inkubasi. Ke tujuh isolat dapat menyisihkan sulfida sehingga dapat dipastikan termasuk bakteri ungu sulfur. Kata kunci : Hidrogen sulfida, Bakteri ungu sulfur, penyisihan sulfida Apabila di suatu perairan banyak terkandung H2S maka perlu dilakukan suatu penanggulangan salah satunya dengan cara metode bioremediasi. Bioremediasi merupakan penggunaan makhluk hidup yang telah dipilih untuk ditumbuhkan pada polutan tertentu sebagai upaya untuk menurunkan kadar polutan tersebut. Pada saat proses bioremediasi berlangsung enzim-enzim yang diproduksi oleh mikroorganisme memodifikasi struktur polutan beracun menjadi tidak komplek sehingga menghasilkan metabolit yang tidak beracun dan tidak berbahaya (Priadie, 2012). Penanggulangan senyawa H2S di perairan dapat dilakukan dengan menggunakan bakteri pengoksidasi sulfur untuk bioremediasinya (Schlegel and
PENDAHULUAN Hidrogen sulfida merupakan senyawa sulfur yang menjadi masalah di perairan karena dapat mengakibatkan kematian pada ikan. Terjadinya peningkatan konsentrasi senyawa anorganik beracun H2S, merupakan akibat dari perombakan bahan organik yang tertimbun di sedimen perairan. Penimbunan bahan organik terjadi karena akumulasi sisa hasil metabolisme, sisa pakan dan limbah lain, yang kemudian membusuk dan tertumpuk didasar perairan (Bay 1986 dalam Triani dkk, 2005). Gas H2S di perairan ini sangat beracun untuk biota air meski dalam konsentrasi sangat rendah yaitu 0,1 mg/L (Boyd, 1984 dalam Triani dkk, 2005).
1
Schmidt, 1994). Menurut Friedrich et al, (2001) salah satu bakteri pengoksidasi sulfur adalah bakteri ungu sulfur. Bakteri ungu sulfur termasuk ke dalam kelompok bakteri fotosintetik anaerobik yang mampu memanfaatkan senyawa H2S untuk hidupnya. Bakteri tersebut dapat di isolasi dari air dengan kondisi lingkungan yang banyak mengandung bahan organik dan senyawa H2S. Bakteri ungu sulfur melalui aktivitas fotosintetik anoksigeniknya memanfaatkan H2S sebagai sumber elektron untuk memfiksasi CO2 sehingga pada akhir fotosintesisnya tidak menghasilkan oksigen melainkan sulfur. Oleh karena itu penelitian mengenai bakteri ungu sulfur perlu dilakukan untuk mengetahui berapa besar pengaruh kemampuan bakteri ungu sulfur dalam menurunkan kadar H2S. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan isolat bakteri ungu sulfur yang potensial untuk penurunan kadar senyawa H2S di perairan tawar.
Limnologi LIPI pada bulan April sampai Juli 2016. Penelitian ini dilakukan dengan 3 tahap antara lain 1) isolasi bakteri ungu sulfur, 2) identifikasi bakteri ungu sulfur 3) pengujian penyisihan sulfida. Isolasi Bakteri Ungu Sulfur Sampel diambil di enam tempat perairan yang diduga terdapat bakteri ungu sulfur, yaitu kolam sidat, kolam lele, Situ Cibuntu, Situ Cilalay, Situ Pasar dan Situ Gedong. Isolasi bakteri ungu sulfur diawali dengan pengkayaan bakteri menggunakan media Pfennig 2 cair (Tabel 1) pada beberapa konsentrasi salinitas. Media dan sampel air dimasukkan ke dalam tabung reaksi dengan perbandingan 1 ml sampel air : 2 ml paraffin cair : 9 ml media dengan perbedaan salinitas NaCl yaitu 0; 0,25‰; 0,5‰; 0,75‰; 1‰ ke dalam larutan media Pfennig 2. Perlakuan ini dilakukan untuk mengetahui salinitas optimum dalam menumbuhkan bakteri ungu sulfur. Di inkubasikan selama 14 hari pada suhu ruangan di tempat dengan kuat cahaya 200-1000 lux.
BAHAN DAN METODE Penelitian ini dilakukan di laboratorium mikrobiologi Pusat Penelitian Tabel 1 : Komposisi Media Pfennig 2 Komposisi Larutan 1 Akuades KH2PO4 NH4Cl MgSO4-7H2O CaCl2-2H2O Larutan 2 Vitamin B12 Larutan 3 Element Solution SL 12 - Akuades - EDTA - FeSO4-7H2O - H3BO3 - CoCl2-6H2O - MnCl2-4H2O - ZnCl2 - NiCl2-2H2O - Na2MoO4-2H2O - CuCl2-2H2O Larutan 4 NaOH 5% Larutan 5 Na2S-9H2O 6%
Media Padat
Media Cair
950 ml 1 gr 0.5 gr 0.4 gr 0.05 gr
950 ml 1 gr 0.5 gr 0.4 gr 0.05 gr
1 ml
1 ml
1 ml 1L 2 gr 1,1 gr 300 mg 190 mg 50 mg 42 mg 24 mg 18 mg 2 mg
1 ml 1L 2 gr 1,2 gr 300 mg 190 mg 50 mg 42 mg 24 mg 18 mg 2 mg
30 ml
30 ml
6 ml
6 ml
(Sumber : Biebel dan Pfannig, 1978 dalam Dworkin et al, 2006) 2
Kultur yang tumbuh dari hasil dari pengkayaan pada media cair kemudian dimurnikan dengan cara menggunakan pengenceran bertingkat. Pemurnian isolat pada metode pengenceran bertingkat (Stainer et al, 1982) menggunakan media Pfennig 2 cair, dengan tingkat pengenceran yang digunakan hingga antara 10-6 – 10-15. Pengenceran dilakukan dengan memindahkan secara aseptik 0,5 ml suspensi sampel ke dalam tabung yang berisi 4,5 ml larutan media Pfennig 2 cair, dan ditambahkan paraffin untuk kondisi anaerob. Kultur hasil pengenceran diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruangan di tempat dengan kuat cahaya 200-1000 lux.
2011). Isolat berumur 3-4 hari yang ditumbuhkan dalam media padat Pfennig 2 cair diambil 1 ml kemudian dimasukkan kedalam 4 ml larutan sukrosa 60% dalam tabung reaksi. Sampel diaduk hingga homogen setelah itu diukur nilai absorbansinya menggunakan spektrofotometer (Biebl and Drews, 1969 dalam Dworkin et al, 2006). Pengamatan pola pertumbuhan isolat unggul bertujuan untuk mendapatkan data mengenai fase-fase pertumbuhan bakteri ungu sulfur. Uji pola pertumbuhan isolat ini dilakukan dengan cara sebagai berikut: sebanyak 9 ml media Pfennig 2 cair dimasukan kedalam tabung Hach steril secara aseptik. Kemudian ditambahkan isolat sebanyak 1 ml dan paraffin cair steril. Inkubasi isolat bakteri dilakukan di tempat dengan kuat cahaya 200-1000 lux. Setiap 2 jam isolat dilakukan pengukuran absorbansi kultur menggunakana spektrofotometer Hach pada panjnag gelombang 600 nm hingga didapatkan fase stasioner (Schlegel and Schmidt, 1994).
Idetifikasi Bakteri Ungu Sulfur Identifikasi dilakukan untuk mengetahui jenis bakteri tersebut. Pengamatan yang dilakukan dari tiap isolat meliputi warna kultur bakteri, bentuk sel dan uji Gram (Cappuccino, 1983). Identifikasi dilakukan dengan 3 cara yaitu 1) uji pewarnaan Gram, 2) uji pola spektral 3) pengukuran pola pertumbuhan. Pewarnaan Gram dilakukan dengan mengambil satu ose isolat bakteri, diletakkan pada kaca objek yang ditetesi 1 tetes air, disebar, kemudian difiksasi. Pewarnaan dilakukan dengan menggunakan larutan kristal violet. Setelah 1 menit dibilas dengan air perlahan, kemudian diberi iodine. Setelah itu ditambahkan aseton alkohol dan dibilas. Kemudian diteteskan larutan safranin sebagai zat warna tandingan dan dibiarkan satu menit. Dibilas dengan air dan dikeringkan perlahan dengan tissue. Selanjutnya diamati dibawah mikroskop terhadap bentuk dan warna penataan sel bakteri (Cappuccino, 1983). Uji pola spektral menggunakan spektrofotometer bertujuan untuk mengetahui keberadaan bakterioklorofil dan karotenoid yang merupakan ciri khas dari bakteri ungu sulfur. Uji pola spektral dilakukan pada rentang panjang gelombang 300-950 nm (Cappelletti,
Uji Penyisihan Sulfida Uji aktivitas penyisihan sulfida pada bakteri ungu sulfur bertujuan untuk mempelajari kemampuan isolat yang diperoleh dalam menurunkan kosentrasi sulfida. kultur isolat diinokulasikan ke dalam media Pfennig 2 cair sebanyak 9 ml, dengan penambahan paraffin 1 ml untuk keadaan anaerob. Setiap kultur isolat dilakukan 3x ulangan. Kultur diinkubasi pada suhu ruang selama 3x24 jam di depan lampu 15 watt dengan kuat penyinaran 200-1000 lux. Setiap 24 jam dilakukan pengujian kadar sulfida dengan menggunakan plat tetes. Satu tetes kultur isolat dimasukkan ke dalam plat tetes dengan penambahan reagent yaitu reaksi amin H2SO4, larutan FeCl3, dan larutan (NH4)2HPO4 masing-masing setetes. Dilakukan pengamatan terhadap warna yang dihasilkan. Jika yang terbentuk warna biru menandakan adanya sulfida, sedangkan jika warna kuning dan bening 3
merah tidak terdapat sulfida. Kepekatan warna yang terbentuk kemudian di klasifikasikan. Warna kuning atau bening merah menunjukkan bahwa sulfida telah habis dan isolat yang demikian diberi nilai “+++” (penyisihan cepat); warna kuning kehijauan menunjukkan bahwa masih terdapat sulfida dengan konsentrasi rendah dan isolate diberi skor “++” (penyisihan sedang); warna biru muda menunjukkan sulfida masih cukup banyak dan isolate diberi skor “+” (penyisihan lambat); dan warna biru pekat menunjukkan bahwa tidak ada penurunan kosentrasi sulfida dan isolate diberi skor “-“ (tidak ada aktivitas penyisihan).
dan CU2), 1 isolat dari Situ Gedong (GO), 1 isolat dari kolam sidat (SD), dan 1 isolat dari Situ Pasar (PS) (Tabel 3). Isolat yang didapat dengan menggunakan metode pengenceran bertingkat dipastikan kemurniannya melalui pengamatan terhadap sel bakteri dari kultur (Tabel 2). Isolat murni L1, L2, CU1, CU2, dan GO diperoleh dari tingkat pengenceran 10-6, sedangkan isolat SD dan PS diperoleh dari tingkat pengenceran 10-15. Pengenceran lebih banyak pada Situ Pasar dan kolam sidat dikarenakan sel bakteri yang terlihat masih tercampur pada pengenceran 10-6. Oleh karena itu pengenceran lanjutan dilakukan untuk mendapatkan bakteri dengan bentuk bakteri yang sama yaitu hingga 10-15. Isolat murni yang diperoleh dari metode pengenceran selanjutnya dikulturkan ke dalam media Pfennig 2 cair baru untuk dilakukan dalam proses pengujian-pengujian selanjutnya.
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Isolasi Bakteri Ungu Sulfur Sebanyak 7 isolat bakteri didapatkan dari metode pengenceran (Tabel 2), yaitu 2 isolat dari kolam lele (L1 dan L2), 2 isolat dari Situ Cibuntu (CU1
Tabel 2 : Hasil Pemurnian Bakteri Ungu Sulfur menggunakan Metode Pengenceran. Tingkat Sampel Kode Isolat Warna Isolat Pengenceran 10-6 Merah muda Kolam Lele L1 -6 10 Merah muda L2 -6 10 Merah kecoklatan Situ Cibuntu CU1 -6 10 Merah kecoklatan CU2 -6 10 Merah kecoklatan Situ Gedong GO 10-15 Merah kecoklatan Situ Pasar PS -15 10 Merah kecoklatan Kolam Sidat SD diberikan ditahap berikutnya. pengamatan bentuk sel diketahui bahwa ke 4 isolat berbentuk basil (L1, L2, CU1, dan CU2), 1 isolat berbentuk cocobasil (GO) dan 2 isolat berbentuk spiral (PS dan SD) (Tabel 3). Menurut Dworkin et al (2006), bakteri ungu sulfur memiliki bentuk sel berbeda seperti cocus, cocobasil, basil, dan spiral dengan warna isolat yang khas (Gambar 7). Morfologi bentuk bakteri ungu sulfur berbeda setiap spesiesnya dan menjadikan ciri khas untuk identifikasi (Imhoff et al. 1998)
Uji Pewarnaan Gram Hasil pengujian pewarnaan Gram menunjukkan bahwa ke tujuh isolat termasuk kedalam Gram negatif (Tabel 3). Hasil ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Kumar et al (2011), yang mengatakan kebanyakan bakteri ungu sulfur termasuk kedalam Gram negatif. Menurut Pelezar (2008) dalam Apriani (2015) bakteri Gram negatif akan kehilangan ungu kristal ketika dicuci dengan alkohol, sehingga dapat menyerap zat warna tandingan merah safranin yang
4
Tabel 3 : Hasil Pewarnaan Gram Kultur Isolat. Sampel
Kode Isolat
Kolam Lele
L1 L2 CU1 CU2 GO PS SD
Situ Cibuntu Situ Gedong Situ Pasar Kolam Sidat
Pewarnaan Gram Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif
Bentuk sel Basil Basil Basil Basil Cocobasil Spiral Spiral
teridentifikasi pada panjang gelombang 440, 460 dan 490 termasuk jenis spirilloxanthin. Terdapat 5 jenis karatinoid sebagai pigmen penangkap cahaya bakteri, yaitu lycopene, rhodopin, anhydrobodovibrin, rhodovibrin dan spirilloxanthin, yang menjadi cirri khas bakteri fotosintetik. Spirollaxanthin memiliki penyerapan panjang gelombang maksimum 440-490 nm (Horibe et al, 2012).
Uji Pola Spektral Hasil pengujian pola spektral (tabel 4) bakteri menujukkan bahwa semua isolat memiliki bakterioklorofil jenis bakterioklorofil a. Hal ini ditandai dengan adanya panjang gelombang maksimum pada 375, 595, 805,855 dan 870 nm. Menurut Pfennig et al dalam Dworkin et al (2006), mengatakan bakterioklorofil a akan menunjukkan panjang gelombang maksimum pada 375, 590-600, dan 800900 nm. Pigmen karotenoid ke tujuh isolat Tabel 4: Hasil Uji Pola Spektral Kultur Isolat
Puncak Panjang Gelombang
Kode Isolat
1
2
3
4
5
6
7
8
GO CU1 CU2 L1 L2 SD PS
375 375 375 375 375 375 375
440 440 440 440 440 440 440
460 460 460 460 460 460 460
490 490 490 490 490 490 490
595 595 595 -
805 805 805 805 805 805 805
855 855 855
870 870 870 870 -
Gambar 1 menunjukkan pola pertumbuhan isolat bakteri ungu sulfur. Pada 10 jam awal pertumbuhan bakteri belum terdeteksi. Hal ini diduga bakteri melakukan penyesuaian terhadap lingkungan atau medium setelah inokulasi. Pada fase adaptasi ini terjadi peningkatan ukuran sel bakteri, dan mengalami sedikit
Jumlah Puncak Panjang Gelombang 7 6 7 6 7 6 6
Bchl a a a a a a a
pembelahan (Agustien dkk, 2010). Fase eksponensial terjadi pada awal 10 jam setelah inkubasi dengan puncak fase eksponensial jam ke 48. Fase eksponensial merupakan fase pembentukan metabolit primer yang dihasilkan oleh mikroorganisme (Agustien dkk, 2010).
5
POLA PERTUMBUHAN
L1
Absorban
0.8
L2
0.6
CU1
0.4
CU2 GO
0.2
PS 0 0
2
4
8
10
12
24
28
32
48
52
72
SD
Waktu/jam
Gambar 1: Pola Pertumbuhan Ketujuh Isolat Selama 72 Jam. Fase eksponesial pada bakteri ungu sulfur ini dapat dijadikan informasi, untuk penggunaan bakteri ungu sulfur yang baik pada 10 jam setelah inkubasi. Menurut Dwidjuseputro (1998) dalam Agustien dkk (2010), pertumbuhan bakteri pada fase eksponesial berlangsung paling cepat. Bakteri pada fase ini baik untuk dijadikan inokulum, untuk produksi senyawa yang diinginkan.
Uji Penyisihan Sulfida Hasil pengujian penapisan awal berupa uji kualitatif dengan menggunakan plat tetes, didapatkan bahwa ketujuh isolat dapat menyisihkan sulfida (Tabel 5).
Tabel 5: Uji Kualitatif Penyisihan Sulfida Menggunakan Plat Tetes Kode Isolat
Penurunan Sulfida
OD
L1 L2 CU1 CU2 GO PS SD
+++ +++ +++ ++ ++ + +
0.611 0.540 0.603 0.518 0.623 0.547 0.287
Keterangan : +++ ++ +
= Cepat = Sedang = lambat
Isolat L1, L2, dan CU1 menyisihkan sulfida lebih cepat, diikuti CU2 dan GO dengan peyisihan sedang, serta PS dan SD yang paling lambat menyisihkan sulfida. Menurut Schlegel
and Schmidt (1994) ciri khas bakteri ungu sulfur pada waktu pertumbuhan senyawa sulfida dengan cepat dioksidasi didalam sel dan mempercepat pertumbuhan bakteri.
6
Infrared Radition (>800 nm) (sampling Location: Little Sippewissett Marsh, Woods H ole, Ma). Microbial Diversity course marine Biological Laboratory. Universitas of Bologna. Cappucino JG. 1983. Microbiology: A Laboratory Manual. Addison Wesley Publishing Company. Dworkin M, Stanley F, Eugens K, KarlHeinz S, and Erko S. 2006. The Prokaryotes. Springer. Volume : 6. 846-870. Friedrich, C.G., D. Rother, F. Bardischewsky, A. Quentmeier, & J. Fischer. 2001. Oxidation of reduced inorganic sulfur compound by bacteria: emergence of a common mechanism? Appl. Environ Microbial. 67 (7) : 28732882. Horibe. T., Katsunori. N., Toshiyuki. K., Ritsuko. F., Richard. J., Codgell., Mamoru. N., Hideki. H., 2012. Polarization Angle Dependence of Strak Absorption Spectra of Spirilloxanthin Boundd to The Reconstituted LH1 Complexes Using LH1-subunits Isolated from The Purple Photosynthetic Bacterium Rhodospirillum rubrum. Biochimica Polonica. Vol 59, No 1. Kumar. R. S., Ranjani., Uday. C.K., Mahmood. S., Vanaja., Uma. D., 2011. Isolation of Photosynthetic Sulfur Bacteria from The Soil Samples of Elevated CO2 Chamber. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. Vol 3 (3). Priadie Bambang. 2012. Teknik Bioremediasi Sebagai Alternatif Dalam Upaya Pengendalian Pencemaran Air. Jurnal Ilmu lingkungan. Vol(10) : 38-48. Schlegel, H.G., and K. Schmidt. 1994. Mikrobiologi umum.Edisi keenam Yogyakarta. Gadjah Mada University Press. Hal 425-450.
KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Dari ke enam sampel sumber dapat diisolasikan tujuh isolat bakteri ungu sulfur sebanyak 7 isolat dari perairan tawar yaitu L1 & L2 (kolam lele), CU1 & CU2 (Situ Cibuntu), GO (Situ Gedong), PS (Situ Pasar), dan SD (kolam sidat) dengan menggunakan metode pengenceran (dilution method). Isolat-isolat yang didapat tersebut memiliki bachterioklorofil a dan pigmen karotenoid jenis spirilloxanthin. Pola pertumbuhan ke tujuh isolat bakteri ungu sulfur menunjukkan awal fase eksponensial terjadi 10 jam setelah inkubasi. Puncak fase eksponensial terjadi pada 48 jam setelah inkubasi. Ke tujuh isolat termsuk bakteri ungu sulfur setelah dilakukan pengujian penyisihan sulfida, Isolat L1, L2, dan CU1 menyisihkan sulfida lebih cepat, diikuti CU2 dan GO dengan peyisihan sedang, serta PS dan SD yang paling lambat menyisihkan sulfida. Saran Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan ini, maka perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui spesies bakteri isolat-isolat tersebut. Perlu dilakukan pengujian terhadap dampak yang diperoleh pada lingkungan setelah menggunakan bakteri ungu sulfur, sehingga isolat yang diperoleh dapat dipergunakan untuk skala lapang. DAFTAR PUSTAKA Agustien. A. Jetty N. Linar Z. 2010. Pingkan A. produksi protease alkali dan karatinase dari brevibacillus agri A-03 termofilik. Jurnal riset kimia. Vol 4 (1). Apriani Ike. (2015). Isolasi, Seleksi dan Karakterisasi Bakteri Mannolitik yang Berasal dari Serasah Tanaman Sawit. Bioilmi. Vol 1. No 1. Cappelletti Martina. 2011. Characterization of Anoxygenic Phototrophs that Grow Using 7
Stainer, R.Y., Adelberg. E.A., & Ingraham, J. (1982). The Microbial World. New Jersey. Pratice Hall Inc. Englewood Ciffs. Triani, Wiwik. Artini P. Okid P.A. 2005. Populasi Bakteri Pengoksidasi
Sulfur Anorganik dan Kadar H2S di Tambak Udang Putih (Penaeus vannamei Boone) Sistem Intensif. BioSMART. Volume 7,Nomor 1. Hal 23-26.
8
