ISOLASI AKTINOMISET ENDOFIT TANAMAN OBAT YANG BERPOTENSI SEBAGAI ANTIDIABETES MELALUI KAJIAN AKTIVITAS α-GLUKOSIDASE
DENNY IRAWAN
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
ABSTRAK DENNY IRAWAN. Isolasi Aktinomiset Endofit Tanaman Obat yang Berpotensi sebagai Antidiabetes Melalui Kajian Aktivitas α-glukosidase. Dibimbing oleh YULIN LESTARI dan MIN RAHMINIWATI. Aktinomiset endofit hidup di dalam jaringan tanaman tanpa menimbulkan efek negatif. Beberapa tanaman obat berasosiasi dengan mikrob endofit yang memproduksi senyawa bioaktif sama dengan tanaman inangnya. Inhibisi α-glukosidase merupakan salah satu mekanisme antidiabetes. Potensi aktinomiset endofit tanaman obat sebagai penghasil inhibitor α-glukosidase perlu dikaji. Temulawak (Curcuma xanthorrhiza), ciplukan (Physalis minima) dan brotowali (Tinospora crispa) disterilisasi permukaan lalu digerus. Ekstrak dicawankan pada media agar humic acid vitamin B. Aktinomiset yang dumbuh dimurnikan, diproduksi pada media International Streptomyces Project No.4 dan ekstrak kasarnya digunakan untuk penentuan aktivitas inhibisi terhadap α-glukosidase, sedangkan bakteri lainnya disimpan sebagai kultur koleksi. Ekstrak kasar dengan aktivitas tertinggi dari tiap sampel tanaman dikeringbekukan. Ekstrak kasar kering beku dilarutkan dalam dimetilsulfoksida sehingga konsentrasinya 0.07%, 0.1%, 0.3%, dan 0.5% (b/v) kemudian diuji aktivitas inhibisinya terhadap α-glukosidase. Inhibitor komersial acarbose (Glucobay; Bayer) digunakan sebagai pembanding. Empat puluh enam isolat bakteri endofit terbagi atas 29 isolat Gram positif dan 17 isolat Gram negatif. Lima belas isolat aktinomiset berasal dari batang brotowali 11 isolat dan rimpang temulawak 4 isolat. Ekstrak kasar Cx-10.1 dari temulawak pada konsentrasi 0.07% (b/v) menunjukkan aktivitas tertinggi (61.27%), lebih tinggi dari Glucobay 0.1% (b/v) (39.70%). Ekstrak kasar Tc-2.1 dari brotowali pada konsentrasi 0.07% (b/v) inhibisinya 24.16%. Dengan demikian isolat Cx-10.1 mempunyai potensi sebagai penghasil inhibitor α-glukosidase yang aktivitasnya lebih tinggi dibandingkan Glucobay.
ABSTRACT DENNY IRAWAN. Isolation of Endophytic Actinomycetes in Medicinal Plants and Their Potency as an Antidiabetes Based on α-glucosidase Activity. Supervised by YULIN LESTARI and MIN RAHMINIWATI. Endophytic actimomycetes lives in plant tissues without causing a negative impact on plant. Several medicinal endophytic microbes are able to produce the same bioactive compounds as produced by the host. Inhibition of α-glucosidase is one of antidiabetes mechanism. The potency of endophytic actinomycetes from medicinal plant as α-glucosidase inhibitor needs to be elucidated. Temulawak (Curcuma xanthorrhiza), ciplukan (Physalis minima) and brotowali (Tinospora crispa) were surface sterilized and crushed, then plated on humic acid vitamin B. Actinomycetes colonies were purified and produced on International Streptomyces Project No. 4 followed by α-glucosidase assay. Crude extracts with the highest inhibition of α-glucosidase were freeze dried, then diluted at 0.07%, 0.1%, 0.3%, 0.5% (w/v) with dimethylsulfoxide and assayed. Commercial inhibitor, acarbose (Glucobay; Bayer) were used as a comparation. Fourty six isolates were classified into 29 isolates Gram positive and 17 isolates Gram negative. Fifteen isolates were actinomycetes which 11 isolates obtained from brotowali stem, and 4 isolates from temulawak rhizome. The highest inhibition (61.27%) were shown by Cx-10.1 temulawak isolate at 0.07% (w/v) concentration compared with Glucobay 0.1% (w/v) which was only 39.70%. At 0.07% (b/v) concentration, Tc-2.1 from brotowali produce low activity (24.16%). Endophytic Cx-10.1 isolate could be potential to produce higher activity of α-glucosidase inhibitor compared with Glucobay.
ISOLASI AKTINOMISET ENDOFIT TANAMAN OBAT YANG BERPOTENSI SEBAGAI ANTIDIABETES MELALUI AKTIVITAS α-GLUKOSIDASE
DENNY IRAWAN
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
Judul Skripsi : Isolasi Aktinomiset Endofit Tanaman Obat yang Berpotensi sebagai Antidiabetes Melalui Kajian Aktivitas α-Glukosidase Nama : Denny Irawan NIM : G34104064
Menyetujui : Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Ir. Yulin Lestari NIP 131 779 515
drh. Min Rahminiwati, PhD NIP 131 473 989
Mengetahui : Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor
Dr. drh. Hasim, DEA NIP 131 578 806
Tanggal Lulus :
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT. atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret hingga November 2008 ini ialah Isolasi Aktinomiset Endofit Tanaman Obat yang Berpotensi Sebagai Antidiabetes Melalui Kajian Aktivitas α-Glukosidase. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Yulin Lestari dan drh. Min Rahminiwati, PhD selaku dosen pembimbing yang telah memberi bimbingan, masukan serta saran dan tempat bertanya selama penelitian dan penulisan laporan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih disampaikan pula kepada Dr. Ir. Suharsono, DEA yang telah memberi saran dan masukan selaku dosen penguji komisi pendidikan Departemen Biologi FMIPA IPB. Selain itu penulis juga sampaikan terima kasih kepada Ibunda tercinta dan keluarga serta doa untuk Ayahanda (alm). Ucapan terima kasih juga ditujukan kepada Bu Nunuk dan Antonio dari Pusat Studi Biofarmaka LPPM IPB, Ferdy Kimia 41, serta teman-teman Laskar Lestari: Budi, Yayo, Desy. Kepada Neta, Nicho, Angel, Teten, Rusna serta teman-teman Biologi angkatan 41 khususnya yang melakukan penelitian di laboratorium Mikrobiologi, tak lupa Mba Dila, Bu Chotimawati, Mba Maya, dan Mba Junda. Serta pihak-pihak yang secara tidak langsung telah membantu dalam penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Desember 2008
Denny Irawan
RIWAYAT HIDUP Penulis merupakan anak tunggal yang dilahirkan di Jakarta pada tanggal 5 Desember 1986 dari ayah Bambang Soebekti dan ibu Rodiyah. Tahun 2004 penulis lulus dari SMA Negeri 47 Jakarta dan pada tahun yang sama masuk Institut Pertanian Bogor melalui Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB). Penulis memilih Departemen Biologi FMIPA IPB pada pilihan pertama. Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten dosen praktikum mata kuliah Biologi Dasar pada tahun ajaran 2005/2006 hingga 2008/2009, Fisiologi Tumbuhan tahun ajaran 2007/2008, Mikrobiologi Dasar dan Genetika Dasar tahun ajaran 2008/2009. Penulis pernah bergabung dalam Ikatan Himpunan Mahasiswa Biologi Indonesia wilayah kerja Jawa-I, dan Uni Konservasi Fauna. Beberapa kepanitiaan juga pernah diikuti, salah satunya pada Mei 2008 yaitu kepanitiaan dalam acara The 1st International Symposium on Temulawak rangkaian “Series Event of Jamu, Brand Indonesia” yang diadakan di IPB International Convention Center sebagai Guests Guide dan peraih The Best Poster Presenter dengan topik penelitian karya ilmiahnya pada acara yang sama. Penulis juga pernah memperoleh beberapa prestasi non akademik, yaitu sebagai runner up kompetisi olahraga fakultas “COSMIC 2008” dalam cabang badminton beregu, serta 10 besar semifinalis penulis cerpen tingkat kampus dalam acara “Miracle Art of Agriculture in IPB Contest (MAGIC) 2008”. Penulis melakukan studi lapang di Kawasan wana Wisata Cangkuang Sukabumi, dengan judul “Penapisan Bakteri Selulolitik dan Xilanolitik Asal Wana Wisata Cangkuang Sukabumi Jawa Barat”. Penulis juga melakukan praktik lapang di PT. Indah Kiat Pulp & Paper Tbk. SerangMill pada bulan Juli hingga Agustus 2007, dengan judul “Pengolahan Air Limbah di PT. Indah Kiat Pulp & Paper Tbk. Serang-Mill”.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ............................................................................................................................vi DAFTAR GAMBAR ........................................................................................................................vi DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................................................vi PENDAHULUAN Latar Belakang .............................................................................................................................1 Tujuan Penelitian..........................................................................................................................1 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat .......................................................................................................................1 Bahan dan Alat .............................................................................................................................1 Metode Penelitian.........................................................................................................................2 Pengambilan Sampel ...............................................................................................................2 Isolasi Aktinomiset Endofit .....................................................................................................2 Produksi Ekstrak Kasar Aktinomiset .......................................................................................2 Penentuan Daya Hambat Isolat yang Menghasilkan Inhibitor α-glukosidase .........................2 Uji Aktivitas Inhibisi α-glukosidase........................................................................................3 HASIL Isolasi Bakteri Endofit..................................................................................................................3 Penentuan Daya Hambat Isolat yang Menghasilkan Inhibitor α-glukosidase..............................5 Uji Aktivitas Inhibisi α-glukosidase ............................................................................................5 PEMBAHASAN ...............................................................................................................................6 SIMPULAN ......................................................................................................................................8 SARAN .............................................................................................................................................8 DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................................................8 LAMPIRAN....................................................................................................................................10
DAFTAR TABEL Halaman 1 2 3 4 5
Sistem reaksi penapisan ................................................................................................................3 Sistem reaksi pengujian.................................................................................................................3 Keragaman bakteri endofit rimpang temulawak pada media NA..................................................4 Keragaman bakteri endofit ciplukan pada media NA ...................................................................4 Keragaman bakteri endofit brotowali pada media ISP no.2 ..........................................................5
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 2 3 4
Aktivitas inhibisi α-glukosidase ekstrak kasar aktinomiset .........................................................5 Aktivitas inhibisi α-glukosidase ekstrak kasar isolat Tc-2.1.........................................................6 Aktivitas inhibisi α-glukosidase ekstrak kasar isolat Cx-10.1. .....................................................6 Koloni pada ISP no.2 agar (a) Tc-2.1 (b) Cx-10.1. ......................................................................6
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 2 3 4 5
Tabel komposisi media................................................................................................................11 Keragaman koloni dan morfologi mikroskopis aktinomiset endofit ...........................................12 Data absorbansi penentuan daya hambat isolat yang menghasilkan inhibitor α-glukosidase .....13 Data absorbansi uji inhibisi α-glukosidase eksrak kasar isolat Tc-2.1........................................14 Data absorbansi uji inhibisi α-glukosidase ekstrak kasar isolat Cx-10.1 ....................................15
1
PENDAHULUAN Latar Belakang Diabetes mellitus (DM) merupakan penyakit metabolik yang menjadi permasalahan cukup serius di Indonesia. Jumlah penderitanya meningkat seiring perubahan gaya hidup, terutama pola makan masyarakat (Direktur Gizi Masyarakat 2003). Jumlah penderita DM di Indonesia berdasarkan survey WHO tahun 2005 menempati peringkat ke empat setelah India, Cina, dan Amerika Serikat. Jumlah penderita DM di Indonesia Tahun 1995 sebanyak 4.5 juta jiwa dan diperkirakan terus meningkat hingga 12.4 juta jiwa pada tahun 2025 (Depkes 2005). Diabetes mellitus adalah penyakit yang disebabkan oleh meningkatnya kadar gula dalam darah akibat kekurangan insulin baik absolut maupun relatif. Terdapat dua tipe DM, yaitu DM tipe I dan DM tipe II. DM tipe I disebabkan kekurangan insulin yang terjadi karena kerusakan sel beta pankreas, sedangkan DM tipe II disebabkan insulin yang tidak dapat bekerja dengan baik (Direktur Gizi Masyarakat 2003). Bangsa Indonesia telah mengenal khasiat berbagai tanaman obat sebagai ramuan untuk pengobatan diabetes. Air rebusan rimpang temulawak, batang brotowali, dan ciplukan digunakan sebagai obat tradisional untuk mengobati diabetes (Thomas 1992, Mistra 2004, Wijayakusuma 2005). Ekstrak metanol brotowali (Tinospora crispa) mengandung senyawa yang memiliki aktivitas antihiperglikemia (Noor & Ashcrof 1998). Temulawak dapat memperbaiki gejala diabetes pada tikus, seperti growth retardation, hyperphagia, polydipsia, tingginya glukosa dan trigliserida dalam serum, serta mengurangi terbentuknya linoleat dari arakhidonat dalam fosfolipid hati (Yasni et al. 1991). Karbohidrat komplek seperti pati dipecah menjadi gula sederhana di usus halus oleh αglukosidase sebelum diabsorpsi. Inhibitor glukosidase adalah senyawa yang menghambat α-glukosidase. Senyawa ini menghambat pemecahan komplek karbohidrat sehingga absorpsi glukosa dapat ditunda atau dicegah (Isslebacker et al. 1998 dan Sundaram et al. 1998) Mikrob endofit adalah mikrob yang tinggal sedikitnya satu siklus hidup di dalam tanaman (Azavedo et al. 2000). Mikrob
endofit menghasilkan bioaktif yang berpotensi di bidang farmasi dan agrokimia. Potensinya meliputi antibiotik, antivirus, antikanker, antioksidan, bioinsektisida, imunosupresif, serta antidiabetik (Strobel & Daisy 2003). Tanaman obat yang digunakan saat ini masih menitikberatkan pada khasiat berbagai bioaktif yang terkandung di dalamnya. Padahal Strobel dan Daisy (2003) menyatakan bahwa beberapa tanaman yang memproduksi senyawa bioaktif juga berasosiasi dengan mikrob endofit yang memiliki kemampuan memproduksi senyawa bioaktif yang sama. Tanaman Taxus spp. merupakan penghasil antikanker peclitaxel. Cendawan endofit, Taxomyces andreanae yang diisolasi dari tanaman tersebut juga memproduksi peclitaxel (Strobel et al. 1993). Tanaman Kennedia nigriscans digunakan suku Aborigin untuk membalut luka dan infeksi. Aktinomiset endofit genus Streptomyces sp. strain NRRL 30562 yang diisolasi dari tanaman tersebut memproduksi antibiotik peptida berspektrum luas yang disebut munumbicins (Castillo et al. 2002). Aktinomiset diketahui sebagai sumber penyumbang senyawa antibiotik dan bioaktif terbesar. Streptomyces spp. merupakan aktinomiset endofit yang berperan dalam pertahanan jagung dan gandum terhadap patogen (Coombs & Franco 2003, Rosenblueth & Romero 2006). Aktinomiset isolat lokal memiliki keragaman yang tinggi dan beberapa isolat menghasilkan senyawa bioaktif antimikrob (Lestari 2006). Oleh karena itu kajian potensi aktinomiset endofit tanaman obat Indonesia sebagai penghasil senyawa bioaktif inhibitor α-glukosidase perlu dilakukan. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengkaji aktinomiset endofit penghasil inhibitor α-glukosidase.
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan dari Maret hingga November 2008, bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi FMIPA IPB, serta Laboratorium Uji Pusat Studi Biofarmaka LPPM-IPB.
2
Bahan dan Alat Sampel tanaman obat adalah temulawak (Curcuma xanthorrhiza), ciplukan (Physalis minima) dan brotowali (Tinospora crispa). Media mikrobiologi yang digunakan adalah nutrient agar (NA), humic acid vitamin-B agar (HV agar), International Streptomyces Project (ISP) no.2 dan no.4 (Lampiran 1). Antibiotik yang digunakan adalah cycloheximide dan nalidixic acid. Enzim αglukosidase (Sigma; USA), Na2CO3, dimetilsulfoksida, dan p-nitrofenil α-Dglukopiranosida. Alat yang digunakan adalah spektrofotometer, sentrifuse, freeze dryer (Takara; Japan), water bath, laminar air flow, dan alat-alat standar laboratorium mikrobiologi. Metode Penelitian Pengambilan Sampel Tanaman yang sehat dipilih untuk menghindari adanya fitopatogen di dalam jaringan tanaman tersebut. Tanaman dihilangkan tanahnya, lalu dicuci. Temulawak yang digunakan adalah rimpangnya, sedangkan brotowali dan ciplukan digunakan seluruh bagian tanaman. Isolasi Aktinomiset Endofit Metode isolasi menggunakan teknik aseptik dengan tiga langkah sterilisasi permukaan (Coombs & Franco 2003). Sampel disterilisasi permukaan dengan cara merendamnya di dalam alkohol 70% selama 60 detik, lalu direndam dalam NaOCl 5.25% selama 5 menit, kemudian direndam dalam alkohol 70% selama 60 detik, terakhir dibilas dengan akuades steril. Bagian tanaman yang telah steril permukaannya lalu dipotong dan digerus menggunakan mortar secara aseptik. Ekstrak yang diperoleh disentrifugasi 3000 x g selama 10 menit. Sebanyak 0.1 ml supernatan disebar pada cawan HV agar mengandung cycloheximide (50 mg/l media) dan nalidixic acid (20 mg/l media) lalu diinkubasi pada suhu ruang selama 14 hari. Supernatan yang disebar pada media HV agar dilakukan triplo. Koloni aktinomiset yang tumbuh diisolasi pada media agar ISP no.2, sedangkan bakteri lainnya diisolasi pada media NA dan disimpan sebagai kultur koleksi. Pengamatan morfologi koloni dan pewarnaan isolat untuk penentuan Gram dilakukan dengan mengikuti prosedur Hadioetomo (1993). Isolat aktinomiset yang
telah diisolasi diuji aktivitas inhibisinya terhadap α-glukosidase. Produksi Ekstrak Kasar Aktinomiset Isolat aktinomiset diremajakan pada media agar ISP no.2 pada suhu ruang selama tujuh hari. Inokulum aktinomiset diambil dengan sedotan steril berdiameter 0.8 cm sebanyak lima bulatan yang dimasukkan dalam media cair ISP no.4 100 ml. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang menggunakan inkubator bergoyang dengan kecepatan 75 rpm selama 14 hari. Kultur disentrifugasi 8500 x g 4 oC 15 menit. Supernatan dari kultur ini digunakan untuk menentukan daya hambat larutan tersebut terhadap aktivitas αglukosidase. Penentuan Daya Hambat Isolat yang Menghasilkan inhibitor α-glukosidase Penentuan daya hambat inhibitor terhadap α-glukosidase mengacu pada Sugiwati (2005) yang menggunakan sistem reaksi pada Tabel 1, duplo. Larutan stok enzim terdiri atas 1 mg α-glukosidase (86 u/mg protein) di dalam 25 ml 100 mM buffer fosfat pH 7 yang mengandung 200 mg bovin serum albumin. Konsentrasi larutan stok tersebut diencerkan menjadi 0.01 mg/ml. Larutan substrat terdiri atas p-nitrofenil α-D-glukopiranosida 20 mM dalam 100 mM buffer fosfat pH 7. Absorban p-nitrofenol yang dilepaskan diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 400 nm. Inhibitor α-glukosidase acarbose 50 mg/tablet (Glucobay; Bayer) digunakan sebagai pembanding. Obat ini dilarutkan dengan akuades sehingga konsentrasinya 1% (b/v). Larutan pembanding diperlakukan sama dengan sampel. Daya hambat ekstrak kasar aktinomiset terhadap aktivitas α-glukosidase dihitung dalam persen inhibisi dengan rumus sebagai berikut. % Inhibisi = C - S x 100% C C ialah absorban kontrol dan S merupakan absorban sampel.
3
HASIL Tabel 1 Sistem reaksi penapisan (dalam µl) Blanko
Kontrol (+)
Kontrol (-)
Sampel
-
-
20
20
20
20
-
-
980
980
980
980
Substrat 500 500 500 Prainkubasi 37 °C selama 5 menit
500
Ekstrak kasar ISP 4 steril Bufer
Bufer
500
-
Enzim 500 Inkubasi 37 °C selama 15 menit Na2CO3
2000
2000
500
-
-
500
2000
2000
(Sugiwati 2005)
Uji Aktivitas Inhibisi α-glukosidase Isolat aktinomiset terpilih dikulturkan pada 300 ml media cair ISP no.4. Inkubasi dilakukan dengan menggunakan inkubator bergoyang dengan kecepatan 75 rpm pada suhu ruang selama 14 hari. Kultur dipanen dengan sentrifugasi 8500 x g 4 oC 15 menit. Supernatan sebanyak 210 ml dikeringbekukan dengan freeze dryer lalu dilarutkan dalam dimetilsulfoksida sehingga konsentrasinya menjadi 0.07%, 0.1%, 0.3% dan 0.5% (b/v). Pelet dikeringkan menggunakan oven bersuhu 60 oC selama 5 hari untuk diukur bobot biomassa keringnya. Ekstrak kasar isolat terpilih diukur aktivitas inhibisinya dengan metode Sugiwati (2005) dan Subramanian et al. (2008) yang dimodifikasi. Pengukuran dilakukan triplo. Glucobay 0.1% digunakan sebagai pempbanding. Konsentrasi α-glukosidase yang digunakan 0.002 mg/ml dengan sistem reaksi pada tabel 2. Tabel 2 Sistem reaksi pengujian (dalam µl) Blanko Sampel
-
DMSO
50 1700
Bufer
Kontrol Kontrol (+) (-) -
50
50
50
-
-
1450
1700
1450
-
250
250
250
250
2000
2000
2000
Enzim 250 Prainkubasi 5 menit suhu ruang Substrat 250 Inkubasi 5 menit 37 °C 2000 Na2CO3
Sampel
(Sugiwati 2005 dan Subramanian et al. 2008 yang dimodifikasi).
Isolasi Bakteri Endofit Bakteri endofit yang berhasil diisolasi dari rimpang temulawak berjumlah dua puluh isolat. Tiga belas isolat merupakan bakteri Gram positif, sedangkan tujuh isolat merupakan bakteri Gram negatif. Empat isolat yang bentuk selnya berfilamen dan digolongkan sebagai aktinomiset adalah Cx-10.1, Cx-10.2, Cx-11.1 dan Cx-12.1 (Tabel 3). Bakteri endofit yang diisolasi dari ciplukan berjumlah sebelas isolat. Lima isolat berasal dari akar, lima isolat dari daun, dan satu isolat dari batang. Semua isolat asal ciplukan tidak ada yang termasuk aktinomiset. Lima isolat merupakan bakteri Gram positif, sedangkan enam isolat merupakan bakteri Gram negatif (Tabel 4). Bakteri endofit yang diisolasi dari brotowali berjumlah lima belas isolat. Sebelas isolat aktinomiset diisolasi dari batang, empat isolat endofit brotowali lainnya merupakan bakteri Gram negatif (Tabel 5). Total Isolat bakteri endofit yang diisolasi berjumlah empat puluh enam isolat. Lima belas isolat diantaranya termasuk dalam aktinomiset. Sebelas isolat aktinomiset diperoleh dari batang brotowali dan empat isolat dari rimpang temulawak. Keragaman aktinomiset endofit yang diisolasi dapat dilihat dari warna miselium dan warna spora. Warna miseliumnya adalah oranye, merah, putih dan krem, serta warna sporanya adalah hijau, abu-abu, serta putih. Aktinomiset yang membentuk miselium aerial digolongkan dalam kelompok streptomiset, sedangkan yang tidak membentuk miselium aerial digolongkan dalam kelompok non streptomiset. Berdasarkan morfologi mikroskopis, diperoleh tujuh isolat streptomiset, yaitu Tc-2.1, Tc-3.1, Tc-3.2, Tc4.1, Tc-4.2, Tc-4.3, dan Tc-4.4. Isolat non streptomiset berjumlah delapan isolat, yaitu Cx-10.1, Cx-10.2, Cx-11.1, Cx-12.1, Tc-1.1, Tc-1.2, Tc-1.4, dan Tc-9.1. Gambar koloni isolat aktinomiset serta morfologi mikroskopis streptomiset dan non streptomiset disajikan dalam Lampiran 2.
4
Tabel 3 Keragaman bakteri endofit rimpang temulawak pada media NA Isolat
Warna koloni
Karakteristik koloni *
Pewarnaan Gram
Bentuk dan penataan sel
Endospora
Cx-1.1 putih b, lc, d + kokus, tunggal Cx-1.2 putih b, ld, c basil, tunggal Cx-1.3 merah muda b, lc, d basil, tunggal Cx-2.1 Putih b, ld, c + kokus, tunggal Cx-2.2 Putih b, ld, c + basil, tunggal terminal Cx-2.3 kuning b, lc, c + basil, tunggal Cx-4.1 putih b, ld, c kokus, berpasangan Cx-4.2 putih b, lc, d + basil, tunggal terminal Cx-4.3 putih tb, lc, d + basil, tunggal terminal Cx-6.1 putih b, ld, c basil, tunggal Cx-9.1 putih b, d, lc kokus, berpasangan Cx-9.3 kuning b, lc, c kokus, tunggal Cx-9.4 oranye b, lc, c + kokus, tunggal Cx-10.1 oranye b, lk, bk + Filamen Cx-10.2 oranye b, lk, bk + Filamen Cx-11.1 cokelat b, lc, bk + Filamen Cx-12.1 oranye b, lc, bk + filamen Cx-13.3 putih b, lc, d + basil, tunggal Cx-15.1 putih b, lc, c kokus, tunggal Cx-15.2 oranye tb, lc, c + basil, bentuk v * b = bulat; tb = tidak beraturan; lk = berlekuk; lc = licin; ld = berlendir; bk = berbukit; d = datar; c = cembung Tabel 4 Keragaman bakteri endofit ciplukan pada media NA Isolat
Asal
Pm-1.2 Pm-1.3
akar akar
Warna
Karakteristik
Pewarnaan
Bentuk dan
Endo-
koloni
koloni *
Gram + +
penataan sel basil, tunggal kokus, tunggal
spora
+
kokus, tunggal
-
-
kokus, tunggal
-
+
basil, tunggal
-
+ -
basil, tunggal basil, tunggal kokus, tunggal kokus, tunggal kokus, tunggal
-
-
kokus, tunggal
-
putih b, r, lc, c kuning b, r, lc, c putih Pm-1.4 akar b, r, lc, c kekuningan kuning Pm-2.1 daun b, r, lc, d muda putih Pm-2.2 daun b, r, lc, c kekuningan Pm-3.2 akar putih b, r, lc, d Pm-5.2 akar putih b, r, lc, c Pm-6.1 batang putih b, r, lc, d Pm-7.1 daun merah b, r, lc, d Pm-7.2 daun putih b, r, lc, d kuning Pm-7.4 daun b, r, lc, d muda * b = bulat; r = rata; lc = licin; d = datar; c = cembung
-
5
Tabel 5 Keragaman bakteri endofit brotowali pada media ISP no.2 Warna Warna Karakteristik Isolat Asal Bentuk sel dan pewarnaan Gram koloni spora aerial koloni * Tc-1.1 batang oranye non spora b, r, bk,t filamen, Gram + Tc-1.2 batang oranye non spora b, r, bk,t filamen, Gram + Tc-1.3 batang putih b, r, lc, c basil, tunggal, Gram Tc-1.4 batang oranye non spora b, r, bk,t filamen, Gram + Tc-2.1 batang putih hijau b, r, bd, t filamen, Gram + Tc-2.2 batang putih b, r, lc, d basil, tunggal, Gram Tc-3.1 batang krem abu-abu b, g, k, t filamen, Gram + Tc-3.2 batang putih putih b, g, bd, d filamen, Gram + Tc-4.1 batang putih putih b, g, bk, t filamen, Gram + Tc-4.2 batang krem putih b, g, k, t filamen, Gram + Tc-4.3 batang krem putih b, g, bk, t filamen, Gram + Tc-4.4 batang krem putih b, r, bd, t filamen,Gram + Tc-9.1 batang merah non spora b, r, lc, t filamen, Gram + Tc-6.1 daun putih b, r, lc, d kokus, berpasangan, Gram Tc-8.1 akar putih b, r, lc, d kokus, tunggal, Gram * b = bulat; r = rata; lk = berlekuk; g = bergelombang; lc = licin; bk = berbukit; bd = berdebu; k = keriput; d = datar; c = cembung; t =timbul 12,00 10,00
In h ib is i (% )
8,00 6,00 4,00 2,00
.1
.1 11
12 Cx
Cx
.1
.2 10
10 Cx
Cx
44
43 Tc
Tc
42
41 Tc
Tc
31
32 Tc
Tc
14 Tc
21
0,00
Tc
Penentuan Daya Hambat Isolat yang Menghasilkan Inhibitor α-glukosidase Dua belas ekstrak kasar isolat aktinomiset endofit telah diuji terhadap aktivitas αglukosidase. Tiga isolat aktinomiset lainnya yaitu Tc-1.1, Tc-1.2, dan Tc-8.1 tidak dapat diuji karena isolat tersebut tidak mampu tumbuh pada media ISP no.4. Ekstrak kasar isolat yang diuji menunjukkan aktivitas inhibisi yang beragam. Aktivitas inhibisi ekstrak kasar aktinomiset dapat dilihat pada Gambar 1. Data absorbansinya disajikan pada Lampiran 3. Isolat Tc-2.1 dan Tc-3.1 dari batang brotowali menunjukkan aktivitas inhibisi αglukosidase tertinggi 6.61%. Isolat Cx-10.1 dari rimpang temulawak menunjukkan aktivitas inhibisi α-glukosidase tertinggi sebesar 5.25%. Isolat Tc-4.3 menunjukkan aktivitas inhibisi terendah yaitu 0.63%. Glucobay 1% sebagai pembanding memiliki aktivitas inhibisi 99.09%. Isolat Tc-2.1 dari brotowali dan Cx-10.1 dari temulawak merupakan isolat terpilih yang diuji aktivitas inhibisinya terhadap α-glukosidase. Penampakan morfologi koloni Isolat Tc-2.1 dan Cx-10.1 dapat dilihat pada Gambar 4.
Isolat
Gambar 1 Aktivitas inhibisi α-glukosidase ekstrak kasar aktinomiset. Uji Aktivitas Inhibisi α-glukosidase Isolat Tc-2.1 dan Cx-10.1 yang diproduksi pada 300 ml media cair ISP no.4 menghasilkan bobot biomassa kering berturutan adalah sebesar 0.90 g dan 0.83 g. Bobot kering beku ekstrak kasar yang diperoleh dari 210 ml ekstrak kasar yang dikeringbekukan berturutan sebesar 0.65 g dan 1.12 g. Isolat Tc-2.1 menunjukkan aktivitas inhibisi tertinggi (24.16%) pada konsentrasi 0.07% (b/v). Aktivitas inhibisi ekstrak kasar Tc-2.1 dapat dilihat pada Gambar 2. Isolat Cx10.1 juga menunjukkan aktivitas inhibisi tertinggi (61.27%) pada konsentrasi 0.07% (b/v). Aktivitas inhibisi ekstrak kasar Cx-10.1 dapat dilihat pada Gambar 3. Glucobay 0.1% (b/v) menunjukkan aktivitas inhibisi 39.70%. Data absorbansinya disajikan pada Lampiran 4 dan 5.
6
100
Inhibisi (%)
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0.07
0.1
0.3
0.5
Glucobay 0.1%
Konsentrasi (% b/v)
Gambar 2
Aktivitas inhibisi α-glukosidase ekstrak kasar isolat Tc-2.1.
100 90
Inhibisi (%)
80 70 60 50 40 30 20 10 0 0.07
0.1
0.3
0.5
Glucobay 0.1%
Konsentrasi (% b/v)
Gambar 3
Aktivitas inhibisi α-glukosidase ekstrak kasar isolat Cx-10.1.
(a) (b) Gambar 4 Koloni pada ISP no.2 agar (a) Tc-2.1 (b) Cx-10.1.
PEMBAHASAN Keragaman aktinomiset yang diisolasi adalah sangat tinggi. Aktinomiset sebagian besar berasal dari batang brotowali yaitu sebelas isolat, sedangkan empat isolat diperoleh dari rimpang temulawak. Keragaman aktinomiset yang terisolasi bergantung pada metode isolasi dan jenis media (Takahashi & Omura 2003). Media isolasi aktinomiset yang digunakan pada penelitian ini adalah agar humic acid vitamin B yang diberi Cycloheximide (50 mg/l) untuk menekan pertumbuhan cendawan dan Nalidixic acid (20 mg/l) untuk menekan pertumbuhan bakteri Gram negatif. Pada umumnya densitas bakteri endofit lebih rendah daripada bakteri rizosfer (Rosenblueth & Romero 2006). Beberapa bakteri rizosfer dapat masuk ke jaringan
tanaman, tidak membahayakan tanaman serta membentuk asosiasi mutualistik sebagai endofit (Azavedo et al. 2000). Bakteri endofit memiliki interaksi yang beragam dengan tanaman, diantaranya menstimulasi respon pertahanan tanaman. Sebaliknya, bakteri endofit mendapatkan proteksi dari cekaman biotik dan abiotik (Hallman et al. 1997). Bakteri dengan bentuk sel filamen digolongkan ke dalam filum Actinobacteria, memiliki karakter Gram positif, dengan kandungan guanine dan cytosine tinggi (70%) (Holt et al. 1994). Aktinomiset dengan hifa yang tumbuh cepat, membentuk miselium aerial, memiliki spora yang tersusun berantai seperti spiral atau heliks tergolong streptomiset. Aktinomiset yang tidak membentuk miselium aerial tergolong non streptomiset (rare actinomycetes). Streptomyces merupakan genus paling banyak (77%) dari kelompok streptomiset. Genus lainnya yang tergolong non streptomiset antara lain Actinomadura, Actinoplanes, Mycobacterium, Nocardia, Saccharopolyspora, Microbispora, dan Micromonospora. Morfologi rantai spora, permukaan spora, warna miselium serta pigmentasi dapat dijadikan dasar klasifikasi hingga level spesies (Miyadoh & Otoguro 2004). Isolat Tc-2.1 tergolong streptomiset yang memiliki warna miselium putih dengan warna spora aerial hijau. Isolat Cx-10.1 tergolong non streptomiset yang memiliki warna miselium oranye dan tidak membentuk spora aerial. Aktinomiset endofit yang diisolasi dari akar gandum meliputi Streptomyces spp, Micromonospora, Microbispora, Nocardioides, Actinomadura, Kitasatospora, dan Dactylosporangium. Streptomyces spp. merupakan isolat yang dominan serta mampu menghambat pertumbuhan cendawan patogen tanaman (Coombs & Franco 2003). Pada brotowali ada indikasi bahwa kelompok streptomiset lebih dominan daripada non streptomiset. Daya hambat aktivitas α-glukosidase dikaji menggunakan pseudo-substrat p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida. Senyawa ini terhidrolisis menjadi α-D-glukosa dan pnitrofenol yang berwarna kuning (Sugiwati 2005). Warna kuning yang dihasilkan merupakan indikator kemampuan inhibisi. Kemampuan inhibitor yang semakin besar menghasilkan produk yang semakin sedikit atau warna larutan setelah inkubasi menjadi lebih cerah (Mikkelsen & Corton 2004, Sugiwati 2005).
7
Ekstrak kasar dari semua isolat yang diuji memiliki aktivitas inhibisi yang beragam terhadap α-glukosidase. Aktivitas inhibisi tertinggi dimiliki oleh isolat Tc-2.1 dan Tc-3.1 dari brotowali serta Cx-10.1 dari temulawak. Isolat Cx-10.1 memiliki aktivitas inhibisi tertinggi (61.27%) pada konsentrasi 0.07% (b/v), sedangkan isolat Tc-2.1 aktivitas inhibisi tertingginya (24.16%) yang dicapai pada konsentrasi 0.07% (b/v). Hal ini menunjukkan bahwa isolat Cx10.1 berpotensi lebih besar sebagai penghasil inhibitor αglukosidase dibandingkan dengan isolat Tc-2.1. Aktivitas ekstrak kasar isolat Tc-2.1 dan Cx-10.1 dalam menghambat α-glukosidase terjadi peningkatan ketika dilakukan pengujian lebih lanjut. Berdasarkan pengukuran bobot kering bekunya, konsentrasi ekstrak kasar Tc-2.1 dan Cx-10.1 pada penapisan (Gambar 1) adalah 0.3% (b/v). Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas inhibisi Tc2-1 (Gambar 2) dan Cx-10.1 (Gambar 3) semakin meningkat pada konsentrasi yang lebih rendah. Aktivitas inhibisi semakin meningkat seiring menurunnya konsentrasi ekstrak kasar pada rentang konsentrasi yang diuji. Peningkatan ini kemungkinan disebabkan oleh interaksi komponenkomponen dalam ekstrak kasar tersebut. Ekstrak kasar aktinomiset masih mengandung berbagai senyawa metabolit sekunder, makro dan mikro nutrien yang ada dalam media produksi. Senyawa yang terkandung di dalamnya akan semakin terpisahkan dari senyawa lain yang kemungkinan dapat mengganggu pengaruh senyawa inhibitor terhadap α-glukosidase jika konsentrasi semakin rendah. Aktivitas inhibisi Tc2-1 dan Cx-10.1 meningkat dengan menggunakan metode Sugiwati (2005) dan Subramanian et al. (2008) yang dimodifikasi. Hal ini dapat dilihat pada konsentrasi yang sama, yaitu pada konsentrasi 0.3% (b/v) aktivitas inhibisi kedua isolat tersebut meningkat (Gambar 1, Gambar 2, dan Gambar 3). Peningkatan ini disebabkan oleh ekstrak kasar yang mengandung senyawa inhibitor (sampel) diinkubasi terlebih dahulu dengan enzim (Tabel 2). Hal tersebut kemungkinan dapat mengurangi kompetisi inhibitor dengan substrat untuk mengikat enzim. Selain itu, peningkatan aktivitas inhibisi juga disebabkan nisbah volume antara ekstrak kasar dengan enzim yang diturunkan dari 1:25 menjadi 1:5. Penggunaan nisbah yang besar menjadi lebih selektif dalam proses penapisan.
Inhibitor dan enzim yang direaksikan terlebih dahulu memiliki analogi dengan aplikasi klinis penggunaan obat inhibitor αglukosidase. Apabila akan dikembangkan lebih lanjut, penelitian ini menunjukkan bahwa senyawa inhibitor yang terkandung dalam ekstrak kasar isolat Cx-10.1 sebaiknya digunakan sebelum makan. Aktivitas inhibisi ekstrak kasar Cx-10.1 lebih tinggi dibandingkan dengan Glucobay pada konsentrasi 0.1% (b/v) (Gambar 3). Pada konsentrasi yang lebih rendah (0.07%), inhibisinya meningkat. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak kasar Cx-10.1 memiliki aktivitas inhibisi yang lebih baik dibandingkan Glucobay. Ekstrak metanol brotowali memiliki aktivitas inhibisi α-glukosidase 23.81% pada konsentrasi 0.5% (b/v) (Historya 2004). Isolat Tc-2.1 merupakan aktinomiset endofit brotowali yang memiliki aktivitas inhibisi lebih tinggi (24.16%) pada konsentrasi yang lebih rendah (0.07% [b/v]). Hal ini menunjukkan bahwa kemungkinan terdapat keterkaitan antara tanaman dengan mikrob endofit dalam memproduksi senyawa bioaktif. Strobel dan Daisy (2003) menyatakan bahwa beberapa tanaman yang memproduksi senyawa bioaktif berasosiasi dengan endofit yang mampu memproduksi senyawa bioaktif yang sama. Aktinomiset merupakan penghasil inhibitor enzim, diantaranya inhibitor αglukosidase. Acarbose merupakan inhibitor kompetitif α-glukosidase (Cannel et al. 1988). Senyawa ini digunakan untuk menekan absorpsi glukosa pada pengidap DM tipe II. Absorpsi glukosa yang ditekan mengakibatkan kadar glukosa dalam darah tidak meningkat tajam. Hal ini menjadikan pengidap DM tipe II dapat mengontrol diet karbohidrat secara lebih baik. Acarbose dan senyawa yang memiliki struktur serupa merupakan senyawa inhibitor α-glukosidase yang diperoleh dari kultur berbagai aktinomiset (Isslebacker et al. 1998). Beberapa senyawa tersebut adalah validamycins / validoxylamines yang dihasilkan oleh Streptomyces hygroscopicus, gabosines oleh Streptomyces sp., dan acarbose oleh Actinoplanes sp. SE50 (Wehmeier & Piepersberg 2004, Chang-Gu et al. 2005). Acarbose merupakan salah satu metabolit sekunder bakteri yang sukses diintroduksi ke pasar farmasi dunia (Wehmeier dan Piepersberg 2004). Actinoplanes endofit pada Taxus sp. mampu memproduksi senyawa antikanker
8
taxol seperti tanaman inangnya (Caruso et al. 2000). Actinoplanes merupakan aktinomiset non streptomiset. Genus ini merupakan anggota famili Micromonosporaceae yang memproduksi spora motil dari sporangia atau vesikel spora yang berkembang dari ujung sporangiofor yang panjang atau pendek. Actinoplanes memiliki miselium yang bercabang, non fragmen, miselium aerial sangat jarang atau tidak ada, membentuk spora motil yang berbentuk sferik atau subsferik sampai tidak beraturan (Yokota 1997). Bakteri endofit yang mampu memproduksi senyawa bioaktif yang sama dengan tanaman inang yakni tanaman obat, dapat mengurangi kebutuhan produksi tanaman tersebut. Produksi senyawa bioaktif sebagai antidiabetes yang dihasilkan aktinomiset endofit akan lebih efisien dibandingkan diproduksi oleh tanaman inangnya. Hal ini juga sangat bermanfaat bila tanaman obat tersebut tumbuh lambat serta langka, sehingga kelestarian tanaman obat tersebut di alam dapat terus terjaga tanpa eksploitasi yang berlebihan. Penelitian ini menunjukkan bahwa temulawak dan brotowali yang telah dikenal secara empiris sebagai obat tradisional untuk terapi diabetes berasosiasi dengan aktinomiset endofit yang menghasilkan senyawa bioaktif sebagai antidiabetes melalui aktivitas inhibitor αglukosidase.
SIMPULAN
SARAN Optimasi produksi dan penentuan struktur senyawa bioaktif inhibitor αglukosidase dari ekstrak kasar Cx-10.1 serta uji in-vivo perlu dilakukan.
DAFTAR PUSTAKA Azavedo JL, Maccheroni W, Pereira JO, Araujo WL. 2000. Endophytic microorganisms : a review on insect control and recent advances on tropical plants. Electronic J Biotechnol 3(1):40-65. Cannell RJP, Farmer P, Walker JM. 1988. Purification of pentagalloylglucose, an α-glucosidase inhibitor / antibiotic from the freshwater green alga Spirogyra varians. Biochem J 255:937-941. Caruso M et al. 2000. Isolation of endophytic fungi and actinomycetes taxane producers. Ann Microbiol 50:3-13. Castillo et al. 2002. Munumbicins, wide spectrum antibiotics produced by Streptomyces NRRL 30562, endophytic on Kennedia nigriscans. Microbiol 148:2675-2685. Chang-Gu H et al. 2005. Molecular detection of α-glucosidase inhibitor-producing actinomycetes. Microbiol 43(3): 313318.
Isolat bakteri endofit yang diperoleh berjumlah empat puluh enam isolat. Lima belas isolat diantaranya tergolong aktinomiset. Sebelas isolat aktinomiset diperoleh dari batang brotowali (Tinospora crispa) dan empat isolat dari rimpang temulawak (Curcuma xanthorrhiza). Ekstrak kasar semua isolat aktinomiset yang diuji menunjukkan aktivitas inhibisi yang beragam dengan kisaran 0.63%–6.61%. Aktivitas inhibisi ekstrak kasar Cx-10.1 (52.43%), lebih tinggi daripada Glucobay (39.70%) pada konsentrasi 0.1% (b/v). Isolat Cx-10.1 menunjukkan aktivitas inhibisi tertinggi (61.27%) pada konsentrasi 0.07% (b/v). Isolat Cx-10.1 merupakan endofit rimpang temulawak penghasil inhibitor α-glukosidase yang berpotensi sebagai penghasil senyawa antidiabetes.
Coombs JT, Franco CCM. 2003. Isolation and identification of Actinobacteria from surface-sterilized wheat roots. Appl Environ Microbiol 69(9):5603-5608. [Depkes]. Departemen Kesehatan. 2005. Jumlah Penderita Diabetes Indonesia Ranking ke-4 Di Dunia. [Terhubung berkala].http://www.depkes.go.id/ind ex.php?option=news&task=viewartic le&sid=1183&Itemid=2. [23 Oktober 2008]. Direktur Gizi Masyarakat. 2003. Peran diit dalam penanggulangan diabetes. [makalah]. Direktorat Jendral Bina Kesehatan Masyarakat, Departemen Kesehatan RI. Hadioetomo RS. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama. Hallmann J, Quadt-Hallmann A, Mahaffee WF, Kloepper JW. 1997. Bacterial
9
endophytes in agricultural crops. Can J Microbiol 43:895-914. Historya D. 2004. Perbandingan daya inhibisi terhadap enzim α-glukosidase dan aktivitas antibakteri antara ekstrak ramuan dan ekstrak tunggal penyusun formula obat antidiabetes alami. [Skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Holt JG, Kreig NR, Sneath PHA, Stanley JT, Williams ST. 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Ed ke-9. Baltimore: Lippincott Willians & Wilkins. Isslebacker KJ et al. 1998. Harison’s Principles of Internal Medicine. Massachusetts : Mc Graw Hill. Lestari Y. 2006. Identification of indigenous Streptomyces spp. producing antibacterial compounds. J Mikrobiol Indones 11(2):99-101. Mikkelsen SR, Corton E. 2004. Bioanalytical Chemistry. New Jersey: J Wiley. Mistra. 2004. Tiga Jurus Melawan Diabetes Mellitus. Jakarta : Puspa Swara. Miyadoh S, Otoguro M. 2004. Workshop on isolation methods and classification of actinomycetes. [makalah]. Biotechnology Center LIPI. Noor H, Ashcrof SJ. 1998. Pharmaco-logical characterization of the antihyperglycaemic properties of Tinospora crispa extracts. J Ethnopharmacol 62:7-13. Rosenblueth M, Romero EM. 2006. Bacterial endophytes and their interactions with hosts. Mol Plant-Microbe Interactions 19(8):827-837. Strobel G, Daisy B. 2003. Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products. Microbiol and Mol Biol Rev 67:491-502. Strobel G, Stierle A, Hess WM, Stierle D. 1993. Taxomyces andreanae a proposed new taxon for a bulbilliferous hyphomycete associated with Pacific yew. Mycotaxon 47:71-18. Subramanian R, Asmawi Z, Sadikun A. 2008. In vitro α-glucosidase and α-amylase enzyme inhibitory effects of Andrographis paniculata extract and andrographolide. Acta Biochimika Polonica 55(2):391–398.
Sugiwati S. 2005. Aktivitas antihiperglikemik dari ekstrak buah ahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.) sebagai inhibitor alfaglukosidase. [Tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Sundaram A et al. 1998. Newer antidiabetic drugs. Int J Diab Dev Countries 18:24-29. Takahashi Y, Omura S. 2003. Isolation of new actinomycete strains for screening of new bioactive compounds. J Gen Appl Microbiol 49:141-154. Thomas, ANS. 1992. Tanaman Obat Tradisional. Jil.2. Yogyakarta : Kanisius. Wehmeier UF, Piepersberg W. 2004. Biotechnology and mollecular biology of the α-glucosidase inhibitor acarbose. J Appl Biotechnol 63:613-625. Wijayakusuma MH. 2005. Bebas Diabetes Mellitus Ala Hembing. Jakarta: Puspa Swara. Yasni S, Katsumi I, Michihiro S. 1991. Effects of an Indonesian medicinal plant, Curcuma xanthorrhiza Roxb. on the levels of serum glucose, and triglyceride, fatty acid desaturation, and bile acid excretion in streptozotocin-induced diabetic rats. Agric Biol Chem 55(12):3005-3010. Yokota A. 1997. Family Micromonosporaceae. Di dalam : Miyadoh S, editor. Atlas of Actinomycetes. Japan: The Society for Actinomycetes Japan.
10
LAMPIRAN
11
Lampiran 1 Tabel komposisi media Media ISP no.2 agar (1 L media) Komposisi
jumlah
Akuades
1000 ml
Yeast extract
4g
Malt extract
10 g
Dextrose
4g
agar
20 g Media cair ISP no.4 (1 L media)
Komposisi
jumlah
Akuades
1000 ml
Soluble starch
10 g
CaCO3
2g
(NH4)2SO4
2g
K2HPO4
1g
MgSO4.7H20
1g
NaCl
1g
FeSO4.7H2O
0.001 g
MnCl2.4H2O
0.013 g
ZnSO4.7H2O
0.001 g
Media HV agar (1 L media) Komposisi
Jumlah
Akuades
1000 ml
Humic acid sol.*
40 ml
CaCO3
0.02 g
FeSO4.7H2O
0.01 g
KCl
1.71 g
MgSO4.7H2O
0.05 g
Na2HPO4
0.5 g
Vitamine B sol. **
5 ml
Cycloheximide Nalidixic acid sol.*** * ** ***
50 mg 4 ml
1 g humic acid dalam 40 ml 0.4% NaOH 100 mm, inkubasi 30 menit. 5 ml ( mengandung 0.5 mg thiamine-HCl, riboflavin, niacin, pyridoxin-HCl,inositol, Capanthothenate, p-aminobenzoic acid, dan 0.25 mg biotin. Vit-B disterilisasi membran). 20 mg dilarutkan dalam campuran 1 ml 0.4% NaOH steril dan 3 ml akuades steril.
12
Lampiran 2 Keragaman koloni dan morfologi mikroskopis aktinomiset endofit a. Gambar keragaman koloni pada media ISP no.2
b. Morfologi mikroskopis
(a)
(b)
(a) streptomiset, miselium aerial ditunjukkan tanda panah, diwakili Tc-4.2 dan (b) non streptomiset, tidak membentuk miselium aerial, diwakili Cx-12.1
13
Lampiran 3 Data absorbansi penentuan isolat yang menghasilkan inhibitor α-glukosidase Nama Blanko Kontrol positif Glucobay 1% Tc-14
Tc-21
Tc-31
Tc-32
Tc-41
Tc-42
Tc-43
Tc-44
Cx-10 1
Cx-10 2
Cx-11 1
Blanko Kontrol positif Cx-12 1
* So = Kontrol negatif
Ulangan
Absorban
Absorban Terkoreksi
Inhibisi (%)
Inhibisi Rataan (%)
1 2 1 2 So 1 2 So 1 2 So 1 2 So 1 2 So 1 2 So 1 2 So 1 2 So 1 2 So 1 2 So 1 2 So
0.077 0.629 0.083 0.081 0.593 0.607 0.083 0.594 0.591 0.081 0.595 0.590 0.078 0.612 0.601 0.078 0.616 0.620 0.079 0.594 0.606 0.075 0.626 0.625 0.072 0.590 0.612 0.074 0.602 0.598 0.077 0.610 0.599 0.075 0.600 0.643 0.079 0.092 0.307 0.303 0.294 0.093
0.552 0.006 0.004 0.516 0.530 0.006 0.517 0.514 0.004 0.518 0.513 0.001 0.535 0.524 0.001 0.539 0.543 0.002 0.517 0.529 -0.002 0.549 0.548 -0.005 0.513 0.535 -0.003 0.525 0.521 0.000 0.533 0.522 -0.002 0.523 0.566 0.002
98.91 99.28 6.52 3.99 6.34 6.88 6.16 7.07 3.08 5.07 2.36 1.63 6.34 4.17 0.54 0.72 7.07 3.08 4.89 5.62 3.44 5.43 5.25 -2.54 -
99.09
1 2 So
0.215 0.211 0.202 0.`001
1.860 6.047 -
5.25
6.61
6.61
4.08
1.99
5.25
0.63
5.07
5.25
4.44
1.36
3.953
14
Lampiran 4 Data absorbansi uji inhibisi α-glukosidase eksrak kasar isolat Tc-2.1 Nama Blanko kontrol negatif Kontrol positif
Ulangan
Absorban
Absorban
Absorban
Inhibisi
Inhibisi
Terkoreksi
Rataan
(%)
Rataan (%)
-
-
-
0.186
42.718 40.129 36.246
39.698
0.277
12.621 8.091 10.356
10.356
19.633
17.152
1 2 3
0.038 0.045 0.351 0.332 0.359
0.007 0.313 0.294 0.321
Pembanding Glucobay 0.1%
1 2 3
0.215 0.223 0.235
0.177 0.185 0.197
0.5
1 2 3
0.308 0.322 0.315
0.270 0.284 0.277
1 2 3
0.310 0.263 0.286
0.272 0.225 0.248
0.248
11.974 27.184 19.741
1 2 3
0.294 0.294 0.294
0.256 0.256 0.256
0.256
17.152 17.152 17.152
1 2
0.283 0.275
0.245 0.237
3
0.259
0.221
0.3
0.1
0.07
0.309
0.234
20.712 23.301 28.479
24.164
15
Lampiran 5 Data absorbansi uji inhibisi α-glukosidase ekstrak kasar isolat Cx-10.1
Nama Blanko kontrol negatif Kontrol positif
Pembanding Glucobay 0.1% 0.5
0.3
0.1
0.07
Ulangan
Absorban
Absorban terkoreksi
Absorbansi Rataan
Inhibisi (%)
Inhibisi rataan (%)
1 2 3 1 2 3
0.026 0.026 0.259 0.243 0.235 0.215 0.223 0.235
0.000 0.233 0.217 0.209 0.177 0.185 0.197
-
42.718 40.129 36.246
-
1 2 3
0.228 0.229 0.233
0.202 0.203 0.207
1 2 3
0.198 0.198 0.198
0.172 0.172 0.172
1 2 3
0.182 0.172 0.165
0.156 0.146 0.139
1 2 3
0.136 0.144 0.157
0.110 0.118 0.131
0.220
0.186
39.698
0.204
8.182 7.727 5.909
7.273
0.172
21.818 21.818 21.818
21.818
0.147
49.515 52.751 55.016
52.427
0.120
64.401 61.812 57.605
61.273
