POTENSI BAKTERI ENDOFIT TANAMAN OBAT SEBAGAI PENGHASIL SENYAWA ANTIHIPERLIPIDEMIA MELALUI AKTIVITAS LIPASE
BUDI WIRAWAN
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
ABSTRAK BUDI WIRAWAN. Potensi Bakteri Endofit Tanaman Obat sebagai Penghasil Senyawa Antihiperlipidemia Melalui Aktivitas Lipase. Dibimbing oleh YULIN LESTARI dan MIN RAHMINIWATI. Bakteri endofit tanaman obat berpotensi menghasilkan berbagai jenis senyawa bioaktif yang juga dihasilkan oleh tanaman inangnya. Ekstrak daun jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.), daun jambu biji (Psidium guajava L.), dan rimpang temulawak (Curcuma xanthorrhiza Roxb.) secara empiris mampu mencegah terjadinya hiperlipidemia. Enzim lipase dapat menghidrolisis senyawa triacylglycerol menjadi asam lemak dan acylglycerol. Tujuan penelitian ini adalah mengisolasi dan mengkaji keragaman dan potensi bakteri endofit dalam menghasilkan senyawa antihiperlipidemia melalui aktivitas lipase. Sebanyak 69 isolat bakteri endofit berhasil diisolasi dari tanaman jati belanda (22 isolat), jambu biji (27 isolat) dan rimpang temulawak (20 isolat). Lima puluh lima isolat dari golongan non-aktinomiset, sedangkan 14 isolat lainnya dari golongan aktinomiset. Keenam puluh sembilan isolat tersebut memiliki karakteristik morfologi koloni dan pigmentasi yang sangat beragam. Penapisan menggunakan media agar Rhodamine B, 8 isolat diketahui memiliki aktivitas lipase. Isolat DPG 3(2) dan AJB 4(4) adalah isolat yang memiliki kemampuan tinggi dalam membentuk pendaran berwarna oranye pada media penapisan. Aktivitas spesifik lipase tertinggi isolat DPG 3(2) terlihat pada jam ke-36 yaitu sebesar 0,874 unit per mg, sedangkan isolat AJB 4(4) terlihat pada jam ke-72 yaitu sebesar 1,139 unit per mg. Isolat DPG 3(2) dan AJB 4 (4) berpotensi sebagai penghasil senyawa antihiperlipidemia melalui aktivitas lipasenya.
ABSTRACT BUDI WIRAWAN. Potency of Endophytic Bacteria in Medicine Plants as Producer of Antihyperlipidemic Compounds Through Lipase Activities. Under the direction of YULIN LESTARI and MIN RAHMINIWATI. Endophytic bacteria that reside within plant tissue are potential to produce similar bioactive compounds that also be produced by the host plant. Several preventive efforts to overcome hyperlipidemic are by using the extract of jati belanda leaves (Guazuma ulmifolia Lamk.), guajava leaves (Psidium guajava L.), and the rhizome of temulawak (Curcuma xanthorrhiza Roxb.). Lipase catalyzes the hydrolysis of triacylglycerol to fatty acids and acylglycerol. The objective of this research was to isolate and to study the diversity and potency of endophytic bacteria as antihyperlipidemic compounds producer through lipase activities. Sixty nine isolates were successfully isolated from jati belanda (22 isolates), guajava (27 isolates), and the rhizome of temulawak (20 isolates). Fifty five isolates belong to the non-actinomycetes group, whereas the other 14 belong to the actinomycetes group. Eight of the 69 isolates were found to be lipase-positive. DPG 3(2) and AJB 4(4) isolates were considered as good lipase producers. The highest specific lipase activity of DPG 3(2) isolate was observed 0,874 units per mg at 38 hours, whereas AJB 4(4) isolates produce the highest specific lipase activities at 1,139 units per mg after 72 hours observation. Eight isolates have a potential as antihyperlipidemic compounds producer through their lipase activity.
POTENSI BAKTERI ENDOFIT TANAMAN OBAT SEBAGAI PENGHASIL SENYAWA ANTIHIPERLIPIDEMIA MELALUI AKTIVITAS LIPASE
BUDI WIRAWAN
Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
Judul Nama NIM
: Potensi Bakteri Endofit Tanaman Obat sebagai Penghasil Senyawa Antihiperlipidemia Melalui Aktivitas Lipase : Budi Wirawan : G34104055
Menyetujui:
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Ir Yulin Lestari NIP 131779515
drh. Min Rahminiwati, PhD NIP 131473989
Mengetahui: Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor
Dr. drh. Hasim, DEA NIP 131578806
Tanggal lulus:
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala limpahan rahmat dan karuniaNya, sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul “Potensi Bakteri Endofit sebagai Penghasil Senyawa Antihiperlipidemia Melalui Aktivitas Lipase”. Penelitian yang dilaporkan dalam karya ilmiah ini dilakukan mulai Februari 2008 sampai dengan November 2008, di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Penulis mengucapkan terima kasih kepada berbagai pihak yang telah membantu selama berlangsungnya kegiatan penelitian ini. Ucapan terima kasih disampaikan kepada Dr. Ir Yulin Lestari selaku dosen pembimbing pertama dan drh. Min Rahminiwati, PhD selaku dosen pembimbing kedua atas segala bimbingan, saran, dan masukan selama berlangsungnya kegiatan penelitian dan selama penyusunan karya ilmiah ini, serta kepada Dr. Ir. R. R. Dyah Perwitasari, M.Sc selaku dosen penguji wakil komisi pendidikan yang telah bersedia menguji dan memberikan masukan saat sidang skripsi dan penyusunan laporan karya ilmiah. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada kedua orang tua tercinta atas segala dukungan dan doa yang telah diberikan, serta teman-teman Biologi 41 dan teman-teman di Laboratorium Mikrobiologi atas semua kekompakkan dan kerja samanya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Januari 2009
Budi Wirawan
RIWAYAT HIDUP Penulis adalah anak tunggal yang dilahirkan di Jakarta tanggal 29 Mei 1986, dari ayah Ihwan Sarwoji dan Ibu Wiyani. Penulis lulus SD pada tahun 1998 dan lulus dari SLTP tahun 2001. Tahun 2004 penulis lulus dari SMU Negeri 6 Tangerang dan pada tahun yang sama diterima di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah Biologi Dasar sejak tahun 2006 hingga 2008, mata kuliah Mikrobiologi Dasar pada tahun 2008 dan mata kuliah Fisiologi Prokariot pada tahun 2008. Penulis melaksanakan kegiatan praktik lapang di PT Coats Rejo Indonesia, Bogor pada tahun 2007. Pada tahun 2006 penulis pernah menjadi koordinator tim kesekretariatan pada acara Lomba Cepat Tepat Biologi (LCTB) dalam rangkaian acara Pesta Sains Nasional FMIPA, IPB. Penulis juga pernah mengikuti keanggotan Bioworld, Himpunan Mahasiswa Biologi (Himabio) dan terpilih menjadi ketua divisi nata de coco periode 2006/2007, selain itu penulis juga merupakan anggota Observasi Wahana Alam (OWA), Himabio. Pada tanggal 27-28 Mei 2008, penulis mengikuti kegiatan The First International Symposium on Temulawak (Curcuma xanthoriza Roxb.) di IPB International Convention Centre (IICC), Bogor, Indonesia dan penelitian yang dilaporkan dalam karya ilmiah ini meraih penghargaan sebagai ”the best poster presentation”.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR .................................................................................................................. vi DAFTAR LAMPIRAN...............................................................................................................
vi
PENDAHULUAN Latar Belakang................................................................................................................. Tujuan ..............................................................................................................................
1 2
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat .......................................................................................................... Bahan dan Alat................................................................................................................ Metode penelitian
2 2
Isolasi Bakteri Endofit dengan Metode Pencawanan............................................ Pemurnian Bakteri Endofit ................................................................................... Penapisan Aktivitas Lipase dari Bakteri Endofit .................................................. Penentuan Kurva Tumbuh dan Produksi Enzim ................................................... Pengukuran Aktivitas Lipase dan Kadar Protein .................................................. Pengukuran Aktivitas Spesifik Lipase ..................................................................
2 2 2 3 3 3
HASIL Isolasi Bakteri Endofit ..................................................................................................... Penapisan Aktivitas Lipase dari Bakteri Endofit ............................................................. Kurva Tumbuh dan Uji Aktivitas Lipase .........................................................................
3 4 4
PEMBAHASAN .........................................................................................................................
6
SIMPULAN ................................................................................................................................
8
SARAN ......................................................................................................................................
8
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................................
8
LAMPIRAN................................................................................................................................
10
DAFTAR TABEL Halaman 1 Kesetaraan aktivitas spesifik lipase isolat DPG 3(2) dengan konsentrasi lipase tipe VII........ 2 Kesetaraan aktivitas spesifik lipase isolat AJB 4(4) dengan konsentrasi lipase tipe VII ........
5 5
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Koloni aktinomiset yang tumbuh pada media HV agar .......................................................... 4 2 Keragaman morfologi koloni dan pigmentasi aktinomiset endofit pada media ISP2.............. 4 3 Pengamatan mikroskopis (400 x) morfologi rantai spora Streptomyces; AJB 4(3) AJB 4(5), APG 5(2), AJB 4(1), APG 5(4), dan non Streptomyces CX 12(1). ........................ 4 4 Endospora yang dibentuk di dalam sel vegetatif isolat AJB 3 dan DPG 3(2) ......................... 4 5 Aktivitas lipase isolat DPG 3(2), AJB 4(4) dan Lipase tipe VII pada media skrining yang mengandung Rhodamine B ............................................................................................ 4 6 Pertumbuhan dan aktivitas spesifik isolat DPG 3(2) pada media yang mengandung minyak zaitun 1%.................................................................................................................... 5 7 Aktivitas spesifik isolat AJB 4(4) pada media yang mengandung minyak zaitun 1% ............ 5
DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3 4 5 6 7 8
Halaman Komposisi media HV agar (stok satu liter) ............................................................................. 11 Komposisi media ISP2 (stok satu liter) ................................................................................... 11 Kurva standar pertumbuhan isolat DPG 3(2) .......................................................................... 11 Bagan alir pembuatan reagen Cupric-acetate pyridine ........................................................... 11 Kurva standar asam margarat.................................................................................................. 12 Kurva standar kadar protein .................................................................................................... 12 Kurva standar aktivitas lipase tipe VII (Sigma Chemical Co)................................................. 13 Tabel keragaman bakteri endofit yang berhasil diisolasi dari daun, batang dan akar jati belanda, jambu biji serta rimpang temulawak ........................................................... 13
1
PENDAHULUAN Latar Belakang Bakteri endofit adalah bakteri yang hidup dalam jaringan tanaman tanpa menimbulkan bahaya dan dapat diisolasi dari jaringan tanaman yang sudah disterilisasi permukaannya atau diekstrak dari jaringan tanaman bagian dalam (Hallman et al. 1997). Hasegawa et al. (2006) mengemukakan bahwa bakteri endofit yang mengkolonisasi jaringan tanaman memperoleh nutrisi dan perlindungan dari tanaman inangnya. Populasi bakteri yang melimpah di alam baik di tanah maupun yang bersifat endofit, memiliki potensi untuk dikaji kemampuannya sebagai penghasil senyawa antihiperlipidemia melalui aktivitas lipasenya. Perubahan pola hidup modern seseorang akibat adanya peningkatan taraf hidup dapat menyebabkan terjadinya pergeseran pola konsumsi pangan kepada produk yang mengandung banyak lemak serta kurang serat. Kondisi ini menyebabkan timbulnya permasalahan kegemukan. Kegemukan merujuk pada situasi kelebihan berat badan akibat meningkatnya konsentrasi lipid darah yang ditandai dengan meningkatnya konsentrasi trigliserida, low density lipoprotein (LDL), kolesterol total dalam darah yang melebihi batas normal (>200 mg/dL) dan menurunnya konsentrasi high density lipoprotein (HDL) (< 40 mg/dL) (Forti & Diament 2006). Kondisi ini biasa dikenal dengan hiperlipidemia. Hiperlipidemia dapat menjadi pemicu munculnya berbagai macam penyakit seperti aterosklerosis yang merupakan penyebab terjadinya penyakit jantung koroner (PJK) dan stroke (Dalimartha 2001). Hiperlipidemia dapat disebabkan oleh perubahan pola makan yang banyak mengonsumsi lemak khususnya lemak jenuh, gula, alkohol, garam dalam menu makan sehari-hari, diabetes yang tidak terkontrol dengan baik, kurang olah raga, kelainan genetik, stres emosional dan gangguan metabolisme (Grundy 1991). Beberapa cara konvensional untuk mengatasi masalah hiperlipidemia, diantaranya adalah banyak melakukan olah raga, mengatur pola makan, hidup teratur, sampai mengonsumsi obatobatan. Meskipun demikian, biasanya penderita merasa jenuh untuk menjalankan cara-cara tersebut. Oleh karena itu, diupayakan pula penggunaan bahan alami seperti tanaman sebagai bahan untuk
menurunkan konsentrasi lemak di dalam tubuh. Beberapa contoh bahan alami yang secara empiris dapat digunakan untuk menurunkan konsentrasi lipid adalah ekstrak daun jati belanda, daun jambu biji, dan temulawak. Ketiga ekstrak tanaman tersebut terbukti mampu menurunkan konsentrasi kolesterol dalam hati tikus yang hiperlipidemia (Rahayu 2007). Berbagai jenis senyawa bioaktif dengan beragam fungsi yang terkandung di dalam tumbuhan, kemungkinan dapat dihasilkan pula oleh mikrob endofit pada tumbuhan tersebut (Strobel & Daisy 2003). Castilo et al. (2002) telah membuktikan bahwa tanaman Snakevine (Kennedia nigrisca) yang dipercaya oleh suku Aborigin di wilayah barat-daya Arnhemland digunakan untuk mengobati luka dan infeksi yang ternyata mengandung mikrob endofit baru yaitu Streptomyces sp. strain NRRL 30562. Streptomyces tersebut mampu memproduksi antibiotik peptida baru dengan spektrum luas bernama munumbycin A-D. Beberapa senyawa bioaktif baru yang mampu dihasilkan oleh bakteri endofit diantaranya berfungsi sebagai antitumor, antiinflamatori, antioksidan dan lain-lain (Firaikovai et al. 2007). Penelitian terhadap ekstrak daun jati belanda menunjukkan bahwa ekstrak etanol tanaman tersebut memiliki kemampuan sebagai senyawa antiobesitas melalui mekanisme inhibisi terhadap aktivitas lipase pankreas (Silitonga 2008). Enzim lipase (triacylglycerol hydrolase, EC 3.1.1.3) dapat menghidrolisis senyawa triacylgyserol menjadi asam lemak dan acylglyserol (Litthauer et al. 2002). Lipase juga berperan dalam metabolisme lipoprotein dalam darah dengan menghidrolisis trigliserida dan fosfolipid yang terdapat pada kilomikron, intermediate density lipoprotein (IDL) dan HDL (Dugi et al. 2000). Peluruhan lemak dapat didekati dengan hidrolisis lemak melalui aktivitas lipase. Berbagai obat komersial antihiperlipidemia dapat disintesis baik secara kimiawi maupun dengan bantuan mikrob. Senyawa antihiperlipidemia yang disintesis secara kimiawi diantaranya adalah amphetamine, phenylpropanolamine, fenflur-amine, dan dexfenfluramine, sedangkan senyawa antihiperlipidemia yang disintesis oleh bakteri diantaranya adalah lipstatin. Lipstatin merupakan senyawa antihiperlipidemia yang dihasilkan oleh Streptomyces toxytricini yang bekerja sebagai inhibitor enzim pankreatik lipase (Weibel et al. 1987). Produk anti-
2
hiperlipidemia ini dikenal dengan nama Orlistat (tetrahydrolipstatin, Xenical®) dan telah diperkenalkan oleh perusahaan Roche Pharmaceutical, UK pada tahun 1998. Beberapa senyawa antihiperlipidemia baru diketahui dari hasil biokonversi senyawa FR177391 oleh Serratia liquefaciens (Kobayashi et al. 2005). Hal tersebut mengindikasikan bahwa bakteri mampu memproduksi senyawa bioaktif yang dapat berfungsi sebagai antihiperlipidemia. Aktinomiset merupakan bakteri Gram positif yang memiliki kandungan guaninsitosin (G+C) tinggi (75%) di dalam genomnya. Bakteri ini juga dikenal sebagai bakteri penghasil antibiotik terbesar, karena dari 10000 antibiotik yang telah ditemukan lebih dari setengahnya dihasilkan oleh aktinomiset. Jika dibandingkan dengan kelompok bakteri lain aktinomiset mempunyai perbedaan yaitu mengalami pembelahan morfologis yang kompleks (Madigan et al. 2006). Selain itu, aktinomiset juga merupakan mikroorganisme penghasil senyawa bioaktif baru yang paling banyak ditemukan. Secara umum, aktinomiset dapat dimasukkan dalam kategori bakteri tanah, namun beberapa jenis aktinomiset diketahui bersifat endofit. Sebagian besar aktinomiset (95%) adalah dari genus Streptomyces (Lachevalier et al. 1977). Data ilmiah mengenai senyawa antihiperlipidemia masih terbatas pada khasiatnya yang terkandung di dalam tumbuhan, sedangkan mengenai senyawa antihiperlipidemia yang dihasilkan oleh mikrob endofit belum banyak dikaji. Oleh karena itu kajian tentang potensi bakteri endofit sebagai penghasil senyawa antihiperlipidemia yang berasosiasi dengan tanaman obat Indonesia perlu dilakukan. Tujuan Mengisolasi dan mengkaji keragaman dan potensi bakteri endofit pada beberapa tanaman obat dalam menghasilkan senyawa antihiperlipidemia melalui aktivitas lipase.
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam-IPB. Penelitian ini
berlangsung mulai bulan Febuari hingga November 2008. Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan adalah tanaman jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.), jambu biji (Psidium guajava L.), rimpang temulawak (Curcuma xanthorrhiza Roxb.), minyak zaitun, media agar nutrien (NA), media agar Humic acid-Vitamin B (HV agar), media International Streptomyces Project 2 (ISP2), media Triton Glucose Yeast Extract (TGY), lipase tipe VII dari Candida rugosa (Sigma Chemical Co) dan media agar Rhodamine B. Peralatan yang digunakan adalah mikroskop, tabung reaksi, Erlenmeyer, spektrofotometer dan peralatan yang umum digunakan di laboratorium Mikrobiologi. Metode Penelitian Isolasi bakteri endofit dengan metode pencawanan. Sterilisasi permukaan dan isolasi bakteri endofit pada daun, batang dan akar jati belanda, jambu biji, serta rimpang temulawak dilakukan dengan menggunakan metode yang dikemukakan oleh Zinniel et al. (2002) yang dimodifikasi. Potongan tanaman jati belanda, tanaman jambu biji dan rimpang temulawak dicuci bersih, kemudian permukaannya disterilkan dengan cara merendam potongan tanaman dan rimpang dalam larutan etanol 70 % selama 1 menit, natrium hipoklorit (NaOCl) 1 % selama 5 menit dan terakhir dengan etanol 70 % selama 1 menit. Potongan bagian tanaman dan rimpang yang telah disterilisasi digerus dengan menggunakan mortar steril hingga halus, lalu dilarutkan menggunakan 12.5 mM buffer fosfat (pH 7.1), kemudian disentrifugasi selama 10 menit pada 3000 rpm. Supernatan hasil sentrifugasi diambil sebanyak 100 µL lalu disebarkan secara merata pada media HV agar (Lampiran 1) dalam cawan Petri yang telah ditambahkan antibiotik sikloheksamida (50 mg/L media), asam nalidiksat (20 mg/L media) dan griseovulvin (0,5 mg/100 mL media) lalu diinkubasi pada suhu ruang (28 0C ) selama ± 14 hari. Pemurnian bakteri endofit. Koloni sampel bakteri non aktinomiset yang muncul setelah diinkubasi selama ± 14 hari, kemudian dimurnikan pada media NA, sedangkan koloni aktinomiset dimurnikan pada media ISP2 (Lampiran 2). Inkubasi dilakukan selama ± 7 hari pada suhu ruang dan diamati morfologi
3
koloni secara pigmentasinya.
mikroskopis
serta
Penapisan aktivitas lipase dari bakteri endofit. Bakteri non aktinomiset endofit murni hasil isolasi dari daun, batang dan akar jati belanda, jambu biji serta rimpang temulawak diambil dengan sedotan steril berdiameter 0,8 cm sebanyak 3 bulatan dan diinokulasikan pada media TGY yang mengandung (per liter) 5 g tryptone, 5 g ekstrak khamir, 1 g dekstrosa dan 1 g K2HPO4 dengan pH 7.2, sedangkan aktinomiset endofit murni diinokulasikan pada media ISP2. Masing-masing media tersebut mengandung 3% minyak zaitun dan 2 mL 0,1% pewarna Rhodamine B yang telah disterilisasi menggunakan milipore (Swinnex) 0,2 µm, kemudian isolat bakteri diinkubasi pada suhu 30 0C selama 48 jam sedangkan isolat aktinomiset diinkubasi pada suhu 25 0C selama 120 jam. Aktivitas lipase pada media penapisan dapat dideteksi di bawah sinar UV sebagai zona berpendar berwarna oranye. Penentuan kurva tumbuh dan produksi enzim. Isolat terpilih yang memiliki aktivitas lipase terbesar diinokulasikan pada 50 mL media tryptone soy broth (TSB) lalu diinkubasi pada suhu 50 0C selama 24 jam. Biakan kemudian diinokulasikan sebanyak 50 mL pada media produksi yang mengandung (per 100 mL) 1% minyak zaitun, 0,02% CaCl2. 2H2O, 0,01% MgSO4. 7H2O, dan 0,04% FeCl3. 6H2O lalu diinkubasi menggunakan inkubator bergoyang pada suhu 50 0C dengan kecepatan 150 rpm. Setiap 12 jam dilakukan pengambilan kultur sel bakteri non aktinomiset untuk diukur densitas selnya pada panjang gelombang 620 nm (Lampiran 3) yang berlangsung selama 96 jam, sedangkan kultur sel aktinomiset diambil setiap 24 jam sekali selama 240 jam. Kultur sel tersebut kemudian disentrifugasi selama 10 menit pada suhu 4 0C dengan kecepatan 10000 rpm. Supernatan yang diperoleh merupakan enzim ekstrak kasar yang selanjutnya diukur aktivitas lipasenya Pengukuran aktivitas lipase dan kadar protein. Enzim ekstrak kasar yang diperoleh diukur aktivitas lipasenya dengan menggunakan metode menurut Kwon dan Rhee (1986). Satu mL enzim ekstrak kasar dicampurkan ke dalam larutan yang mengandung 2,5 mL minyak zaitun + 0,005 M buffer fosfat (1:1) dan 20 µL CaCl2, kemudian diinkubasi menggunakan inkubator bergoyang
dengan kecepatan 200 rpm pada suhu 60 0C selama 30 menit. Campuran ditambah 1 mL 6 N HCl dan 5 mL larutan isooktan lalu dihomogenasi menggunakan vortex selama 1 menit. Empat mL lapisan atas isooktan kemudian dipindahkan ke dalam tabung yang baru, ditambah dengan 1 mL reagen cupric acetate-pyridine (Lampiran 4) dan dihomogenasi menggunakan vortex selama 1 menit. Selanjutnya campuran diukur dengan spektrofotometer pada absorbansi 715 nm. Satu unit aktivitas lipase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang membebaskan 1 µmol asam lemak per mL/menit pada suhu 60 0C. Pengukuran aktivitas lipase dilakukan dengan meng-gunakan kurva standar asam margarat (asam heptadekanoat) yang diukur absorbansinya pada 715 nm (Lampiran 5). Asam margarat adalah salah satu jenis asam lemak dan merupakan monomer penyusun trigliserida yang dihasilkan dari hidrolisis trigliserida oleh lipase. Asam margarat ini kemudian juga direaksikan dengan reagen cupric-acetate pyridine. Besarnya aktivitas lipase ditandai dengan banyaknya asam lemak yang dibebaskan per menit, sehingga penggunaan asam margarat pada penelitian ini bertujuan untuk mendekati jumlah asam lemak yang dibebaskan dari hidrolisis trigliserida (minyak zaitun) oleh enzim ekstrak kasar (sampel). Kadar protein diukur berdasarkan metode Bradford (1976) dengan menggunakan standar bovine serum albumin (BSA) (Lampiran 6). Pengukuran aktivitas spesifik lipase. Aktivitas spesifik lipase diukur dengan menggunakan rumus sebagai berikut; Aktifitas spesifik lipase (unit/mg) = aktivitas lipase (unit/mL) / kadar protein (mL/mg). Aktivitas spesifik lipase yang diperoleh kemudian disetarakan dengan konsentrasi (ppm) lipase tipe VII sebagai kontrol positifnya (Lampiran 7).
HASIL Isolasi bakteri endofit. Isolasi bakteri endofit dari daun, batang dan akar jati belanda, jambu biji, serta rimpang temulawak pada media HV agar berhasil memperoleh 69 isolat bakteri endofit, 55 diantaranya dimasukkan ke dalam golongan non aktinomiset sedangkan 14 diantaranya dimasukkan ke dalam golongan aktinomiset. Isolasi dari tanaman jati belanda diperoleh 22 isolat, dan dari tanaman jambu biji diperoleh
4
27 isolat, sedangkan dari rimpang temulawak diperoleh 20 isolat. Keenam puluh sembilan isolat tersebut memiliki karakteristik morfologi koloni dan pigmentasi yang sangat beragam (Lampiran 8). Isolasi aktinomiset pada media HV agar memperlihatkan adanya per-tumbuhan aktinomiset endofit pada media tersebut (Gambar 1). Selain itu, isolat aktinomiset yang berhasil dipurifikasi pada media ISP2 juga menunjukkan keragaman yang tinggi dalam morfologi koloni dan pigmentasinya (Gambar 2). Pengamatan mikroskopis juga dilakukan terhadap morfologi rantai spora koloni aktinomiset endofit baik yang diduga termasuk ke dalam genus Streptomyces maupun non Streptomyces. Isolat AJB 4(3), AJB 4(5), AJB 4(4), AJB 4(1), dan APG 5(4) merupakan isolat aktinomiset endofit yang termasuk ke dalam genus Streptomyces karena mampu membentuk rantai spora dengan morfologi yang beragam (seperti kait hingga spiral), sedangkan CX 12(1) merupakan isolat aktinomiset endofit yang termasuk ke dalam genus non Streptomyces karena berdasarkan pengamatan mikroskopis diketahui tidak membentuk rantai spora (Gambar 3). Dua puluh tujuh dari 55 isolat bakteri nonaktinomiset endofit terbukti mampu membentuk endospora di dalam sel vegetatifnya seperti isolat AJB 3 dan DPG 3(2) (Gambar 4).
C
Gambar 3 Pengamatan mikroskopis (400 x) morfologi rantai spora Streptomyces; AJB 4(3) (a), AJB 4(5) (b), AJB 4(4) (c), AJB 4(1) (d), APG 5(4) (e), dan non Streptomyces CX 12(1) (f).
Gambar 4 Endospora yang dibentuk di dalam sel vegetatif isolat AJB 3 (a) dan DPG 3(2) (b).
Penapisan aktivitas lipase dari bakteri endofit. Hasil penapisan aktivitas lipase terhadap 69 isolat bakteri endofit pada media agar Rhodamine B menunjukkan delapan isolat bakteri endofit memiliki aktivitas lipase. Hal ini terlihat dari kedelapan isolat endofit mampu membentuk pendaran berwarna oranye dengan kemampuan yang berbedabeda. Dua isolat diantaranya yaitu DPG 3(2) dan AJB 4(4) memiliki kemampuan tertinggi diantara keenam isolat lainnya (Gambar 5). Isolat DPG 3(2) merupakan bakteri dari golongan non-aktinomiset yang diisolasi dari daun tanaman jambu biji, sedangkan isolat AJB 4(4) merupakan bakteri dari golongan aktinomiset yang diisolasi dari akar tanaman jati belanda. Kedua isolat ini kemudian dipilih untuk diuji aktivitas lipasenya.
Gambar 1 Koloni aktinomiset yang tumbuh pada media HV agar.
AJB 4(4) Gambar 2 Keragaman morfologi koloni dan pigmentasi aktinomiset endofit pada media ISP2.
Gambar 5 Isolat DPG 3(2) (a), AJB 4(4) (b) dan lipase tipe VII (1000 ppm) (c) memperlihatkan aktivitas lipase, sedangkan AJB 4(3) (d) tidak memperlihatkan aktivitas lipase pada media penapisan agar Rhodamine B.
5
Aktiv ita s spesifik lipa se (unit/m g )
1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
4,381
4,405 3.624
3,147
4,385
4,393
0,773
0.874
3.5 0.566
0.444
5 4.389
4.385
3.817 0.552
0.522
0.426
0.212
2 0.331 0.5
L o g jum la h sel ba kteri
terlihat pada jam ke-72 yaitu sebesar 1,139 unit per mg, pada jam ke-96 aktivitas spesifik lipase terlihat mulai menurun sebesar 0,734 unit per mg (Gambar 7). Aktivitas spesifik lipase isolat DPG 3(2) dan AJB 4(4) ini kemudian disetarakan dengan konsentrasi kontrol positifnya yaitu lipase tipe VII (Sigma chemical co). Berdasarkan data pada Tabel 1 dan 2, diketahui bahwa aktivitas spesifik lipase tertinggi isolat DPG 3(2) setara dengan konsentrasi lipase tipe VII 10, 172 ppm, sedangkan aktivitas spesifik lipase tertinggi isolat AJB 4(4) setara dengan konsentrasi lipase tipe VII 13, 260 ppm.
Kurva tumbuh dan uji aktivitas enzim. Pengukuran pertumbuhan dan uji aktivitas lipase isolat DPG 3(2) dilakukan setiap 12 jam sekali selama 96 jam. Untuk isolat AJB 4(4) uji aktivitas lipase dilakukan setiap 24 jam sekali selama 240 jam. Jumlah sel tertinggi dan aktivitas spesifik lipase tertinggi isolat DPG 3(2) terlihat pada jam ke-36 yaitu sebesar 4,405 log jumlah sel dan 0,874 unit per mg (Gambar 6). Jumlah sel terlihat mulai menurun pada jam ke-48 yaitu sebesar 4,381 log jumlah sel, begitu juga dengan aktivitas spesifik yang terlihat menurun pada jam ke48 sebesar 0,773 unit per mg. Aktivitas spesifik lipase tertinggi isolat AJB 4(4)
‐1 0
12
24
36
48
60
72
waktu (jam)
84
96
Aktivitas spesifik lipase Log jumlah sel bakteri
Gambar 6 Pertumbuhan dan aktivitas spesifik isolat DPG 3(2) pada media yang mengandung minyak zaitun 1%.
Aktivitas spesifik lipase (unit/mg)
1.2
1.139
1
0.935
0.8
0.734 0.632
0.6
0.637 0.568
0.651
0.431
0.4 0.414 0.2 0
0 0
0 24
48
72
96
120
144
168
192
216
240
Waktu (jam) Gambar 7 Aktivitas spesifik isolat AJB 4(4) pada media yang mengandung minyak zaitun 1%
6
Tabel 1 Kesetaraan aktivitas spesifik lipase isolat DPG 3(2) dengan konsentrasi lipase tipe VII Waktu Aktivitas spesifik Konsentrasi lipase (jam) lipase (unit/mg) tipe VII (ppm) 0 0,212 2,479 12 0,444 5,177 24 0,522 6,080 36 0,874 10,172 48 0,773 8,995 60 0,566 6,592 72 0,552 6,434 84 0,426 4,970 96 0,331 3,826 Tabel 2 Kesetaraan aktivitas spesifik isolat AJB 4(4) dengan konsentrasi lipase tipe VII Waktu Aktivitas spesifik Konsentrasi lipase (jam) lipase (unit/mg) tipe VII (ppm) 0 0 0 24 0 0 48 0,935 10,888 72 1,139 13,260 96 0,734 8,552 120 0,632 7,363 144 0,651 7,577 168 0,637 7,415 192 0,568 6,616 216 0,431 5,022 240 0,414 4,823
PEMBAHASAN Bakteri endofit yang berhasil diisolasi dari daun, batang dan akar jati belanda, jambu biji, serta rimpang temulawak dengan menggunakan media HV agar berjumlah 69 isolat. Keenam puluh sembilan isolat bakteri endofit tersebut menunjukkan keragaman yang tinggi baik dalam hal morfologi koloni maupun pigmentasinya. Berdasarkan morfologi koloninya, 55 isolat diantaranya dimasukkan ke dalam golongan non aktinomiset, sedangkan 14 isolat lainnya termasuk ke dalam golongan aktinomiset. Bakteri endofit paling banyak ditemukan di akar tanaman jati belanda dan jambu biji termasuk di bagian rimpang temulawak yaitu sebanyak 45 isolat. Bakteri endofit masuk ke dalam jaringan tumbuhan melalui bagian akar lateral kemudian menyebar ke dalam ruang interseluler dan berkas pembuluh, sehingga bagian ini merupakan bagian yang paling banyak dihuni oleh bakteri dibandingkan dengan bagian lainnya pada tumbuhan (Sharma et al. 2005). Pernyataan tersebut didukung oleh Lamb et al. (1996) yang menyatakan bahwa secara umum, populasi bakteri endofit sangat melimpah di bagian akar dan kelimpahannya menurun di bagian
batang dan daun. Variasi jumlah ini sangat dipengaruhi oleh jenis tanaman inangnya, umur tanaman, jenis jaringan tanaman, waktu pengambilan sampel, dan kondisi lingkungannya. Selain itu, Leben et al. (1968) juga menyatakan bahwa bakteri endofit dapat masuk ke dalam jaringan tanaman melalui berbagai bagian tanaman yang terbuka seperti bunga, batang, daun, kotiledon, stomata dan bagian tanaman yang terluka. Bakteri ini kemudian tinggal di dalam jaringan tanaman dan menyebar ke dalam jaringan ruang interseluler atau di dalam berkas pembuluh. Media HV agar merupakan media yang digunakan untuk mengisolasi aktinomiset. Media ini biasanya disuplementasi dengan berbagai macam antibiotik seperti asam nalidiksat untuk menekan pertumbuhan bakteri Gram negatif dan sikloheksamida untuk menekan pertumbuhan cendawan. Hasil isolasi aktinomiset pada media HV agar menunjukkan bahwa koloni aktinomiset endofit mampu tumbuh pada media tersebut. Koloni aktinomiset yang muncul kemudian dipurifikasi pada media ISP2 untuk dilakukan observasi terhadap morfologi koloni dan pigmentasinya. Koloni aktinomiset endofit yang berhasil dipurifikasi pada media ISP2 memiliki keragaman morfologi dan pigmentasi yang sangat tinggi. Aktinomiset dapat dibedakan dari bakteri lain dengan mudah dengan melihat bentuk koloninya di medium padat. Koloni Aktinomiset nampak keras seperti tumbuh akar di dalam agar-agar, berbeda dengan bakteri lain yang koloninya lunak di atas agar-agar. Selain itu, identifikasi koloni aktinomiset pada genus Streptomyces dapat dilakukan dengan mengamati morfologi rantai sporanya secara mikroskopis (Kudo 1997). Karakteristik mikroskopis ini secara jelas tampak pada isolat-isolat aktinomiset endofit yaitu isolat AJB 4(3), AJB 4(5), dan AJB 4(1) memiliki morfologi rantai spora berbentuk spiral yang berbeda-beda. Hal ini mengindikasikan bahwa isolat-isolat tersebut merupakan isolat dari genus Streptomyces dengan spesies yang berbeda. Sebaliknya, isolat AJB 4(1) dan APG 5(4) memiliki morfologi rantai spora yang mirip. Hal ini mengindikasikan bahwa kedua isolat tersebut memiliki kekerabatan yang dekat. Kudo (1997) menjelaskan bahwa bentuk permukaan spora dan rantai spora, warna miselium, warna pigmen serta penggunaan berbagai karbohidrat merupakan standar taksonomi yang dapat digunakan untuk identifikasi sampai dengan tingkat spesies.
7
Isolat AJB 4(3), AJB 4(5), AJB 4(1), AJB 4(4) dan APG 5(4) merupakan isolat aktinomiset yang termasuk genus Streptomyces. Hal ini berdasarkan ciri-ciri kelima isolat tersebut yang mampu membentuk miselium vegetatif dan mempunyai banyak sekali hifa serta membentuk rantai spora yang tersusun seperti rantai keriting atau heliks dari pucuk belahan hifanya. Isolat CX 12(1) merupakan isolat aktinomiset yang termasuk kedalam genus non Streptomyces karena diketahui hanya membentuk miselium vegetatif tanpa membentuk hifa sehingga koloninya terlihat lembab di atas media agar. Berdasarkan pewarnaan Gram, diketahui bahwa ke-69 isolat bakteri endofit dapat dikelompokkan ke dalam bakteri Gram negatif (17 isolat) dan Gram positif (52 isolat). Berdasarkan teknik ini juga diketahui bahwa tiap koloni bakteri endofit memiliki morfologi sel yang berbeda-beda. Koloni bakteri endofit tersebut diketahui memiliki bentuk sel batang hingga kokus. Hal serupa juga dilaporkan oleh Zinniel et al. (2002) bahwa bakteri Gram positif maupun Gram negatif dapat diisolasi dari berbagai jenis jaringan tanaman pada sejumlah spesies tanaman yang berbeda. Keragaman ini juga dilihat dari kemampuan ke-55 isolat bakteri non-aktinomiset dalam menghasilkan endospora. Hal tersebut dibuktikan melalui kemampuan 27 dari 55 isolat bakteri endofit dalam membentuk endospora di dalam sel vegetatifnya. Posisi endospora yang dibentuk di dalam sel vegetatif juga beragam, seperti isolat AJB 3 yang mampu membentuk endospora pada posisi sub-terminal di dalam sel vegetatifnya, sedangkan isolat DPG 3(2) membentuk endospora pada posisi terminal di dalam sel vegetatifnya. Delapan dari 69 isolat hasil isolasi tersebut telah diketahui memiliki aktivitas lipase pada media penapisan agar Rhodamine B. Enzim lipase dihasilkan oleh berbagai mikroorganisme baik secara tunggal maupun dengan senyawa-senyawa lain seperti esterase (Carboxylic-ester hydrolase EC 3.1.1.1). Penapisan bakteri penghasil lipase pada media agar biasanya dilakukan dengan menggunakan tributyrin atau Tween 80 sebagai substrat enzim. Namun, substrat tersebut tidak cocok digunakan untuk mendeteksi lipase yang sebenarnya karena senyawa tersebut juga dapat dihidrolisis oleh enzim-enzim esterase (Peled & Krenz 1981). Hofelmann et al. (1983) menyatakan bahwa lipase dapat divisualisasi pada agar yang mengandung
trioleoylglyserol dan pewarna berpendar Rhodamine B. Metode penapisan pada penelitian ini diadaptasi dari metode tersebut dengan minyak zaitun 3% digunakan sebagai substitusi trioleoylgliserol. Hasil penapisan aktivitas lipase pada media agar Rhodamine B menunjukkan sebanyak 8 isolat memiliki aktivitas lipase. Kouker dan Jaeger (1987) berpendapat bahwa proses pengikatan Rhodamine B dengan asam lemak dan mono atau digliserida sangat spesifik dan sensitif. Selain itu, pembentukan dimer kompleks antara Rhodamine B dengan asam lemak dan mono atau digliserida menghasilkan pendaran yang dapat dideteksi di bawah sinar UV. Spesifitas dari metode ini ditunjukkan ketika enzim esterase diuji pada media penapisan yang mengandung minyak zaitun 3% dan Rhodamine B, tidak ada zona berpendar yang dihasilkan. Sensitifitas metode ini telah dibuktikan melalui fakta bahwa aktivitas lipase dapat dideteksi hingga 60 nmol asam lemak yang dilepaskan per menit, sementara penapisan aktivitas lipase menggunakan metode titrimetric dapat dideteksi apabila aktivitas lipase mencapai 1200 nmol asam lemak yang dilepaskan per menit. Berdasarkan pernyataan tersebut, ke-8 koloni bakteri endofit (dua diantaranya dari golongan aktinomiset dan 6 lainnya dari golongan non aktinomiset) yang telah ditumbuhkan pada media yang mengandung minyak zaitun 3% dan pewarna Rhodamine B dapat dideteksi kemampuannya dalam menghasilkan lipase. Isolat DPG 3(2) dan AJB 4(4) dipilih sebagai isolat uji karena mampu menghasilkan pendaran yang kuat diantara keenam isolat penghasil lipase lainnya. Hal ini serupa dengan yang dinyatakan oleh Hou dan Johnston (1992) bahwa bakteri penghasil lipase yang baik dapat dilihat dari kekuatan pendaran dan besarnya diameter zona fluorescent halo yang dihasilkan. Isolat DPG 3(2) merupakan bakteri dari golongan non aktinomiset yang diketahui mampu mensekresikan protein yang memiliki aktivitas lipase pada media produksi yang ditambah dengan minyak zaitun 1%. Hal serupa terjadi dengan isolat Bacillus sp. strain 42 yang juga memiliki aktivitas lipase pada media yang juga ditambah dengan 1% minyak zaitun (Eltaweel et al. 2005). Aktivitas spesifik lipase tertinggi isolat DPG 3(2) didapatkan pada saat akhir fase log ketika densitas sel mencapai jumlah yang paling tinggi (4,405 log jumlah sel) pada jam ke-36 yaitu sebesar 0,874 unit per mg. Setelah jam ke-36, aktivitas lipase terlihat mulai menurun
8
hingga akhir pengujian yaitu saat jam ke-96 sebesar 0,331 unit per mg. Aktinomiset merupakan mikroorganisme penghasil senyawa bioaktif baru yang paling banyak ditemukan. Lestari (2006) melaporkan bahwa isolat Streptomyces spp. yang diisolasi dari tanah di daerah Sukabumi, Kepulauan Seribu, Cipanas, dan Kalimantan Timur mampu menghasilkan senyawa antibakteri yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri patogen seperti Bacillus subtilis, dan Xanthomonas axonopodis. Selain itu, isolat lokal aktinomiset seperti Streptomyces sp. SKK1-8 yang diisolasi dari daerah Sukabumi juga dilaporkan mampu menghasilkan enzim xylanase (Meryandini et al. 2006). Hasegawa et al. (2006) menyatakan bahwa beberapa isolat Streptomyces juga diketahui mampu memproduksi enzim-enzim hidrolitik seperti selulase, hemiselulase, kitinase, amilase, dan glukanase. Hasil yang diperoleh dari penelitian ini, diketahui bahwa isolat aktinomiset AJB 4(4) memiliki aktivitas spesifik lipase tertinggi pada jam ke-72 yaitu sebesar 1,139 unit per mg. Aktivitas lipase terlihat mulai menurun setelah jam ke-72 hingga akhir pengujian yaitu saat jam ke-240 yaitu sebesar 0,414 unit per mg. Nilai aktivitas spesifik lipase isolat DPG 3(2) dan AJB 4(4) berkorelasi positif dengan berbagai konsentrasi lipase tipe VII sebagai kontrol positifnya. Semakin tinggi nilai aktivitas spesifik lipasenya, maka semakin besar pula konsentrasi lipasenya. Hal tersebut terlihat dari nilai aktivitas spesifik lipase tertinggi isolat DPG 3(2) pada jam ke-36 setara dengan konsentrasi lipase tipe VII 10,172 ppm sedangkan nilai aktivitas spesifik lipase yang menurun pada jam ke-48 diketahui setara dengan konsentrasi lipase tipe VII 8,995 ppm. Hal yang sama juga terjadi pada isolat AJB 4(4) bahwa aktivitas spesifik lipase tertinggi pada jam ke-72 setara dengan konsentrasi lipase tipe VII 13,260 ppm dan menurunnya aktivitas spesifik lipase pada jam ke-96 diketahui setara dengan konsentrasi lipase tipe VII 8,552 ppm. Menurunnya aktivitas spesifik lipase isolat DPG 3(2) pada jam ke-48 hingga jam ke-96 serta isolat AJB 4(4) pada jam ke96 hingga jam ke-240 diduga disebabkan oleh adanya metabolit yang dapat menghambat aktivitas lipase yang dikeluarkan bersamasama dengan lipase kedua isolat tersebut pada media produksinya. Lipase yang dihasilkan dari penelitian ini diharapkan mampu berperan dalam lipolisis cadangan lemak yang menumpuk pada jaringan adiposa. Akibat berkurangnya
cadangan lemak pada jaringan adiposa ini, secara efektif menyebabkan terjadinya penurunan berat badan.
SIMPULAN Sebanyak 69 isolat bakteri endofit berhasil diisolasi dari tanaman jati belanda (22 isolat), jambu biji (27 isolat), dan rimpang temulawak (20 isolat). Delapan isolat diantaranya diketahui memiliki aktivitas lipase dan dua isolat diantaranya merupakan bakteri penghasil lipase terbaik yaitu isolat DPG 3(2) dan AJB 4(4). Aktifitas spesifik lipase tertinggi isolat DPG 3(2) terlihat pada jam ke36 yaitu sebesar 0,874 unit per mg. Sedangkan aktivitas spesifik lipase tertinggi isolat isolat AJB 4(4) terlihat pada jam ke-72 yaitu sebesar 1,139 unit per mg. Kedelapan isolat berpotensi menghasilkan senyawa antihiperlipidemia melalui aktivitas lipasenya. Isolat AJB 4(4) memiliki potensi yang lebih besar dibandingkan dengan isolat DPG 3(2).
SARAN Perlu dilakukan optimasi kondisi pertumbuhan terkait dengan produksi senyawa antihiperlipidemia. Selain itu, perlu juga dilakukan uji in-vivo untuk melihat pengaruhnya terhadap enzim gastrointestinal lipase.
DAFTAR PUSTAKA Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Anal Biochem. 72: 248-254 Castillo et al. 2002. Munumbicins, widespectrum antibiotics produce by Streptomyces NRRL 30562, endophytic on Kennedia nigrisca. Microbiology 148: 2675-2685 Dalimartha S. 2001. 36 Resep Tumbuhan Obat untuk Menurunkan Kolesterol. Edisi ke-3. Jakarta : Penebar Swadaya Dugi et al. 2000. In vivo evidence for both lipolytic and nonlipolytic function of hepatic lipase in the metablism of HDL. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20: 793800 Eltaweel MA, Rahman RNZ, Salleh AB, Basri M. 2005. An organic solvent-stable lipase from Bacillus sp. strain 42. Annals of Microbiol. 55(3): 187-192
9
Firaikovai S, Maria A, Marta M. 2007. Bioactive Secondary Metabolites Produced by Microorganisms Assosiated with Plants. [Abstrak]. Slovakia: Departement of Biochemical Technology, Institute of Biotechnology and Food Industry, Slovak University of Technology. Forti N, Diament J. 2006. High-density lipoproteins: metabolic, clinical, epidemiological and therapeutic intervention aspects. An update for clinicians. Arq Bras Cardiol. 87(5): 1590-1612 Grundy SM. 1991. Multifactorial ethiology of hypercholesterolemia: implication for prevention of coronary heart disease. Artheriosclerosis and Thrombisis. 11 : 1619-1635 Hallman J, Quadt-Hallman A, Mahaffee WF, Kloepper JW. 1997. Bacterial endophytes in agricultural crop. Can J Microbiol. 43: 895-914 Hasegawa S, Meguro A, Shimizu M, Nishimura T, Kunoh H. 2006. Endophytic actinomycetes and their interaction with host plants. Actinomycetologica. 20: 7281 Hofelmann M, Kittsteiner-Eberle R Schreire P. 1983. Ultra thin-layer agar gel: a novel print technique for ultra thin-layer isoelectric focusing of enzymes. Anal Biochem. 128:217-222 Hou CT, Johnston TM. 1992. Screening of lipase activities with cultures from the agricultural research service culture collection. JAOCS. 69(11): 1088-1097 Kobayashi M, Sato K, Yoshimura S, Yamaoka M, Takase S, Ohkubo M, Fujii T, Nakajima H. 2005. FR177391, a new anti-hyperlipidemic agent from Serratia. J Antibiot 58(10): 648-653 Kouker G, Jaeger KE. 1987. Specific and sensitive plate assay for bacterial lipases. Appl Environ Microbiol. 53: 211 Kudo T. 1997. Family Streptomycetaceae. In : Miyadoh S (ed). Atlas of Actinomycetes. The Society for Actinomycetes Japan. Kwon YD, Rhee JS. 1986. A simple and rapid colorimetric method for determination of free fatty acids for lipase assay. JAOCS. 63: 89-92 Lachevalier MP, C De Bievre & HA Lachevalier. 1977. Chemotaxonomy of aerobic actinomycetes: phospholipid composi-tion. Biochem Syst Ecol 5: 249260 Lamb TG, Tonkyu DW, Kluepfel DA. 1996. Movement of Psuedomonas aureofaciens
from the rhizos-phere to aerial plant tissue. Can J Microbiol. 42:1112-1120 Leben C, Daft GC, Schmitthenner AF. 1968. Bacterial blight of soybeans: population levels of Pseudo-monas glycinea in relation to symptom development. Phytopathology. 58:1143-1146 Lestari Y. 2006. Identification of indigenous Streptomyces spp. producing antibacterial compounds. J Mikrobiol Indones. 11(2):99-101 Litthauer D, Ginster A, Skein E. 2002. Pseudomonas luteola lipase: a new member of the 230-residue Pseudomonas lipase family. Enzyme Microb Tech. 30: 219-226 Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2006. Brock Biology of Microorganisms. Toronto : Prentice Hall Canada Inc Meryandini A, Hendarwin T, Saprudin D, Lestari Y. 2006. Characterization of xylanase Streptomyces spp. SKK1-8. Hayati 13(4): 151-155 Peled N, Krenz MC. 1981. A new assay of microbial lipases with emulsified trioleoylglycerol. Anal Biochem. 112:219-222 Rahayu YS. 2007. Khasiat ekstrak ramuan daun jati belanda terhadap konsentrasi kolesterol hati tikus yang hiperlipidemia. [Skripsi]. Bogor: Program Studi Biokimia, Departemen Kimia FMIPA IPB Sharma PK, Sarita S, Prell J. 2005. Isolation and characterization of an endophytic bacterium related to rhizobium / agrobacterium from wheat (Triticum aestivum L.) Roots. Current Sci. 89(4): 608-610 Silitonga RF. 2008. Daya inhibisi ekstrak daun jati belanda dan bangle terhadap aktivitas lipase pankreas sebagai antiobesitas. [Skripsi]. Bogor: Program Studi Kimia, Departemen Kimia FMIPA IPB. Strobel G, Daisy B. 2003. Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products. Microbiol and Mol Biol Rev 67: 491-502 Weibel EK, Hadvary P, Hochuli E, Kupfer E, Lengsfeld H. 1987. Lipstatin, an inhibitor of pancreatic lipase, produce by Streptomyces toxytricini. J Antibiot 40: 1081-1085 Zinniel et al. 2002. Isolation and characterization of endophytic colonizing bacteria from agronomic crops and prairie plants. Appl Environ Microbiol. 68: 2198-2208
10
LAMPIRAN
11
Lampiran 1 Komposisi media HV agar (stok satu liter) Komposisi bahan-bahan Jumlah yang dibutuhkan Humic acid 1 g* CaCO3 0,02 g 0,01 g FeSO4. 7 H2O KCl 1,71 g MgSO4. 7 H2O 0,05 g 0,5 g Na2HPO4 B-vitamins 5 mL Cycloheximide 50 mg Pure agar 18 g Akuades 1L pH 7,2 *) Dilarutkan dalam 40 mL 0,4% NaOH Lampiran 2 Komposisi media ISP2 (stok satu liter) Komposisi bahan-bahan Yeast extract Malt extract Glukosa Pure agar
Jumlah yang dibutuhkan 4g 10 g 4g 18 g
Lampiran 3 Kurva standar pertumbuhan isolat DPG 3(2) Kurva standar pertumbuhan isolat DPG 3(2)
Data kurva standar pertumbuhan isolat DPG 3(2) 3
Jumlah sel (10 )
OD terkoreksi (620 nm)
2,73
0,228
1,365
0, 093 0,046 0,032
0,170625
0,016
y = 0.0822x - 0.0035 Ab so rb an si (6 2 0 )
0,6825 0,34125
0.25 2
R = 0.9876
0.2 0.15 0.1 0.05 0 0
0.5
1
1.5
Jumlah sel (10 3) Jumlah sel (10 3)
Lampiran 4 Bagan alir pembuatan reagen cupric-acetate pyridine 5 gram cupric-acetate
Larutkan dengan 100 mL akuades hingga homogen
Sesuaikan pH larutan dengan pyridine hingga mencapai pH 6
2
2.5
3
12
Lampiran 5 Kurva standar asam margarat Data standar asam margarat (asam heptadekanoat) Konsentrasi (ppm) OD terkoreksi (715 nm) 0
0
100
0,03
200
0,074
300
0,117
400 500
0,139 0,202
Aktivitas lipase (unit/mL) = volume total volume akhir
x
1000
x (1 / T) x (1 / BM) x [X]
volume enzim
Keterangan: • Volume total = Volume total larutan awal (minyak zaitun, buffer, CaCl2, enzim) • Volume akhir = Volume larutan setelah inkubasi • 1000 = Nilai konversi dari mL ke µL • Volume enzim = Volume enzim/supernatan yang diberikan ke dalam larutan (1 mL) • T = Waktu inkubasi (30 menit) • BM = Bobot molekul asam margarat (270,5) • [X] = Konsentrasi asam margarat Nilai absorbansi yang digunakan dalam pengukuran aktivitas lipase diperoleh dengan menggunakan rumus: Absorbansi = (Blanko-Kontrol) - (Blanko-Sampel)
Lampiran 6 Kurva standar kadar protein Kurva Standar Kadar Protein Data standar Bovine serum albumin (BSA) Konsentrasi OD terkoreksi (595 nm) (ppm) 0
0,2
0,135
0,4
0,22
0,6
0,3035
0,8
0,4075
1
0,4835
0.6 Ab so rb an si (5 9 5 )
0
y = 0.4741x + 0.0212
0.5
2
R = 0.9931
0.4 0.3 0.2 0.1 0 0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
Konsentrasi BSA (mg/mL)
Metode pengukuran kadar protein (Bradford 1976) (makro assay) Pereaksi Blanko (mL) Standar (mL) BSA 0,1 Akuades 0,1 Enzim Reagen Bradford 5 5
Sampel (mL) 0,1 5
1.2
13
Lampiran 7 Kurva standar aktivitas lipase tipe VII (Sigma Chemical Co) Data standar aktivitas lipase tipe VII Konsentrasi (ppm)
Aktivitas spesifik lipase (unit/mg)
0
0
1
0,0933
2
0,1832
3
0,2282
4
0,3218
5
0,4577
Lampiran 8 Tabel keragaman bakteri endofit yang berhasil diisolasi dari daun, batang dan akar jati belanda, jambu biji serta rimpang temulawak Isolat
Warna koloni
Karakteristik koloni*
Pewarnaan Gram
Bentuk sel dan penataan
Endospora
Aktivitas lipase
Endofit temulawak -
CX 1(1)
putih
b, lc, d
positif
kokus, tunggal
-
CX 1(2)
putih
b, ld, c
negatif
batang, tunggal
-
-
CX 1(3)
merah muda
b, lc, d
negatif
batang, tunggal
-
-
CX 2(1)
putih
b, ld, c
positif
kokus, tunggal
-
-
CX 2(2)
putih
b, ld, c
positif
batang, tunggal
terminal
-
CX 2(3)
kuning
b, lc, c
positif
batang, tunggal
-
-
CX 4(1)
putih
b, ld, c
negatif
kokus, berpasangan
-
-
CX 4(2)
putih
b, lc, d
positif
batang, tunggal
terminal
-
CX 4(3)
putih
tb, lc, d
positif
batang, tunggal
terminal
+
CX 6(1)
putih
b, ld, c
negatif
batang, tunggal
-
-
CX 9(1)
putih
b, d, lc
negatif
kokus, berpasangan
-
-
CX 9(3)
kuning
b, lc, c
negatif
kokus, tunggal
-
-
CX 9(4)
oranye
b, lc, c
positif
kokus, tunggal
-
-
CX 13(3)
putih
b, lc, d
positif
batang, tunggal
-
-
CX 15(1)
putih
b, lc, c
negatif
kokus, tunggal
-
-
CX 15(2) Endofit jati belanda
oranye
tb, lc, c
positif
batang, bentuk v
-
AJB 2(1)
kuning
sk, lc, bt
negatif
batang, tunggal
-
krem kekuningan
t, tb, tb
positif
batang, tunggal
sub terminal
-
AJB 3
-
-
AJB 3(1)
merah muda
b, lc, c
positif
batang, tunggal
terminal
+
AJB 3(2)
kuning cerah
t, lc, b
positif
batang, tunggal
terminal
-
AJB 3(3)
kuning
t, lc, b
positif
batang, tunggal
terminal
-
AJB 3(4)
merah muda
st, lc, b
positif
batang, tunggal
terminal
AJB 3(5)
kuning
t, lc, b
positif
batang, tunggal
terminal
+
BJB 1(1)
krem
c, lc, b
negatif
kokus, tunggal
-
-
BJB 1(2)
krem kekuningan
st, lc, b
positif
batang, tunggal
terminal
-
BJB 2(1)
merah muda
sk, bo, bt
positif
kokus, tunggal
-
-
BJB 2(2)
kuning kecoklatan
t, lc, b
negatif
kokus, tunggal
-
-
krem tua
t, lc, b
positif
kokus, tunggal
-
-
BJB 3 DJB 1
putih
d, bo, tb
negatif
kokus, tunggal
-
+
DJB 2(1)
putih
d, bo, d
positif
batang, tunggal
terminal
-
14
DJB 2(2)
krem keputihan
bk, tb, k
positif
batang, tunggal
terminal
-
DJB 2(3)
krem
d, lk, tb
positif
batang, tunggal
terminal
-
DJB 3 Endofit jambu biji
putih
c, lc, b
positif
kokus, tunggal
-
-
APG 1(1)
kuning muda
c, lc, b
negatif
kokus, berpasangan
-
-
APG 1(2)
krem-merah muda
c, lc, b
positif
batang, tunggal
sub terminal
-
kuning
c, lc, b
negatif
kokus, tunggal
-
-
APG 3(1)
kuning muda
t, lc, b
positif
kokus, tunggal
-
-
APG 3(2)
krem
t, bo, b
positif
batang, tunggal
terminal
-
APG 3(3)
kuning muda
c, lc, b
positif
kokus, tunggal
-
-
APG 4(1)
putih
t, bo, bt
negatif
kokus, berpasangan
-
-
APG 4(2)
oranye cerah
t, lc, b
positif
batang, tunggal
sub terminal
-
BPG 1(1)
krem
t, lc, b
positif
batang, tunggal
terminal
-
BPG 1(2)
oranye muda
t, lc, b
positif
batang, tunggal
terminal
-
BPG 2(1)
krem
d, bo, bl
positif
batang, berantai
sub terminal
APG 2
-
BPG 2(2)
krem tua
d, bo, bl
positif
batang, berpasangan
sub terminal
BPG 2(3)
krem
d, bo, bl
positif
batang, tunggal
sub terminal
-
BPG 3
krem
c, lc, b
negatif
batang, tunggal
-
-
BPG 4(1)
krem
t, lc, b
negatif
batang, tunggal
-
-
BPG 4(2)
krem kekuningan
t, lc, b
positif
batang, tunggal
terminal
-
DPG 3 DPG 3(1)
krem oranye
t, bo, b c, lc, b
negatif positif
kokus, tunggal batang, tunggal
terminal
DPG 3(2)
krem
c, lc, b
positif
batang, tunggal
terminal
+ +
DPG 4
putih
t, lc, b
positif
batang, tunggal
terminal
-
krem keputihan
t, lc, bt
positif
batang, tunggal
terminal
-
DPG 4(2) Aktinomiset endofit
kuning muda
t, lc, b
positif
batang, tunggal
terminal
-
CX 10(1)
oranye muda
b, lk, bk
positif
filamen
-
-
CX 10(2)
oranye
b, lk, bk
positif
filamen
-
-
DPG 4(1)
-
CX 11(1)
cokelat
b, lc, bk
positif
filamen
-
+
CX 12(1)
oranye
b, lc, bk
positif
filamen
-
-
AJB 4(1)
cokelat
b, tb, c
positif
filamen
-
-
AJB 4(2)
putih
b, tb, c
positif
filamen
-
-
AJB 4(3)
cokelat
b, tb, bk
positif
filamen
-
-
AJB 4(4)
putih-krem
b, tb, bk
positif
filamen
-
+
AJB 4(5)
putih-cokelat
b, tb, bk
positif
filamen
-
-
APG 5(1)
putih
b, tb, bk
positif
filamen
-
-
APG 5(2)
merah tua
t, tb, c
positif
filamen
-
APG 5(3)
merah muda
t, tb, c
positif
filamen
-
-
APG 5(4)
putih
b, tb, bk
positif
filamen
-
-
-
APG 5(5) putih-krem b, tb, bk positif filamen * b = bulat; tb = tidak beraturan; lk = berlekuk; lc = licin; ld = berlendir; d = datar; c = cembung; bk = berbukit; sk = seperti kawah; t = timbul; st = seperti tombol; bo = berombak; bl = bentuk L; bt = bundar dengan tepian timbul; k = keriput
