POTENSI BAKTERI ENDOFIT TANAMAN OBAT SEBAGAI PENGHASIL SENYAWA ANTIHIPERLIPIDEMIA MELALUI AKTIVITAS LIPASE
BUDI WIRAWAN
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
ABSTRAK BUDI WIRAWAN. Potensi Bakteri Endofit Tanaman Obat sebagai Penghasil Senyawa Antihiperlipidemia Melalui Aktivitas Lipase. Dibimbing oleh YULIN LESTARI dan MIN RAHMINIWATI. Bakteri endofit tanaman obat berpotensi menghasilkan berbagai jenis senyawa bioaktif yang juga dihasilkan oleh tanaman inangnya. Ekstrak daun jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.), daun jambu biji (Psidium guajava L.), dan rimpang temulawak (Curcuma xanthorrhiza Roxb.) secara empiris mampu mencegah terjadinya hiperlipidemia. Enzim lipase dapat menghidrolisis senyawa triacylglycerol menjadi asam lemak dan acylglycerol. Tujuan penelitian ini adalah mengisolasi dan mengkaji keragaman dan potensi bakteri endofit dalam menghasilkan senyawa antihiperlipidemia melalui aktivitas lipase. Sebanyak 69 isolat bakteri endofit berhasil diisolasi dari tanaman jati belanda (22 isolat), jambu biji (27 isolat) dan rimpang temulawak (20 isolat). Lima puluh lima isolat dari golongan non-aktinomiset, sedangkan 14 isolat lainnya dari golongan aktinomiset. Keenam puluh sembilan isolat tersebut memiliki karakteristik morfologi koloni dan pigmentasi yang sangat beragam. Penapisan menggunakan media agar Rhodamine B, 8 isolat diketahui memiliki aktivitas lipase. Isolat DPG 3(2) dan AJB 4(4) adalah isolat yang memiliki kemampuan tinggi dalam membentuk pendaran berwarna oranye pada media penapisan. Aktivitas spesifik lipase tertinggi isolat DPG 3(2) terlihat pada jam ke-36 yaitu sebesar 0,874 unit per mg, sedangkan isolat AJB 4(4) terlihat pada jam ke-72 yaitu sebesar 1,139 unit per mg. Isolat DPG 3(2) dan AJB 4 (4) berpotensi sebagai penghasil senyawa antihiperlipidemia melalui aktivitas lipasenya.
ABSTRACT BUDI WIRAWAN. Potency of Endophytic Bacteria in Medicine Plants as Producer of Antihyperlipidemic Compounds Through Lipase Activities. Under the direction of YULIN LESTARI and MIN RAHMINIWATI. Endophytic bacteria that reside within plant tissue are potential to produce similar bioactive compounds that also be produced by the host plant. Several preventive efforts to overcome hyperlipidemic are by using the extract of jati belanda leaves (Guazuma ulmifolia Lamk.), guajava leaves (Psidium guajava L.), and the rhizome of temulawak (Curcuma xanthorrhiza Roxb.). Lipase catalyzes the hydrolysis of triacylglycerol to fatty acids and acylglycerol. The objective of this research was to isolate and to study the diversity and potency of endophytic bacteria as antihyperlipidemic compounds producer through lipase activities. Sixty nine isolates were successfully isolated from jati belanda (22 isolates), guajava (27 isolates), and the rhizome of temulawak (20 isolates). Fifty five isolates belong to the non-actinomycetes group, whereas the other 14 belong to the actinomycetes group. Eight of the 69 isolates were found to be lipase-positive. DPG 3(2) and AJB 4(4) isolates were considered as good lipase producers. The highest specific lipase activity of DPG 3(2) isolate was observed 0,874 units per mg at 38 hours, whereas AJB 4(4) isolates produce the highest specific lipase activities at 1,139 units per mg after 72 hours observation. Eight isolates have a potential as antihyperlipidemic compounds producer through their lipase activity.
POTENSI BAKTERI ENDOFIT TANAMAN OBAT SEBAGAI PENGHASIL SENYAWA ANTIHIPERLIPIDEMIA MELALUI AKTIVITAS LIPASE
BUDI WIRAWAN
Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
Judul Nama NIM
: Potensi Bakteri Endofit Tanaman Obat sebagai Penghasil Senyawa Antihiperlipidemia Melalui Aktivitas Lipase : Budi Wirawan : G34104055
Menyetujui:
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Ir Yulin Lestari NIP 131779515
drh. Min Rahminiwati, PhD NIP 131473989
Mengetahui: Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor
Dr. drh. Hasim, DEA NIP 131578806
Tanggal lulus:
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala limpahan rahmat dan karuniaNya, sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul “Potensi Bakteri Endofit sebagai Penghasil Senyawa Antihiperlipidemia Melalui Aktivitas Lipase”. Penelitian yang dilaporkan dalam karya ilmiah ini dilakukan mulai Februari 2008 sampai dengan November 2008, di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Penulis mengucapkan terima kasih kepada berbagai pihak yang telah membantu selama berlangsungnya kegiatan penelitian ini. Ucapan terima kasih disampaikan kepada Dr. Ir Yulin Lestari selaku dosen pembimbing pertama dan drh. Min Rahminiwati, PhD selaku dosen pembimbing kedua atas segala bimbingan, saran, dan masukan selama berlangsungnya kegiatan penelitian dan selama penyusunan karya ilmiah ini, serta kepada Dr. Ir. R. R. Dyah Perwitasari, M.Sc selaku dosen penguji wakil komisi pendidikan yang telah bersedia menguji dan memberikan masukan saat sidang skripsi dan penyusunan laporan karya ilmiah. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada kedua orang tua tercinta atas segala dukungan dan doa yang telah diberikan, serta teman-teman Biologi 41 dan teman-teman di Laboratorium Mikrobiologi atas semua kekompakkan dan kerja samanya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Januari 2009
Budi Wirawan
RIWAYAT HIDUP Penulis adalah anak tunggal yang dilahirkan di Jakarta tanggal 29 Mei 1986, dari ayah Ihwan Sarwoji dan Ibu Wiyani. Penulis lulus SD pada tahun 1998 dan lulus dari SLTP tahun 2001. Tahun 2004 penulis lulus dari SMU Negeri 6 Tangerang dan pada tahun yang sama diterima di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah Biologi Dasar sejak tahun 2006 hingga 2008, mata kuliah Mikrobiologi Dasar pada tahun 2008 dan mata kuliah Fisiologi Prokariot pada tahun 2008. Penulis melaksanakan kegiatan praktik lapang di PT Coats Rejo Indonesia, Bogor pada tahun 2007. Pada tahun 2006 penulis pernah menjadi koordinator tim kesekretariatan pada acara Lomba Cepat Tepat Biologi (LCTB) dalam rangkaian acara Pesta Sains Nasional FMIPA, IPB. Penulis juga pernah mengikuti keanggotan Bioworld, Himpunan Mahasiswa Biologi (Himabio) dan terpilih menjadi ketua divisi nata de coco periode 2006/2007, selain itu penulis juga merupakan anggota Observasi Wahana Alam (OWA), Himabio. Pada tanggal 27-28 Mei 2008, penulis mengikuti kegiatan The First International Symposium on Temulawak (Curcuma xanthoriza Roxb.) di IPB International Convention Centre (IICC), Bogor, Indonesia dan penelitian yang dilaporkan dalam karya ilmiah ini meraih penghargaan sebagai ”the best poster presentation”.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR .................................................................................................................. vi DAFTAR LAMPIRAN...............................................................................................................
vi
PENDAHULUAN Latar Belakang................................................................................................................. Tujuan ..............................................................................................................................
1 2
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat .......................................................................................................... Bahan dan Alat................................................................................................................ Metode penelitian
2 2
Isolasi Bakteri Endofit dengan Metode Pencawanan............................................ Pemurnian Bakteri Endofit ................................................................................... Penapisan Aktivitas Lipase dari Bakteri Endofit .................................................. Penentuan Kurva Tumbuh dan Produksi Enzim ................................................... Pengukuran Aktivitas Lipase dan Kadar Protein .................................................. Pengukuran Aktivitas Spesifik Lipase ..................................................................
2 2 2 3 3 3
HASIL Isolasi Bakteri Endofit ..................................................................................................... Penapisan Aktivitas Lipase dari Bakteri Endofit ............................................................. Kurva Tumbuh dan Uji Aktivitas Lipase .........................................................................
3 4 4
PEMBAHASAN .........................................................................................................................
6
SIMPULAN ................................................................................................................................
8
SARAN ......................................................................................................................................
8
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................................
8
LAMPIRAN................................................................................................................................
10
DAFTAR TABEL Halaman 1 Kesetaraan aktivitas spesifik lipase isolat DPG 3(2) dengan konsentrasi lipase tipe VII........ 2 Kesetaraan aktivitas spesifik lipase isolat AJB 4(4) dengan konsentrasi lipase tipe VII ........
5 5
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Koloni aktinomiset yang tumbuh pada media HV agar .......................................................... 4 2 Keragaman morfologi koloni dan pigmentasi aktinomiset endofit pada media ISP2.............. 4 3 Pengamatan mikroskopis (400 x) morfologi rantai spora Streptomyces; AJB 4(3) AJB 4(5), APG 5(2), AJB 4(1), APG 5(4), dan non Streptomyces CX 12(1). ........................ 4 4 Endospora yang dibentuk di dalam sel vegetatif isolat AJB 3 dan DPG 3(2) ......................... 4 5 Aktivitas lipase isolat DPG 3(2), AJB 4(4) dan Lipase tipe VII pada media skrining yang mengandung Rhodamine B ............................................................................................ 4 6 Pertumbuhan dan aktivitas spesifik isolat DPG 3(2) pada media yang mengandung minyak zaitun 1%.................................................................................................................... 5 7 Aktivitas spesifik isolat AJB 4(4) pada media yang mengandung minyak zaitun 1% ............ 5
DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3 4 5 6 7 8
Halaman Komposisi media HV agar (stok satu liter) ............................................................................. 11 Komposisi media ISP2 (stok satu liter) ................................................................................... 11 Kurva standar pertumbuhan isolat DPG 3(2) .......................................................................... 11 Bagan alir pembuatan reagen Cupric-acetate pyridine ........................................................... 11 Kurva standar asam margarat.................................................................................................. 12 Kurva standar kadar protein .................................................................................................... 12 Kurva standar aktivitas lipase tipe VII (Sigma Chemical Co)................................................. 13 Tabel keragaman bakteri endofit yang berhasil diisolasi dari daun, batang dan akar jati belanda, jambu biji serta rimpang temulawak ........................................................... 13
1
PENDAHULUAN Latar Belakang Bakteri endofit adalah bakteri yang hidup dalam jaringan tanaman tanpa menimbulkan bahaya dan dapat diisolasi dari jaringan tanaman yang sudah disterilisasi permukaannya atau diekstrak dari jaringan tanaman bagian dalam (Hallman et al. 1997). Hasegawa et al. (2006) mengemukakan bahwa bakteri endofit yang mengkolonisasi jaringan tanaman memperoleh nutrisi dan perlindungan dari tanaman inangnya. Populasi bakteri yang melimpah di alam baik di tanah maupun yang bersifat endofit, memiliki potensi untuk dikaji kemampuannya sebagai penghasil senyawa antihiperlipidemia melalui aktivitas lipasenya. Perubahan pola hidup modern seseorang akibat adanya peningkatan taraf hidup dapat menyebabkan terjadinya pergeseran pola konsumsi pangan kepada produk yang mengandung banyak lemak serta kurang serat. Kondisi ini menyebabkan timbulnya permasalahan kegemukan. Kegemukan merujuk pada situasi kelebihan berat badan akibat meningkatnya konsentrasi lipid darah yang ditandai dengan meningkatnya konsentrasi trigliserida, low density lipoprotein (LDL), kolesterol total dalam darah yang melebihi batas normal (>200 mg/dL) dan menurunnya konsentrasi high density lipoprotein (HDL) (< 40 mg/dL) (Forti & Diament 2006). Kondisi ini biasa dikenal dengan hiperlipidemia. Hiperlipidemia dapat menjadi pemicu munculnya berbagai macam penyakit seperti aterosklerosis yang merupakan penyebab terjadinya penyakit jantung koroner (PJK) dan stroke (Dalimartha 2001). Hiperlipidemia dapat disebabkan oleh perubahan pola makan yang banyak mengonsumsi lemak khususnya lemak jenuh, gula, alkohol, garam dalam menu makan sehari-hari, diabetes yang tidak terkontrol dengan baik, kurang olah raga, kelainan genetik, stres emosional dan gangguan metabolisme (Grundy 1991). Beberapa cara konvensional untuk mengatasi masalah hiperlipidemia, diantaranya adalah banyak melakukan olah raga, mengatur pola makan, hidup teratur, sampai mengonsumsi obatobatan. Meskipun demikian, biasanya penderita merasa jenuh untuk menjalankan cara-cara tersebut. Oleh karena itu, diupayakan pula penggunaan bahan alami seperti tanaman sebagai bahan untuk
menurunkan konsentrasi lemak di dalam tubuh. Beberapa contoh bahan alami yang secara empiris dapat digunakan untuk menurunkan konsentrasi lipid adalah ekstrak daun jati belanda, daun jambu biji, dan temulawak. Ketiga ekstrak tanaman tersebut terbukti mampu menurunkan konsentrasi kolesterol dalam hati tikus yang hiperlipidemia (Rahayu 2007). Berbagai jenis senyawa bioaktif dengan beragam fungsi yang terkandung di dalam tumbuhan, kemungkinan dapat dihasilkan pula oleh mikrob endofit pada tumbuhan tersebut (Strobel & Daisy 2003). Castilo et al. (2002) telah membuktikan bahwa tanaman Snakevine (Kennedia nigrisca) yang dipercaya oleh suku Aborigin di wilayah barat-daya Arnhemland digunakan untuk mengobati luka dan infeksi yang ternyata mengandung mikrob endofit baru yaitu Streptomyces sp. strain NRRL 30562. Streptomyces tersebut mampu memproduksi antibiotik peptida baru dengan spektrum luas bernama munumbycin A-D. Beberapa senyawa bioaktif baru yang mampu dihasilkan oleh bakteri endofit diantaranya berfungsi sebagai antitumor, antiinflamatori, antioksidan dan lain-lain (Firaikovai et al. 2007). Penelitian terhadap ekstrak daun jati belanda menunjukkan bahwa ekstrak etanol tanaman tersebut memiliki kemampuan sebagai senyawa antiobesitas melalui mekanisme inhibisi terhadap aktivitas lipase pankreas (Silitonga 2008). Enzim lipase (triacylglycerol hydrolase, EC 3.1.1.3) dapat menghidrolisis senyawa triacylgyserol menjadi asam lemak dan acylglyserol (Litthauer et al. 2002). Lipase juga berperan dalam metabolisme lipoprotein dalam darah dengan menghidrolisis trigliserida dan fosfolipid yang terdapat pada kilomikron, intermediate density lipoprotein (IDL) dan HDL (Dugi et al. 2000). Peluruhan lemak dapat didekati dengan hidrolisis lemak melalui aktivitas lipase. Berbagai obat komersial antihiperlipidemia dapat disintesis baik secara kimiawi maupun dengan bantuan mikrob. Senyawa antihiperlipidemia yang disintesis secara kimiawi diantaranya adalah amphetamine, phenylpropanolamine, fenflur-amine, dan dexfenfluramine, sedangkan senyawa antihiperlipidemia yang disintesis oleh bakteri diantaranya adalah lipstatin. Lipstatin merupakan senyawa antihiperlipidemia yang dihasilkan oleh Streptomyces toxytricini yang bekerja sebagai inhibitor enzim pankreatik lipase (Weibel et al. 1987). Produk anti-
2
hiperlipidemia ini dikenal dengan nama Orlistat (tetrahydrolipstatin, Xenical®) dan telah diperkenalkan oleh perusahaan Roche Pharmaceutical, UK pada tahun 1998. Beberapa senyawa antihiperlipidemia baru diketahui dari hasil biokonversi senyawa FR177391 oleh Serratia liquefaciens (Kobayashi et al. 2005). Hal tersebut mengindikasikan bahwa bakteri mampu memproduksi senyawa bioaktif yang dapat berfungsi sebagai antihiperlipidemia. Aktinomiset merupakan bakteri Gram positif yang memiliki kandungan guaninsitosin (G+C) tinggi (75%) di dalam genomnya. Bakteri ini juga dikenal sebagai bakteri penghasil antibiotik terbesar, karena dari 10000 antibiotik yang telah ditemukan lebih dari setengahnya dihasilkan oleh aktinomiset. Jika dibandingkan dengan kelompok bakteri lain aktinomiset mempunyai perbedaan yaitu mengalami pembelahan morfologis yang kompleks (Madigan et al. 2006). Selain itu, aktinomiset juga merupakan mikroorganisme penghasil senyawa bioaktif baru yang paling banyak ditemukan. Secara umum, aktinomiset dapat dimasukkan dalam kategori bakteri tanah, namun beberapa jenis aktinomiset diketahui bersifat endofit. Sebagian besar aktinomiset (95%) adalah dari genus Streptomyces (Lachevalier et al. 1977). Data ilmiah mengenai senyawa antihiperlipidemia masih terbatas pada khasiatnya yang terkandung di dalam tumbuhan, sedangkan mengenai senyawa antihiperlipidemia yang dihasilkan oleh mikrob endofit belum banyak dikaji. Oleh karena itu kajian tentang potensi bakteri endofit sebagai penghasil senyawa antihiperlipidemia yang berasosiasi dengan tanaman obat Indonesia perlu dilakukan. Tujuan Mengisolasi dan mengkaji keragaman dan potensi bakteri endofit pada beberapa tanaman obat dalam menghasilkan senyawa antihiperlipidemia melalui aktivitas lipase.
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam-IPB. Penelitian ini
berlangsung mulai bulan Febuari hingga November 2008. Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan adalah tanaman jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.), jambu biji (Psidium guajava L.), rimpang temulawak (Curcuma xanthorrhiza Roxb.), minyak zaitun, media agar nutrien (NA), media agar Humic acid-Vitamin B (HV agar), media International Streptomyces Project 2 (ISP2), media Triton Glucose Yeast Extract (TGY), lipase tipe VII dari Candida rugosa (Sigma Chemical Co) dan media agar Rhodamine B. Peralatan yang digunakan adalah mikroskop, tabung reaksi, Erlenmeyer, spektrofotometer dan peralatan yang umum digunakan di laboratorium Mikrobiologi. Metode Penelitian Isolasi bakteri endofit dengan metode pencawanan. Sterilisasi permukaan dan isolasi bakteri endofit pada daun, batang dan akar jati belanda, jambu biji, serta rimpang temulawak dilakukan dengan menggunakan metode yang dikemukakan oleh Zinniel et al. (2002) yang dimodifikasi. Potongan tanaman jati belanda, tanaman jambu biji dan rimpang temulawak dicuci bersih, kemudian permukaannya disterilkan dengan cara merendam potongan tanaman dan rimpang dalam larutan etanol 70 % selama 1 menit, natrium hipoklorit (NaOCl) 1 % selama 5 menit dan terakhir dengan etanol 70 % selama 1 menit. Potongan bagian tanaman dan rimpang yang telah disterilisasi digerus dengan menggunakan mortar steril hingga halus, lalu dilarutkan menggunakan 12.5 mM buffer fosfat (pH 7.1), kemudian disentrifugasi selama 10 menit pada 3000 rpm. Supernatan hasil sentrifugasi diambil sebanyak 100 µL lalu disebarkan secara merata pada media HV agar (Lampiran 1) dalam cawan Petri yang telah ditambahkan antibiotik sikloheksamida (50 mg/L media), asam nalidiksat (20 mg/L media) dan griseovulvin (0,5 mg/100 mL media) lalu diinkubasi pada suhu ruang (28 0C ) selama ± 14 hari. Pemurnian bakteri endofit. Koloni sampel bakteri non aktinomiset yang muncul setelah diinkubasi selama ± 14 hari, kemudian dimurnikan pada media NA, sedangkan koloni aktinomiset dimurnikan pada media ISP2 (Lampiran 2). Inkubasi dilakukan selama ± 7 hari pada suhu ruang dan diamati morfologi
