IPARI ENZIMEK
1.
Enzimek mérföldkövei -
-
-
2.
Évezredek borjú gyomor tejalvasztó enzim 1836 SCHWANN: gyomorból izolálta a pepszint, fehérjebontó enzim, triviális név 1876 KÜHNE enzim elnevezés 1890 TAKAMINE takadiasztase enzimpreparátum (Aspergillus oyzae) proteáz, amiláz 1894 E. FISCHER: α - és β glikozidos kötéssel foglalkozott α -metil-Dglükózt bont a maltóz (élesztő) β -metil-D-glükózt bont emulzim(mandula) 1913 MICHAELIS -MENTEN: enzimkinetikai leírás 1926 SUMMER tisztított enzim kristályos formában, ureáz babból 1966 Lizozim térszerkezete 1969 Enzimek és sejtek immobilizálása (de 1823 Franciao. ecetsav generátor) o 1969 TANABE D,L-Met reszolválása (enzim) japán o 1973 6-amino-penicillánsav enzimes előállítása(enzim) o 1974 NOVO HFCS enzimes előállításaClinton Corn Proc. Co.USA o 1977 Laktáz (enzim)Snam-Progetti(Olaszország) 1975 KLIBANOV enzimes reakció szerves fázisban, átészterezési reakció 1999 ENZYME DATA BANK 3705 db enzimet tartalmaz
Enzim források 2.1. Állati szövetek: • • • •
tripszin rennin emésztőcsatorna emésztőenzimei májból glutamát dehidrogenáz
2.2. Növényi eredetű: • • •
papain bromelin α -, β -amiláz-csírázó magvakból
2.3. Mikroorganizmusok: • •
•
Egyenértékű vagy jobb enzimet termelnek. A géneket egy kedvezőbb tulajdonságú mikroorganizmusba teszik át Pl: Str. pneumonieval senki nem fermentálna így a számunkra fontos gént belőle pl. B. subtilisbe teszik át
1
3.
Enzimek piaci helyzete Enzyme Bacillus protease Glucoamylases Bacillus amylases Glucose isomerases Rennin (microbial) Amylases (fungal) Pectinases Proteases (fungal) Others
Enzyme preparation (tons/year) 6200 4500 4200 1900 1500 800 100 100 -
Sales(percent of total) 45 13 5 6 10 4 3 2 12 Aunstrup et al.,1979
-
-
-
-
-
4.
45% baktérium proteázok • mosószerekben • a szálló pora allergiát okoz - termelésben volt egy hanyatló szakasz, de a problémát megoldották a porzás mentes készítményekkel 13% glükoamiláz • keményítőipar Bacillus amiláz Glükóz izomeráz Rennin • Tejalvasztás • Tejiparban használják • Borjúgyomorból izolálták, ma fermentálják gomba eredetű amiláz • söripar a malátázást kiváltják, ill rásegítenek • textilipar--->növényi poliszacharidok emésztése --->írtelenítés pektinázok • gyümölcsökben található poliszacharidok • gélesítőanyag • lé tisztább és kezelhetőbb lesz pektináz adagolás hatására • galakturonsavak kötéseit bontja gomba proteázok
Enzimek alkalmazása 4.1. Ipar
élelmiszeripar detergens ipar textilipar bőripar papíripar
4.2. Analitika
glükóz-oxidáz,
2
alkohol dehidrogenáz, koleszterin oxidáz
4.3. Orvosi alkalmazás
aszparagináz proteáz lipáz sztreptokináz
4.4. Kutatás
5.
Restrikciós endonukleázok Reverz transzkiptáz DNS-ligáz DNS-polimeráz
Ipari enzimek termelése
1987-ben az enzimtermelés 450 M USD 1995 kb.800 M USD illetve 1998 1600 M USD ipari enzim előállítás, és 23000 M USD terápiás enzim előállítás.
5.1. Ipari enzimek piaca Világtermelési érték (1998) Terápiás enzimek(1996) Gastro-intestinális betegségeknél Reumás betegségeknél Anyagcsere betegségeknél Trombózisnál Ráknál a.) Alkalmazásuk Élelmiszeripar ebből keményítőipar Detergens ipar Textilipar Bőripar Papír
45% 11% 34% 11% 9% 1,2%
1600 M USD 2300 M USD
60%-a rekombináns Er
Chymosin (1993) 140M USD RE (1996)100 M USD Taq polimeráz (1998) 80 M USD Detergens enzimek (1997) 200 M USD A detergens enzimeket site dirested mutagenezissel állították elő, mégpedig úgy, hogy az aktív centrumtól távol eső 8 AS-at módosítottak így megnövekedett a mosóerő valamint 100°C-on a hőstabilitás 34-szeres lett.
3
b.) Rekombinás ER AQUAZYM ULTRAR : Írtelenítésnél használják B. stearothermophilus B. licheniformis PENICILLIN ACILASER : E. coli multikópiás plazmid 28X aktivitás MAXIRENR : Tejipar használja Chymosin borjúE. coli(Pfizer USA) B. subtilis (Genencor USA) Kluyveromyces lactis (Gist Brocades) NATUPHOSR: Fitáz Asp. nigerAsp. niger (genomba) 25-30%-kal jobb PURADAXR: mosó celluláz Bac. BCE(lúg,°C)B. subtilis CD-GLIKOZIL-TRANSZFERÁZR ciklodextrin Kl. Pneumoniae B. subtilis-ba A teljes piac 90%-át 9 cég uralja: NOVO, GIST BROCADES, IBIS, GENECOR INTERN, RHONE-POULENC, SOLVAY ENZYM INTERN., COLLECTIVE JAP.IND.PRODUC, MILES A termelés 40%-át USA adja, Európa 35%-át és Japán 24°%-át.
5.2. Tenyésztés: a) Felületi (mold bran): tálca, forgódob (takadiastase, pektináz) b) Szubmerz Specifikum:
Olcsó termék: Nagy produktivitás kell. Nagy térfogatú fermentor Folytonos: glükóz.izomeráz (NOVO) Rátáplálásos:α-amiláz, proteáz, pen aciláz Törzsfejlesztés: egy enzim bevitel kell csak O2 limitben jó termelés: glükóz izomeráz, aspargináz, pen.aciláz De: proteáznak jó OTR kell 8% CO2 a levegőben jó az α-amiláz termelés ( B. subtilis) Alk.proteáz (és mások is) 3 típusú fermentáció. Lebontja az extracelluláris fehérjéker: izolálás egyszerű.
Katabolit represszió Cél: ne nőjön hanem fehérjét építsen a sejt Glükóz, fruktóz, sőt Glu is (glüko-amiláznál), α amiláz, celluláz, proteáz, amilo-glükozidáz Kivédés: • más, lassan bomló szénhidrát:laktóz, keményítő, mannóz, (cellulóznál) glicerin (α-amiláznál) 1200-szoros aktivitás növekedés • Adagolás (glükóz) • Mutáns (adenil-cikláz regulációs mutáns) Nézzük meg a lac operon esetében a katabolit repressziót. Ha glükóz és laktóz egyidejűleg van jelen a táptalajban, akkor nincs erõs lac expresszió. Ezt a jelenséget nevezik katabolit repressziónak. A glükóz ugyanis jobb szén- és energiaforrás, ezért elõbb ezt használja fel a baktérium. Ekkor nincs szüksége a laktóz hasznosítási enzimekre. Ha a sejt "éhezik" kevés ATP és sok ciklikus AMP (cAMP) keletkezik. A keletkezõ cAMP a katabolit aktivátor proteinnel (CAP ) egy cAMP-CAP komplexet alkot. Ez a komplex pedig aktivátora más cukorhasznosítási 4
géneknek, így a lac operonnak is. Ha a glükóz elegendõ, akkor a cAMP:ATP arány eltolódik az ATP javára és így nincs elég cAMP-CAP komplex, az egyéb cukorhasznosítási operonok (pl. lac, ara ) működése nem aktivált, azaz látszólag represszált. A lac operont már annyiszort tanították, úgyhogy itt nem anyag.
1.ára Katabolit represszió
Indukció Konstitutív enzimek: állandóan termelnek Induktív enzimek:csak akkor termelnek ha kell Mit mivel indukáljunk?Leginkább a szubsztráttal • Amilázokat keményítővel • Invertáz szacharózzal • β -galaktozidáz laktózzal • Glükóz-izomeráz xilóz (xilán, korpa)
2.ábra A lac operon szerkezete és expressziója
5.3. Feldolgozás: Intracelluláris enzimek (sejtfeltárás)
Extracelluláris enzimek
Kicsapás: Na2SO4, (NH4)2 SO4, izopropanol…..izoelektromos ponton csapunk ki Kromatográfia: Gél-, ioncserés-, adszorpciós-, biospecifikus-kromatográfia: S-analóg, antitest Membrán elválasztás: ultraszűrés (koncentrálás) Szárítás: • dob-,fluidágyas-,porlasztva szárító,liofilezés • Folyadékban szárítás: drága pl: α -amiláz (2% E+20% NaCl) és Glükoamiláz (5% E) • Por ill. granulálás: extrúderes granulálás (pormentes ) pl: proteázok, a detergensben az enzim koncentráció 0,015- 0,025%
5
6.
Ipari enzimek • • • •
6.1. Amilázok α-amiláz β -amiláz γ -amiláz (amiloglükozidáz, glükamiláz) (pullulanáz, izo-amiláz)
3.ábra Amilázok fajtái
6.1.1. α-amiláz Jellemzői • extracelluláris enzim • katabolit represszió: glükóz helyett később keményítő (induktor is egyben)
6
• • •
Thermomonospora:opt °C enzim(53°C) amelyet magasabb hőfokon is lehet használni B. subtilis: 27-30 °C az optimális hőmérséklete Az extracelluláris enzim egy szignálpeptid segítségével jut ki a sejtből.
4.ábra Szignálpeptidek működése
Minden olyan mikroba termeli amelyik keményítőt emészt: • Aspergillus oryzae • • Aspergillus niger • • Bacillus subtilis •
Bacillus licheniformis Bacillus amyloliquefaciens Mucor nemzetség
Felhasználás • keményítő lebontás • söripar • írtelenítés Az írtelenítő enzim először a maláta volt.1917 BOIDIN EFFRONT baktérium amiláz melyet 1945 után kereskedelmileg termeltek. Majd 1950-ben NOVO-NORDISK B. subtilis kereskedelmi enzimet termeltek írtelenítéshez. Ez egy olcsó, stabil, kemikáliákra nem érzékeny, nagy aktivitású enzimAQUAZYM. Ezt követően B. stearothermophilus: egy nagy hőstabilitású és széles pH optimummal rendelkező, de kis mennyiségű enzimet termel. Mivel kis mennyiségben termeli ezt az enzimet ezért B.licheniformisba klónozták(nem patogén, maga is amiláz és proteáz termelő, kicsi a kalcium igénye, nagy az aktivitása)AQUAZYM ULTRAR
7
6.1.2. β-amiláz: Termelő mikrobák • Bacillus polymyxa • Streptomyces • Pseudomonas sp Jellemzője • nagyobb hőtolerancia Felhasználás • maltóz szirup előállítás • söripar • erjedési ipar 6.1.3. Pullulanáz Mikrobák • Pullularia pullulans • Aerobacter aerogenes Jellemzői • α -1,6 kötést bont,határdextrint • induktor: i-maltóz, pullulán <---ma konstitutív mutánssal termelik Felhasználás: keményítő hidrolízis Glükóz előállítás (α -amiláz, pullulanáz, glüko-amiláz) Corn starch(40%w/v) Deionized water Ca2+(20ppm) α -amiláz 5 min 105°C
Pullulanáz
60 min 95°C
pH 4,5 60°C, filtration
Dilution (10-20% dry weight)
Glucoamylase
48h 60°C
8
Glucose (98% yield)
5.ábra Keményítő bontás Novo Industries, 1977
1 strach 2 glükóz E1 α –amiláz (Bac. licheniformis, Asp. niger) E2 glükoamiláz (Asp. niger) E3pullulanase (Pullularia pullulans, Aerobacter aerogenes, Ps.) 1) Áztatás:Kukorica+víz+SO2+ tejsavas baktérium 2) Nedves őrlés, ívszitákolaj, rost, fehérje 3) Elfolyósítás: pH: 6-6,5 T=115°C-95°C Termostabil amiláz: Ca aktivál és stabilizál 4) Elcukrosítás: pH:4,2 T=60°C Konverzió:98% Enzim:oldható de van immobilizált is Reaktor:Folyamatos kevert reaktor 9
5) Hidrolízis:48h, glükózzá alakul át, fontos, hogy higítsuk a rendszert mert ha az enzim nem talál vizet akkor transzglikoziláló enzimként működhet , mely képes a cukrokat is hidrolizálni. 6.1.4. Glükoamiláz Termelő mikrobák • Aspergillus niger • Aspergillus awamori • Rhisopus nigrigans Jellemzői • nem redukáló végen bont • maltózt nem hidrolizálja • Katabolit represszor: glükóz. laktóz, Glu • Induktor: keményítő, dextrin
6.2. Glükóz-izomeráz (xilóz-izomeráz) Induktora:xilán (xilóz – ötszénatomos cukor – polimerje, fában, fűrészporban található) Konstitutív mutánsokat alkalmaznak: Bacillus coagulans NOVO: Sweetzyme: glükóz katabolit represszió, kobalt és magnézium kell az enzimtermeléshez - mutáns: nem kell! Folytonos technológia: glükóz és oxigén limitben Felhasználás: Izoszörp előállítás Izoszörp előállítás (xilóz-izomeráz,glükóz izomeráz) Az izomerizálásra kerülő glükózszirupnak tisztának kell lennie: szűrés v. aktív szenes kezelés vagy ioncserés tisztítás, különben mérgezik az enzimet Mikroorganizmus: • B. coagulans, katabolit represszió, induktív enzimet termel ( ma konstitutív mutáns). Fermentáció: • Folytonos fermentáció, Co és Mg –ot kell adagolni a fermentációhoz, mivel az intracelluláris enzimek drágák ezért immobilizált enzimet alkalmaznak. • pH: 7,5-8 • T= 50-60 °C ez akadályozza a M. infekciót, de lassan inaktiválja az enzimet • Fix ágyas párhuzamos reaktorokat alkalmaznak ( sejt rögzített) ld.Ábra • 1000 t HFCS/nap: 20 reaktor • t1/2 = 100 nap ( 12%-os aktivitás-csökkenésnél csere) Konverzió: • •
glükóz (55%)-fruktóz(45%) (egyensúlyi) 50%-os fruktóz tartalmat a melléktermékek képződése és a hosszú kontaktidő miatt nem lehet elérni, de: ioncserével 55% is elérhető.
Termelés kezdete: • 1967 Clinton Corn Proc.Co. • 1974 Immobilizálás Felhasználás: • Élelmiszeripar
10
• • •
Édesítőipar Sütőipar Tejipar
Magyarország • 1982 Szabadegyháza • 50 000 t/év • Immobilizált enzim • Nettó hozam: 12M USD/év
6.ábra Izoszörp előállítás
6.3. Pektinázok Pektin: Poli-galakturonsav részlegesen metilészterezve. A monomerek béta1,4-es kötéssel kapcsolódnak össze. Ezeket a kötéseket bontják a poligalakturonázok (= pektinázok), beszélhetünk exo- és endo poligalakturonázról.
11
13.ábra Pektin
14.ábra A pektin hidrolízise Felhasználás • Gyümölcsléipara gyümölcsök húsát ezzel az enzimmel kezelve a lé mennyiségét megnövelhetik és a feldolgozhatóságot javítják • Olivaolaj gyártásolajos-vizes emulziók stabilitását javítja • Borászat a préselhetőséget javítja Termelő mikroorganizmusok: • Aspergillus niger • Rhyzopus nemzetség • Botrytis cinerea
6.4. Celluláz A gyapotszálak cellulózból állnak. A celluláz általános mosó additív: a cellulózszál pelyheket (bolyhokat) eltávolítja, de nem támadja meg a cellulóz rostokat, új bolyhok nem képződnek, színes, fényes marad a textil hosszú hordás és gyakori mosás után is. 12
A celluláz pH optimuma savas, míg a mosás pH-ja lúgos. Így az lett a cél, hogy alkalikus cellulázokat kell keresni. Kelet Afrikában alkalikus tavak és hőforrások vannak (50-110 °C) (pH=8-12). Mégis sok mikroorganizmus él bennük extremofilek: alkáli toleránsok, obligát alkalofilek és hőtoleráns fajok. Prokarióták. A tavak körülményei azonosak a mosáséval. Ezek a baktériumok nehezen szaporíthatóak, így a celluláz enzimüket más mikroorganizmusba kell klónozni. A Bacillus BCE103 nehezen szaporítható és kevés celluláz enzimet termel, ezért ezt az endocelluláz gént klónozták B. subtilis-be. Ez jó gazdaszervezet mert: • Nem patogén • Sok más enzimet is kiválaszt • A celluláz extracelluláris tehát izolálása egyszerű PURADAXRhő-; alkáli- és fehérítőtűrő enzim
6.5. β–galaktozidáz (laktáz) Laktóz glükóz + galaktóz Termelő mikroorganizmusok: • Baktériumok, élesztők, penészek • Kluyveromyces lactis: pH = 6-7, tejben laktóz hidrolízis • Asp. niger: pHopt=4-5, savó hidrolízis Alkalmazás • Tej, tejpor: laktóz hidrolízis, növeli az édességet (laktóz 20% < galaktóz 58% < glükóz 70%), laktóz intoleráns betegeknek • Fermentált termékeknél (joghurt, sajt stb.) a fermentáció sebességét növeli • Takarmányba kerülő savó hidrolízise • Élelmiszerekbe kerülő savó hidrolízise: könnyebb felvétel, emészthetőség, édesség növelése, valamint megakadályozza a kristályosodást (fagylaltok, sütemények esetében) Technológia 1) Szakaszos enzimes technológia • Tej+ enzim • T=35°C • t=4 h • 70-80%-os laktóz hidrolízis • UHT sterilezés • Aszeptikus csomagolás 2) Folytonos enzimes technológia • Immobilizált enzim • Tejnél nagy a fertőzési veszély, ezért ritkán • Savónál jobb, mivel kisebb a pH • SNAMPROGETTI ( Olaszország) cellulóz triacetát szálon immobilizálás (szál reaktorok:Plug flow), konverzió: 75-80%, kapacitás 8000l tej /nap(1977) Laktóz intolerancia, laktóz érzékenység
13
• • • •
A leggyakoribb enzim hiánybetegség Európa lakosságának: 5- 15%-a, Afrika 80%-a, Kína 90%-a szenved ilyen betegségben Az anyatej 7,5%-a laktóz, a tehéntej 4,5%-a A bélfal 3 éves korig mindenkinél termeli az enzimet ez bontja a tejcukrot, a csecsemő képes asszimilálni. A hiánybetegségnél az enzimtermelés ebben a korban megszűnik, a tejcukor bontatlanul a vastagbélbe kerül és megakadályozza a széklet vízleadását hasmenés. A bélbaktériumok a laktózt erjesztik gázképződés, felfúvódás.
14
6.6. Proteázok • • • • • • •
6200 t tiszta enzim/év Mosószeripar, tejipar, gyógyszeripar, bőripar, élelmiszeripar Fehérje hidrolizátum: tápoldat, infúzió. Élelmiszer Peptid kötéseket bont (létrehoz) (Hidrolízis-szintézis) Aktiválás proteolízissel: pepszinogén, tripszinogén, proinzulin, véralvadás Fehérje lebontás: élelmiszer, tejalvadás, mosóenzimek, infúzió, vérrögoldás Fehérje/peptid szintézis: aszpartám előállítás
6.6.1. Alkalikus proteázok Jellemzői • Szerin proteáz • Mosószer-proteáz o Jó detergens és o hőstabilitás o Jól bírja a lúgos közeget o Nagy a kelát és perborát stabilitása Termelő mikrobák: • Streptomyces nemzetség • Aspergillus nemzetség • B. amyloliquefaciens: szubtilizint termel, ami egy szerin proteáz és amely reverzibilis acilezésre képes Screening • pH = 10-es fehérje-agaron szélesztéssel Törzsjavítás • Célja: az adott törzs több enzimet termeljen (Génsebészet és a protein engineering) 1.) erős promótert teszünk az adott gén elé 2.) multikópiás plazmid: az adott gén több példányban legyen jelen • törzsjavítással foglalkozó cégek: NOVO, GIST-BROCADES, PROCTERGAMBLE Fermentáció • Fed batch fermentáció • NH4 és aminosav koncentrációra figyelni kell, alacsonyan kell tartani az egész fermentáció alatt • Nagy oxigén bevitel kell: 1 VVM , 48-72 h • 1971-ben allergia krízis: mivel ezek por állagúak voltak allergiát okoztak így gyöngyszemcsézték őket, ezzel elkerülve allergén hatásukat. • Stabilitásuk érdekében kutatások folytak melyek bebizonyították, hogy a Met 222 (mely a stabilitásért felelős) Ser-re cserélve jobb aktivitást tapasztaltak de stabilitása nem volt jobb. 6.6.2. Neutrális proteázok Jellemzői • Olyan fehérjebontó enzim, amely semleges pH-n dolgozik • Érzékeny: hőre
15
o Stabilizátorokra CaCl2, NaCl o Alkalikus proteáz gyorsan lebontja Termelő mikrobák • Bacillus subtilis • Str. griseus • Aspergillus oryzae Felhasználás • Élelmiszeripar: kenyér, keksz gyártás • Bőripar: Szőrtelenítésre használják mivel a bőr is egy fehérje ezért ennek egy irányított folyamatnak kell ennek lennie Régen emberi fekáliával kezelték a bőröket - emberi emésztő enzimek 6.6.3. Savas proteázok Jellemzői Cys proteáz Enzimek, melyek hasonlóak a pepszinhez (pH opt=2-4), ilyen papain, bromelin Felhasználás • Emésztést elősegítő • Szója szósz előállítás • Glutén hidrolizátum Rennin = chimozim = gasztriktin Jellemzői: • (enyhén) savas proteáz • Sajtgyártás legfontosabb enzime. • Ez egy alvasztó enzim, Asp van az aktív centrumban tehát aszparagin-proteáz • 3-4 hetes borjú gyomorban található pre-pro chymozin formában • Izoenzim: chymosin A 244. aminosav Asp, 40%, nagyobb az aktivitása chymosin B 244. aminosav Gly, 60%, A tehénben vagy A illetve vagy B van A megnövekedett igényt nem tudták fedezni( 64 Mt sajt gyártása évente), ezért arra törekedtek hogy valahogy megpróbálják pótolni a hiányzó mennyiséget. Pótlással többféleképpen próbálkoztak: 1) állati pepszinek (csirke pepszinIzrael, Csehország) 2) savas penész proteázok • M. miehei • M. pusillus • Endothia parasitica kereskedelmi készítmény 1937 (SUPRAREN USA, Franciaország) • Ez is egy savas proteáz (pH = 4-5,5) • Hőstabilitása viszonylag nagy, ez itt nem jó tulajdonság, megmarad az aktivitás a hőkezelés után is. • Extracelluláris enzim, kicsapódhat 3.) Rekombináns DNS technika 1980 elején a borjú renin gént klónozták RENNETR szabadalmaztatták és engedélyeztették 16
Gazdaszervezet: • E. coli: az enzim oldhatatlan „inclusin body” formába van, • Az összfehérje 15-20%-a rennin • probléma, hogy nem élelmiszeripari mikroba, veszélyesnek minősül • B. subtilis: élelmiszeripari mikroba, de glikozilálja az enzimet • Kluyveromyces lactis • Élelmiszeripari, SCP tejsavón • 1950-60-ban savóból izolálták • A tejiparban használatos béta–galaktozidázt ezzel termelte a Gist- Brocades • Aktív enzim szekrécióval rendelkezik • 1988-tól ezzel termeltették az enzimet (Franciaország: Gist- Brocade, Hollandia) • Rekombináns K. lactis előállítása
8. ábra Plazmid
A fenti ábrán látható ez a plazmid. Az expressziós vektorba beleraktak egy laktóz promóter régiót, laktóz terminátor régiót, pro-chymosin DNS-t, egy transzpozont és egy szignál-peptid részt is. Az élesztő alfa-faktor leadert, mint szignál szekvenciát használva a prochymosint extracellulárisan termeli. Mivel a törzs kevés extracelluláris fehérjét termel, könnyű a rennint izolálni: Prochymosin chymosin MAXIRENR Scale up: könnyű mert ezzel az enzimmel termelték a β-galaktozidázt (bár az intracelluláris enzim volt). Élő sejtet nem tartalmazhat a termék, ezért azokat benzoesavval megölik, alacsony pH-n és szűrik, közben a fenti reakció végbemegy. A termék tartósítását benzoesavval vagy NaCl-dal végzik, a lényeg az, hogy DNS-t nem tartalmazhat.
17
Régebben plazmidos rekombináns élesztővel termeltették a prochymosint, ma a prochymosin gént a kromoszómába építették be. MAXIRENR: • Tisztább, mint a borjú rennin, nincs kísérő enzim (pepszin+ egyéb) • A rennintel kémiailag és biológiailag teljesen azonos • Ez kereskedelmi termék az egész világon. • Termelése olcsó • Állandó tisztaságú, mentes állati szervmaradványoktól • Mennyisége korlátlan • 1988-tól ipari termelés Seclinben Franciaországban, ez az üzem ISO 9002 Bizonyítvánnyal rendelkezik rekombináns tenyésztésére. Sőt kóser engedéllyel is rendelkezik, oly módon, hogy növényi, vegetáriánus élelmiszernek minősítették termékeiket. Az engedélyeztetés nehéz volt sok mindent figyelembe vesznek: DNS stabilitást, patogenitást, mutagenitást, toxikusságot. Etetési tesztnek kell megfelelni. Sajtgyártási teszteket is csinálnak. Organoleptikus vizsgálatokat, valamint allergológiai vizsgálatokat is. Valamint az EC előírásokat be kell tartani, melyek a termelésre és a termékre vonatkozik. A sajtgyártás technológiái Ez az első termék amelynél enzimet és mikrobát is használnak évek óta.
A fontos tej fehérjék: Fehérje Kazein alfa s1-kazein alfa s2- kazein béta-kazein kappa-kazein Savó fehérjék béta-laktoglobulin béta laktalbumin immunglobulin szérum albumin
%
Foszfát csoportok molekulánként
32 8 32 8 80
8 10-13 5 1-2
12 4 3 1 20
0 0 0 0
Hőstabil P miatt kalcium kötő. Micella képző
Ezek ultraszűréssel eltávolíthatók
0,1 kalcium jelenlétében a kazein micellában van mely a következő ábrán látható:
18
9. ábra Kazein micellában
Rennin hatás: 1.fázis: κ-kazein hidrolízise
10.ábra κ-kazein hidrolízise
19
11.ábra Aktív chymosin előállítása A rennin fenilalanin-metionin hasítást csinál, mely hatására keletkezik két fehérjedarab és ez a vágás destabilizálja az egész szerkezetet. 2. fázis : koaguláció, mely a hőmérséklettel és a kalcium ionokkal nő Sajtérlelés: Bizonyos sajtokat érlelni kell (4 hét-2 év), az idővel fordított arányban változik a víztartalom. Valamint előfordulhatnak: kémiai, biokémiai, mikrobiológiai változások. • Ha tejcukor maradt a rendszerben és mikrobák beleesnek akkor rossz ízt produkálnak • Sok szabad zsírsav keserű ízt ad • A fehérje bomlás folyamatos 6.6.4. Fémproteázok Thermolizin az aszpartám gyártás fontos enzime. Törzsizolálás: meleg helyekről
• •
BOC:Benzil-oxi-karbonil-származék, mely hidrogénezéssel eltávolítható Egyébként:random dipeptidek és oligopeptidek képződnek
Aszpartám gyártás Az aszpartám egy mesterséges édesítőszer, ami a fenilalanin metilészterének és aszparaginsavnak a kondenzációjával keletkezik a Thermolizin segítségével. Ahhoz, hogy a fenilalanin-metilészter aminocsoportja reakcióba lépjen az aszparaginsav karboxil csoportjával a rajtuk lévő másik funkciós csoportokat blokkolni kell. A metilészter a karbonsavat alapból blokkolja az aszparaginsav aminocsoportját pedig egy benzoil-oxi-karbonil (BOC) csoporttal blokkolják.
Tehát a szintézishez szükséges: 1) L-aszparaginsav 2) Fenilalanin a fenilalanin nem baj , ha racém, mert az enzim amúgyis csak az L konformációkat kapcsolja össze, a D-fenilalanin csapadékot képez az aszpartámmal, ami kiszűrhető. 3) Ebből a kettőből a thermolizin enzim hatására csapadék keletkezik, a reakció közel semleges pH-n és 50°C-on megy végbe. 4) A csapadékot elválasztják 5) Majd visszaoldják. Az enzimes kezelés előnyei: • Nincs β -izomer képződés • Az enzim tökéletesen sztereoszelektív: racém Phe is használható • Nincs racemizáció a szintézis alatt
20
•
A reakció vizes közegben végrehajtható
21
• • •
12.ábra Aszpartám előállítás
Oldott enzimet használnak Vizes fázis Fermentáció: o Szakaszos keverős reaktor o pH=7-7,5 o T=50°C
6.7. Lipáz A zsírok fizikai tulajdonságai a zsírsav komponensektől függnek. Ezek a tulajdonságok változnak: • Frakcionált kristályosításkor:szilárd és folyadék frakció • Hidrogénezéssel: telítetlen telített, o. p. növekedés: margaringyártás • Átészterezés: kémiai: statisztikus folyamat Enzimes: irányítható régióspecifikusság Jellemzői • A lipázok a zsírok módosítását végzik, az észter kötéseket hidrolizálják A hidrolízis sebessége eltérő, függ: a hossztól, a telítetlen kötésektől valamint más sebességgel hidrolizálják a glicerin szélső és a középső észtereit. • A növényolaj ipar, zsíripar számára káros a lipáz hatása, itt célszerű a lipázokat távol tartani. • Az átészterezési reakciókban fontos szerepet játszanak, a trigliceridben lévő kötött és a szabad zsírsavak statikus folyamatban kicserélődnek és egyensúly alakul ki. • Extracelluláris enzim • Induktora a növényi olaj • Represszora a glükóz és a glicerin • Szubsztrát specifitás Zsírsav specifikusság: nem erős, de a specifikusság mértéke függ: a zsírsav hosszától és a telítetlen kötések helyétől és számától Glicerin specifikusság a) egyes enzimeknél nincs glicerin specifikusság, a kémiai reakcióhoz hasonlóan ez is egy statisztikus átészterezés vagy bontás. (Candida nemzetség) b) Regiospecifikusság: 1, 3-ra specifikus:.Mucor és Rhizopus nemzetség tagjai • Használják immobilizált enzimként vagy makropórusú hordozóhoz rögzítve (diatómaföld, akrilát, poli-propiléngyanta) Termelő mikroorganizmusok: • Aspergillus nemzetség • Mucor nemzetség • Rhyzopus nemzetség • Candida nemzetség
22
Felhasználás • Emésztést elősegíti (pankreász lipáz pótló) • Sajtérlelésben: ízjavító (P.raquefartii spóra) • Szappan ipar (Candida lipáz) • Átészterezés, észterképzés Átészterezés folyamata:
Ezekben a kétfázisú rendszerekben fontos szerepe van a víznek. Ha a víz koncentrációja nagy(vizes fázis) hidrolízis Ha a víz koncentrációja kicsi(szerves fázis)szintézis Zsírok átészterezése: a) Trigliceridek között
b) Triglicerid és zsírsav között A hozzáadott zsírsav beépül és „új zsír” képződik.
23
Esettanulmány: Pálmaolaj (olcsó) kakaóvaj (drága) Enzimes termék Kakóvaj Triglicerid Pálmaolajban% % % StStSt 5 3 1 POP 16 16 58 POSt 13 39 41 StOSt 2 28,5 27 StLnSt 9 8 8 StOO 4 4 6 St = sztearát (18) P = Palmitát (16) O = Oleát (18) Ln = Linolát (18)
A kakóvaj már testhőmérsékleten olvad:
- élelmiszerek - kúpok
Aroma anyag előállítás
Észter előállítása lipáz enzimmel (Candida antaretica)
24
15.ábra Észter előállítása lipáz enzimmel i-propanol az oldószer • pH=7 • Immobilizált enzim • T= 60°C • Hozam:99% Probléma: A képződő víz eltávolítása, itt szintézisről van szó. a) azeotróp desztillációval, a propanolt folyamatosan táplálják a reaktorba b) pervaporáció i-propil–mirisztát alkalmazása: szapan, kenőcs, bőrkrém előállítása Az eljárás alkalmas más észterek előállítására is. Gyártó:UNICHEM (Hollandia) •
6.8. Penicillin aciláz • • • • •
G penicillin 6-amino-penicillánsav + fenilecetsav Félszintetikus penicillin előállítása a 6-amino-penicillánsavból történik. Enzimfermentáció E.coli ATCC III05 mutáns Fenil-ecetsav adagolás:induktív enzim
25
• • •
Glükóz katabolit represszió Oxigénlimit szükséges a jó enzimtermeléshez Intracelluláris enzim alkalmazása esetén a sejteket nagynyomású homogenizátorral fel kell tárni. Penicillin hidrolízis: a) sejttömeggel szakaszos hidrolízis • Penicillin+sejt pH=8, 37°Chidrolízis • Szűrés, pH = 2 6APA extrakció(metil-izobutil keton) • 6-APA kicsapás izoelektromos ponton, pH = 4, 3 b) Immobilizált sejttel vagy enzimmel. Előny: ár, tisztaság
6.9. Fitáz • • • •
Fitinsav: mezoinozit-hexafoszfát Fitin: a fitinsav Ca v. Mg sója növényi sejtfal komponense Állattartás: nagy mennyiségű trágya N és P tartalma nagy probléma, mert eutrofizációt okoz • Növényi fitin P az állat ezt felhasználja. De a sertés és a csirke gyomra nem termel fitázt. Így vagy foszfort vagy fitázt kell a takarmányhoz adni. Termelő mikroorganizmusok: Asp. niger kis mennyiségben termeli, gazdaságtalan. A Gist-Brocades 1985 táján klónozta a gént glüko-amiláz promóter szekvenciához, és ezt a „kazettát” integrálták statisztikusan Asp. niger genomjába. Ennek az lett az eredménye, hogy a titer jelentősen megnőtt, a termelés gazdaságossá vált. Szűrés után koncentrálás: folyadék (ultraszűrés+ szorbit). Por: búzakorpa hordozó NATUPHOSR = nem kell foszfort adni a takarmányba és a trágya foszfor tartalma 25-30%kal csökken.
26
