NEUROTRANSZMISSZIÓBAN RÉSZTVEVŐ ENZIMEK VIZSGÁLATA

Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet Általános Orvostudományi Kar Debreceni Egyetem

BIOKÉMIA GYAKORLAT

NEUROTRANSZMISSZIÓBAN RÉSZTVEVŐ ENZIMEK VIZSGÁLATA elméleti bevezetés

Dr. Köröskényi Krisztina 2015

TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

2

ELMÉLETI BEVEZETŐ

3

1. Neuronális kommunikáció, idegi szinapszis

3

2. Neurotranszmisszió, kémiai szinapszis

4

3. Neurotranszmitterek

5

3.1. Acetilkolin

5

3.1.1. Kolinészterázok

6

3.1.2. A pszeudo-kolinészteráz (PChE) aktivitásának meghatározása

7

3.1.3. A kolinerg rendszer farmakológiája

8

3.1.4. A kolinészteráz-aktivitás meghatározásának klinikai jelentősége

9

3.2. Monoamin neurotranszmitterek

10

3.2.1. Monoamin-oxidázok

10

3.2.2. A monoamin-oxidázok aktivitásának meghatározása

11

3.2.3. A monoamin-oxidázok jelentősége a klinikumban

12

1

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

4-AA

4-aminoantipirin

acetil-CoA

acetil-koenzim A

ACh

acetilkolin

AChE

acetilkolin-észteráz

DTNB

ditio-nitro-benzoát

GABA

gamma-amino-vajsav

KIR

központi idegrendszer

mAChR

muszkarinos acetil-kolin receptor

MAO

monoamino-oxidáz

nAChR

nikotinos acetil-kolin receptor

PChE

butirilkolin-észteráz, pszeudo-kolinészteráz, plazma kolinészteráz

TNB

5-tio-2-nitrobenzoát

2

NEUROTRANSZMISSZIÓBAN RÉSZTVEVŐ ENZIMEK VIZSGÁLATA ELMÉLETI BEVEZETŐ

1. Neuronális kommunikáció, idegi szinapszis A neuronok egymással az úgynevezett szinapszisokon keresztül kommunikálnak, melyek a preszinaptikus sejt axonterminálisa, illetve a posztszinaptikus sejt dendritje, sejtteste vagy – ritább esetben – axonja között találhatóak. Az emberi agy nagyszámú szinaptikus kapcsolattal rendelkező neuronhálózat, melyben a közel 1011 idegsejt mindegyike átlagosan 7000 szinapszist alakít ki más neuronokkal. Az intenzív fejlődéssel jellemezhető gyermeki agy megközelítőleg 1017 (1 kvadrillió) szinapszist tartalmaz, mely a kor előrehaladtával csökken. A szinapszisok hatásuk szerint excitatórikusak (posztszinaptikus neuron aktivitását fokozó) vagy inhibitorikusak (posztszinaptikus neuron aktivitását gátló) lehetnek. Működésüket tekintve két alaptípusukat - elektromos és kémiai szinapszist - különböztetjük meg (1. táblázat).

ELEKTROMOS SZINAPSZIS

KÉMIAI SZINAPSZIS  a preszinaptikus neuron elektromos aktivitása neurotranszmitter felszabadulásához vezet,

 a pre- és posztszinaptikus neuron membránját réskapcsolat (gap junction) köti össze,

mely a posztszinaptikus neuronon lévő recep-

mely lehetővé teszi a töltések, ezáltal az

toraihoz kötődik  a receptorok bonyolult intracelluláris jelátvi-

elektromos ingerület akadálytalan áramlását

teli rendszere miatt a neurotranszmitter kötő előnye a sejtek közötti gyors jeltovábbítás

dése komplex hatást gyakorol a poszt-szinaptikus neuron működésére

1. táblázat: Az elektromos és kémiai szinapszis fő jellemzői

3

2. Neurotranszmisszió, kémiai szinapszis Az ingerületátvivő anyagok (neurotranszmitterek) felszabadulásával és posztszinaptikus neuronon lévő receptoraihoz való kötődésével járó folyamatot ingerületátvitelnek, neurotranszmissziónak nevezzük. A neurotranszmisszió fő lépései a

1. ábra: A kémiai szinapszis szerkezete (forrás: Wikipedia)

következőek:

1. Neurotranszmitter szintézise: a neuronok sejttestében, axonjában illetve axonterminálisában zajló folyamat. 2. Neurotranszmitter tárolása: az axonterminálisokban található granulumokban és vezikulumokban. 3. Neurotranszmitter felszabadulása: az axon terminálist érő küszöb-potenciál vagy fokozódó (gradált) elektromos potenciál hatására feszültségfüggő Ca2+-csatornák nyílnak meg és Ca2+ ionok lépnek be az axonterminálisba. Az intracelluláris Ca2+ jel a neurotranszmitter szinaptikus résbe történő felszabadulásához vezet. 4. Neurotranszmitter – receptor kötődés: felszabadulását követően a neurotranszmitter a szinaptikus résben diffundálva eléri a posztszinaptikus neuron membránjában lévő receptorait és kötődik azokhoz. A ligand-receptor kapcsolódás olyan komplex változásokat idéz elő, melyek hatására fokozódik vagy csökken a posztszinaptikus neuron aktivitása. A kifejtett hatások egy része gyors és rövidtávú (pl. membránpotenciál megváltozása), míg mások hosszútávú hatást gyakorolnak a posztszinaptikus neuronra. 5. Termináció: a posztszinaptikus neuron megfelelő válaszadásának érekében a receptorhoz való kötődést, illetve a biológiai hatás kiváltását követően a neurotranszmitter molekulákat el kell távolítani a szinaptikus résből. Az eltávolítás többféle módon történhet:  a neurotranszmitter szinaptikus résből történő eldiffundálásával  a szinaptikus membránokhoz kötött enzimek általi inaktivációval/lebontással  az axonterminálisba történő, specifikus pumpák általi visszavétellel A kémiai szinapszisokat a felszabaduló neurotranszmitter alapján csoportosíthatjuk. A leggyakoribbak a glutamáterg, GABAerg, kolinerg és adrenerg szinapszisok. 4

3. Neurotranszmitterek A neurotranszmitterek olyan speciális, endogén hírvivő molekulák, melyek feladata a jel továbbítása egyik idegsejttől a másikig, illetve az izom- vagy mirigysejtekig. Több mint 100 különféle neurotranszmitter ismert, leggyakoribb képviselőiket és fő típusaikat foglalja össze a 2. táblázat.

TÍPUS

NEUROTRANSZMITTER

AMINOSAVAK

glutamát, aszpartát, GABA (γ-amino-vajsav), glicin

AMINOK

MONOAMINOK

dopamin, szerotonin (5-HT), noradrenalin, adrenalin, hisztamin

NYOM-AMINOK

triptamin, tiramin, feniletilamin

PEPTIDEK

szomatosztatin, substance P, opioidok, CART (kokain- és amfetamin-regulált transzkript )

PURINOK

ATP (adenozin trifoszfát), adenozin

GÁZOK

CO (szén-monoxid), H2S (kén-hidrogén), NO (nitrogén-monoxid)

IONOK

cink

EGYÉB

acetilkolin (ACh), anandamid

2. táblázat: A neurotranszmitterek fő típusai Legtöbbjük az idegrendszerben termelődik, csak ott található meg és ott fejti ki hatását, de vannak, amelyek a vérben szétterjedve szisztémás hatással is rendelkeznek (pl.: adrenalin). Néhányuk a testben hormonként funkcionál, az agyban pedig neurotranszmitter szerepet tölt be. A leggyakoribb neurotranszmitter a serkentő hatású glutamát, mely az emberi agyban található szinapszisok mintegy 90%-ában szerepel ingerületátvivőként.

3.1. Acetilkolin Az elsőként felfedezett neurotranszmitter acetilkolin (ACh) az autonóm idegrendszer legfontosabb ingerületátvivő molekulája, mely mind a perifériás, mind a központi idegrendszerben (KIR) elengedhetetlen szerepet tölt be. Az ACh a motoros neuronokat és izmokat összekötő neuromuszkuláris junkció kizárólagos neurotranszmittere. Míg a KIR-ben és a szív szabályozó rendszerében a kolinerg rendszer általában gátló hatást közvetít, addig a vázizom neuromuszkuláris junkcióban excitatórikus neurotranszmitterként viselkedik. Az ACh hatásának szisztémás blokkolása izombénulást (légzés- és szívleállás) okozhat. A kurare nyílméreg a nikotinos ACh receptorok blokkolásán, a butulin az ACh felszabadulásának gátlásán, a feke-

5

te özvegy pók mérge pedig az ACh túlzott felszabadulásán keresztül zavarja meg a kolinerg szinapszisok működését. Az ACh speciális idegsejtben képződik kolin és acetil-CoA prekurzorokból kolinacetiltranszferáz enzim segítségével, míg lebontásáért a szinaptikus résben jelenlévő kolinészteráz enzimek felelősek, melyek kolinná és ecetsavvá alakítják az ACh-t. Az ACh hatásait nikotinos (nAChR) és muszkarinos (mAChR) receptorokon fejti ki (3. táblázat).

NIKOTINOS ACh RECEPTOR (nAChR)

MUSZKARINOS ACh RECEPTOR (mAChR)

 ACh és nikotin stimulálja  Na+, K+ és Ca2+ ionokra szelektív ionotróp receptor (ligandvezérelt ioncsatorna)  gyors és rövidtávú hatást gyakorol a célsejtekre  nagy mennyiségben van jelen a motoros véglemezekben, az autonóm idegrendszerben és a KIR-ben

 ACh és muszkarin stimulálja  metabotróp receptorként a neuronok hatását hosszabb távon befolyásolja  a KIR-ben, valamint a periferiás idegrendszer szívet, tüdőt, felső tápcsatornát és verejtékmirigyeket beidegző részében dominál

3. táblázat: A nikotinos és muszkarinos acetilkolin receptorok jellemzői 3.1.1. Kolinészterázok Az ACh lebontását a kolin-észterázok végzik (2. ábra). A reakcióban kétféle kolin-észteráz vehet részt: (1) az idegvégződésekben és az agy szürkeállományában valamint a vörösvérsejtekben és a lépben funkcionáló acetilkolin-észteráz (AChE; valódi kolinészteráz) illetve a (2) butirilkolin-észteráz (PChE, pszeudo-kolinészteráz, PChE, plazma kolinészteráz), mely a szérumban, hasnyálmirigyben, váz- és szívizomban és az agy fehérállományában mutatható ki. A máj, tüdő és a vegetatív ganglionok mindkét kolinészterázt tartalmazzák.

2. ábra: Kolinészteráz reakció

6

A neuromuszkuláris junkció és a kolinerg szinapszisok pre- és posztszinaptikus membránjához asszociált acetilkolin-észteráz (AChE) az ACh inaktiválásán keresztül kulcsszerepet játszik az ingerületátvitel terminálásában. Az ACh bontásakor keletkező kolin a preszinaptikus idegvégződésekbe vevődik vissza és foszforilkolin formájában tárolódik, majd ACh-ná alakulva újrahasznosul a neurotranszmisszióban. Az AChE aktivitásának csökkenése (genetikai abnormalitások vagy enzimgátlás miatt) az ACh felszaporodásához vezet, mely a neurotranszmissziót gátolva izombénulást, rohamokat és akár halált is okozhat. A pszeudo-kolinészteráz (PChE) nem-specifikus kolinészteráz, mely különféle kolinésztereket képes hidrolizálni. Fiziológiás szerepe kevéssé tisztázott, hiányában nem alakul ki betegség. A szérumban lévő PChE talán a feleslegben lévő ACh lebontásában játszik szerepet. Farmakológiai és toxikológiai szempontból azonban fontos szereppel bír: az észter-alapú helyi érzéstelenítőként használt hatóanyagok (pl.: szukcinilkolin, prokain) – valamint a heroin és kokain – lebontásában nélkülözhetetlen enzim. Csökkent vagy hiányzó aktivitása esetében elmarad az előbb említett hatóanyagok lebontása, illetve fokozódnak azok nemkívánt szisztémás hatásai. 3.1.2. A pszeudo-kolinészteráz (PChE) aktivitásának meghatározása A gyakorlat során a PChE aktivitását egy szintetikus szubsztrát, a butiril-tiokolin alkalmazásával határozzuk meg. A butiril-tiokolin nem szubsztrátja az AChE-nek, alkalmazásával a PChE és AChE aktivitás elkülöníthető. Az enzim a szubsztrátot butirátra és tiokolinra hidrolizálja. A keletkező tiokolin ditio-nitro-benzoáttal (DTNB) reagálva sárga

színű

terméket

(5-tio-2-

nitrobenzoát, TNB) eredményez (3. ábra), melynek fényelnyelési maximuma 410 nm körül van. Gyakorlaton a PChE aktivitását a 405 nm hullámhosszon mért abszorbancia-változás alapján számítjuk ki. 3. ábra: A PChE aktivitásának kolorimetriás meghatározása

7

3.1.3. A kolinerg rendszer farmakológiája Az ACh hatását befolyásoló hatóanyagok az orvostudomány számos területén használt terápiás szerek. A kolinerg rendszer működését az ACh receptor agonisták (pl.: karbakol, muszkarin, nikotin) stimulálják, az antagonisták (pl.: atropin, szkopolamin, hexametónium, pankurónium, rokurónium) pedig gátolják. Az ACh receptorokon kifejtett direkt hatásuk mellett mindkét hatóanyagcsoport indirekt módon is, például a kolinészteráz enzimek befolyásolásán keresztül, képes módosítani a kolinerg rendszer működését. A Prometazin egy antihisztamin hatóanyag, mely altató, nyugtató és hányáscsillapító hatással bír. A készítmény egyes allergiás betegségek tüneteinek kezelésére, émelygés, hányinger, hányás megelőzésére és kezelésére, rövid távú nyugtatásra, műtéti érzéstelenítés során a nyugtató, illetve fájdalomcsil4. ábra: Hazai forgalomban lévő prometazin hatóanyagú gyógyszer

lapító hatás fokozására, valamint utazási betegség megelőzésére és kezelésére alkalmazható.

A Prometazin fő farmakológiai célpontjai a H1 hisztamin receptor (antihisztamin hatás) és a D2 dopamin receptor (nyugtató és hányáscsillapító hatás). Ezek mellett erős antikolinerg, valamint antiadrenerg és antiszerotoninerg hatást is kifejt. A kolinerg rendszerben egyrészt az ACh receptorokat (a M1 típusú mAChR antagonistája), másrészt a kolinészterázokat (AChE és PChE gátlószer) blokkolva fejti ki hatását. Az AChE gátlószerei az élet különféle területein vannak jelen: növényi és állati méreganyagok komponensei, rovarirtószerként használatosak a mezőgazdaságban, a kémiai hadviselés eszközei, valamint terápiás eszközök az orvostudományban. A klinikai gyakorlatban izomrelaxánsok hatásának visszafordítására és bizonyos betegségek (myasthenia gravis, glaucoma) kezelésére használják őket. Emellett kiemelkedő szereppel bírnak a KIR egyes betegségeihez (Alzheimer-kór, schizophrenia, autizmus, a demencia speciális formái) társuló kognitív tünetek (memória- és tanulási problémák) mérséklésében is. Az orvostudomány a viszonylaggyorsan (órák alatt) lebomló reverzibilis AChE inhibítorokat

használja

terápiás

céllal.

Leggyakoribb

képviselőik:

Neostigmin

(neromuszkuláris gátlószerként használt altató- és érzéstelenítőszerek hatásának visszafordítása, ritkábban myasthenia gravis terápiája), Physostigmin (glaucoma és antikolinerg drogok

8

túladagolásának kezelése). A koffein az AChE nem-kompetitív inhibítora, míg a tetrahidrokannabinol az AChE kompetitív inhibítora. Az AChE irreverzibilis gátlószerei izombénulást, zavartságot, légzési nehézséget, kritikus esetben pedig fulladás miatt bekövetkező halált okozhatnak. Ezek a – főként szerves foszfátészter típusú – vegyületek javarészt rovarirtószerek (pl.: Malation, Paration) és vegyifegyverek (pl.: Sarin, Soman, Tabun, VX gáz) komponensei. 3.1.4. A kolinészteráz aktivitás meghatározásának klinikai jelentősége A PChE referencia tartománya humán minták esetében: 3500-8500 U/L. Napjainkban leggyakrabban két célt szolgál a kolinészterázok aktivitásának meghatározása: 1. Szerves foszfát-észter mérgezés (növényvédőszerek, harci gázok): akut mérgezés megállapítása illetve szerves foszfát vegyületeknek folyamatosan kitett személyek (pl.: mezőgazdasági és ipari dolgozók) követése. Expozíciót követően az AChE és PChE aktivitás 20%-kal történő esése semmilyen tünettel nem jár, 60%-kal történő csökkenés viszont súlyos tüneteket okoz. A PChE alkalmazásának egy speciális területe az idegrendszerre ható úgynevezett szerves foszfát-észter hatóanyagokkal történő mérgezés, mely során profilaktikus céllal adagolják az érintett egyéneknek az enzimet. 2. Szukcinilkolin érzékenység: az emberi populáció kb. 3%-a rendelkezik csökkent aktivitású PChE variánssal (genetikai polimorfizmusnak köszönhetően). Ezekben az egyénekben az általános izomrelaxánsként alkalmazott szukcinilkolin adása elnyújtott hatással járhat, mely fokozza a nemkívánatos posztoperatív események (légzési problémák, súlyos esetben halál) kockázatát. Olyan betegek esetében, akiknél korábban, illetve családjukban előfordult a szukcinilkolin adását követően légzési probléma, érdemes a beavatkozást megelőzően PChE aktivitás meghatározást végezni.

9

3.2. Monoamin neurotranszmitterek A monoamin neurotranszmitterek aromás gyűrűt, valamint ahhoz két szénatomos láncon (-CH2-CH2-) keresztül kapcsolódó amino csoportot tartalmazó vegyületek, melyek aromás aminosavakból

(fenilalanin,

tirozin,

triptofán)

és

tiroid

hormonokból

keletkeznek

dekarboxilációval. A monoaminerg idegi hálózatok kulcsszerepet játszanak a kognitív folyamatok (pl.: érzelmek), az ébrenlét és a memória bizonyos formáinak folyamatában. A monoamin rendszert befolyásoló hatóanyagok sikeresen használhatóak a különféle pszichiátria betegségek (pl.: depresszió, szorongás, schizophrenia) kezelésében. A klasszikus monoamin neurotranszmitterek közé tartozik a hisztamin, a katekolaminok (adrenalin és noradrenalin, dopamin) és a triptaminok (szerotonin, melatonin). A sejtekben keletkező monoamin ingerületátvivő anyagok szekréciójáért specifikus monoamin transzporterek a felelősek, míg a szinaptikus résből történő eltávolításuk döntően visszavétellel (a visszavett monoaminok vezikulumokban raktározódnak

és

újrahasznosulnak)

vagy

monoamin-oxidázok (MAO) általi

5. ábra: Monoamin-oxidáz reakció

lebontással történik.

3.2.1. Monoamin-oxidázok Az oxidoreduktázok közé tartozó monoamin-oxidázok a külső mitokondriális membránhoz kapcsolódó flavoproteinek, melyek monoaminok oxidatív dezaminációját katalizálják. Az amin csoport eltávolításához molekuláris oxigént használnak fel, a reakció végterméke ammónia és a monoaminból származó aldehid (5. ábra). Az emberi szervezetben két típusuk van jelen: a MAO-A és a MAO-B (4. táblázat). Míg a MAO-A leginkább szerotonint, dopamint, norad-renalint és tiramint bont le, addig a MAO-B elsősorban a dopamin metabolizmusában játszik szerepet.

10

MONOAMIN-OXIDÁZ A (MAO-A) SZÖVETI EXPRESSZIÓ

FUNKCIÓ

SZUBSZTRÁT SPECIFICITÁS

MONOAMIN-OXIDÁZ B (MAO-B)

 neuronok, asztroglia

 neuronok, asztroglia

 máj, tüdő érfali endotélium, tápcsatorna, placenta

 vérlemezkék

 táplálékkal felvett monoaminok lebontása  monoamin neurotranszmitterek inaktivációja

 monoamin neurotranszmitterek inaktivációja

 szerotonin, melatonin, adrenalin, noradrenalin

 benzilamin, fenetilamin

 egyenlő mértékben vesznek részt a dopamin, tiramin és triptamin lebontásában

4. táblázat: A monoamin-oxidázok fő jellemzői 3.2.2. A monoamin-oxidázok aktivitásának meghatározása A különféle aktivitásmérési módszerek közül a legelterjedtebbek a MAO reakcióban keletkező aldehid illetve hidrogén-peroxid (H2O2) mennyiségi meghatározásán alapuló technikák. A gyakorlat során az utóbbit alkalmazzuk. A meghatározás elvét az 6. ábra szemlélteti.

6. ábra: A MAO aktivitásának kolorimetriás meghatározása

A reakcióban szubsztrátként használt benzilamint a MAO benzaldehiddé alakítja. A folyamat során keletkező hidrogén-peroxid a 4-aminoantipirin (4-AA) peroxidáz általi oxidációjában hasznosul. A 4-AA oxidált származéka az ún. Trinder-reakcióban fenollal reagálva vörös színű terméket ad, melynek mennyisége fotometriás módszerrel meghatározható. A mintákban 11

jelenlévő kataláz képes a hidrogén-peroxidot vízzé bontani, ennek megakadályozására nátrium-azidot (kataláz inhibítor) adunk a reakcióelegyhez. 3.2.3. A monoamin-oxidázok jelentősége a klinikumban Míg a MAO-A genetikai defektusa szellemi visszamaradottsággal és viselkedési zavarokkal jár együtt, addig a MAO-B esetében – a vizelet megemelkedett fenetilamin tartalmát leszámítva – semmilyen fenotípusos abnormalitás nem figyelhető meg. A MAO-A genetikai polimorfizmusára irányuló vizsgálatok kimutatták, hogy a magasabb aktivitással rendelkező variánsok jelenléte major depressziós megbetegedésekkel és erőszakos viselkedéssel jár együtt. Az alacsonyabb MAO-A aktivitás viszont az autizmussal mutat kapcsolatot. MAO-B esetében egyes polimorf variánsok fokozzák a különféle pszichiátriai megbetegedések (pl.: depresszió, szenvedélybetegségek) kockázatát. A MAO-B agyban mért szintje Alzheimer- és Parkinson-kór esetében magasabb, illetve a korral fokozatosan emelkedik, mely felveti annak a lehetőségét, hogy a MAO-B szerepet játszik az idősebb korban jelentkező neurológiai betegségek és a normális szellemi hanyatlás kialakulásában. A profilaktikus céllal alkalmazott MAO-B inhibítorok öregedést lassító hatása élénk vita tárgyát képezik. A kétféle MAO szubsztrátspecificitásában mutatkozó különbségeket kihasználva a MAO-A inhibítorokat a depresszió, míg a MAO-B gátlószereit a Parkinson-kór terápiájában alkalmazzák sikeresen.

12