Peroxidáz és NADPH-oxidáz enzimek működésének vizsgálata
Doktori értekezés
Donkó Ágnes
Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola
Témavezető: Dr. Geiszt Miklós egyetemi docens Hivatalos bírálók:
Dr. Ifj. Gallyas Ferenc egyetemi docens, az MTA doktora Dr. Varga Gábor egyetemi tanár, az MTA doktora
Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Gyires Klára egyetemi tanár, az MTA doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Füst György egyetemi tanár, az MTA doktora Dr. Nusser Zoltán az MTA levelező tagja
Budapest 2010.
1. TARTALOMJEGYZÉK 2. RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK............................................................................................. 4 3. BEVEZETÉS .............................................................................................................. 8 3.1. A Duox-laktoperoxidáz antibakteriális rendszer működése és szerepe ......... 9 3.2. Reaktív oxigén származékok ............................................................................ 10 3.3. Reaktív oxigén származékok természetes forrásai a NADPH-oxidázok ...... 13 3.3.1. A Nox enzim család .................................................................................... 15 3.3.1.1. Nox2 ...................................................................................................... 15 3.3.1.2. Nox1 ...................................................................................................... 18 3.3.1.3. Nox3 ...................................................................................................... 20 3.3.1.4. Nox4 ...................................................................................................... 21 3.3.1.5. Nox5 ...................................................................................................... 21 3.3.2. A Duoxok ..................................................................................................... 22 3.3.2.1. A Duox gének és promóter régióik ..................................................... 22 3.3.2.2. A Duox enzimek szerkezete ................................................................ 23 3.3.2.2.1. A Duoxok peroxidáz-szerű doménje ........................................... 24 3.3.2.3. A Duoxok aktivitásának szabályozása ............................................... 27 3.3.2.3.1. Kalcium általi szabályozás ........................................................... 27 3.3.2.3.2. Duox érési- és más szabályozó faktorok ..................................... 28 3.3.2.3.3. A foszforiláció szabályozó szerepe .............................................. 29 3.3.2.3.4. Expresszió-szintű szabályozás ..................................................... 30 3.3.2.4. A Duoxok funkciói ............................................................................... 31 3.3.2.4.1. A Duoxok szerepe a pajzsmirigy-hormonok szintézisében ....... 31 3.3.2.4.2. A Duoxok szerepe az extracelluláris mátrix stabilizálásában .. 33 3.3.2.4.3. A Duoxok szerepe az immunvédekezésben ................................ 34 3.4. Emlős hem peroxidázok .................................................................................... 36 3.4.1. Mieloperoxidáz ........................................................................................... 36 3.4.2. Eozinofil peroxidáz ..................................................................................... 39 3.4.3. Tireoperoxidáz ............................................................................................ 39 3.4.4. Peroxidazin .................................................................................................. 40 3.4.5. Laktoperoxidáz ........................................................................................... 41 3.4.5.1. A laktoperoxidáz szerepe az immunvédekezésben ........................... 41 3.4.6. A ditirozinképzés a peroxidázok általános tulajdonsága ........................ 45 4. CÉLKITŰZÉSEK .................................................................................................... 46 5. MÓDSZEREK .......................................................................................................... 47 5.1. Felhasznált antitestek és anyagok .................................................................... 47 5.1.1. Poliklonális anti-PXDN antitest előállítása .............................................. 47 5.2. Nox4-et stabilan kifejező Freestyle 293F sejtvonal létrehozása .................... 48 5.2.1. Nox4 és peroxidazin mRNS kifejeződésének detektálása Northern blot módszerrel ............................................................................................................. 48 5.3. COS-7 sejtek tenyésztése és tranziens transzfekciója .................................... 49 5.4. Peroxidáz aktivitás mérése ............................................................................... 49 5.5. Urotél sejtek és Nox4-et kifejező FreeStyle 293F sejtvonal H2O2termelésének mérése ................................................................................................. 49 5.5.1. H2O2-mérés Amplex Red módszerrel ....................................................... 49 5.5.2. H2O2-mérés laktoperoxidáz-ditirozin módszerrel ................................... 50 5.6. Kísérletek humán vérplazmával ...................................................................... 50 5.6.1. Plazma preparálás ...................................................................................... 50
2
5.6.2. Plazmafehérjék keresztkötése laktoperoxidázzal .................................... 51 5.7. A ditirozin detektálása HPLC-MS módszerrel ............................................... 51 5.8. Western blot kísérletek ..................................................................................... 51 5.9. A Duox1 egértörzs genetikai jellemzői és visszakeresztezése C57BL/6 háttérre ...................................................................................................................... 52 5.10. Duox1 egerek genotipizálása .......................................................................... 52 5.10.1. Genomiális DNS izolálás egérfarokból ................................................... 52 5.10.2. Duox1 egerek genotípusának meghatározása PCR reakcióval ............ 53 5.11. RT-PCR kísérletek .......................................................................................... 54 5.12. Immunhisztokémia fagyasztott metszeteken ................................................ 55 5.13. Immunfluoreszcens festés és konfokális mikroszkópia ................................ 55 5.14. Primer egér urotélium sejtek preparálása .................................................... 56 5.15. Statisztikai analízis .......................................................................................... 56 6. EREDMÉNYEK ....................................................................................................... 58 6.1. Laktoperoxidáz-katalizálta ditirozinképzés .................................................... 58 6.1.1. A ditirozinképződés detektálása ................................................................ 58 6.1.2. A ditirozinképzés jellemzése ...................................................................... 60 6.1.3. A ditirozinképzés alkalmazása .................................................................. 63 6.1.3.1. Glükóz-oxidáz termelte H2O2 mérése ditirozinképződéssel............. 63 6.1.3.2. Nox4-termelte H2O2 mérése ditirozinképzéssel ................................ 64 6.1.4. A ditirozinképződés egy lehetséges funkciója .......................................... 66 6.2. A humán peroxidazin vizsgálata ...................................................................... 71 6.2.1. A peroxidazin peroxidáz-aktivitásának vizsgálata .................................. 71 6.2.2. A peroxidazin szöveti expressziójának vizsgálata ................................... 72 6.2.3. A peroxidazin sejten belüli lokalizációja .................................................. 73 6.3. A Duox1 enzim funkciójának vizsgálata Duox1 knockout egér segítségével 75 6.3.1. Primer egér urotél sejtek kalcium-indukálta H2O2-termelése ............... 75 6.3.2. A Duox1 mRNS detektálása az urotéliumban ......................................... 76 6.3.3. A Duox1 knockout egér jellemzése ........................................................... 76 6.3.4. A Duox1 immunhisztokémiai vizsgálata................................................... 78 6.3.5. A Duox1 KO urotéliumban károsodott a kalcium-indukált H2O2termelés .................................................................................................................. 79 6.3.6. A Duox1 H2O2-termelése kiváltható TRPV4 agonistával ....................... 80 7. MEGBESZÉLÉS ...................................................................................................... 82 8. KÖVETKEZTETÉSEK........................................................................................... 87 9. ÖSSZEFOGLALÁS ................................................................................................. 89 10. SUMMARY ............................................................................................................. 90 11. IRODALOMJEGYZÉK ........................................................................................ 91 12. AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ PUBLIKÁCIÓK ...................... 100 13. AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÉZIRAT ................................ 100 14. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁHOZ KAPCSOLÓDÓ EGYÉB PUBLIKÁCIÓ 100 15. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS .............................................................................. 101
3
2. RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK 293F: FreeStyle 293F humán embrionális vese sejtvonal 293F-Nox4: Nox4-et stabilan expresszáló FreeStyle 293F sejtvonal ASL: légúti nyálkaréteg ATF2: aktiváló transzkripciós faktor 2 Caco2: humán epitéliális kolorektális adenokarcinóma sejtek cAMP: ciklikus adenozin monofoszfát CF: cisztás fibrózis CFTR: cisztás fibrózis transzmembrán konduktancia regulátor CGD: krónikus granulomatózis betegség CHO: kínai hörcsög ovárium sejtvonal COS-7: immortalizált afrikai zöld majom vese sejtvonal C-terminális: karboxil-terminális CYBA: p22phox-ot kódoló gén CYBB: gp91phox-ot kódoló gén DAG: diacil-glicerin DNS: dezoxiribonukleinsav DPI: difenil-jodónium Duox: kettős oxidáz (dual oxidase) EF-hand: kalcium-kötő motívum EPO: eozinofil peroxidáz ER: endoplazmatikus retikulum ERK: extracelluláris jel által regulált kináz FAD: flavin-adenin-dinukleotid fMLP: N-formil-L-metionil-L-leucil-L-fenilalanin G418: Geneticin antibiotikum GDP: guanozin-difoszfát GSH: redukált glutation GSSG: oxidált glutation GTP: guanozin-trifoszfát HEK 293: humán embrionális vese sejtvonal HOCl: hipoklórossav
4
HPLC: nagy teljesítményű folyadékromatográfia HT29: humán bél epitéliális sejtek IFNγ: interferon-gamma IL: interleukin IP3: inozitol-3,4,5-triszfoszfát JAK: Janus kináz LPO: laktoperoxidáz LPS: lipopoliszacharid, endotoxin LRR: leucin-gazdag régió MEKK1: mitogén-aktivált protein-kináz kináz kináz-1 MKK3: MAP kináz kináz-3 MPO: mieloperoxidáz mRNS: hírvivő RNS MS: tömegspektrometria MyD88: mieloid differenciációs faktor 88 NADH: redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid NADPH: redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát NF-κB: nukleáris faktor κB NHBE: humán bronchiális epitél sejtek NIH-3T3: egér embrionális fibroblaszt sejtvonal NO: nitrogén-monoxid Nox: NADPH-oxidáz Noxa1: Nox aktivátor 1 Noxo1: Nox szabályozó 1 N-terminális: amino-terminális O2•−: szuperoxid OSCN−: hipotiocianát p38 MAPK: p38 mitogén-aktivált protein-kináz PAMP: patogénhez asszociált molekuláris mintázat PB1: Phox és Bem1 domén PBS: foszfát-pufferelt sóoldat PDI: protein diszulfid izomeráz
5
PI(3,4)P2: foszfatidilinozitol-3,4-biszfoszfát PI(4)P: foszfatidilinozitol -4'-monofoszfát PKA: protein-kináz A PKC: protein-kináz C PLCß: foszfolipáz Cß PMA: forbol-mirisztoil-acetát PMN: polimorfonukleáris sejtek PRR: prolin-gazdag régió PX: Phox homológia domén PXDN/VPO1: peroxidazin RhoGDI: Rho GDP-disszociáció inhibítor RNS: ribonukleinsav RNSi: RNS interferencia ROS: reaktív oxigén származékok SCN−: tiocianát-ion SDS: nátrium dodecil-szulfát Sf9: Spodoptera frugiperda rovar bélhámsejt SH3: Src homológia 3 domén siRNS: specifikus kis interferáló RNS SME: szolubilis mikrobiális extraktum SOD: szuperoxid-dizmutáz SSC: nátrium-citrátos sóoldat STAT: Signal Transducer and Activator of Transcription T3: trijód-tironin T4: tiroxin TBE: humán tracheobronchiális epitél sejtek TGF-ß1: transzformáló növekedési faktor-ß1 TLR: toll-like receptor TM: transzmembrán domén TPO: tireoperoxidáz TRP: tetratrikopeptid régió TRPV4: tranziens receptor potenciál vanilloid 4 csatorna
6
TSH: pajzsmirigy-stimuláló hormon Udx1: tengerisün Duox1 VPO1/PXDN: vaszkuláris peroxidáz
7
3. BEVEZETÉS A
reaktív
oxigén
származékokat
(ROS),
köztük
az
oxigén
eredetű
szabadgyököket sokáig, mint szervezetünk káros molekuláit tartották számon, melyek felelősek többek között, az öregedésért, vagy számos daganatos és neurodegeneratív betegség kialakulásáért. Az utóbbi néhány évtized kutatásainak eredményeképpen, azonban kiderült, hogy a ROS szervezetünkben több fiziológiás folyamatban is részt vesznek, például az immunvédekezésben, a hormonszintézisben és különféle jelátviteli útvonalakban. A fiziológiás ROS termelés megváltozása például immunhiányos állapotot, hipotireózist vagy szív- és érrendszeri megbetegedéseket okozhat. Az emberi szervezetben a ROS-oknak számos forrása lehet, melyek közül egyik legismertebb a mitokondrium, ahol a szuperoxid (O2•−) a légzési lánc melléktermékeként keletkezik. Emlős sejtekben a szabályozott ROS termelésre az első példa a fagocita sejtek ún. oxidatív robbanása volt, melyért a fagocitákban kifejeződő nikotinamid-dinukleotidfoszfát-oxidáz (NADPH-oxidáz) felelős. Az utóbbi néhány évben, különféle szövetekben több a fagocita-oxidázzal homológ enzimet fedeztek fel, melyeket ma a NADPH-oxidázok Nox enzimcsaládjaként ismerünk. A NADPH-oxidázok funkciója a szabályozott ROS termelés. Az emlős peroxidázok, olyan hem tartalmú enzimek, melyek a NADPHoxidázok által termelt hidrogén-peroxidot (H2O2) felhasználva, különböző oxidált vegyületeket képeznek. A peroxidázok és NADPH-oxidázok szervezetünkben különböző folyamatokban működnek együtt, például az immunvédekezésben és a pajzsmirigyhormon szintézisében. Az emlős peroxidáz enzimek közös tulajdonsága, hogy tirozin aminosavak keresztkötésével
ditirozin-kötések
kialakítására
képesek,
melynek
funkciója
alacsonyabb rendű élőlényekben az extracelluláris mátrix (ECM) stabilizálása. A peroxidáz enzimek ditirozin képző aktivitásának funkcióját magasabb rendű élőlényekben még nem vizsgálták. A laktoperoxidáz (LPO) egy könnyben, nyálban, tejben és különféle nyálkahártya szekrétumokban kifejeződő peroxidáz, melynek fő funkciója a nyálkahártyák védelme a nyálkahártyán megtapadó kórokozókkal szemben. A LPO
8
ditirozinképző aktivitásának funkcióját még nem vizsgálták, ezért doktori munkám során a LPO ditirozinképzését jellemeztem. Az emlős peroxidázok családjának további tagja a peroxidazin (PXDN). Szerkezete alapján a peroxidazin egyesíti a peroxidázok és az ECM fehérjék tulajdonságait. A PXDN-t elsőként Drosophila-ban írták le, ahol mRNS-e már az embriógenezis korai szakaszában megjelenik. A Drosophila PXDN egy aktív peroxidáz, mely
rendelkezik
ditirozinképző
aktivitással,
aminek
feltehetően
az
ECM
megszilárdításában van szerepe, például a rovar szárnyának a fejlődése során. A humán PXDN-ról még nagyon keveset tudunk, funkciója nem ismert, expresszióját illetően ellentmondásos közlemények jelentek meg. Mivel a humán peroxidazin enzimről nem volt ismert, hogy a többi peroxidázhoz hasonlóan rendelkezik-e peroxidáz aktivitással és ditirozinképző aktivitással, dolgozatomban ezt is vizsgáltam. A NADPH-oxidázok családjába tartozó Duox enzimek, a NADPH-oxidáz homológ doménjük mellett, szintén tartalmaznak egy extracelluláris, peroxidáz homológ domént. A C. elegans Duox enzimmel ellentétben, a humán Duox1 peroxidáz doménje, heterológ expressziós rendszerben kifejezve nem rendelkezik ditirozinképző aktivitással. A Duox1 és Duox2 enzimeket elsőként a pajzsmirigyben azonosították, ahol az általuk termelt H2O2-ot a tireoperoxidáz (TPO) pajzsmirigyhormonok szintéziséhez használja. A Duox2 enzim mutációja már heterozigóta formában is részleges, homozigóta formában pedig súlyos hipotireózist okoz. Pajzsmirigyben a Duox1 és Duox2 elkülönült funkciójára utal, hogy Duox1 mutációra visszavezethető hipotireózist még nem írtak le, valamint, hogy a Duox1 enzim nem képes kompenzálni a Duox2 funkcióvesztését. Dolgozatomban a Duox1 enzim funkcióját is vizsgálom. 3.1. A Duox-laktoperoxidáz antibakteriális rendszer működése és szerepe A könnyben, nyálban, tejben és különféle nyálkahártya-szekrétumokban található LPO H2O2-ot felhasználva, különböző oxidált vegyületeket képez. Ezek között különösen jelentős a hipotiocianát (OSCN-), mely a baktériumok, vírusok és gombák ellen is hatásos vegyület. Bár a LPO alapú antibakteriális rendszert már 1966-ban jellemezték (1), a folyamathoz nélkülözhetetlen H2O2-forrás felfedezése még sokáig
9
váratott magára. A megoldást az egyre bővülő NADPH-oxidáz enzimcsalád tagjainak felfedezése hozta, melynek Dual oxidase (Duox) homológjai H2O2-termelésre képesek. A humán Duox1 és Duox2 NADPH-oxidáz enzimeket 1999-ben klónozták meg pajzsmirigyből (2, 3). A pajzsmirigyben a Duoxok által termelt H2O2-ot a TPO enzim jodid-ionok oxidálására fordítja, mely esszenciális lépése a pajzsmirigy-hormonok szintézisének. A Duox enzimek expressziója azonban nem korlátozódik a pajzsmirigyre, hírvivő RNS-ét számos más szövetben is detektálták. A Duox1 megtalálható hasnyálmirigyben, méhlepényben, prosztatában, herében, tüdőben és a légutakban, a Duox2 pedig szintén a légutakban, valamint a gasztrointesztinális rendszer mentén, a nyálmirigyben, gyomorban, patkóbélben, vastagbélben és a végbélben (3-8). A Duox és TPO pajzsmirigyben való együttműködésének analógiájára Geiszt és munkatársai a légutakban leírtak egy hasonló együttműködést, melyben a LPO a Duox által termelt H2O2-ot használja fel az antimikrobiális hatású OSCN− képzéséhez (5). Ez a felfedezés a Duox-LPO-SCN− antibakteriális rendszer átfogó kutatásainak megindulásához vezetett. 3.2. Reaktív oxigén származékok A reaktív oxigén származékok, olyan oxigén eredetű kis molekulák és vegyületek, melyek nagy reaktivitásuknak köszönhetően más molekulákkal gyorsan reakcióba lépnek. Lehetnek, ún. oxigén gyökök, mint pl. a O2•−, a hidroxil-gyök (•OH), a peroxil-gyök (RO2•) és az alkoxil-gyök (RO•), de lehetnek olyan nem gyök természetű vegyületek is, amelyek erős oxidáló tulajdonsággal rendelkeznek vagy önmaguk könnyen szabadgyökké alakulnak, mint például a hipoklórossav (HOCl), az ózon (O3), a szinglet oxigén (1O2) és a hidrogén-peroxid (H2O2) (9). A nitrogén tartalmú oxigén származékokat,
mint
például
a
nitrogén-monoxid
(NO)
reaktív
nitrogén
származékoknak (RNS: NO•, NO2•, N2O3, HNO2, ONOOCO2−, ONOO−) nevezzük (10). A reaktív oxigén származékok keletkezése a szervezetben kaszkádszerűen megy végbe, ahol a biológiai folyamatok során elsőként szuperoxid keletkezik, ami alacsony pH-n spontán, vagy szuperoxid-dizmutáz (SOD) hatására enzimatikusan alakul át H2O2-á, NO-dal reagálva pedig peroxinitritet (ONOO−) képez. Az 1. ábra a reaktív oxigén is nitrogén származékok képződését mutatja.
10
1. ábra: Reaktív oxigén és reaktív nitrogén származékok képződése a szervezetben (10).
A sejtekben keletkezett reaktív oxigén származékok nagyon gyorsan reagálnak különböző szervetlen és szerves vegyületekkel, melyeknek ezzel megváltoztathatják, vagy megszüntethetik a fiziológiás funkcióját. Ezek a rövid életű reaktív molekulák felelősek az aspecifikus molekuláris sérülések kialakulásáért, mint például a DNSmutáció, lipid-peroxidáció vagy a fehérjék és szénhidrátok oxidációja, ami alapján a reaktív oxigén származékokat az öregedés egyik fő kiváltó okának tartják. Emlős szervezetben a szuperoxid legnagyobb mennyiségben a mitokondriális légzési lánc működése során melléktermékként keletkezik, de a ROS eliminálásra számos mechanizmus áll rendelkezésre. A keletkezett szuperoxidot a szuperoxiddiszmutázok (SOD1 mitokondriális mátrixban, SOD2 citoszolban) H2O2-á redukálják, amit a kataláz tovább bonthat vízre és oxigénre, vagy a glutation peroxidázok vízre és redukált glutationra (GSH). A keletkezett szuperoxidot semlegesíthetik még a peroxiredoxinok, a citokróm-oxidázok, vagy közvetlenül reagálhat oxidált citokróm cvel (11). Más, jelentős sejten belüli ROS forrás a citokróm P-450 enzim és a
11
peroxixóma, melyben a zsírsavak β-oxidációja és a flavin-oxidázok működése során keletkeznek a szabadgyökök (12).
2. ábra: ROS keletkezése és lebontása a sejtben. GPX, glutation peroxidáz; GR, glutation reduktáz; GRXo, glutaredoxin (oxidált); GRXr, glutaredoxin (redukált); GSHr, glutation (redukált); GSSG, glutation (oxidált); TRXo, tioredoxin (oxidált); TRXr, tioredoxin (redukált); XO, xantin oxidáz. (13)
A reaktív oxigén származékok szabályozott termelésére az első példa a fagocita sejtek működése során kialakuló un. oxidatív robbanás volt, melyet a membránban elhelyezkedő NADPH-oxidáz generál (14). A reakcióban O2•− keletkezik, melyet a fagocitózisra képes sejtek, mint pl. a neutrofil granulociták a bekebelezett baktérium elpusztítására fordítanak. A folyamat jelentőségét jelzi, hogy számos mutáció, amely a fagocita membránjában elhelyezkedő NADPH-oxidáz enzimkomplex funkcióvesztését eredményezi, egy súlyos, visszatérő bakteriális fertőzésekkel járó betegséget, a krónikus granulomatózist (CGD: chronic granulomatous disease) okozza (15, 16). A
12
granulomatózisban szenvedő betegekből származó polimorfonukleáris (PMN) sejtekben a fagocitózis, a kemotaxis és a degranuláció alapvetően megtartott, de leukocitáik képtelenek az ún. oxidatív robbanásra és a baktériumölésre (17-19). Nem mitokondriális eredetű reaktív oxigén származékokat számos szövetben megfigyeltek, amiből arra következtettek, hogy a szigorúan szabályozott ROS termelés nem egyedülálló tulajdonsága a fagocita sejteknek. A humán genom projekt befejezésével lehetőség nyílt a szekvencia-adatbázisokban való kutatásokra, mely végül a fagocita NADPH-oxidáz homológjainak, a Nox enzimcsalád tagjainak a felfedezéséhez vezetett. 3.3. Reaktív oxigén származékok természetes forrásai a NADPH-oxidázok Az elsőként a fagocita sejtekben leírt NADPH-oxidáznak, amit gp91phox-nak és Nox2-nek is nevezünk, ma 6 homológja ismert: Nox1, Nox3, Nox4, Nox5, Duox1 és Duox2 (20). Közös tulajdonságuk, hogy a membránon keresztül egy elektront transzportálnak, mely végül molekuláris oxigénre kerül, ezáltal O2•− képződik. Ennek a közös enzimaktivitásnak megfelelően konzervált struktúrális elemek is felfedezhetők, melyek általánosan jellemzőek a Nox enzimcsaládra (3. ábra). A C-terminális végükön található egy NADPH-kötő hely, ezt követi egy FAD-kötő hely, majd 6 konzervált transzmembrán (TM) régió következik. A TM szegmensekben található 4 konzervált hisztidin, melyekből kettő a 3. és kettő az 5. TM régióban helyezkedik el. A Duox enzimek ezeken a konzervált régiókon kívül tartalmaznak még egy TM régiót, ezért bennük a konzervált hisztidinek a 4. és 6. TM régiókban találhatók. A Duoxokban továbbá található egy extracelluláris peroxidáz-homológ régió, valamint az első és a második TM régió között elhelyezkedő intracelluláris hurkon 2 db „EF hand” motívum, melyek Ca2+-kötésre képesek. A Duoxokhoz hasonlóan a Nox5 inracelluláris Nterminális részén „EF hand” motívumokat tartalmaz.
13
FAD
FAD
FAD
3. ábra: A NADPH oxidázok Nox családjának szerkezete és elhelyezkedése a membránban. Minden Nox/Duox tartalmaz 6 TM régiót, 2 hemet és NADPH- és FAD-kötő konzervált régiókat. Ezeken az általános szerkezeti hasonlóságokon kívül a Nox5 az Nterminális részén tartalmaz 4 db Ca2+-kötő motívumot, a Duoxok pedig egy extra TM régiót, egy peroxidáz-szerű domént és két Ca2+-kötő domént (20).
Az enzim aktiválódásakor az elektron a NADPH-ról a FAD-ra, majd a TM régiókban kötött két hem molekulán keresztül az extracelluláris térbe vagy a fagoszómába kerül, ahol a végső elektron akceptor a molekuláris oxigén
14
(O2 + e− → O2•−), melyből a folyamat eredményeképpen redukcióval szuperoxid-anion keletkezik. Evolúciós kapcsolatuk alapján a Nox enzimcsaládot 3 alcsoportra lehet felosztani (4. ábra). A gp91phox alcsoportba tartoznak a Nox1, Nox2, Nox3 és a Nox4 enzimek, melyek mindegyike egy kb. 65 kDa-os fehérje. A második csoportba a Duox enzimek tartoznak, melyek 180 kDa-os molekulasúlyukkal kb. háromszor akkorák, mint a gp91phox. A harmadik csoportot, eddig mindössze egy taggal a humán Nox5 alkotja, ami a legtávolabbi rokona a gp91phox enzimnek (21).
4. ábra: A Nox enzimcsalád filogenetikai családfája. A Nox enzimek családját három alcsoportra lehet osztani. Az első alcsoportot a Nox1, Nox2, Nox3 és Nox4 enzimek, a másodikat a Duox enzimek alkotják. A gp91phox legtávolabbi rokona a 3. csoportba tartozó Nox5 enzim (21).
3.3.1. A Nox enzim család
3.3.1.1. Nox2 1978-ban fedezték fel, hogy CGD-ben szenvedő betegek leukocitáiból hiányzik a citokróm b558 heterodimer fehérje (22, 23). Az 1980-as évek végén két munkacsoport párhuzamosan klónozta meg a citokróm b558 dimerből az aktivitásért felelős gp91phox alegységet (CYBB), amit a mai Nox nomenklatúra szerint Nox2-nek nevezünk. A PMN sejtekben kifejeződő Nox2 egy erősen glikozilált ~70-90 kDa molekulasúlyú fehérje,
15
melynek molekulasúlya endoglikozidáz-F emésztés után 55 kDa-ra csökken (24). Mutagenezis kísérletekben a 2. és 3. extracelluláris hurkokban találták a glikozilálódó aszparaginokat (132Asn, 149Asn, 240Asn) (25, 26). A Nox2 expressziója rendkívül széleskörű. Fagocita sejteken (neutrofilek, eozinofilek,
monociták,
kardiomiocitákban,
makrofágok)
harántcsíkolt
kívül,
izomban,
a
Nox2
fehérjét
hepatocitákban,
neuronokban,
endothel
sejtekben,
fibroblasztokban és hemopoetikus őssejtekben detektálták (10). Neutrofil granulumaiban
granulocitában a Nox2 elsősorban a primer és szekunder található,
melyek
aktivációkor
fuzionálnak
a
fagoszómákkal.
Fagocitózis során az oxidáz aktivációja Fc- vagy komplement-receptorok hatására történik. Kísérletes körülmények között a sejtek aktivációja kiváltható például opszonizált zimozannal, bakteriális peptidekkel, például fMLP-vel (N-formil-Lmetionil-L-leucil-L-fenilalanin) vagy PMA-val (forbol-mirisztil-acetát) (10). A Nox2 a membránban, a citokróm b558 heterodimer kis alegységével, a p22phox (22 kDa, CYBA) fehérjével kapcsolódik. A p22phox-ot kódoló gén emberben a 16-os kromoszómán található. A p22phox két TM régiót tartalmazó, glikozilált fehérje, melynek az N- és a C-terminális vége is a citoplazma felé néz (26). A p22phox mRNS mind magzati, mind felnőtt szövetekben (27), valamint különféle sejtvonalakban is kifejeződik (28). Fontos kiemelni, hogy a Nox2 és p22phox dimer élettani körülmények között önmagában nem termel szuperoxidot. A fagocita aktivációja során a p47phox, p67phox, p40phox és Rac citoszolikus fehérjék a membránhoz transzlokálódnak és ennek hatására elindul a szuperoxid-termelés (5. ábra).
16
5. ábra: A Nox2-aktiválódás mechanizmusa. Nyugalomban a Nox2 és a p22phox intracelluláris vezikulák membránjában, míg a p47phox, p67phox, p40phox fehérjék összekapcsolódva a citoplazmában találhatók. Aktivációkor a citoszolikus alegységek a membránban lévő flavocitokrómhoz kötődnek. Ezeken túl szükséges, hogy a RhoGDI (Rho GDP-disszociáció inhibítor) disszociáljon a RacGDP-ről, ami ezután GTP-t köt és a membrán-komplexhez kapcsolódik. A komplex összeállása után elindul a szuperoxid-termelés (10).
A p47phox a Nox2 citoszolikus szabályozó fehérjéje, újabban Nox organizer 2nek (Noxo2) is nevezik. Számos fehérje-fehérje interakcióért felelős régiót tartalmaz. Az N-terminális végről kezdve található egy PX (phox) domén, két SH3 (Scr homológ 3) régió, egy autoinhibícióért felelős, bázikus aminosavakat és foszforilációs helyeket tartalmazó szakasz, majd a C-terminális végen egy prolin gazdag régió (PRR). A phoxdoméneket (PX) elsőként a fagocita oxidáz p47phox és p40phox fehérjékben azonosították (29). A PMN aktiválódásakor az autoinhibíciós régióban szerinek foszforilálódnak, ami konformáció-változáshoz vezet és az így szabaddá váló SH3-régió a membránban a p22phox PRR-doménjéhez köt (30, 31). A konformáció-változás során szabaddá váló PX-domén PXXP-motívuma a membránban lévő PI(4)P és PI(3,4)P2 foszfolipidekhez köt (32). A p47phox 2. SH3-régiójával a p67phox PRR-motívumához köt, ezzel a p67phox-ot is a membránhoz szállítja. A p67phox a komplex
aktivátora, mely tartalmaz
négy N-terminális
tetratrikopeptid régiót (TPR), egy konzervált aktivációs domént, egy PRR-régiót egy kevésbé konzervált PB1-domént (Phox és Bem1), melyet két C-terminális SH3 domén
17
fog közre (26). Az aktivációs doménen (199-210 aminosavak) keresztül közvetlenül kapcsolódik a gp91phox fehérjéhez, ami nélkülözhetetlen az aktivációhoz, mert feltehetően az elektron NADPH-ról FAD-ra kerülését katalizálja (33). A p67phox Nterminális TPR-jein keresztül Rac kis G fehérjéhez, PB1-doménjén keresztül pedig a p40phox PX-motívumhoz kötődik (34). C-terminális részén ERK2 és p38MAPK foszforilációs helyeket azonosítottak, azonban ennek jelentősége még nem ismert (35). Az oxidáz működéséhez a RacGTP kötése is szükséges. Humán monocitákban és makrofágokban a Rac1-et, neutrofilekben pedig a Rac2-őt találták az oxidáz komplexben, de in vitro sejtlizátumon végzett kísérletekben mindkettő jól működött. A Rac membránhoz kötéséhez nélkülözhetetlen a C-terminális végének preniláltsága (26).
3.3.1.2. Nox1 Az elsőként azonosított gp91phox-homológ a Nox1 volt, amit eredetileg mox1-nek (mitogenic oxidase) és NOH-1-nek is neveztek (36). A Nox1 gén az X-kromoszómán található, a fehérje 564 aminosavból áll és 56 %-ban azonos a Nox2vel. A Nox1 mRNS legnagyobb mennyiségben a vastagbélben expresszálódik, ezért colon oxidáznak is nevezik. A Nox1 megtalálható még érfal simaizomban, endothel sejtekben, méhben, méhlepényben, prosztatában, oszteoklasztokban, retina pericitákban, valamint Caco-2 colon tumor, DLD-1 és HT-29 sejtvonalakban (26). A Nox1 működéséhez citoszolikus Noxo1 (Nox organizer1) és Noxa1 (Nox activator1) szükséges (37). A humán p47phox- és p67phox-homológokat Geiszt és munkatársai azonosították, melyeket molekulasúlyuk alapján a p41phox és p51phox nevet kapták, a jelenlegi irodalomban azonban, a funkciójukat jobban leíró Noxo1 és Noxa1 elnevezés terjedt el. Domén szerkezetükben nagyon hasonlítanak a p47phox és p67phox fehérjékhez (6. ábra) (38).
18
A
B mNoxa1
Noxo1
hNoxa1
6. ábra: A Noxo1 és Noxa1 Nox1 szabályozó és aktivátor fehérjék szerkezete. A: A
humán Noxo1 domén szerkezete azonos a p47phox-al (PX, 2 db SH3, PR), de az
autokatalitikus régiót nem tartalmazza. B: Az egér és humán Noxa1 fehérjék szerkezetileg hasonlóak a humán p67phox-hoz (TRP, AD, PB1), azonban mindkét homológból hiányzik a központi SH3 domén (38).
A Noxo1 vastagbélben és más gasztrointesztinális szövetekben, míg a Noxa1 a vastagbélen kívül nagy mennyiségen található méhben és nyálmirigyben, kisebb mértékben pedig gyomorban, vékonybélben, tüdőben és a pajzsmirigyben (38). A Nox1 szuperoxid-termeléséhez szintén szükséges a p22phox (39), valamint a Rac1 GTP kötött formája (40). A Nox1 funkciója jelenleg nem ismert, de expressziós mintázata és nagyfokú szerkezeti hasonlósága a Nox2-vel valószínűsíti, hogy a kolonban a fagocita-oxidázhoz hasonlóan az antibakteriális védekezésben és a nyálkahártya homeosztázisának fenntartásában van szerepe (7. ábra) (41).
7. ábra: A Nox1 oxidáz-komplex szerkezete. A Nox1 szuperoxid-termeléséhez szükséges a p22phox membránfehérje, továbbá citoszolikus komponensek, a Noxa1, Noxo1 és a Rac (41).
A bélnyálkahártya-immunitásban betöltött funkciót valószínűsíti, hogy Caco2 és HT29 sejtekben interferon-gamma (IFNγ), tengerimalac bélhámsejtjeiben pedig
19
H. pylori lipopoliszacharid (LPS) stimulálta a Nox1-expressziót, valamint, hogy vastagbél epitél-sejtekben Salmonella enteritidis flagellin fokozta a Nox1-függő szuperoxid-termelést (40, 42-44). Nox1 génhiányos és transzgenikus egereken végzett kísérletek alapján, a Nox1nek szerepe van a vérnyomás szabályozásában, valamit az angiotenzin II-indukálta magas vérnyomás hatására kialakuló aortafal-hipertrófiában (45-47).
3.3.1.3. Nox3 A Nox3 568 aminosavból áll, aminosav szekvenciája 58 %-ban azonos a Nox2-vel (48). Emberben a Nox3 a 6-os kromoszómán található. A Nox3 mRNS-ét kezdetben felnőtt szövetekben nem, csak fetális tüdőben, májban, vesében és lépben tudták kimutatni (27, 48). Később egy egyensúly-érzékelési zavarban szenvedő egértörzs vizsgálata során kifejlett egerekben a belső fülben detektálták. Az egér a vesztibuláris rendszer funkcióképtelensége miatt, a vad típustól eltérően úszás közben elmerül, a fejét pedig kissé megdöntve tartja, amiről a „haed tilt” (het) elnevezést kapta. A het egér vizsgálata során kiderült, hogy az egér belső fülének utriculus és sacculus üregeiből hiányoznak az otolit kristályok, melyek a test lineáris gyorsulását közvetítik a sztereocilium felé (49). A Nox3 aktivitás p22phox-függését igazolja, hogy a p22phox fehérjét kódoló CYBA gén mutációt hordozó egér szintén egyensúlyérzékelési zavarokban szenved (50). Egérben a Noxo1 szabályozó szerepére genetikai bizonyítékot, a szintén súlyos egyensúlyzavarokkal küzdő hslt (head slant) egér törzs adott, amelyben egy frameshift mutáció a 349 aminosavból álló Noxo1-ből egy csonka 34 aminosavból álló fehérjét eredményez (51). Heterológ expressziós rendszerben végzet kísérletben a Rac1 szintén fokozta a Nox3 aktivitását (40). A Nox3 által termelt szuperoxid hozzájárulása az otolit kristályok képződéséhez ismeretlen. Egy lehetséges elmélet szerint a termelt szuperoxid, valamilyen peroxidázfüggő
reakcióban
az
exracelluláris
mátrix
fehérjéinek
ditirozinon
keresztüli
összekapcsolására szolgálna. A reakcióban keletkezett fehérje-komplexek vázként funkcionálnak a kalcium-karbonát tartalmú otokonia kristályok képződéséhez.
20
3.3.1.4. Nox4 A Nox4-et kezdetben vese oxidáznak (renal oxidase, Renox) nevezték, mivel legnagyobb mennyiségben a vesében található (52, 53). A Nox4 egy 578 aminosavból álló membránfehérje, 39 %-ban homológ a Nox2-vel. A Nox4 konstitutívan aktív, amihez a p22phox és néhány endogénen expresszáló sejtben a Rac1 is szükséges (26). Egérben in situ hibridizációval a Nox4 mRNS-t nagy mennyiségben detektálták a vese kéregben és a proximális tubulusok epitél sejtjeiben. Humán vesében Geiszt és munkatársai a vesevelő gyűjtőcsatornáiban és a vese papillák epitéliumában, míg mások a disztális tubulusokban detektálták (53). Patkányban vese mezangiális sejtekben találták (54). A Nox4 mRNS kisebb mértékben megtalálható fetális májban, ér endothelben, simaizomsejtekben, oszteoklasztokban, hemopoetikus őssejtekben és adipocitákban. Nagymértékű
vese-expressziója
alapján
azt
feltételezték,
hogy
az
oxigénérzékelésben és az eritropoetin-szintézis szabályozásában van szerepe, de ezt még nem sikerült igazolni (20). A Nox4 ér endothelben a domináns NADPH-oxidáz, így az általa termelt O2•− szerepet játszhat a kardiovaszkuláris szabályozásban és az érelmeszesedés kialakulásában (20). Tüdőben a Nox4 által termelt szuperoxid szükséges a TGF-β1-indukálta fibroblaszt-miofibroblaszt átalakuláshoz és az extracelluláris mátrix szintézishez (55). A Nox4-et egér embrionális fibroblasztokban (NIH 3T3) kifejezve szuperoxid-termelést, míg humán embrionális vese (HEK293) sejtvonalban H2O2termelést detektáltak (20).
3.3.1.5. Nox5 A Nox5 egy 565 aminosavból álló fehérje, ami 27 %-ban azonos a Nox2-vel (27). Bánfi és mtsai 4 db 565 as-nál nagyobb Nox5-homológot (α, β, γ és δ) azonosítottak, amelyek az N-terminális intracelluláris hurkon négy darab kalciumkötőmotívumot tartalmaznak (56). A Nox5 kifejeződik petefészekben, placentában, méhben, hasnyálmirigyben, csontvelőben, érfal simaizomban, magzati szövetekben, herében, valamint a lép és nyirokcsomók T- és B-limfocitákban gazdag részeiben. Fontos megjegyezni, hogy a Nox5 egér és patkány genomjában nem található, továbbá pontos
21
élettani szerepe sem ismert (20). Aktivitását a kalcium közvetlenül szabályozza. Kalcium kötéskor az „EF hand” motívumokat tartalmazó rész konformáció-változáson megy keresztül, melynek hatására az N- és C-terminális részek között intramolekuláris kapcsolat jön létre, ami az oxidáz aktiválódásához vezet (57).
3.3.2. A Duoxok 3.3.2.1. A Duox gének és promóter régióik A Duox enzimeket először a pajzsmirigyben azonosították, ezért kezdetben a Thox1 (Thyroid oxidase1) és Thox2 (Thyroid oxidase2) elnevezést kapták (2, 3). Edens, aki az enzimek Caenorhabditis elegans homológját jellemezte, javasolta a Duox (Dual oxidase) elnevezést a fehérje szerkezetére utalva (lásd. 8. ábrán) (4). A humán Duox gének a 15. kromoszóma hosszú karján találhatók (15q15.3), ahol egymástól 16 kb távolságra fej-fej orientációban helyezkednek el. A humán Duox1 gén hozzávetőlegesen 36 kb nagyságú, 35 exonból áll és egy 1551 aminosavból álló fehérjét kódol. A Duox2 gén 22 kb nagyságú, 34 exont tartalmaz, és róla egy 1548 aminosavat tartalmazó fehérje képződik. A Duox1 és Duox2 aminosav szekvenciája 83 %-ban megegyezik egymással. A Duoxok NADPH-oxidáz régiója aminosav szinten 47 %-ban homológ a gp91phox (Nox2) fehérjével (58). Egyéb pajzsmirigy eredetű fehérjékkel ellentétben a Duox gének promóterei mind pajzsmirigy eredetű (PC CL3 és FRTL5), mind nem pajzsmirigy eredetű sejtvonalakban (Hela, Rat-2 fiboblaszt) aktívak voltak (58). Egy nemrég megjelent közleményben
primer
tüdő
adenokarcinómák
50 %-ában
valamelyik
Duox
expressziójának csökkenését tapasztalták, melynek hátterében a Duox promóter régiójának hipermetilációját találták (59). A 15. kromoszómán a Duox gének közötti részen találhatók a Duox érési faktorok (Duoxa1 és Duoxa2) génjei (8. ábra).
22
kromoszóma: 15, lokalizáció: 15q15.3
8. ábra: A Duox és Duoxa gének elhelyezkedése a 15. kromoszóma hosszú karján. A Duox1 és Duox2 egymástól 16 kb távolságra fej-fej orientációban, a Duoxa gének farok-farok orientációban helyezkednek el. Egérben a Duox és Duoxa gének elhelyezkedése a 2. kromoszómán szintén hasonló (Forrás: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/53905).
3.3.2.2. A Duox enzimek szerkezete A Duoxok abban különböznek a többi NADPH-oxidáztól, hogy gp91phox-homológ doménjük mellett egy peroxidáz-homológ régiót is tartalmaznak (9. ábra). A Duox fehérjék két N-glikozilációs helyet tartalmaznak, ezért humán pajzsmirigy lizátumon végzett Western blot kísérletben két csík detektálható, egy 180 kDa és egy 190 kDa magasságban (3).
FAD
9. ábra: A Duox enzimek szerkezete. A NADPH-oxidáz homológ régióban a C-terminális végtől kezdve található egy FAD-kötő, egy NADPH-kötő hely, 6 db TM régió, amiben két hem prosztetikus csoport található. A Duoxok tartalmaznak még egy nagy inracelluláris hurkot 2 „EF hand” motívummal, egy extra TM régiót és egy extracelluláris peroxidáz-szerű domént az N-terminális végükön (60).
23
3.3.2.2.1. A Duoxok peroxidáz-szerű doménje Mivel a Duox enzimek peroxidáz-szerű doménjéből hiányoznak azok a konzervált hisztidin aminosavak (10. ábra), amik az emlős peroxidázokban a hem kötéséhez esszenciálisak, munkacsoportunk felvetette, hogy a Duox peroxidáz doménje nem rendelkezik peoxidáz aktivitással (60).
10.
ábra:
A
humán
TPO
és
Duox1
peroxidáz-szerű
régiójának
szekvencia
összehasonlítása. A TPO hem-kötésért felelős konzervált hisztidinjei nyíllal vannak jelölve, melyeknek megfelelő helyeken a hDuox1 fehérjében szerinek találhatók (60).
Edens C. elegans genomban azonosította a 1497 aminosavból álló Ce-Duox1 enzimet, mely a humán Duox1-el nagy homológiát mutat. (A Ce-Duox2 1503 aminosavból áll.) A Ce-Duox1 funkciójának felderítéséhez az RNS-interferencia technikát használták, ami a poszt-transzlációs elcsendesítés egy olyan formája, melyben rövid, specifikus RNS hatására a célgén hírvivő RNS-e degradálódik (61). A féreg
24
gonádjába duplaszálú Ce-Duox1-specifikus RNS-t injektálva, a férgeken hólyagok és egyéb morfológiai defektusok jelentek meg, melyek a tökéletlen kutikula-bioszintézis következményei (11. ábra).
11. ábra: A Ce-Duox1 duplaszálú RNS hatása a C. elegans nematóda kutiluka stabilizálására. A Ce-Duox1 visszanyomásának hatására a férgen hólyagok jelentek meg (B), ami a tökéletlen kutikula bioszintézis eredménye. A vad típusú állathoz (A) képest a mozgása sérült, amit jól demonstrál, hogy a Ce-Duox1 hiányos féreg a tojásait egy helyben rakta le, valamint, hogy a feji részénél (jobb oldal) hiányzik a baktérium pázsit, mert csak az ott talált táplálékot tudta elfogyasztani (4).
A szerzők a Duox fehérjét a C. elegans hipodermális sejtjeiben detektálták (4). Hasonló fenotípust figyeltek meg a kollagén bioszintézist érintő mutációkban. A Ce-Duox1 és a humán Duox1 peroxidáz-szerű doménjét E. coli-ban expresszálva, külsőleg hozzáadott H2O2 hatására mindkét peroxidáz domén katalizálta a di- és tritirozin kötések képződését. Ezek alapján úgy tűnik, hogy a C. elegans Duox ditirozin kötések létrehozásán keresztül az extracelluláris mátrix stabilizálásában vesz részt. Ezen kísérletei alapján Edens feltételezte, hogy a Duox NADPH-homológ régiója által termelt H2O2-ot, a Duox peroxidáz-szerű régiója ditirozinképzésre használja (12. ábra a). A fenti kísérletek alapján azonban nem lehet kizárni, hogy a Duoxok peroxidáz-szerű doménje valójában nem rendelkezik peroxidáz aktivitással, hanem a termelt H2O2-ot egy jelen lévő peroxidáz használja fel, mely modellre példa a fertilizációs burok megszilárdulása tengeri sün petesejtben (12. ábra b) (60).
25
12. ábra: Alternatív modellek a Duox fehérjék keresztkötésben betöltött szerepére. a) A Duoxok peroxidáz doménje rendelkezik peroxidáz aktivitással. b) A Duoxok peroxidáz doménje nem rendelkezik peroxidáz aktivitással, az általa termelt H2O2ot egy peroxidáz használja fel a ditirozin keresztkötések kialakítására (60).
Két közlemény is megjelent, melyekben tovább vizsgálták a Duox enzimek peroxidáz aktivitását. Az elsőben HBE1 (papilloma vírussal immortalizált humán TBE: tracheobronchiális epitél sejtek) sejtekben IFNγ indukciót követően mérték a peroxidáz aktivitást TMB (3,5,3’,5’-tetramethylbenzidine)-oxidáláson alapuló módszerrel. A IFNγ
26
hatására a Duox2 expessziója és a sejtek peroxidáz aktivitása is emelkedett. A folyamatban a Duox2 szerepét specifikus anti-Duox2 duplaszálú RNS-t kifejező sejvonalon igazolták, ahol a Duox2 csendesítésének következtében csökkent a peroxidáz aktivitás is (62). Egy másik közleményben a C. elegans és humán Duox1 enzimek peroxidáz doménjét (Ce-Duox11-589 és hDuox11-593) Sf9 sejtekben kifejezték, tisztították, majd vizsgálták a peroxidáz aktivitást, a hem spektrumot és a szuperoxiddizmutáz aktivitást. A Ce-Duox11-589 a hem csoportot kovalensen kötötte és peroxidáz aktivitással rendelkezett, de a hDuox11-593 esetében sem peroxidáz aktivitást, sem kovalensen kötött hem csoportot nem tudtak kimutatni (63). A Duox fehérjék érdekes tulajdonsága, hogy a Nox enzimekkel ellentétben, H2O2-ot
termelnek,
amit
a
fehérje
poszt-transzlációs
módosításaival
hoztak
összefüggésbe (8). Morand és mtsai felvetették, hogy a NADPH-oxidáz domén által termelt szuperoxidot a peroxidáz-szerű domén alakítja H2O2-dá. Ezen elméletüket arra alapozták, hogy ha a Duox enzimeket heterológ expressziós rendszerben nem a saját érési faktorával fejezték ki (Duox1-et a Duoxa2-vel vagy Duox2-t a Duoxa1-el), akkor a Duox H2O2-termelése jelentősen csökkent és szuperoxid termelést tapasztaltak (64). A fenti felvetés ellen szól, hogy heterológ módon expresszált Duox peroxidáz doméneknél nem detektáltak szuperoxid-diszmutáz aktivitást (63). 3.3.2.3. A Duoxok aktivitásának szabályozása 3.3.2.3.1. Kalcium általi szabályozás Az „EF-hand” motívumok jelenléte az 1. és 2. TM régió közötti inracelluláris hurkon magyarázza a kalcium stimuláló hatását a H2O2-termelésre pajzsmirigyben és léguti epitél sejtekben (NHBE) (5, 65, 66). NHBE sejtekben jelemtős H2O2-termelést lehetett elérni az inracelluláris kalcium-koncentráció emelésével, például ionofórral (ionomycin), receptor agonistával (ATP) vagy ER SERCA gátlóval (thapsigargin) (66). A
Duox1
H2O2-termelése
gátolható
difenil-jodóniummal
(DPI)
vagy
RNS
elcsendesítéssel (antiszenz oligonukleotid) (5). Egy
dél-koreai
kutatócsoport
Drosophila
melanogaster-en
végzett
RNS-interferencia kísérletekben igazolta, hogy a dDuox Gαq─foszfolipáz-Cβ (PLCβ)
27
útvonalon keresztül aktiválódott. Az aktiválódott PLCβ a membránban lévő PIP2-ből IP3-at szabadít fel, mely a belső kalcium raktárak ürítésével a Duox H2O2-termelésének aktiválásához vezetett. A Drosophila bélcsatornájában a folyamatban résztvevő bármely enzim (Gαq, PLCβ, dDuox) mRNS-ének elcsendesítése az állat pusztulásához vezetett, amennyiben elő Saccharromyces cerevisie-et tartalmazó tápoldattal etették (67). A fenti adatok felvetik a Duox enzimek szerepét a tápcsatorna immunvédekezésében. 3.3.2.3.2. Duox érési- és más szabályozó faktorok A Nox fehérjék közül a Nox1-4 aktivitásához nagy valószínűséggel szükséges a p22phox membránfehérje. A p22phox-hiányos egér fenotípusa alapján azonban csak a Nox2 és Nox3 működéséhez esszenciális, ezért a Nox1 és Nox4 p22phox-függésének igazolása
még
további
kísérleteket
igényel
(50).
A
Duox
enzimek
ko-
immunprecipitálhatók a p22phox fehérjével, de nem valószínű, hogy valóban szükséges lenne aktivitásukhoz, mert a C. elegans és D. melanogaster genom nem tartalmaz p22phox-homológ fehérjét, és sem a p22phox-hiányos CGD-ben szenvedő betegekben, sem p22phox knockout egerekben nem tapasztaltak hipotireozist (20). A Duox fehérjék heterológ expressziós rendszerben való vizsgálatát sokáig megakadályozta, hogy a transzfektált sejtekben az enzim az endoplazmatikus retikulumban (ER) maradt (68-70). Az ER-retenció vizsgálatához Morand csonka Duox mutánsokat készített, melyek az extracelluláris peroxidáz-szerű domént és az első inracelluláris hurok különböző részeit tartalmazták. Kísérleteiben megállapította, hogy a hDuox fehérjében az 596. és 685. aminosavak között, a sertés Duox-ban pedig az első intracelluláris hurokban található a retencióért felelős szignál szekvencia. Ezekben a régiókban a Duox2 éréséhez szükséges számos ciszteint is azonosítottak (70). A megoldást a Duox érési faktorok, Duoxa1 és Duoxa2 felfedezése hozta, melyeket a Duox enzimekkel kotranszfektálva, a Duoxok az ER-ból a plazmamembránba jutottak. A Duoxa érési faktorok a Duox hiányában szintén az ER-ban maradnak és csak a Duox enzimmel együtt képesek a plazmamembránba kerülni (71). A humán Duoxa1-nek 4 splice variánsát (hDuoxa1α, β, γ, δ) azonosították. A hDuoxa1 β- és δ-variánsai nem tartalmazzák a 3. exont, heterológ expressziós rendszerben inaktívak, a Duox1-el együtt az ER-ban maradnak. Ezzel szemben a
28
hDuoxa1 α és γ variánsok, melyek egymástól a C-terminális inracelluláris hurok hosszában különböznek, a Duox1-el együtt a membránba kerültek. Humán trachea metszeten a Duoxa1 a csillószőrös hengerhám apikális pólusán helyezkedik el. Heterológ expressziós rendszerben a legtöbb H2O2-ot a hDuox1 a hDuoxa1α-val együtt kifejezve termelte. Érdekes, hogy amennyiben a Duox2-t nem a saját Duoxa2 kofaktorával, hanem vagy a Duoxa1α-val, vagy a Duoxa1γ-val expresszálták, akkor lehetett O2•--ot detektálni, míg egyébként csak H2O2-ot lehetett mérni. A szerzők szerint ez esetben a peroxidáz domén poszt-transzlációs módosítása nem tökéletes, így nem tudja betölteni funkcióját, ami a szuperoxid H2O2-dá alakítása lenne (64). Humán léguti epitél sejtek primer tenyészeteiben végzett kísérletekben azt találták, hogy alap állapotban a Noxa1 a membránban lévő Duox1-hez kötődik SH3doménjén keresztül és ezzel a Duox-ot inaktív állapotban tartja. Ionomicinnel kiváltott kalcium koncentráció emelkedés hatására a Noxa1 disszociál a Duox1-ről és a citoplazmába kerül. Az endogén Noxa1 siRNS-el történő elcsendesítésére az alap Duox1 aktivitás fokozódott. Ezek alapján azt feltételezik, hogy a Noxa1 negatívan szabályozza a Duox1 alap aktivitását, ami gátolja a Duox1 spontán kalcium koncentráció-ingadozásokra bekövetkező aktiválódását (72). Élesztő két-hibrid rendszerben azonosították a Duox1 és Duox2 egy interakciós partnerét, az EFP1 fehérjét (EF hand binding protein1), de a kapcsolat fiziológiás funkciója ismeretlen. Az EFP1 két tioredoxin domént tartalmazó fehérje és redox reakciókban vesz részt (73). 3.3.2.3.3. A foszforiláció szabályozó szerepe A Duox1 és Duox2 enzimek eltérő inracelluláris foszforilációs útvonalon aktiválódnak. A cAMP-függő protein kinázt (PKA) aktiváló forskolin fokozta a hDuox1 H2O2-termelését. Az aktiválódás hátterében a 955. szerin PKA-függő konstitutív foszforilációja áll, ami fokozza az enzim kalciummal szembeni érzékenységét. Ezzel szemben a hDuox2 aktivitását a protein kináz C (PKC) általi foszforláció fokozta, amit PMA stimulussal indukáltak. Feltételezésük szerint a foszforilációnak a Duoxok aktivitásának fenntartásában van szerepe. Ennek a mechanizmusa, hogy TSH-stimulus hatására, Gs- és Gq-kapcsolt receptorok aktiválódnak. A cAMP szint emelkedése
29
aktiválja a PKA-t, ami foszforilációval aktiválja a Duox1-et. A PLCβ hatására keletkező diacil-glicerin (DAG) pedig aktiválja a PKC-t, ami foszforiláción keresztül a Duox2 aktivitását fokozza. (74). 3.3.2.3.4. Expresszió-szintű szabályozás Elfogadott
tény,
hogy
az
ún.
veleszületett
immunrendszer
védekező
mechanizmusai között a H2O2 és a peroxidázok központi szerepet játszanak. A légutak felszínén ezt a természetes védekező mechanizmust a H2O2-LPO-SCN--rendszer biztosítja, melyhez a H2O2-ot a Duox enzimek termelik. Humán TBE sejtekben a Duox enzimek expresszióját a Th1- és Th2-típusú citokinek eltérően szabályozzák. A Duox1 expressziója 3−6-szorosára emelkedett IL-4 és IL-13 Th2-típusú citokinek hatására, míg a Duox2 expressióját a Th1-citokinek közé tartozó IFNγ 15-szörösére emelte. A Duox2 expresszióját a vírusfertőzést imitáló poli-inozin-poli-citidilsav és a rinovírus is fokozta. Stimulálás nélkül a Duox1 2−5-ször nagyobb mennyiségben található a TBE sejtekben, mint a Duox2, ellenben az utóbbi expressziója nagyobb mértékben indukálható. Expressziójuk eltérő szabályozása arra utal, hogy a tüdő immunvédelmében is különböző funkciót látnak el (75). További vizsgállatokban megállapították, hogy a Duox2 expresszió fokozása nem a klasszikus IFNγ-JAK-STAT1 útvonalon keresztül történik, hanem a JAK3-STAT5 útvonalon keresztül az IFNγ gátolja a Duox2 expressziót, ami magyarázhatja a Duox2 kisebb bazális kifejeződését (76). A bélhámsejteknek tolerálniuk kell a bélben jelen lévő kommenzális baktériumokat és ezek bizonyos mértékű szaporodását, ám ezzel egy időben gátolniuk kell a szervezetre káros patogén baktériumok kóros elszaporodását. Immunológiai szempontból az egyensúly fenntartása nem könnyű feladat, mivel a patogén és hasznos baktériumok ugyanazokat az immunválaszt kiváltó molekuláris mintázatokat hordozzák a felszínűkön, melyeket az immunrendszer felismer. D. melanogaster bélrendszerében a Duox által termelt H2O2 jelentősen hozzájárul a gasztrointesztinális rendszer antimikrobiális védelméhez. Duox hiányában a Drosophila elpusztul a táplálékkal felvett S. cerevisiae kóros elszaporodása következtében. A rovar bélrendszerében a Duox expressziója szigorú pozitív-negatív szabályozás alatt áll. Az expresszió pozítív regulációja a MEKK1-MKK3-p38-ATF2
30
útvonalon keresztül valósul meg, ahol a MEKK1 MAP-kináz (mitogén-aktivált protein kináz) aktivációját szolubilis mikrobiális extraktummal (SME) indukálták. Az ATF2 (activating transcription factor 2) a sejtmagban a Duox promóterében az ATF2-kötő helyhez kötve aktiválja a Duox transzkripcióját. A p38 fokozott aktivációjára csak a baktériumok túlszaporodása esetén van szükség, ezért normál bakteriális jelenlét esetén a p38 negatív szabályozás alatt áll a PLC-β - CanB (kalcineurinB) - MKP3 (MAP kináz foszfatáz 3) útvonalon keresztül. A Duox expresszió-szabályozás fentebb tárgyalt konzerváltságát humán Caco-2 sejtvonalon is vizsgálták. Caco-2 sejtekben a Duox2 H2O2-temelését a SME-p38 aktiválódáson keresztül fokozta, melyhez PLC-β2 is szükséges volt. Ezekben a sejtekben a Duox2-expressziójának növekedése nem a Toll-like−receptorokra jellemző MyD88-NF-κB-útvonalon keresztül jött létre, ami emlősben egy a MyD88−NFκB−független Duox-szabályozó mechanizmus jelenlétére utal (77). 3.3.2.4. A Duoxok funkciói 3.3.2.4.1. A Duoxok szerepe a pajzsmirigy-hormonok szintézisében A pajzsmirigy-hormon szintéziséhez nélkülözhetetlen a H2O2, melyet a follikulusokban a TPO a tiroglobulin tirozin oldalláncainak jódozására használ, mely a T3 és T4 pajzsmirigy-hormonok szintézisének első lépése. Azt, hogy a H2O2-ot a pajzsmirigyben egy NADPH-oxidáz termeli, már évtizedekkel ezelőtt tudták, de a Duox NADPH-oxidáz homológokat csak az ezredforduló évében sikerült azonosítani. Mindkét Duox enzim a tireociták apikális membránjában helyezkedik el (7). A H2O2-képződés mechanizmusát a pajzsmirigyben az 13. ábra mutatja.
31
13. ábra: A H2O2-képződés mechanizmusa a pajzsmirigyben. A Duox2/Duoxa2 enzimkomplex által termelt H2O2-ot a TPO a jodid-ionok oxidálására, majd tirozin aminosavak jódozására, végül a jódtirozinok keresztkötésére fordítja. A Duox aktiválódása TSH hatására Gq heterotimer G-fehérje által indított jelátviteli útvonalon keresztül zajlik. A folyamatban felszabadult Ca2+ (PLC-β /IP3) és az aktivált PKC (PLC-β/DAG) együttesen aktiválják a Duox2 H2O2-termelését. A pajzsmirigy hormon szintézisében alárendelt szerepű Duox1/Duoxa1 az ábrán nincs feltüntetve (78).
Frissen
eltávolított
humán
pajzsmirigyből
készített
plazmamembrán
preparátumon végzett ko-immunprecipitációs kísérletekben kimutatták, hogy a Duox a TPO-hoz közvetlenül kapcsolódik a membránban. A kapcsolat erősségét fokozza a H2O2 és a PKC, ami a Duox2-t aktiválja, ellenben a Duox1-et aktiváló PKA csökkenti. A jelenség leírói e közeli kapcsolat jelentőségét abban látják, hogy a Duox által termelt H2O2-ot így a TPO hatékonyabban és gyorsabban tudja felhasználni, amivel egyben minimalizálja a H2O2 esetleges sejtkárosító hatását a szövetben (79). Kezdetben azt feltételezték, hogy azért van szükség két homológ Duox enzimre a pajzsmirigyben, hogy az egyik funkcióképtelenné válása esetén, a másik biztosítsa a hormonszintézishez szükséges H2O2-ot. Ez az elmélet megdőlt, amikor azonosították az első Duox2-mutációra visszavezethető hipotireózist, mert ez bizonyította, hogy a Duox1
32
nem, vagy csak részlegesen képes helyettesíteni a Duox2 enzimet (80). A Duox2 mutációja már heterozigóta formában is részleges, homozigóta formában pedig súlyos hipotireózist okoz. A Duox2 enzimnek már számos hipotireózist okozó mutációját azonosították, a Duox1-nek ellenben egyet sem. Ez alapján elképzelhető, hogy a Duox2 és Duox1 különbőző funkciót lát el a pajzsmirigyben. Nemcsak a Duox2-nek, hanem érési faktorának, a Duoxa2-nek a mutációja is okozhat veleszületett hipotireózist. Az Y246X mutációt hordozó Duoxa2-t Hela sejtekben Duox2-vel koexpresszálva nem tudtak H2O2-termelést detektálni. A Duoxa2-ben Y246X mutációt homozigóta formában hordozó betegben a hipotireózis enyhébb volt, mint a homozigóta nonszenz Duox2 mutánsnál, amire az lehet a magyarázat, hogy a Duoxa1 részlegesen képes helyettesíteni a Duoxa2-t. Ezt a feltételezést heterológ expressziós rendszerben sikerült igazolni (81). 3.3.2.4.2. A Duoxok szerepe az extracelluláris mátrix stabilizálásában Már majd egy évszázaddal ezelőtt leírták, hogy a tengerisün petesejt fertilizációjakor jelentősen megnövekszik az oxigénfogyasztás, azonban a folyamatban részt vevő enzimek még sokáig ismeretlenek voltak. Korai kísérletek azt mutatták, hogy a fertilizáció során keletkező H2O2 nem a mitokondriumból származik, hanem létezik egy kalcium-függő enzim. Az enzimet 2004-ben klónozták meg Strongylocentrotus purpuratus és Lytechinus variegatus tengeri sünökből, és Duox enzimekkel való homológiája miatt az Udx1 (urchin dual oxidase 1) nevet kapta. A petesejtbe az Udx1 NADPH-kötő régióját felismerő antitestet injektálva csökkent a kalcium ionofórok által kiváltott H2O2-termelés (82). Megtermékenyüléskor jellegzetes változások sorozata megy végbe a petesejtet körülvevő extracellulláris mátrixban, a vitellin rétegben, melynek célja a polispermia megakadályozása és a fejlődő embrió védelme a külső környezeti hatásokkal szemben. A folyamat eredményeképpen kialakul a kemény fertilizációs burok. Első lépésként intracelluláris kalcium-jel hatására megtörténik a membránhoz kapcsolódó kortikális granulumok exocitózisa, melyben sok más fehérje mellett, autoaktivációs szerin proteázok és az ovoperoxidáz található (14. ábra). A proteázok hatására a vitellin réteg eltávolodik a plazmamembrántól, így egy puha fertilizációs burok jön létre. Ezt
33
követően az ovoperoxidáz ditirozin keresztkötéseken keresztül hozzájárul a fertilizációs burok megszilárdulásához (82). Az ovoperoxidáz aktiválódásához a közeg lúgosodása vezet (a pH 5-ről 8-ra változik), mely a peroxidáz működéséhez szükséges H2O2szintézis következménye (83). A Ce-Duox C. elegans kutikulájának stabibilizásában betöltött szerepét a 3.4.2.1. fejezetben részletesen ismertettem.
14. ábra: Az ovoperoxidáz működéséhez szükséges H2O2-ot az Udx1 termeli a tengeri sün petesejt fertilizáció során (60).
3.3.2.4.3. A Duoxok szerepe az immunvédekezésben A Duoxok által termelt H2O2-nak a gerinctelenek immunvédekezésében is van szerepe. Az első ezt alátámasztó kísérletek D. melanogaster vizsgálata során születtek, ahol a Duox gasztrointesztinális elcsendesítése sérült bakteriális védekezéshez és gyorsabb puszulásához vezetett (lásd a 3.3.2.3.1. fejezetben részletezve) (84). C. elegans hipodermális és intestinális sejtjeiben a Ce-Duox1 expressziójának duplaszálú RNS-el való csökkentése a férget fogékonyabbá tette Enterococcus faecalis fertőzéssel szemben. A szerzők ezt azzal magyarázták, hogy a Ce-Duox1 csendesítésének hatására csökkent az E. faecalis által kiváltott H2O2-termelés (85). Zebrahal lárvákon végzett kísérletekben kimutatták, hogy a Duox által termelt H2O2 a fehérvérsejtek kemotaxisának fokozásán keresztül szerepet játszik a hal immunvédelmében. A zebrahal lárvák farokuszonyának végét levágva a seb környékén
34
H2O2 termelődik, ami odavonzza a sebhez a leukocitákat. A Duox által termelt H2O2-ot DPI-vel vagy a Duox expressziót RNS interferencia segítségével csökkentve, a fehérvérsejtek sebhez toborzása károsodott (86). Az alacsonyabbrendű előlényekkel ellentétben, emlősökben nincs egyértelmű bizonyíték a Duox antimikrobiális védekezésben betöltött szerepére, de az utóbbi években számos közleményben vizsgálták a Duox immunvédekezésben betöltött szerepét. A Duox enzimek jelen vannak a nyálmirigyek kivezető csövében (Duox2) és a gasztrointesztinális rendszer (Duox2), valamit a légcső és a bronchusok felszínét borító nyálkahártyában (Duox1), ahol az általuk termelt H2O2-ot a LPO az antimikrobiális hatású OSCN− képzésre fordítja (5, 8, 66). A Duox fehérjék a légutakban feltehetően részt vesznek a különféle környezeti hatások okozta oxidatív stressz kialakulásában. A légúti sejtek felszínén okozott sérülés ATP felszabaduláshoz vezet, amely a környező ép sejteken lévő P2-purinerg receptorokon keresztül aktiválja a Duox1-et. A sérülés helyén a Duox1 által termelt H2O2-nak a sejtek vándorlásában és a sebgyógyulásban van szerepe (87). Normál humán bronchiális epitél sejtekben a Duox1 szabályozza a légúti szekrétumban legnagyobb mennyiségben jelen lécő MUC5AC mucin expresszióját (88). A légutakhoz
hasonlóan a
LPO
és
Duox
enzimek valószínűleg
a
gasztrointesztinális rendszerben is hozzájárulnak az antibakteriális védekezéshez, de ezen a területen még kevés eredmény született. Northern blot kísérletben LPO mRNS-t detektáltak patkány gasztrointesztinális rendszerben. A Duox2 mRNS emberben legnagyobb mennyiségben a végbélban fejeződik ki (5). Disznóban a Duox2 a teljes emésztőrendszerben megtalálható, de legnagyobb mennyiségben a gyomorban, vakbélben és szigmabélben találták. Caco-2 sejtekben a Duox2 expressziója konfluens sejttenyészetben bekövetkező spontán differenciálódás során indukálódik. Emberben és diszóban egyaránt, a Duox2 fehérjét az enterociták kefeszegélyén az apikális oldalon detektálták, ami azt mutatja, hogy a Duox differenciált sejtekben expresszálódik (8). Crohn-betegségben a Duox2 expressziójának emelkedését tapasztalták (89). A LPO és Duox2 expressziós mintázata alapján feltételezhetően szerepet játszik a normális bélflóra fenntartásában, ám ennek bizonyítása még további kísérleteket igényel.
35
3.4. Emlős hem peroxidázok A peroxidázokat két csoportra oszthatjuk, hemet nem tartalmazó peroxidázokra, mint például a glutation vagy a tioredoxin peroxidáz, és hem prosztetikus csoportot tartalmazó peroxidázokra. A hem peroxidázoknak további két nagy családja van. Az elsőbe tartoznak a gombák, növények és az ősbaktériumok peroxidázai, melyekre jellemző, hogy egy közös ősi génből génduplikációval keletkeztek, ezért szekvenciájuk homológ és harmadlagos szerkezetükben is csak kis eltérések mutatkoznak. A másik nagy családba tartoznak az emlős peroxidázok, melyeknek elsődleges és harmadlagos szerkezetükben is nagyobb különbségek mutatkoznak. Az emlős peroxidázok elnevezés nem teljesen fedi a valóságot, mert ide tartoznak az ízeltlábúak és a puhatestűek, mint például a C. elegans és a Drosophila peroxidázai is. Az első család, amelynek tagjai egy közös géntől származnak, jó példája a divergens evolúciónak, míg az emlős peroxidázok enzimeit konvergens evolúció eredményezte (90). A humán szervezetben megtalálható emlős peroxidázok a laktoperoxidáz, mieloperoxidáz (MPO), eozinofil peroxidáz (EPO), tireoperoxidáz és PXDN. Az LPO, MPO és EPO az immunvédekezésben, a TPO a pajzsmirigy-hormon szintézisben, a PXDN pedig az extracelluláris mátrix fehérjehálózatának kialakításában vesz részt. 3.4.1. Mieloperoxidáz Emberben a MPO a 17. kromoszómán található, közel a LPO és az EPO génekhez (90). A fehérjét 1941-ben tuberkolózisos betegek empiémájából (gennyes váladék) izolálták, mint egy vastartalmú, peroxidáz aktivitással rendelkező enzimet, amit kezdetben intenzív zöld színe miatt verdoperoxidáznak neveztek (91). Ezt követően megállapították, hogy myeloid eredetű sejtekben fejeződik ki, majd 1970-ben Klebanoff leírta, hogy a MPO a fagocita sejtek oxigén-függő baktériumölésében vesz részt, amivel hozzájárul a szervezet természetes immunitásához (92). A neutrofil granulociták azurofil granulumainak, szerin-proteázok és lizoszómahidrolázok mellett a MPO a fő alkotója, ami a sejt száraz tömegének 5 %-át teszi ki. Aktivációkor az azurofil granulumok tartalma a bekebelezett baktériumot tartalmazó fagoszómába kerül, ahol a MPO a fagocita oxidáz által termelt szuperoxidból (O2•-)
36
képződött H2O2-ot felhasználva antimikrobiális hatású hipoklórsavat (HOCl) képez (15. ábra).
15. ábra: A MPO hozzájárulása a neutrofil garnulocita baktérium öléséhez. A neutrofil aktiválódásakor képződő H2O2-ot a MPO, antibakteriális hatású hipoklórsav képzésére fordítja (93).
Az aktív MPO egy 146 kDa-os fehérje, melyben a két 73 kDa molekulatömegű alegység egy cisztein (Cys 153) diszulfid-kötésen keresztül kapcsolódik (16. ábra). A MPO enzim aktív centrumában konzervált proximális és disztális hisztidinek találhatók, melyeknek megfelelő aminosavak az EPO-ban és a LPO-ban is konzerváltak. A proximális hisztidin a redox folyamatokat szabályozza. A disztális hisztidin sav-bázis katalizátorként működik, ami először a H2O2-ról egy protont vesz fel, majd a HO2-ből az oxigénkötés (O-O) elhasításával és azt követő proton donálással vizet képez. A disztális hisztidinhez közel található egy konzervált aszparagin aminosav, ami Ca2+ kötésén keresztül a hisztidint a reakcióhoz optimális térbeli pozícióban tartja (90).
37
16. ábra: A MPO kristályszerkezete. A MPO két alegységből áll, melyek egy-egy hemet kötnek, valamint egy-egy kalcium-iont koordinálnak (94).
Az enzimek fő szubsztrátjai közül a Cl-, Br- és I- a halogenid-ionok közé tartoznak, a SCN- pedig a pszeudohalogének közé. Eltérő mértékben ugyan, de mindhárom peroxidáz (MPO, EPO, LPO) képes a Cl-, Br- és SCN- ionok oxidálására. Fiziológiás pH és ionkoncentráció mellett a MPO elsődlegesen HOCl-ot és HOSCN-ot képez, az EPO főleg HOBr-ot és HOSCN-ot, a LPO fő terméke pedig a HOSCN (90). A peroxidázok előbb említett termékeinek és a peroxidáz-működés során keletkező egyéb reaktív molekuláknak (1O2, NO2•, HO•) jelentős szerepet tulajdonítanak a gyulladások helyén kialakuló szövetkárosodásban. Ezen reaktív termékek gyorsan reagálnak
nukleofil
tulajdonságú
csoportokkal,
különösen
a
kén-
és
nitrogéntartalmúakkal, mint például a tiol, tioészter, amin és amid csoportok. A sejtekben lévő GSH oxidálásán (GSSG) keresztül befolyásolják a redox folyamatokat. Ezen kívül egyes enzimek aktív centrumában található ciszteinek oxidálásával befolyásolhatják az enzimek működését. Erre példa a tirozin foszfatázok (PTP) gátlása, melyek aktív centrumában szintén egy konzervált cisztein található (95).
38
A peroxidázok okozta oxidatív szövetkárosodásnak szerepet tulajdonítanak a különböző gyulladásos, fibrotikus és degeneratív betegségek patogenezisében (90). 3.4.2. Eozinofil peroxidáz Az EPO az egyik fő granulum fehérjéje az eozinofil granulocitáknak, melyek soksejtű paraziták eliminálására specializálódott sejtek. Az eozinofil granulociták szekréciós granulumaikat a parazita környezetébe ürítik, mely granulumok különféle neurotoxin hatású fehérjék mellett nagy mennyiségű EPO-t tartalmazzák. Az EPO az eozinofil granulumok egyéb bázikus fehérjéihez hasonlóan a parazita felszínéhez köt, mely fokozza ölő hatását. Az izolált EPO-ról kimutatták, hogy hatékonyan ölte a Schistosoma mansoni parazitát és antivirális hatása volt a humán immunodeficiencia vírus 1-es típusával (HIV-1) szemben (96). Az EPO aminosav szinten 70 %-os homológiát mutat a MPO-zal, amihez hasonlóan az érett 69,8 kDa molekulasúlyú fehérje homodimert alkot, amiben a monomerek egy nehéz (57,9 kDa) és egy könnyű (11,9 kDa) láncból épülnek fel (90).
3.4.3. Tireoperoxidáz Emberben a TPO gén a 2. kromoszómán helyezkedik el és 933 aminosavból áll. A gént 17 exon és 16 intron alkotja. Az enzim első 735 aminosavat tartalmazó része 42 %-ban homológ a humán mieloperoxidáz szekvenciájával. A mieloperoxidáz családdal (MPO, EPO, LPO) ellentétben egy TM régiót is tartalmaz. A TPO expresszióját a TTF-1, TTF-2, és Pax8 pajzsmirigy-specifikus transzkripciós faktorok szabályozzák. A TPO egy glikozilált, hemet tartalmazó fehérje. A TPO cDNS-ének számos variánsát leírták. Az érett enzim a tireociták apikális membránjában helyezkedik el úgy, hogy az enzim katalitikus helye a follikulus lumen felé néz (97). A TPO esszenciális a pajzsmirigy hormon szintéziséhez. Szerepe a tireoglobulin tirozin oldalláncainak jódozása, melyben monojódtirozint és dijódtirozint képez, majd ezek keresztkötése, mely folyamatban tireoglobulihoz kötött T3 (3,5,3’-trijód-tironin) és T4 (3,5,3’,5’-tetrajód-tironin vagy tiroxin) keletkezik (98). A tirozin oldalláncok
39
jódozása és keresztkötése nem TPO-specifikus, mert a LPO és MPO is képes rá (99). A TPO aktivitásához szükséges H2O2-ot az apikális membránban lévő Duox NADPH oxidázok termelik (2, 3). A hormonszintézishez szükséges jodid-ionok a plazmából a tireociták bazális membránban elhelyezkedő nátrium-jód szimporteren (NIS) keresztül jutnak a sejtbe. A jodid-ion a beépülés helyére, a follikulus lumenébe a tireociták apikális membránjában lévő pendrin anion-kicserélő transzporteren keresztül jut (100). A pajzsmirigy veleszületett alulműködése (congenitalis hypothyreosis, CH) a Magyarországon 1984-ben bevezetett szűrés előtt a mentális retardáció leggyakoribb oka volt. Hazánkban a primer CH incidenciája 1:4000 élveszülés, melyeknek 10 %-a vezethető vissza a pajzsmirigyhormon-bioszintézis zavarára, melyet a Duox2 és Duoxa2 mutációk mellett okozhatnak még NIS, pendrin, TPO és tiroglobulin mutációk, de CHhoz vezet a TTF-1, TTF-2, Pax8 transzkripciós faktorok mutációja is (101).
3.4.4. Peroxidazin A peroxidazin (PXDN vagy VPO1: vascular peroxidase1) különleges struktúrával rendelkezik a peroxidázok között, mert peroxidáz-homológ doménje mellett az extracelluláris mátrix fehérjéire jellemző interakciós motívumokat tartalmaz. Elsőként D. melanogaster-ben azonosították, ahol az állat számos fejlődési szakaszában detektálták a fehérjét, de funkciója máig ismeretlen (102). Humán homológját EB1 vastagbélrák
sejtvonalból
izolálták,
melyben
a
p53
tumorszupresszor
gén
overexpressziójával kiváltott apoptózisban megnövekedett a PXDN expressziója. A szerzők a humán PXDN mRNS-ét az agyat és a fehérvérsejteket kivéve szinte minden szövetben, legnagyobb mennyiségben a szívben, méhlepényben, petefészekben és a belekben detektálták (103). A PXDN expressziójával kapcsolatos irodalmi adatok meglehetősen ellentmondásosak, mivel Horikoshi-val ellentétben Mitchell a PXDN mRNS-ét különféle melanomákon kívül csak ép bőrszövetben azonosította (104). A humán PXDN génje 110 kb nagyságú, 23 exont és 22 intront tartalmaz, és a 2. kromoszómán a TPO génjével farok-farok orientációban helyezkedik el. A C-terminális végen elhelyezkedő peroxidáz doménje, mely 42 %-ban homológ a MPOzal, tartalmazza a hem kötéséhez szükséges, emlős peroxidázokban konzervált hisztidin
40
és arginin aminosavakat. Az N-terminális végén szekretoros szignál szekvencia található, ezeket 6 db leucin-gazdag régió (LRR), 4 db immunoglobulin C2 domén követi, a C-terminális végén pedig egy von Willebrand faktor C-típusú domén található (17. ábra), mely régiók mindegyikét fehérje-fehérje kapcsolatokban írták le (105).
17. ábra: A peroxidazin domén szerkezete. A humán PXDN 1479 aminosavból áll. N-terminális végén található 6 db LRR, majd egy imunoglobulin C2 domén, ezt követi a peroxidáz domén, majd a C-terminális végen egy von Willebrand faktor C-típusú domén.
3.4.5. Laktoperoxidáz A könnyben, nyálban, tejben és a nyálkahártyákat borító folyadékban megtalálható laktoperoxidáz elsődleges szerepe a szervezet védelme a nyálkahártyákat támadó kórokozókkal szemben. A LPO gén a 17. kromoszómán farok-farok orientációban helyezkedik el a mindössze 2,5 kilobázis távolságra lévő MPO géntől (106). A humán LPO egy 80 kDa molekulasúlyú, 712 aminosavból álló N- és Oglikozilációs helyekkel rendelkező glikoprotein, amelynek aminosav szekvenciája a MPO szekvenciájával 51 %-ban azonos. A LPO szekretoros szignál szekvenciát tartalmaz. Az enzimnek nemrég két alternatív splice-variánsát is leírták, ami magyarázhatja, hogy SDS-poliakrilamid gélen elválasztva több specifikus csíkot detektáltak (107). 3.4.5.1. A laktoperoxidáz szerepe az immunvédekezésben A légutak strukturális felépítése, a bronchopulmonális szegmentumokban lévő gyakori elágazások és kanyarulatok különösen kedveznek a légzéssel bekerült részecskék megtapadásának. A légutak felső kétharmadából a megtapadt partikulumok eltávolítását a köhögési reflex és a folyamatos csillómozgás segíti. A mechanikai
41
tisztántartás
mellett
a
légutak
nyálkahártyájának
természetes
immunitása
kulcsfontosságú, melyet a defenzinek, immunglobulinok, komplement fehérjék, lipopoliszacharid-kötő fehérjék, lizozim és laktoferrin mellett a laktoperoxidáz lát el (108). A LPO a szekrétumban lévő tiocionát-iont (SCN-) hidrogén-peroxid felhasználásával hipotiocionát-ionná alakítja, a következő egyenlet szerint (18. ábra).
SCN- + H2O2
LPO
OSCN- + H 2O
18. ábra: A LPO katalizálta hipotiocianát képzés reakcióegyenlete. A reakcióhoz szükséges H2O2-ot termelhetik maguk a baktériumok vagy a NADPH-oxidázok családjába tartozó Duox enzimek. Birka légutaiban az összes fehérje 1 %-át a LPO adja, amit dapszonnal (4,4-diamino-difenil-szulfon) gátolva kimutatták, hogy az állat fogékonyabb lett Pasteurella hemolytica fertőzésre (109). A HOSCN gyengébb oxidáló hatású, mint a fagoszómában keletkező hipoklórsav, azonban így a gazdaszervezet epitél sejtjeire is kevésbé káros, ami lényeges az enzim konstitutív expressziója miatt. A OSCN−-ion vizes közegben egyensúlyban van a hipotiociánsavval (pKa=5,3),
mely
membrán
permeábilitásának
köszönhetően
a
baktériumok
intracelluláris oxidatív károsodását okozza. A nyál 6,5-ös pH értékénél a hipotiocianát ionok 5,9 %-a van protonálva (106). A LPO és Duox expressziós mintázata alapján Geiszt és munkatársai javasoltak egy modellt, amelyben a nyálkahártyák felszínén a Duox enzimek termelik a H2O2-ot a LPO számára (5). A nyálmirigyben a LPO a mirigyvégkamrákban termelődik. Az interkaláris kivezetőcsövek falában lévő NIS transzportálja a jodid- és tiocianát-ionokat a szekrétumba, majd az antimikrobiális rendszer a nagy kivezetőcsövek apikális membránjában kifejeződő Duox2 által termelt H2O2-dal válik teljessé (19. ábra).
42
19.
ábra:
A
Duox-laktoperoxidáz
antimikrobiális
rendszer
expressziójának
és
működésének modellje nyálmirigyben. A LPO a nyálképződés korai fázisában a szerózus acinusokban termelődik (a), a kivezetőcsövek falában a NIS transzportálja a szekrétumba a jodid- és tiocionát-ionokat, melyek a LPO szubsztrátjai (b), végül a Duox2 enzim által termelt H2O2 a terminális csatornákban adódik a nyálhoz (c) (5).
Az utóbbi néhány évben folytatott kutatások eredményeképpen a LPO/ H2O2/SCN− antimikrobiális rendszerről egyre inkább bebizonyosodott, hogy fontos szerepet játszik a légutak immunvédekezésében. Primer humán bronchiális epitél sejtek különféle kalciumstimulusokra (ATP, ionomicin, tapszigargin) H2O2-ot termeltek, ami DPI-vel vagy anti-Duox1 oligonukleotiddal gátolható. Ezen a sejtekben a Duox1 az epitél sejtek apikális felszínén található. Primer bronchiális epitél sejtek által termelt H2O2 hatékonyan gátolta S. aureus és P. aeruginosa légutakban fertőző baktériumok növekedését, amennyiben a sejttenyészet LPO-dal és SCN─-tal egészítették ki (110). A Duox enzimek működése során a NADPH-ból keletkező protonok, proton csatornákon keresztül a légutak felszínét borító folyadékrétegbe kerülnek, ahol hozzájárulnak a LPO optimális működéséhez szükséges enyhén savas közeg (pH=6,5-7,0) kialakításához (6). Kutatások alapján a cisztás fibrózisban (CF) kialakuló légúti patofiziológiás folyamatokhoz jelentősen hozzájárul a LPO-SCN− antimikrobiális rendszer elégtelen működése (110). A CF-t a plazmamembránban lévő CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) klorid-csatorna működésképtelensége vagy teljes hiánya okozza. A CFTR csatorna a légúti epitél sejtek apikális membrájában helyezkedik el. A mutáns csatorna több szervben is okoz elváltozásokat, de a fő problémát a légutak krónikus fertőzése okozza, ami légzésfunkció-csökkenéshez és súlyos esetben halálhoz vezehet (111). A Pseudomonas aeruginosa a legyengült immunrendszerű szervezetek, mint például az égési sérültek, az immunszupresszált és a cisztás fibrózisos betegek gyakori
43
léguti
patogénje.
A
baktérium
a
fertőzés
előrehaladtával
adaptálódik
a
gazdaszervezethez, ami bakteriális biofilm kialakulásához és krónikus infekcióhoz vezet. Az adaptálódáshoz nagymértékben hozzájárul a baktérium által termelt piocianin, ami több ponton is gátolja a LPO/Duox/SCN− antimikrobiális rendszer működését. A piocianin, egy membrán permeábilis vegyület, amely a sejtbe jutva oxidálja a NADPH koenzimet, ily módon elvonva a szubsztrátot a Duox H2O2-termelés elől. A sejtben a piocianin oxigénnel reagálva képes szuperoxidot képezni, ami intracelluláris oxidatív stresszhez és a Duox citokinek általi upregulációjának a gátlásához vezet. A LPO mindezen hatásokat képes kivédeni a piocinanin oxidálásával, a folyamathoz azonban szükséges a Duox által termelt H2O2 (112). Jelenleg két elmélet létezik, hogy miért szükséges a funkcióképes CFTR a Duox/LPO antimikrobiális rendszer működéséhez (20. ábra). Mindkettő azon alapul, hogy a CFTR egy nem-szelektív anion csatorna, így a klorid-ion mellett más, pl. tiocianát és hidrogén-karbonát (HCO3−) anionokat is transzportál (113). A tiocianát hipotézis szerint, mivel a CFTR csatorna SCN− aniont is transzportál, nincs elegendő SCN− a légutak felszínén a LPO antibakteriális OSCN- képzéséhez (20. abra: A). A másik feltételezés szerint a CFTR csatorna HCO3− anion transzporttal segíti a felszínen a lúgos pH létrejöttét, ami a Duox H2O2-termeléséhez szükséges (20. ábra: B). Feltehetően mindkét mechanizmus hozzájárul a betegség előmeneteléhez (114).
44
20. ábra: Feltételezett kapcsolat a LPO-Duox antimikrobiális védekezés és a CFTR között. A) SCN− hipotézis. A CFTR, mint SCN− transzpoter, szükséges a LPO/Duox rendszer megfelelő működéséhez. CF-ben kevesebb SCN− kerül a légutak felszínére és a csökkent mennyiségű OSCN− hozzájárul a betegség kialakulásához. B) pH hipotézis. A CFTR által transzportált HCO3− szükséges az ASL lúgos pH-jához, ami lehetővé teszi, hogy a HCVN1 proton csatorna a NADPH-ból képződött H+-t az extracelluláris térbe vezesse. A proton a Duox H2O2-képzéséhez szükséges (114).
A LPO-nak bakteriosztatikus hatása mellett jelentős szerepe van az emlős sejtekre káros H2O2 lebontásában is, melyből a sejtben toxikus hidroxil-gyökök képződhetnek. A laktoperoxidáz a savtermelő baktériumok szaporodásának kordában tartásával hozzájárul a száj mikroflórájának fenntartásához és a fogzománc védelméhez. E tulajdonságát kihasználva a laktoperoxidázt különféle szájápolási termékekhez, például fogkrémekhez és szájvizekhez adják (115). 3.4.6. A ditirozinképzés a peroxidázok általános tulajdonsága A ditirozin-képző aktivitás az ovoperoxidáz nem egyedülálló tulajdonsága, hanem sokkal inkább a hemet koordináló emlős peroxidázok általános jellemzője. A ditirozinképzés mechanizmusát MPO segítségével vizsgálták. A MPO oxidája a tirozint, mely során tirozil-gyök képződik. Két fehérjéhez kötött tirozil-gyök reagálásával o,o’-ditirozin keletkezik. A humán plazma szabad tirozin koncentrációja 55 µM, a vénás vérben 22 és 83 µM között ingadozik. Mivel az MPO-katalizálta ditirozin-képződés fiziológiás klorid koncentráció mellett is jelentős, a reakcióban képződött tirozil-gyököt az oxidatív szövetkárosodás egyik fő markerének tartják (116).
45
4. CÉLKITŰZÉSEK Kísérleteinkben a következő célokat tűztük ki magunk elé: 1. A laktoperoxidáz-katalizálta ditirozinképzés in vitro jellemzése, emlős szervezetben betöltött funkciójának vizsgálata és annak meghatározása, hogy a reakció alkalmas-e a H2O2 kvantitatív meghatározására. 2. A humán peroxidazin enzim peroxidáz aktivitásának meghatározása és a peroxidazin szöveti expressziójának, valamint intracelluláris lokalizációjának vizsgálata. 3. Húgyhólyag epitél sejtek H2O2-termelő képességének vizsgálata, a termelt H2O2 enzimatikus forrásának azonosítása, valamint annak meghatározása, hogy a légúti nyálkahártyákhoz
hasonlóan,
az
urotélium
antibakteriális rendszerrel.
46
rendelkezik-e
hasonló
Duox-LPO
5. MÓDSZEREK 5.1. Felhasznált antitestek és anyagok A kísérletekben használt anti-Duox poliklonális antitestet Dr. Xavier de Deken (Université Libre de Bruxelles, Brüsszel, Belgium) bocsátotta rendelkezésünkre (117). Az anti-PDI antitestet az Abcam cégtől vásároltuk. A GSK 1016790A, ATP, thapsigargin, DPI, LPO és PerfectHyb™ Plus hibridizációs puffer a Sigma-Aldrich-tól származik. A következő anyagok az Invitrogen™ Life Technologies cégtől származtak: Alexa-488 és Alexa-568 konjugált másodlagos antitestek, Freestyle 293F sejtvonal, pcDNA™3.1
plazmid,
Lipofectamine2000,
Amplex
Red
reagens.
A
szövettenyésztéshez használt flaskákat és fluoreszcens méréshez használt lemezeket a Greiner Bio-One GmbH-tól vásároltuk. A Fugene6 transzfekciós reagenst és FastStart DNA Master SYBR Green I mixet a Roche cégtől vásároltuk. A sejttenyésztéshez használt DMEM és magzati borjú szérum (FBS), valamint a Vialight Plus KIT a Lonza cégtől származott. A proteináz K, Taq DNS polimeráz és Reverz transzkriptáz enzimeket a Fermentas cégtől vásároltuk. A kísérleteinkben használt extracelluláris Hmédium összetétele: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,8 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 5 mM glukóz, pH = 7,4. 5.1.1. Poliklonális anti-PXDN antitest előállítása A poliklonális anti-hPXDN antitest előállításához nyulakat immunizáltunk ismételt
intrakután
injekcióval,
melyhez
glutation-S-transzferáz-PXDN
fúziós
fehérjével kevert Freund-adjuvánst használtunk. A fúziós fehérje a humán PXDN 13291479 aminosavait tartalmazta. A nyúl szérumból az antitestet az immunizáláshoz használt antigénnel fedett Affigel 10 (BioRad Laboratories) gyöngyökkel tisztítottuk a gyári protokollban leírtak szerint.
47
5.2. Nox4-et stabilan kifejező Freestyle 293F sejtvonal létrehozása A Freestyle 293F humán embrionális vese sejtvonalat 10%-os fetális borjú szérumot, valamint penicillint (100 U/ml) és streptomycint (50 μg/ml) tartalmazó Dulbecco’s modified Eagle’s médiumban (DMEM) tenyésztettük. A humán Nox4 gén kódoló régióját pcDNA3.1 V5/His TOPO vektorba illesztettük TOPO klónozó kit segítségével. A vektorban PCMV promóter, valamint Neomicin rezisztencia gén található, ezért ezzel transzfektálva a 293F sejteket, geneticin szelekció után Nox4-et stabilan expresszáló klónokat kaptunk. A transzfekciót megelőző napon 1,2 millió Freestyle 293F sejtet raktunk egy 10 cm-es átmérőjű sejttenyésztő Petri-csészébe 12 ml DMEM médiumban. A sejteket pcDNA3.1-Nox4 DNS-sel transzfektáltuk Fugene6 transzfekciós reagenssel a gyártó által megadott utasítások szerint. A következő napon 800 µg/ml G418-al megkezdtük a szelekciót, amit addig folytattunk, amíg az 5. nap után jól elkülöníthető, a szelekciót túlélő sejtcsomók jelentek meg. A túlélt, Nox4-et stabilan expresszáló klónokból 24 dbot izoláltunk, melyeket 12-lyukú plate-en növesztettünk tovább a szelekció fenntartása mellett. A konfluencia elérése után minden lyukból a sejteket 2 db 6-lyukú plate-en tenyészettük tovább. Az egyik plate-ről a klónokat fagyasztottuk, a másikról RNS-t izoláltunk és Northern blottal vizsgáltuk a Nox4 mRNS kifejeződését. 5.2.1. Nox4 és peroxidazin mRNS kifejeződésének detektálása Northern blot módszerrel A Nox4-et stabilan expresszáló klónokból Trizol reagenssel RNS-t izoláltunk a gyártó által leírt utasítások szerint. Az RNS-ekből RNS gélen 15-15 µg-ot elválasztottunk, majd az RNS-t 10x SSC oldatban egy éjszakán át Whatman Nytran™ nylon-membránra
blottoltuk.
Az
RNS-t
a
membránon
UV
besugárzással
keresztkötöttük. A membránt 1 órán át 65ºC-on hibridizációs kamrában előinkubáltuk 5 ml PerfectHyb™ Plus hibridizációs pufferben, majd egy éjszakán át P32-izotóppal jelölt próbával hibridizáltattuk 65ºC-on. A próbához a teljes Nox4 kódoló részt használtuk, melyet BstXI restrikciós enzimmel vágtunk ki pcDNA3.1 vektorból és az Amersham cég Ready-To-Go (-dCTP) jelölő kit-tel jelöltük a használati utasítás szerint.
48
A jelölt membránt kétszer 15 percig szobahőmérsékleten mostuk 2x SSC 0,1 % SDS oldatban, majd a radioaktív jelet egy éjszakán át -80 ºC-on FUJI Super RX filmen detektáltuk. A humán PXDN mRNS expressziójának vizsgálatához a Clontech cég humán Northern blot szövetpanelét használtuk (2-2 µg poli [A]+ RNS). Hibridizációs próbának a PXDN mRNS 3’ le nem fordított régióját jelöltük. 5.3. COS-7 sejtek tenyésztése és tranziens transzfekciója A COS-7 sejteket 10%-os fetális borjú szérumot, valamint 50 U/ml penicillint és 50 μg/ml streptomycint tartalmazó DMEM médiumban tenyésztettük 37 ºC-os 5 % CO2-ot tartalmazó inkubátorban. A PXDN kódoló régióját tartalmazó pcDNA3.1 plazmidot Fugene6 vagy Lipofectamine2000 transzfekciós reagensekkel transzfektáltuk a gyártók által megadott utasítások szerint. 5.4. Peroxidáz aktivitás mérése A PXDN cDNS-ével transzfektált COS-7 sejteket két nappal a transzfekció után 1 % hexadeciltrimetilammónium-bromidot tartalmazó PBS-ben lizáltuk, majd azonnal mértük a peroxidáz aktivitást Amplex Red peroxidáz KIT-tel a használati utasításban leírtak szerint. A reakcióban keletkezett rezofurin mennyiségét 30 perc után 590 nm hullámhosszon mértük. Kontrollként üres pcDNA3.1 plazmiddal transzfektált COS-7 sejtlizátumot használtunk. 5.5. Urotél sejtek és Nox4-et kifejező FreeStyle 293F sejtvonal H2O2-termelésének mérése 5.5.1. H2O2-mérés Amplex Red módszerrel A 293F kontroll és Nox4-et stabilan expresszáló sejteket tripszinnel mobilizáltuk, majd 1 millió/ml-es koncentrációban H-médiumban szuszpendáltuk. A sejtszuszpenzióból 100-100 µl-t fekete 96-lyukú plate-re mértük és hozzáadtunk 100-
49
100 µl 50 µM Amplex Red-et és 0,1 U/ml HRP-t tartalmazó 1x reakció puffert. Fél óra 37 ºC-os inkubálás után 590 nm-en mértük a keletkezett rezofurin mennyiségét. A méréseket 3 párhuzamossal végeztük, melyek átlagát és a szórást ábrázoltuk. Kontrollként Amplex Red-et tartalmazó oldatot használunk. Az urotél sejtek által termelt H2O2-ot szintén H-médiumban mértük. A frissen izolált urotél sejtek stimuláláshoz thapsigargint (200 nM), NaATP-t (10 µM) vagy GSK 1016790A (10 nM) TRPV4 agonistát használtunk. 60 perc 37 ºC-os inkubálás után mértük a képződött rezofurin mennyiségét. Kontrollként Duox1 KO egerekből izolált Duox1-deficiens urotél sejteket használtunk vagy a vad típusú sejteket 37 ºC-on 10 percig 5 µM DPI-vel előkezeltük. Minden mérést 3 párhuzamossal végeztünk. Egyegy pontban a preparálástól függően 20-50000 urotél sejtet mértünk. A kapott fluoreszcencia értékeket 10000 sejtre normalizáltuk és a változást a nem stimulált sejtekre vonatkoztatva ábrázoltuk.
5.5.2. H2O2-mérés laktoperoxidáz-ditirozin módszerrel A sejteket 1 millió/ml-es koncentrációban H-médiumban szuszpendáltuk. A sejtekből 100-100 µl-t 96-os fluoreszcens plate lyukaiba mértünk és hozzáadtunk 100-100 µl 2 mM tirozint, 1 µg/ml LPO-t tartalmazó H-médiumot. 30 perces 37 ºC-os inkubálás után, 320 nm excitációs és 405 nm emissziós hullámhosszon, mértük a keletkezett ditirozin mennyiségét, ami arányos a termelt H2O2 mennyiségével. Kontrollként laktoperoxidázt nem tartalmazó H-médiumot használtunk. Minden kísérletben 3 párhuzamost mértünk és ezek átlagát, valamint a szórást ábrázoltuk. 5.6. Kísérletek humán vérplazmával 5.6.1. Plazma preparálás A frissen levett humán vért PBS-ben oldott heparinnal (végkoncentráció 125 IU) alvadásgátoltuk, a plazmát centrifugálással (1200 g, 4 ºC, 10 perc) elválasztottuk a sejtektől és a sejtmentes felülúszót azonnal felhasználtuk. Minden kísérlethez frissen izolált plazmát használtunk.
50
5.6.2. Plazmafehérjék keresztkötése laktoperoxidázzal A plazmához 12,5 mg/ml LPO-t és 2 mM H2O2-ot adtunk, majd 30 percig 37 ºC-on inkubáltuk. A keletkezett ditirozin mennyiségét fluoriméteren mértük. Kontrollként a LPO-t és a H2O2-ot steril PBS-sel helyettesítettük, majd a többi mintával megegyező módon kezeltük. A ditirozinképződést HPLC-MS módszerrel is igazoltuk. 5.7. A ditirozin detektálása HPLC-MS módszerrel A laktoperoxidázzal és hidrogén-peroxiddal kezelt plazma mintákat 6 N sósavban 110 ºC-on 24 órát hidrolizáltuk, majd a mintákat bepároltuk. A bepárolt mintákat 2 ml metil-alkoholban oldottuk, majd liofilizáltuk és végül desztillált vízben szuszpendáltuk. A savas hidrolízisen átesett mintákból a HPLC méréseket Dr. Szabó T. Pál, a Magyar Tudományos Akadémia Kémiai Kutató Intézetének munkatársa végezte egy PerkinElmer Series 200-as HPLC készüléken, amelyhez egy Applied Biosystems 3200QTrap tömegspektrométer volt csatlakoztatva detektorként. A mobil fázis 10 mM ammóniumformiát és acetonitril elegye volt, a térfogatáram pedig 400 µl/perc. A mintákból 10 µl-t vittünk fel az oszlopra. A mintákban a ditirozin mellett a triptofán aminosavak mennyiségét is meghatároztuk, majd erre normalizáltuk a mért ditirozin mennyiségeket. 5.8. Western blot kísérletek A plazma mintákat, COS-7 és urotél sejt lizátumokat 4x Laemmli mintapufferben denaturáltuk. A plazma mintákat és a COS-7 sejtlizátumokat 10 percig 100 ºC-on denaturáltuk. A plazma mintákat 10 %-os, az egér urotél és COS-7 sejtlizátumokat pedig 8 %-os SDS-poliakrilamid gélen szeparáltuk. A gélen elválasztott fehérjéket nitrocellulóz membránra blottoltuk (12 óra, 45 V), majd 5 %-os tejport és 0,1 % Tween 20-at tartalmazó PBS-ben blokkoltuk. Az elsődleges antitestekkel 1 órát inkubáltuk a blokkoló oldatban, majd 6x5 perces mosás után, HRP-konjugált anti-nyúl másodlagos antitestet használtunk 1:5000 hígításban, melyet egy kemilumineszcencia elven működő eljárással (ECL, GE Healthcare) előhívtunk, majd a jelet FUJI Super RX
51
filmen detektáltuk. Anti-hLPO, anti-Duox és anti-PXDN poliklonális antitesteket 1:1000-es hígításban használtuk. 5.9. A Duox1 egértörzs genetikai jellemzői és visszakeresztezése C57BL/6 háttérre A Duox1 knockout egér törzset a Lexicon Genetics cégtől vásároltuk meg (OmniBank nyilvántartási száma: XM_130483.4). A knockout egeret egy lentivirális targetáló kazetta segítségével az ún. géncsapda módszerrel hozták létre. Amikor a transzkripció a beépült kazetta poliadenilációs szignáljához ér, a génátírás megakad, és a keletkezett rövidebb mRNS lebomlik, fehérje nem keletkezik. A beépült kazetta helyét szekvenálással azonosították. A Duox1 knockout egerek vegyes, 129/SvEvBrd és C57BL/6J genetikai háttéren érkeztek. Szerettük volna, ha a Duox1 knockout törzsünk homogén C57BL/6 genetikai háttérrel rendelkezik, ezért elvégeztük az egerek visszakeresztezését. Először a Duox1 génre heterozigóta nőstény egereket kereszteztünk C57BL/6 hím egérrel, majd ebből az első (F1) generációból a heterozigóta hím egereket kereszteztük tovább C57BL/6 nőstényekkel (F2), amit hasonlóképpen folytattunk az F8 generációig. Az F3, F4 és F5 generációkban született hím egerek genomját a Jackson Laboratory ún. speed congenic programjában vizsgálták. A Jackson Laboratory a genomiális DNS-ekben C57BL/6 egértörzsre jellemző genetikai markereket vizsgált, ami alapján a genetikai azonosság mértékét
a
C57BL/6
törzzsel
%-ban
kifejezték.
Az
F5
generációban
a
továbbkeresztezett Duox1 heterozigóta hím 99,5 %-ban volt azonos a C57BL/6 törzzsel, ennek leszármazottait még kétszer kereszteztük C57BL/6 nősténnyel és végül ezek utódait (F8-as generáció) használtuk a kísérletekhez. 5.10. Duox1 egerek genotipizálása 5.10.1. Genomiális DNS izolálás egérfarokból Az egerek farkából levágtunk egy 0,5 cm-es darabot, melyet egy éjszakán át 0,5 ml 10 µM Proteináz K enzimet tartalmazó farok-lízis pufferben 56 ºC-on emésztettünk. A DNS-t 500 µl fenol-kloroform-izoamilalkohol (25:24:1 v/v %) hozzáadásával
52
extraháltuk, majd 10 perces 16000 g-en történő centrifugálással szeparáltuk. A DNS tartalmú felülúszót egy új 1,5 ml-es Eppendorf-csőbe pipettáztuk, majd 1 ml 95 %-os etil-alkohollal a DNS-t kicsaptuk és centrifugáltuk (10 perc, 16000 g). 1 ml 70 %-os etil-alkoholos mosás (5 perc, 5400 g) és száradás után 50 µl Tris-EDTA pufferben oldottuk. Az oldódást 1 órás 55 ºC-os melegítéssel segítettük. A PCR reakciókhoz genomiális DNS-ek tízszeres hígításából 1 µl-t használtunk. 5.10.2. Duox1 egerek genotípusának meghatározása PCR reakcióval A genotipizálás a Duox1 gént megszakító trapping kazetta helyspecifikus kimutatásán alapszik. A génhiányos és vad típusú PCR termékek amplifikálása két külön reakcióban zajlik (1. és 2. táblázat). 1. táblázat: Duox1 knockout egér genotipizáláshoz használt primerek. Primer neve Primer szekvenciája Rev2
5’-GTGAATCAAGACATAGTTAACC-3’
vad típus
For2
5’-CCTTCCTGCTCCTTCTTACC-3’
vad típus és knockout
LTRRev2
5’-ATAAACCCTCTTGCAGTTGCATC-3’ knockout 2. táblázat: A Duox1 genotipizálás PCR kondíciói T (ºC) t (perc) 1.
denaturálás
94
3
2.
denaturálás
94
0,5
55
0,5
35x tapadás
3.
amplifikálás 72
0,75
amplifikálás 72
2
53
+/-
KO
]
]
VT
]
A PCR reakcióban kapott termékeket 1,5 % -os gélen elválasztottuk és értékeltük.
21. ábra: A genotipizálás PCR eredménye. Egy vad típusú, egy heterozigóta és egy Duox1 knockout egérből készült reprezentatív PCR reakció. A kapcsos zárójelek első oszlopában a knockout allél egy kb. 350 bp-os termékét, a második oszlopban a 433 bp-os vad típusú terméket amplifikáljuk.
5.11. RT-PCR kísérletek A frissen izolált egér urotéliumokból Trifast reagens segítségével teljes RNS-t izoláltunk a gyári protokollban leírtak szerint. Az RNS-ekből 1-1 µg-ot RNS gélen szeparáltunk és ellenőriztük az RNS minőségét. Koncentrációmérés után 1-1 µg RNSből, 20 µl térfogatban cDNS-t szintetizáltunk, melyhez oligo(dT)18 primert és M-MuLV reverz transzkriptáz enzimet használtuk a gyártó által javasolt reakció körülmények szerint. A cDNS-ből 1-1 µl-eket (50 ng RNS) használtunk a RT-PCR reakciókhoz, melyeket a Roche LightCycler 1.5 készülékén LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I
reakció mix-el végeztük 2,25 mM Mg2+ és 0,5 µM primer
koncentrációk mellett, összesen 10 µl reakciótérfogatban. A primereket mindig olyan szomszédos exonokra terveztük, amelyek legalább 500 bp-os intronnal voltak szeparálva, hogy kiküszöböljük a genomiális DNS szakaszok felerősítését. A következő protokollt használtuk: 95 ºC 10 perc, majd 40-szer ismételve 95 ºC 10 s, 60 ºC 5 s, 72 ºC 11-15 s elongáció (PCR termék mérete bp/25), végül egy olvadási görbét vettünk fel 65 ºC-tól 95 ºC-ig 0,1 ºC/s sebességgel. Az eredmények értékeléséhez a LightCycler Softwere 4.05 programot használtuk. Az ún. jellemző ciklusszámot (Cp: crossing point), ahol az amplikon mennyisége eléri a detektálási küszöböt, a 2. derivált módszerrel határoztuk meg. Egy hígítási sorral minden primerpárnak meghatároztuk a hatékonyságát (efficiency). Minden mintában az adott gén primerjeinek hatékonysága alapján számolt mennyiségét elosztottuk a háztartási gén, esetünkben a β-aktin
54
mennyiségével, majd ezeket a relatív expressziókat ábrázoltuk. A reakciókban használt primereket a 3. táblázat tartalmazza. 3. táblázat: A kísérletekben használt RT-PCR primerek. Primer neve
Primer szekvenciája
RT-PCR primerek: Mm Duox1 F
5’- TACATCAGCCAGGAGAAGATCTGC -3’
Mm Duox1 R 5’- TACATCAGCCAGGAGAAGATCTGC -3’ Mm Duox2 F
5’- TCCATTAGTGAGTCTGATTGTC -3’
Mm Duox2 R 5’-GTTTGTCAAGGACCTGCAGACT -3’ Rat β-aktin F
5’- CTCGCCATGGATGACGATATCGC -3’
Rat β-aktin R
5’- CTGGGTCATCTTTTCACGGTTGG -3’
5.12. Immunhisztokémia fagyasztott metszeteken A Duox1 KO és vad típusú egerekből származó szöveteket TissueTek OCT oldatban, szárazjégen beágyaztuk, majd a metszetek készítéséig -20 ºC-on tároltuk. A beágyazott szövetekből Lukácsi Erika, a Semmelweis Egyetem Anatómia, Szövet- és Fejlődéstani Intézetének munkatársa 8 µm-es metszeteket készített, melyeket 10 percig acetonban fixált, végül felhasználásig – 20 ºC-on tároltuk. Immunfestés előtt a metszeteket 30 percig szobahőmérsékleten szárítottuk, majd 10 percig ismét acetonban fixáltuk. 1 órát 1 % albuminnal és 2 % kecske szérummal kiegészített PBS-ben blokkoltunk, majd 2 órát inkubáltuk Duox ellenes poliklonális antitesttel 1:150-es hígításban. Hatszor 5 percig PBS-ben mostuk, majd másodlagos antitestként a blokkoló oldatban 1:1000 hígításban Alexa-488 vagy Alexa-568 fluorofórral konjugált anti-nyúl kecske szérumot használtunk. Végül a metszeteket hatszor 5 perces mosás után Vectashield® (Vector Laboratories) médiumban fedőlemezzel fedtük és 4 ºC-on tároltuk. 5.13. Immunfluoreszcens festés és konfokális mikroszkópia A
fedőlemezen
növesztett,
majd
transzfektált
COS-7
sejteket
4
%
paraformaldehid tartalmú PBS-ben fixáltuk. Ezután PBS-sel ötször mostuk, majd
55
100 mM glicint tartalmazó PBS-ben inkubáltuk. Ezt követően PBS-sel kétszer mostuk, majd 1 % marha szérum albumin és 0,1 % Triton X-100 tartalmú PBS-sel 20 percig szobahőmérsékleten permeabilizáltuk. 3 % albumin oldatban egy órát blokkoltuk, majd anti-PXDN és anti-PDI antitesttel egy órát inkubáltuk. A primer antitetestet 3 % albumint tartalmazó PBS-ben oldottuk. Inkubálás után PBS-ben hatszor mostuk, majd 1 órát inkubáltuk a másodlagos antitesttel. Végül a fedőlemezeket Mowiol 4-88 (polivinilalkohol 4-88 és glicerin vizes oldata, pH Tris-sel 8,5-re állítva) médiumban fedtük. A felvételeket egy Zeiss LSM 510 konfokális lézer mikroszkóppal 63x-os, 1,4 numerikus apertúrájú plan Apochromat vagy 40x-es, 1,3 numerikus apertúrájú plan Neofluar immerziós objektívekkel készítettük. Az excitációhoz 25 mW-os argon lézert (488 nm) és 1 mW-os hélium/neon lézert (543 nm) alkalmaztunk. Az emissziót 500530-nm-es szűk sávú filterrel detektáltuk az A488 és egy 560-nm felett átengedő széles sávú filterrel az A568 fluorofór esetében. 1-2 µM optikai szeletvastagságú képeket készítettünk. A fluorofórok közötti átbeszélés elhanyagolható volt. 5.14. Primer egér urotélium sejtek preparálása A vad típusú és Duox1 génhiányos egereket dietil-éterrel elkábítottuk, majd cervikális diszlokáció után a húgyhólyagokat eltávolítottuk és szilikon gélt tartalmazó kristályosító csészében, H-médiumban, a húgycső felől injekciós tűvel rögzítettük. A hólyagot középen kettévágtuk, az urotéliumot és a húgyhólyag többi részét egy-egy csipesszel megfogtuk, majd óvatosan kettéválasztottuk. A hólyagról leválasztott urotélium réteget PBS oldatban egyszer öblítettük, majd 1 ml 200 mg/l-es tripszin-EDTA oldatban 30 percig 37 ºC-on emésztettük. Tripszin-neutralizáló oldat hozzáadása után a sejteket 10 percig 500 g-vel centrifugáltuk, majd a felülúszót eltávolítva a sejteket Hmédiumban szuszpendáltuk, mérésig szobahőmérsékleten tartottuk. Az állatkísérleteket a 22.1/1100/003/2008-számú etikai engedélyben leírtak szerint végeztük. 5.15. Statisztikai analízis Az adatokat átlag ± szórás formában mutatjuk. A csoportok közötti különbségeket Tukey és Student-Newman-Keuls teszttel kombinált Kruskal-Wallis nem-parametrikus
56
varianciaanalízissel vizsgáltuk, a SigmaStat for Windows 3.5 program (Systat Software Inc., Richmond, CA) segítségével. A 0,05-nél kisebb p értéket tekintettük szignifikánsnak.
57
6. EREDMÉNYEK
6.1. Laktoperoxidáz-katalizálta ditirozinképzés 6.1.1. A ditirozinképződés detektálása A laktoperoxidáz enzim H2O2 jelenlétében nagy hatékonysággal alakítja át az oldatban lévő tirozin aminosavakat ditirozinná, mely egy jól detektálható fluoreszcens vegyület. A reakció (22. ábra) a következő egyenlet szerint megy végbe:
2 Tyr + H2O2
LPO
diTyr + 2 H2O
22. ábra: A ditirozinképződés reakcióegyenlete.
A ditirozin mennyisége fluoriméteren 320 nm excitációs és 405 nm emissziós hullámhosszon mérhető. Ditirozint csak akkor detektáltunk, ha a reakcióelegyben tirozin, hidrogén-peroxid és laktoperoxidáz egyaránt jelen volt (23. ábra). Kataláz enzim hozzáadásával a ditirozinképződés gátolható volt, ami igazolja, hogy a laktoperoxidáz ditirozinképzéséhez H2O2 szükséges.
58
RFE (átlag ± szórás)
40000
30000
20000
10000
K at
2
O
O 2
H
Ty r LP
O
+
L-
LP
O
Ty r
+
+
L-
LP
2
+
2
H +
+ O
+ O LP
2
O 2
H
L-
LP
Ty r
O
0
23. ábra.: Laktoperoxidáz-katalizálta ditirozinképzés hidrogén-peroxid jelenlétében. A ditirozint 320 nm excitációs és 405 nm emissziós hullámhosszon detektáltuk. A reakcióban 10 µM H2O2-ot, 1mM L-Tyr-t és 1 µg/ml LPO és 1000 U/ml katalázt alkalmaztunk. Bármely komponens kihagyása a reakció elegyből, nem eredményez ditirozin fluoreszcencia növekedést.
Szervezetünk fehérjéit L-aminosavak alkotják, szerves kémiai szintézissel azonban előállítható az aminosavak sztereoizomerje, amelyeket D-aminosavaknak nevezünk. Az enzimek általában csak az egyik fajta enantiomert képesek átalakítani. Mivel a sztereoizomerek fizikai és kémiai tulajdonságukban nem, csak a polarizált fény síkjának forgatási irányában különböznek, kíváncsiak voltunk, hogy a laktoperoxidáz képes-e D-tirozint is keresztkötni. A laktoperoxidáz a D-tirozint az L-tirozinhoz hasonló affinitással képes ditirozinná alakítani (24. ábra). Az enzimnek e tulajdonsága azért lehet hasznos, mert D-tirozin használatával olyan biológiai rendszerekben is alkalmas lehet az LPO-katalizálta ditirozinképzés H2O2 detektálásra, ahol az L-tirozin mennyisége csökken, például aminosav transzport következtében.
59
RFE (átlag ± szórás)
30000
20000
10000
K
at
2
O
H LP
O
+
D
LP
O
-T y
r
+
+
D
H
-T yr
2
+
2
+
2
O
2
O 2
+ O LP
LP
O
+
D
H
-T
LP
yr
O
0
24. ábra: Laktoperoxidáz-katalizálta ditirozinképzés D-tirozinból. A reakcióban 10 µM H2O2-ot, 1mM D-Tyr-t és 1 µg/ml LPO-t és 1000 U/ml katalázt használtunk. Bármely komponens kihagyásával a ditirozin képzés elmarad. A reakcióhoz adott H2O2 kataláz enzimmel történő lebontásakor ditirozin nem képződött.
6.1.2. A ditirozinképzés jellemzése A továbbiakban a LPO katalizálta ditirozinképzés reakciókörülményeit jellemztük. Elsőként a szükséges és elégséges tirozin koncentrációt vizsgáltuk. A laktoperoxidáz ditirozinképzését már 100 µM tirozin is támogatta, és a tirozin koncentrációt egészen 2 mM-ig emelve, a keletkezett ditirozin koncentrációja emelkedett (25. ábra). 2 mM-os tirozin koncentráció fölött mérést nem végeztünk, mivel a tirozin rossz oldhatósága miatt töményebb homogén tirozin oldatot nem tudunk előállítani.
60
RFE (átlag ± szórás)
6000 5000 4000 3000 2000 1000
2. 00
1. 50
1. 00
0. 50
0. 10
0. 01
0
[Tyr] (mM)
25. ábra: A laktoperoxidáz katalizálta ditirozinképzés tirozin függése. A kísérletben a tirozin koncentrációt 10 µM és 2 mM között változtattuk, miközben a LPO (0,5 µg/ml) és a H2O2 (5 µM) koncentrációk azonosak voltak.
A reakcióhoz szükséges laktoperoxidáz mennyiségének a meghatározásához LPO hígítási sort készítettünk, melyben 100 ng/ml és 5 µg/ml között változtattuk az enzim koncentrációt (26. ábra). A mért fluoreszcencia 600 ng/ml-es laktoperoxidáz koncentrációig emelkedik, viszont 600 ng/ml fölött a ditirozin mennyisége már nem változik, tehát 600 ng/ml-es LPO koncentráció is elég az oldatban lévő 1 mM tirozin átalakításához.
RFE (átlag ± szórás)
25000 20000 15000 10000 5000
0 5.
0 1.
8 0.
6 0.
4 0.
2 0.
1 0.
0.
0
0
[LPO] (g/ml)
26. ábra: A laktoperoxidáz katalizálta ditirozinképződés LPO-függése. A laktoperoxidáz mennyiségét 100 ng/ml és 5 µg/ml között változtattuk, miközben a L-Tyr (1 mM) és H2O2 (5 µM) koncentrációkat állandó értéken tartottuk.
61
A ditirozinképződés LPO és Tyr koncentráció-függését azért vizsgáltuk, mert a reakció H2O2 koncentráció meghatározásra csak akkor alkalmazható, ha a LPO-t és tirozint feleslegben adjuk, így a reakció egyedüli limitáló komponense a H2O2 lesz. A következő kísérletben a ditirozinképződés kinetikáját vizsgáltuk. A mérés elindítása után 5 µM H2O2-t injektáltunk a reakcióhoz és a ditirozin fluoreszcencia-változást időben követtük (27. ábra). A H2O2 hozzáadásakor a ditirozin fluoreszcencia gyors emelkedését tapasztaltuk, mely kb. 2 perc után érte el a maximumot és beállt egy stacionárius állapot. 5 µM H2O2 ismételt adagolásával további fluoreszcencia növekedést tapasztaltunk, mely alapján arra következtettünk, hogy a hozzáadott H2O2 elfogyott, tehát a választott LPO és tirozin koncentrációk mellett a reakció alkalmas lehet a H2O2 mennyiségi meghatározására.
5 M
RFE (átlag
szórás)
5 M
30000
20000
10000
0 0
10
20
30
40
50
60
idõ (perc)
27. ábra: Az LPO-katalizálta ditirozinképződés kinetikája. A mérés megindítása után a nyilakkal jelzett időpontokban két alkalommal 5 µM H2O2-ot injektáltunk, majd időben követtük a ditirozinképződést. A reakcióban 0,5 µg/ml LPO-t és 1 mM Tyr-t használtunk.
Szerettük volna vizsgálni, hogy a ditirozinképzés lineárisan függ-e a H2O2koncentrációtól, ehhez 20 nM és 100 µM közötti koncentráció-tartományban hígítási sort készítettünk, és mértük a keletkező ditirozin mennyiségét. Alacsonyabb koncentráció-tartományban, körülbelül 20 µM-ig a H2O2-koncentráció arányos a mért ditirozin fluoreszcenciával, a mérési eredményekre egyenes illeszthető és már 500 nM
62
H2O2 is kimutatható. 60 µM-os koncentráció fölött a ditirozin fluoreszcencia csökkenni kezdett, ami arra utal, hogy nagyobb mennyiségű H2O2 gátolja az enzim aktivitását (28. ábra).
60000
RFE (átlag ± szórás)
RFE (átlag ± szórás)
40000
30000
20000
10000
0
50000 40000 30000 20000 10000 0
0
5
10
15
20
0
[H2O2] (M)
25
50
75
100
[H2O2] (M)
28. ábra: A laktoperoxidáz-katalizálta ditirozinképzés H2O2 függése. A kísérletben a LPO (2µg/ml) és Tyr (1 mM) koncentrációkat állandó értéken tartottuk, míg a H2O2 koncentrációt 20 nM és 100 µM értékek között változtattuk. A ditirozinképződés 20 µMig lineárisan függ a H2O2 koncentrációtól és már 0,5 µM is támogatja a ditirozin képződést. 60 µM fölötti H2O2 koncentráció gátolta a ditirozinképződést.
A LPO szubsztrát-specificitásának a megállapításához vizsgáltuk, hogy a hidrogén-peroxid mellett más reaktív oxigén származékokkal - mint például a szuperoxid vagy a peroxinitrit - kiváltható-e ditirozinképzés. A xantin/xantin oxidáz rendszer által termelt szuperoxid látszólag képes volt támogatni a ditirozinképződést, de kataláz hozzáadásával igazoltuk, hogy a LPO valójában nem a szuperoxiddal, hanem a belőle spontán dizmutációval képződött H2O2-dal lépett reakcióba. Peroxinitrit sem önmagában, sem laktoperoxidáz jelenlétében nem támogatta a ditirozinképződést.
6.1.3. A ditirozinképzés alkalmazása 6.1.3.1. Glükóz-oxidáz termelte H2O2 mérése ditirozinképződéssel A glükóz-oxidáz a β-D-glükózt D-glükuno-1,5-laktonná alakítja, ami tovább hidrolizál D-glükuronsavvá. A folyamat során H2O2 keletkezik. Érdekes tény, hogy mézben a glükóz-oxidáz a levegő oxigénjével érintkezve, azt hidrogén-peroxiddá
63
alakítja, ami a méz természetes antimikrobiális vegyülete. A glükóz-oxidáz által termelt H2O2-ot sikeresen mértük a LPO-katalizálta ditirozinképzéssel (29. ábra). B
A
40000
szórás)
szórás)
40000
30000
20000
RFE (átlag
RFE (átlag
20000
30000
G + GO G + GO + Kat
10000
0
10000
0 0
5
10
15
20
25
G
30
G + GO
G + GO + Kat
idõ (perc)
29. ábra: A glükóz-oxidáz által termelt H2O2 mérése LPO-katalizálta ditirozinképződés alapján. A. A LPO ditirozinképzése alkalmas a glükóz-oxidáz által termelt H2O2 követésére. 500 U/ml kataláz hozzáadása teljesen gátolta a ditirozinképzést. B. Ditirozin fluoreszcencia 30 perces 37 ºC-os inkubálás után. A kísérletben 5 mU/ml glükózoxidázt, 1 µg/ml LPO-t, 1 mM tirozint használtunk. A H-médium 5 mM glükózt tartalmazott.
6.1.3.2. Nox4-termelte H2O2 mérése ditirozinképzéssel A továbbiakban azt vizsgáltuk, hogy a laktoperoxidáz katalizálta ditirozin képződés alkalmas-e a sejtek által termelt H2O2 detektálására. Ehhez Nox4-et stabilan expresszáló Freestyle 293F humán embrionális vese sejtvonalat hoztunk létre, melyben a Nox4 fehérjével komplexet alkotó p22phox endogén módon kifejeződik. A humán Nox4 kódoló régióját tartalmazó pCDNA3.1 vektorral transzfektált sejteket Geneticinnel szelektáltuk. Az antibiotikumrezisztens klónokat kiterjesztettük, majd a sejtekben Northern blot technikával vizsgáltuk a Nox4 mRNS kifejeződésének mértékét (30. ábra).
64
2.4 kB 30. ábra. Nox4 mRNS kifejeződésének vizsgálata 293F sejtvonalban Northern blot technikával. A G418-rezisztens klónokból 15-15 µg teljes RNS-t gélen szeparáltunk, majd nitrocellulóz membránra blottoltuk és P32-izotóppal jelölt Nox4 cDNS-el hibridizáltuk. A nyilak Nox4-et nagy mennyiségben kifejező klónokat mutatnak. A Nox4 hírvivő RNS 2,4 kB nagyságú.
Egy a Nox4 mRNS-t nagymértékben expresszáló klón H2O2-termelését detektáltuk Amplex Red és ditirozin módszerrel egyaránt (31. ábra). A reakció H2O2-specificitását a kataláz hatására mérhető fluoreszcencia csökkenés mutatja. B
A
1500
(átlag ± szórás)
3000 2500 2000 1500 1000 500 0
1250 1000 750
AR
3500
500
RFE
RFE
DT
(átlag ± szórás)
4000
250 0
Nox4
Nox4+DPI Nox4+Kat kontroll
Nox4
Nox4+DPI Nox4+Kat kontroll
31. ábra: Nox4 aktivitás mérése LPO-katalizálta ditirozinképzéssel és Amplex Red módszerrel. A. Nox4-et expresszáló 293F sejteket 0,5 µg/ml LPO és 1 mM tirozinnal inkubáltuk Hmédiumban 30 percig 37ºC-on, majd mértük a ditirozin fluoreszcenciát. B. A sejtek által termelt H2O2-ot Amplex Red módszerrel is mértük. A 30 perc alatt keletkezett fluoreszcens rezofurin mennyiségét detektáltuk. 1000 U/ml kataláz hozzáadása minkét módszer esetén csökkentette a mért fluoreszcenciát. A kontroll nem-transzfektált 293F sejtek H2O2-termelését mutatja.
Egy H2O2 hígítási sor segítségével meghatároztuk a Nox4-et kifejező 293F sejtek egységnyi időre vonatkoztatott H2O2 termelését, ami 8,6 nmol/106 sejt/óra volt. Gyakori tapasztalat, hogy Nox4-et expresszáló sejteknél extracellulárisan nem lehet O2•−-ot mérni, ezért kíváncsiak voltunk, hogy a Nox4-et stabilan kifejező
65
293F sejteknél detektálható-e O2•−. A citokróm-c oxidáláson alapuló módszerrel szuperoxid-termelést azonban nem tudtunk kimutatni. 6.1.4. A ditirozinképződés egy lehetséges funkciója Alacsonyabb rendű élőlényekben leírták, hogy a fehérjék közötti ditirozin keresztkötések részt vesznek a C. elegans hengeres féreg kutikulájának stabilizálásában. Tengeri sünöknél a szekretált ovoperoxidáz ditirozin-kötéseken keresztül stabilizálja a petesejt megtermékenyülése után kialakuló, ún. fertilizációs burkot. Szerettük volna vizsgálni, hogy a laktoperoxidáz is képes-e fehérjék közötti ditirozin-kapcsolódások kialakítására, valamint, hogy ennek mi lehet a fiziológiás következménye. Ehhez olyan kísérleti modellt kerestünk, ami hasonlóan a különféle szekrétumokhoz összetett és magas fehérje tartalommal rendelkezik és a kísérletet megelőzően még nem találkozott laktoperoxidázzal, tehát a benne található tirozin aminosav oldalláncok nagy valószínűséggel még nem keresztkötöttek. Választásunk frissen, heparinnal alvadásgátolt vérből izolált humán plazmára esett, melyben LPO és H2O2 hozzáadása után jelentős ditirozinképződést tudtunk kimutatni. Bármely komponens kihagyása nem eredményezett ditirozin floureszcencia növekedést (32. ábra). A kontrollokban látható fluoreszcenciát háttérnek tekintettük, melynek pontos eredetét nem ismerjük, lehet ditirozin vagy valamilyen plazma alkotó fluoreszcenciája a ditirozin meghatározáshoz használt 320 nm excitációs és 405 nm emissziós hullámhosszakon.
66
RFE (átlag
szórás)
4000
3000
2000
1000
+
2
H
2
LP O
O
2
+
a
LP O
az m pl
az m
a
+
pl
pl
az m
a
+
pl
H
2
az m
a
O
0
32. ábra: A ditirozin kimutatása fluoreszcens méréssel humán plazma mintákban. 100-100 µl frissen izolált heparinnal alvadásgátolt plazmában, 12,5 mg/ml LPO és 2 mM H2O2 hozzáadást követően, 30 perces 37ºC-os inkubálás után fluoriméteren detektáltuk a keletkezett ditirozin mennyiségét. Az ábrán egy reprezentatív mérés látható két párhuzamos mintával, melyet többször mérve hasonló eredményt kaptunk.
Szerettük volna megerősíteni, hogy fluoreszcens módszerrel valóban a keletkezett ditirozin keresztkötéseket mérjük, ezért a ditirozin mennyiségét HPLC-vel (High
Performance
Liquid
Chromatography:
nagy
teljesítményű
folyadékkromatográfia) is meghatároztuk. Tömegspektrométerrel kimutattuk, hogy mind a kontroll, mind a kezelt plazmában volt ditirozin. A folyadékkromatográfiás méréseket a Kémiai Kutató Intézet munkatársa, Dr. Szabó T. Pál fejlesztette és kivitelezte. A méréshez a plazma mintákat savas hidrolízisnek vetettük alá. A HPLC módszerrel kapott ditirozinra jellemző csúcsok integrálját a mintában lévő triptofán mennyiségére normalizáltam (33. ábra). A laktoperoxidázzal és hidrogén-peroxiddal kiegészített mintában jelentős ditirozin mennyiség emelkedés volt detektálható a csak laktoperoxidázt kapott kontrollhoz képest. Ezen kísérletek alapján kijelenthetjük, hogy az ovoperoxidázhoz hasonlóan, a LPO is képes fehérjékhez kötött tirozin oldalláncok keresztkötésére.
67
Terület arány (diTyr / Trp) (átlag szórás)
0.0075
0.0050
0.0025
2
pl
az m
a
+
pl
LP O
az m
+
a
+
H
2
LP O
O
0.0000
33. ábra: A képződött ditirozin mérése HPLC módszerrel humán plazma mintákban. 100-100 µl frissen izolált heparinnal alvadásgátolt plazmát 12,5 mg/ml LPO és 2 mM H 2O2 jelenlétében 30 perces 37ºC-os inkubálás után HPLC-vel mértük a keletkezett ditirozin mennyiségét. A ditirozinra jellemző csúcsok görbe alatti területét a mintában lévő triptofán mennyiségre normalizálva ábrázoltam.
Megvizsgáltuk, hogy a létrejövő fehérje-fehérje kapcsolatoknak milyen hatása lehet a szekrétumokra. A kísérletben a plazmához laktoperoxidázt és H2O2-ot adtunk, majd a fehérje oldatot 8 %-os poliakrilamid gélen elválasztottuk és Coomassie Blue festést végeztünk (34. ábra). Kontrollként a plazmát csak laktoperoxidázt tartalmazó oldattal inkubáltuk. A Coomassie Blue festésről készített fotón megfigyelhető, hogy a H2O2-ot és LPO-t is tartalmazó mintában nagy molekulasúly tartományban a gél sötétebb, valamint, hogy az egyes fehérjékre jellemző csíkok kevésbé diszkrétek (34. ábra). Mindezen megfigyelések arra utalnak, hogy a plazmában ditirozin kötésen keresztül kapcsolt fehérjekomplexek jöttek létre.
68
250 kDa
130 kDa
plazma + LPO + H2 O 2
plazma + LPO
34. ábra: A fehérjék között létrejövő ditirozin keresztkötések detektálása humán vérplazma mintában Coomassie Blue festéssel. A heparinnal alvadásgátolt plazmát 12,5 mg/ml LPO és 2 mM H2O2 jelenlétében 30 percig 37ºC-os vízfürdőben inkubáltuk majd 8 %-os poliakrilamid gélen elválasztva, Coomassie Blue-val festettük. A kontroll mintához csak LPO-t adtunk és azonos körülmények között kezeltük.
A keresztkötött plazma mintákban a LPO-t Western blot módszerrel detektáltuk (35. ábra). A laktoperoxidázzal és H2O2–dal kiegészített plazmában, inkubálás után 250 kDa fölötti molekulasúly tartományban (felső nyíl) keresztkötött fehérje-komplexek jelentek meg. A fehérje-komplexek a laktoperoxidázt is tartalmazták, vagyis az enzim önmagát is a fehérjékhez kötötte. Az alsó nyíl a laktoperoxidáznak megfelelő kb. 95 kDa molekulasúlyú enzimet mutatja, melynek mennyisége csökkent, mivel egy része átkerült a 250 kDa fölött detektált fehérjekomplexekbe.
69
1
2
250 kDa 130 kDa 95 kDa 72 kDa 55 kDa
plazma plazma + LPO + LPO + H2O2
35. ábra: Laktoperoxidáz detektálása humán plazma mintákban Western blot módszerrel. Anti-huLPO antitestet 1:1000-es hígításban használtuk. A felső nyíl a fehérjékhez keresztkötött, az alsó a monomer LPO-t mutatja.
Ezen kísérletek alapján levonhatjuk a következtetést, hogy a LPO a fehérjéket önmagával együtt, ditirozin kötéseken keresztül összekapcsolja, ami nagyobb molekulasúlyú fehérjekomplexek kialakulásához vezet.
70
6.2. A humán peroxidazin vizsgálata 6.2.1. A peroxidazin peroxidáz-aktivitásának vizsgálata Fontos különbség a PXDN és a többi peroxidáz között, hogy a PXDN peroxidázdoménen kívül még számos fehérje-fehérje interakció kialakítására alkalmas domént tartalmaz. A PXDN peroxidáz-doménje tartalmazza a hem csoport kötéséhez szükséges konzervált aminosavakat. Szerettük volna megvizsgálni, hogy a peroxidazin, a többi emlős peroxidázhoz hasonlóan képes-e tirozin aminosavak keresztkötésére. A humán PXDN peroxidázaktivitásáról nem voltak irodalmi adatok, ezért elsőként ezt határoztuk meg Amplex Red peroxidáz esszé segítségével. A PXDN cDNS-ét tartalmazó pCDNA3.1 vektorral COS-7 sejteket transzfektáltunk és 48 óra múlva a sejtekből készített lizátum peroxidáz-aktivitását mértük (36. ábra).
FRE (átlag
szórás)
2500 2000 1500 1000 500 0 kontroll
PXDN
36. ábra: PXDN-nal transzfektált COS-7 sejtlizátum peroxidáz-aktivitásának detektálása. Transzfekció után 48 órával a sejteket 1 % hexadeciltrimetilammónium-bromid oldatban lizáltuk, majd Ampex Red peroxidáz kittel mértük a PXDN peroxidáz aktivitását. A fluoreszcens terméket 30 perc inkubálás után 590 nm-es hullámhosszon detektáltuk. A PXDN-nal transzfektált sejtekben a kontrollhoz képest jelentős peroxidáz aktivitást detektáltunk.
A peroxidáz domén ditirozinképző aktivitásának méréséhez a peroxidáz domént Sf9 sejtekben kifejeztük. Az Sf9 sejtekből tisztított peroxidáz doménen ditirozin mérést
71
terveztük, azonban a feltárt Sf9 sejtekből a peroxidáz domént nem tudtuk tisztítani, mert mindig az inszolubilis frakcióban maradt. 6.2.2. A peroxidazin szöveti expressziójának vizsgálata A humán peroxidazin szöveti expressziójáról ellentmondásos adatok jelentek meg, ezért Northern blot segítségével mi is vizsgáltuk, hogy milyen szövetekben található PXDN mRNS. Mivel a PXDN peroxidáz doménje nagyfokú homológiát mutat a MPO-dal, ezért a keresztreakciók elkerülése végett hibridizációs próbának a PXDN cDNS-ének 3’ le nem fordított szakaszát használtuk. A Northern blot alapján a PXDN számos humán szövetben kifejeződik, például szívben, harántcsíkolt izomban, vastagbélben, lépben, vesében, májban, vékonybélben és méhlepényben, ellenben
pajzsmirigy lép vese máj vékonybél méhlepény tüdő FVS
agy szív harántcsíkolt izom vastagbél
agyban, pajzsmirigyben és fehérvérsejtekben (FVS) nem (37. ábra).
7,5 Kb
37. ábra: A PXDN mRNS szöveti eloszlásának meghatározása Northern blot technikával. A PXDN expresszióját egy összetett szövet panelen vizsgáltuk, mely a jelölt szövetekből 2-2 µg poli[A]+ RNS-t tartalmazott. A membránt P32-izotóppal jelölt, a PXDN 3’ le nem fordított régióját tartalmazó próbával 65ºC-on hibridizáltuk. A PXDN mRNS 7,5 Kb hosszúságú.
72
6.2.3. A peroxidazin sejten belüli lokalizációja Mivel a peroxidazint felismerő antitest kereskedelmi forgalomban nem volt kapható, ezért nyulak immunizálásával PXDN-specifikus poliklonális antitestet készítettünk, melyet transzfektált COS-7 sejtvonalon teszteltünk. A peroxidazint COS-7 sejtekben kifejezve egy kb. 180 kDa molekulasúlyú fehérjét detektáltunk (38. ábra).
MS (kD) 200
PXDN -
+
150 b-aktin
38. ábra: A PXDN detektálása COS-7 sejtvonalban Western blot módszerrel. A COS-7 sejteket a PXDN kódoló régióját tartalmazó pCDNA3.1-el transzfektálva a fehérje kifejeződik (+). A poliklonális antitest specificitását jelzi, hogy az üres vektorral transzfektált sejtlizátumban (-), a megfelelő magasságban az antitest fehérjét nem ismer fel. A kontrollként előhívott β-aktin mutatja, hogy mindkét zsebben azonos mennyiségű fehérje volt szeparálva.
Végül az általunk előállított poliklonális antitettel, immunfluoreszcens festéssel vizsgáltuk a transzfektált PXDN lokalizációját COS-7 sejtvonalban. Ezekben a sejtekben a PXDN-t az endoplazmatikus retikulumban detektáltuk, melyet PDI endoplazmatikus retikulum marker kolokalizációval igazoltunk (39. ábra).
73
PXDN
PDI
átfedés
39. ábra: A transzfektált PXDN sejten belüli lokalizációja COS-7 sejtekben. A transzfetált sejteket paraformaldehides fixálás és permeabilizálás után poliklonális antiPXDN és anti-PDI antitestekkel festettük. A PXDN jelentős kolokalizációt mutat a PDI ER markerrel. Az első képen a fehér vonal 20 µm-t jelöl.
Munkacsoportunk további kísérletekben megállapította, hogy a PXDN humán bőr és tüdő fibroblasztokban szintén az ER-ban található. TGFβ1 kezelés hatására bekövetkező miofibroblaszt átalakulás során a fibroblasztok a PXDN-t szekretálták, ami az ECM fehérjékkel fibril-szerű kötegekbe rendeződött. Ezen kísérletek további részletei az értekezéshez
csatolt
„The
American
Journal
közleményben találhatók.
74
of
Pathology”-ban
megjelent
6.3. A Duox1 enzim funkciójának vizsgálata Duox1 knockout egér segítségével 6.3.1. Primer egér urotél sejtek kalcium-indukálta H2O2-termelése Kutatásaink célja a Duox1 emlős szervezetben betöltött szerepének vizsgálata volt. Kíváncsiak voltunk, hogy a pajzsmirigy és légúti epitél sejtekhez hasonlóan az urotél sejtek is termelnek-e H2O2-ot kalcium-stimulus hatására. Ehhez frissen izolált urotélium sejteket stimuláltunk thapsigarginnal, ami az ER Ca2+-ATP-áz gátlásán keresztül citoszolikus kalcium koncentrációemelkedést hoz létre (40. ábra). A thapsigarginnal kiváltott H2O2-termelés gátolható volt DPI-vel, a NADPH oxidázok nem-specifikus gátlószerével. B növekedés (átlag ± szórás)
növekedés(átlag szórás)
A
VT kontroll VT + TG VT + TG + DPI
70 60 50 40 30 20 10 0 0
5
10
15
20
25
*
2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 kontroll
30
TG
TG + DPI
idő (perc)
40. ábra: Primer egér urotél sejtek H2O2-termelésének mérése Amplex Red módszerrel. A) 200 nM thapsigargin (TG) stimulálást követően 37 ºC-ra előmelegített fluoriméteren 30 percig mértük a sejtek által termelt H2O2-ot. Kontrollként nem stimulált vagy a stimulálást megelőzően 5 µM DPI-vel 10 percig 37ºC-on kezelt sejteket használtunk. Az ábrán egy reprezentatív mérés eredménye látható, ahol a mért változást 10000 sejtre és a nem stimulált sejtek kiindulási fluoreszcencia értékére vonatkoztatva ábrázoltuk. B) TG-stimulus hatására termelt H2O2 30 perc inkubálás után. Az ábrán 4 kísérlet átlagának eredménye látható 10000 sejtre vonatkoztatva és a nem stimulált kontrollhoz képesti növekedés formájában kifejezve (p<0,05).
75
6.3.2. A Duox1 mRNS detektálása az urotéliumban Az urotélium sejtek által termelt H2O2-ot feltehetőleg a Duox enzimek termelik. RT-PCR technikával a húgyhólyagban mindkét Duox mRNS-ét kimutattuk, ezért az urotéliumban is vizsgáltuk a két Duox enzim expresszióját. Az urotéliumban a Duox1 mRNS nagy mennyiségben, a Duox2 pedig elenyésző mennyiségben fejeződik ki (41. ábra). 3,5
rel. mRNA szint (átlag szórás)
3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0 Duox1
Duox2
41. ábra: Relatív Duox1 és Duox2 mRNS szintek egér urotéliumban RT-PCR-rel detektálva. A Duox1 és Duox2 expressziós szintek meghatározása standard kalibrációs egyenesek segítségével történt, az értékeket β-aktin génre normalizáltuk. Az RNS-t 2 vad típusú nőstény egér urotéliumából izoláltuk.
6.3.3. A Duox1 knockout egér jellemzése Annak igazolására, hogy az urotéliumban detektált H2O2-ot valóban a Duox1 termeli, Duox1 knockout egerek urotéliumát kezdtük vizsgálni. A Lexicon Genetics cégtől megvásároltuk a Duox1 knockout egér törzset, melyet géncsapda módszerrel hoztak létre. A módszer lényege, hogy az egér embrionális őssejt tenyészetben a génbe egy retrovirális vektor integrálódik, mely az esetek többségében nullmutációhoz vezet. Esetünkben a vektor a Duox1 gén 20. és 21. exonok között elhelyezkedő intronikus régiójába integrálódott (42. ábra).
76
Duox1 gén:
LTR Trapping kazetta LTR
E20
ATG
E21
STOP
42. ábra: A Duox1 gén megszakítása lentivirális géncsapda módszerrel. A vektor a 20. és 21. exonok közötti intronba integrálódott.
A transzkripció során, amikor a DNS-polimeráz a trapping kazettához ér, a rajta található poliadenilációs résznél az átírás befejeződik. A keletkezett fúziós mRNS instabil és róla funkcióképes Duox1 fehérje nem íródik át. Mivel a megvásárolt egerek 129/SvEvBrd
és
visszakereszteztük
C57BL/6J őket
vegyes
C57BL/6J
genetikai háttérre.
háttérrel
Ehhez
érkeztek,
beállítottuk
az
elsőként egerek
genotipizálásához szükséges PCR reakciót, ami heterozigóta és génhiányos egerek esetében az integrálódott kazetta kimutatásán alapszik (lásd Az anyagok és módszerek című fejezetben). A Duox1 knockout egérben Western blot módszerrel igazoltuk, hogy az integrálódott vektor eredményeképpen, valóban nincs jelen Duox1 fehérje az urotéliumban (43. ábra). [kDa] 250
KO
VT anti-Duox
130 55
anti-beta-aktin
43. ábra: Duox1 enzim detektálása Western blottal primer egér urotél sejtekben. A 8%-os poliakrilamid gél egy-egy zsebébe 100 000 urotél sejtlizátumát vittük fel, majd nitrocellulóz membránra való blottolás után anti-duox antitesttel 1:1000 hígításban inkubáltuk, kontrollként anti-β-aktint használtunk 1:5000-ben.
A Western blot kísérletet nyelőcső, nyelv és bőr szöveteken is elvégeztünk, ahol szintén hasonló eredményt kaptunk. Mivel a poliklonális Duox antitest nem tesz
77
különbséget a Duox1 és Duox2 fehérje között, ezért a kísérlet azt is bizonyítja, hogy Duox1 hiányában nincs kompenzatórikus Duox2 expresszió fokozódás (117). A Duox1 knockout egerek fertilisek és nem rendelkeznek a vad típustól eltérő kóros fenotípussal. Lényeges, hogy a Duox2 knockout egérrel ellentétben, a Duox1 knockout egér hipotireózisban sem szenved. 6.3.4. A Duox1 immunhisztokémiai vizsgálata A Duox1 urotéliumon belüli lokalizációjához immunhisztokémiai festést végeztünk, melyhez kontrollként knockout egérből származó szövetet használtunk. Vad típusú húgyhólyag metszeten a kötőszövet feletti urotélium sejtjei élénken festődnek, ami a Duox1 knockout egér metszeten nem látható (44. ábra). VT
Duox1 KO
L
L
44. ábra: Duox1 immunfestés egér húgyhólyag fagyasztott metszeten. A vad típusú egérből származó metszeten Duox1 festődés látható a kötőszövet felett elhelyezkedő urotél rétegben, míg ez a Duox1 knockout metszeten nem detektálható. A húgyhólyag lumenét L betűvel jelöltem. Anti-Duox antitestet 1:150, Alexa 568-konjugált antinyúl másodlagos antitestet 1:1000 hígításban használtuk.
Mivel a Ce-Duox a C. elegans nematódában ditirozin kapcsolatok kialakításán keresztül részt vesz a kutikula stabilizálásában, fermerült bennünk, hogy a Duox1 hasonló szerepet tölt be az urotéliumban. Ezen feltételezésünket hematoxilin-eosin (HE) festéssel vizsgáltuk, hogy van-e valamilyen morfológiai különbség a Duox1 knockout és vad típusú urotélium között. A Duox1 knockout és vad típusú metszeten morfológiai különbség nem látható, mindkét hám hasonlóan ép (45. ábra).
78
VT
Duox1 KO
L
L
45. ábra: Duox1 knockout és vad típusú húgyhólyag metszetek HE festése. A knockout és vad típusú húgyhólyagok hámja hasonlóan ép. A húgyhólyag lumenét L betűvel jelöltem. A fekete vonal 50 µm-t reprezentál.
6.3.5. A Duox1 KO urotéliumban károsodott a kalcium-indukált H2O2-termelés A következő kísérletben összehasonlítottuk Duox1 knockout és vad típusú urotél sejtek thapsigargin-indukált H2O2-termelését. A Duox1 knockout sejtek bazális H2O2termelése kis mértékben csökkent és a vad típusú sejtekkel ellentétben TG-nal nem lehetett stimulálni (46. ábra). Vad típusú sejtekben ATP receptor agonistával is ki lehetett váltani H2O2-termelést, ami szintén kisebb mértékű volt a knockout sejtek esetében. A knockout sejtekkel kapott eredményeink arra utalnak, hogy az urotéliumban a H2O2-ot a Duox1 enzim termeli.
79
növekedés (átlag ± szórás)
*
2
* 1
0 VT
TG ATP
-
KO
+ -
-
VT
+ -
-
KO
+
-
+
46. ábra: H2O2-termelés mérése vad típusú és Duox1 knockout urotél sejteken. Az ábrán 4 kísérlet eredménye látható. A kísérletekben 30 perces 37ºC-os inkubálás után 590 nm-en mértem a keletkezett rezofurin mennyiségét. A kapott értékeket 10000 sejtre normalizáltam és a változást a nem stimulált sejtekre vonatkoztatva ábrázoltam. A sejteket 200 nM thapsigarginnal vagy 10 µM ATP-vel stimuláltuk. A csillaggal jelölt különbségek statisztikailag szignifikánsak, p<0,05.
Kíváncsiak voltunk, hogy a Duox1 knockout urotélium sejteken mérhető csökkent H2O2 termelés a vizelet H2O2-tartalmának csökkenésében is megnyilvánul-e. A Duox1 jelenlététől függetlenül azonban az egér vizeletben H2O2-ot nem tudtunk kimutatni. A kísérletek során kiderült, hogy az egér vizelethez külsőleg hozzáadott H2O2 sem mérhető, ami arra utal, hogy az egér vizeletében valamilyen hatékony antioxidáns
mechanizmus
működik.
Az
egér
vizelet
H2O2-tartalmának
a
meghatározására irányuló kísérleteket Dr. Péterfi Zalán végezte. 6.3.6. A Duox1 H2O2-termelése kiváltható TRPV4 agonistával A húgyhólyag működése során az urotélium sejtjei nagy nyomásváltozásoknak vannak kitéve. A húgyhólyag feszülésének pontos érzékelése esszenciális a fiziológiás hólyagfunkció fenntartásához. A mechanikai változások érzékelésében valószínűleg részt vesz a TRPV4 (tranziens receptor potenciál vanilloid 4) csatorna, mely magas szinten expresszálódik az urotéliumban (118, 119). Az urotélium mechanikai
80
jelátvitelben betöltött szerepének fontosságát jelzi, hogy TRPV4 knockout egerekben megnövekedett a hólyagban tárolt vizelet mennyisége, valamint nőtt a vizelések között eltelt idő (118). Kíváncsiak voltunk, hogy az urotéliumban a TRPV4 csatorna stimulálásával is kiváltható-e a Duox1 H2O2-termelése. A stimuláláshoz a szelektív és effektív GSK1016790A TRPV4-agonistát használtuk (120). A GSK agonista csak a vad típusú sejtekben váltott ki H2O2-termelést (47. ábra), ami bizonyítja, hogy a TRPV4 csatornán keresztül kialakuló citoszolikus kalcium koncentrációemelkedés aktiválja a Duox1 enzimet.
növekedés (átlag ± szórás)
2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0 VT
GSK
-
KO
+
-
+
47. ábra: A GSK TRPV4-agonista aktiválja a Duox1 H2O2-termelését primer vad típusú urotél sejtekben. A frissen izolált urotél sejteket 60 percig 37ºC-on Amplex Red jelenlétében inkubáltam, majd mértem a képződött rezofurin mennyiségét. A sejteket 10 nM GSK1016790A TRPV4-agonistával indukáltam. A kapott értékeket 10000 sejtre normalizáltam és a változást a nem stimulált sejtekre vonatkoztatva ábrázoltam. Az ábrán két mérés átlaga látható.
81
7. MEGBESZÉLÉS Az emlős peroxidázok közös tulajdonsága, hogy H2O2-ot felhasználva ditirozinkötések létrehozására képesek (4, 121-123). Ditirozin-kötések stabilizálják például a C. elegans nematóda kutikuláját, aminek hiányában a kültakaró egyes rétegei nem megfelelően kapcsolódnak egymáshoz, ezért a férgen hólyagok jelennek meg. Edens és mtsai RNS interferencia kísérletekben bizonyították, hogy a Ce-Duox1 expressziójának csökkentésével az állatban csökkent a ditirozin mennyisége. Feltételezésük szerint a tirozin aminosavak keresztkötését a Ce-Duox1 peroxidáz-doménje katalizálta, melyhez szükséges H2O2-ot a Ce-Duox1 NADPH-oxidáz doménje termeli (4). Az Edens által leírt fenotípusnak azonban, az az általunk bevezetett modell is megfelel, miszerint a Ce-Duox1 csak a H2O2-ot termeli és a ditirozin-kötések kialakulását egy peroxidáz enzim katalizálja (60). E feltételezésünket arra alapoztuk, hogy a Ce-Duox1-ből hiányoznak
a
hem
kötéséhez
szükséges
konzervált
hisztidin
aminosavak.
Feltételezésünket alátámasztja, hogy a ditirozin kötések kialakításáért felelős MLT-7 C. elegans peroxidázt 2009-ben azonosították, melynek elcsendeítése a Ce-Duox1 mutánssal azonos fenotípust eredményezett (124). Egy nemrég megjelent közleményben leírták, hogy a Ce-Duox1 peroxidáz doménje kovalensen köt hemet és képes tirozin keresztkötésre (63). Ezek alapján tehát mindkét enzim szükséges a C. elegans kutikula ditirozin-kötéseken keresztüli stabilizálásához. Munkám első részében a LPO-katalizálta ditirozinképzést jellemeztem. Kísérleteinkben
azt
tapasztaltuk,
hogy
a
tehéntejből
tisztított
LPO
már
szubmikromoláris H2O2-koncentrációk mellett is hatékonyan képez ditirozint. Azt is vizsgáltuk, hogy a ditirozinképzés alkalmas-e a Nox4 enzim által termelt H2O2 detektálására. Választásunk azért a Nox4 enzimre esett, mert azt különféle heterológ expressziós rendszerekben kifejezve főleg H2O2-ot detektáltak (125). A laktoperoxidázkatalizálta ditirozin képzéssel sikeresen mértük a Nox4-et stabilan expresszáló FreeStyle 293F sejtek H2O2-termelését, ami 8,6 nmol/106/h volt. Az irodalmi adatoknak megfelelően kísérleteinkben mi sem detektáltunk szuperoxidot. A szuperoxid termelés hiányának feltehetően az a magyarázata, hogy a Nox4 valamilyen inracelluláris sejtalkotóban található, így a termelt szuperoxid az extracelluláris térbe történő diffúziója során spontán vagy enzimatikus dizmutációval H2O2-dá alakul. A H2O2-
82
detektálás egyik legegyszerűbb módja lehet a laktoperoxidáz-katalizálta ditirozinképzés, mely számos előnnyel rendelkezik a kereskedelmi forgalomban lévő Amplex Red-del szemben. Mivel a ditirozinképzéshez szükséges tirozin és LPO nagy mennyiségben felhasználva is gazdaságos reagensek, a módszer alkalmas lehet ún. high-throughput screening tanulmányok kivitelezésére. Fontos azonban megjegyezni, hogy a LPOkatalizálta ditirozinképzés elsődlegesen extracelluláris térben alkalmas H2O2-méréshez, mivel a sejtben található redukáló ágensek, mint például a NADH, NADPH és redukált glutation interferáltak a LPO katalizálta ditirozin képződéssel. Az Amplex Red-ről szintén leírták, hogy a NADH és redukált glutation interferál a rezofurin képződésével (126). A LPO számos exokrin szekrétumban, mint például tej, nyál, könny, és hörgőváladék megtalálható. Ezekben a szekrétumokban a LPO az antimikrobiális védekezésben vesz részt, mivel H2O2 jelenlétében a tiocianátot hipotiocianáttá alakítja. A hipotiocianát számos mikroorganizmus ellen, köztük baktériumok és vírusok, egyaránt hatásos, de az immunvédekezésben betöltött pontos szerepe még nem tisztázott. Humán plazmán végzett kísérletekben kimutattuk, hogy a LPO a fehérjéket tirozin oldalláncaikon keresztül összekapcsolja, mely fehérje komplexbe az enzim önmagát is rögzíti (34-35. ábrák). Ennek a mechanizmusnak fiziológiás jelentősége nem ismert, de elképzelhető, hogy ditirozin keresztkötések létrehozásán keresztül a LPO képes különböző bakteriális peptideket inaktiválni vagy a baktérium felszínén található fehérjékhez kötődve, fokozni antibakteriális aktivitását. Kísérleteink alapján elmondhatjuk, hogy a LPO-katalizálta ditirozinképzés egy ígéretes módszer a H2O2 meghatározására különböző sejtes rendszerekben, valamint, hogy a LPO ditirozinképző aktivitása hozzájárulhat az enzim antibakteriális hatásához. Munkám következő részében a humán peroxidazin enzimet vizsgáltam. A PXDN a peroxidáz enzimek családjának különleges tagja, mivel a peroxidáz-domén mellett az extracelluláris mátrix fehérjéire jellemző doméneket, köztük leucin-gazdag régiókat, immunoglubulin C2 típusú doméneket és von Willebrandt faktor C–típusú domént is tartalmaz. A PXDN-t elsőként D. melanogaster-ben hemocitákban találták, ahol valószínűleg a rovar fejlődése során az ECM kialakulásában vesz részt (102). Humán megfelelőjét Horikoshi és mtsai p53-indukálta apoptotikus sejtekből izolálta
83
(103). Egy másik munkacsoport a PXDN-t egy új melanoma génként (MG50) azonosította, mivel expresszióját normál szövetekben alig, ellenben számos melanoma szövetben detektálták (104). Kísérleteink Horikoshi kísérleteit támaszják alá, mivel mi a PXDN mRNS-ét számos szövetben detektáltuk, melyek közül szívben, harántcsíkolt izomban, vékonybélben és méhlepényben volt a legmagasabb az expresszió (37. ábra). Kísérleteinkben szerettük volna vizsgálni, hogy a PXDN peroxidáz-doménje rendelkezik-e peroxidáz és ditirozinképző aktivitással, mivel erre vonatkozó irodalmi adatokat nem találtunk. Ehhez a PXDN-t COS-7 sejtekben kifejeztük, ahol az enzim peroxidázként funkcionált (36. ábra). A peroxidáz ditirozinképző aktivitásának vizsgálatához a PXDN hisztidin-jelöléssel (His-tag) ellátott peroxidáz-doménjét Sf9 sejtekben is kifejeztük, azonban megtisztítani nem tudtuk, mivel a fehérje többféle detergens-kezelés ellenére is az inszolubilis frakcióban maradt. A PXDN további vizsgálatához nyulak immunizálásával anti-PXDN antitestet készítettünk (38. ábra), mellyel megállapítottuk, hogy a PXDN-t COS-7 sejtekben kifejezve a fehérje az endoplazmatikus retikulumba lokalizálódik (39. ábra). Munkacsoportunk továbbá megállapította, hogy a PXDN humán tüdő és bőr fibroblasztok TGF-β1-indukálta miofibroblaszt átalakulása során szekretálódik és az ECM fehérjékkel komplexet képez, mely folyamatnak a fiziológiás és patofiziológiás szövetátalakulásban lehet szerepe. A PXDN kísérleteinket leíró cikk elbírálása során megjelent egy közlemény, melyben a PXDN-t, mint egy új ér peroxidázt (VPO1: vascular peroxidase1) jellemzik, mivel szívben és érfalban magas expressziós szintet detektáltak (105). Cheng és mtsai kísérleteikben azt találták, hogy a PXDN a többi emlős peroxidázhoz hasonlóan kovalensen köt hem csoportot, valamint a fehérjét HEK sejtekben kifejezve szintén mértek peroxidáz aktivitást, ami a mi COS-7 sejtekben demonstrált eredményeinket is alátámasztja. A NADPH-oxidázok családjába tartozó Duox enzimek szintén rendelkeznek peroxidáz-szerű doménnel. A Duox enzimek peroxidáz doménje, azonban irodalmi adatok szerint emlősökben nem rendelkezik peroxidáz aktivitással. Kísérleteink következő részében a Duox1 enzim vizsgáltát tűztük ki célul. Pajzsmirigyben mind a Duox1, mind a Duox2 enzim a tireociták apikális pólusán található. Az utóbbi évek kutatási eredményei azonban arra utalnak, hogy csak a Duox2 enzim esszenciális a
84
pajzsmirigy-hormon szintéziséhez (2, 3, 78). Ez alapján úgy tűnik, hogy a két enzim eltérő funkciót tölt be a szervezetünkben. Habár kezdetben a Duoxok kizárólagos expressziós helyének a pajzsmirigyet gondolták, napjainkban a Duox enzimeket az epitél sejtek fő ROS forrásának tartják (60). A Duox2 kifejeződik a nyálmirigy kivezetőcsöveiben, valamint a gasztrointesztinális rendszerben, legnagyobb mértékben a vastag- és végbélben. A trachea és a bronchusok csillószőrős hengerhámjában mindkét enzim expresszálódik (5, 75, 110). A külvilággal kapcsolatba kerülő hámok felszínén a Duox feltehetően az immunvédekezésben játszik szerepet, melyre az első genetikai bizonyítékot Drosophila vizsgálata során találták (77, 84). Az emlős Duox enzimeket olyan szervekben detektálták, ahol az antimikrobiális aktivitású LPO és NIS szintén kifejeződött, mely enzimek együttműködését elsőként Geiszt és mtsai javasolták (5). Ezt követően izolált légúti epitél sejtekben kimutatták, hogy a Duox támogatja a LPO antibakteriális aktivitását (110, 113, 127). A légúti és pajzsmirigy epitél sejtekről leírták, hogy kalcium-stimulus hatására H2O2-ot termelnek (5, 68). Mivel a húgyhólyag epitélben ismert volt, hogy feszülés hatására Ca2+-jel képződik, kíváncsiak voltunk, hogy a húgyhólyag urotélium sejtjei is képesek-e H2O2 termelésre. Kísérleteinkben elsőként demonstráltuk, hogy az urotél sejtek termelnek H2O2-ot (38. és 44-45. ábrák). Duox1 knockout sejtek vizsgálatával bizonyítottuk, hogy az urotéliumban a H2O2 forrása a Duox1 enzim (41. és 44-45. ábrák). Mivel a légutak felszínén kifejeződő Duox1 által termelt H2O2-ot a LPO antibakteriális OSCN─ képzésre fordítja, az urotéliumban is vizsgáltuk a LPO enzim expresszióját. Az urotéliumban a konrollként használt nyálmiriggyel ellentétben LPO mRNS kifejeződést nem detektáltunk, ezért a húgyhólyagban a LPO és Duox együttműködése nem valószínű. Ettől függetlenül a Duox1 részt vehet az urotélium immunvédekezésében,
mivel
a
H2O2-ról
kimutatták,
hogy
már
alacsony
koncentrációban is kemorepellensként hat a baktériumokra (128). Botteaux és mtsai demonstrálták, hogy Duox2 kifejezése COS-7 sejtekben gátolta a Salmonella fertőzést (129). Allaoui és mtsai szerint pedig a Duoxok által termelt ROS részt vesz a nyálkahártya felszínek sterilitásának fenntartásában (130). Duox1 knockout és vad típusú egerek húgyhólyagját urethrán kersztül E. coli-val fertőzve, a húgyhólyagban túlélt baktériumok számában különbséget nem tudtunk kimutatni és előkísérleteink alapján a Duox1 expresszió sem emelkedett.
85
A Duoxok immunvédekezésben betöltött szerepe mellett a különbőző fajokban számos más funkciót is tulajdonítanak az enzimeknek (60). Például a Duox termelte H2O2-ot a tengeri sün ovoperoxidáz a fertilizációs burok stabilizálására használja (82). Ellentétben a Duox-deficiens C. elegans nematódával, a Duox1 hiányos egerek urotéliumán a vad típustól eltérő nyilvánvaló morfológiai defektust nem tapasztaltunk (46. ábra). Feltehetőleg emlősökben a Duox1 nem vesz részt az epitélium stabilizálásában. A ROS szerepét számos jelátviteli útvonalban igazolták. Például a H2O2-ról kimutatták, hogy reverzibilisen gátolja a tirozin foszfatázokat, melyen keresztül hozájárulhat a különféle tirozin-kináz receptorok által közvetített jelátviteli folyamatok erősítéséhez (95). Növényekben leírták, hogy a ROS szerepet játszik a mechanikai jelátvitelben (131). A húgyhólyagban a hidrosztatikus nyomás tág határok között változhat, ezért az urotélium sejtek számára esszenciális a mechanikai stimulusok pontos érzékelése, melyben az utóbbi évek kutatásai szerint a TRPV4 fontos szerepet játszik (118, 119, 132). A TRPV4 egy mechanikai feszülés hatására nyíló tranziens receptor potenciál csatorna, melyen keresztül kalcium áramlik a sejtbe, ami az urotélium sejtekből ATP-felszabadulást vált ki (119). Ezzel a mechanizmussal az urotélium sejtek képesek a mechanikai stimulus ATP-szignállá való konvertálására. Kísérleteink során kimutattuk, hogy az urotél sejtek mind ATP, mind TRPV4-agonista hatására Duox1-függő módon H2O2-termeléssel reagálnak (48-49. ábrák). Ezek alapján azt feltételezzük, hogy a húgyhólyag feszülésekor kialakuló mechanikai stimulus összetett mechanizmuson keresztül ROS felszabaduláshoz vezet, melynek fiziológiás vagy patofiziológiás folyamatokban betöltött szerepének megválaszolásához még további kísérletek szükségesek.
86
8. KÖVETKEZTETÉSEK Kimutattuk, hogy a laktoperoxidáz H2O2 jelenlétében hatékonyan alakítja át az oldatban lévő szabad tirozin aminosavakat ditirozinná, mely 320 nm excitációs és 405 nm emissziós hullámhosszak mellett mérhető fluoreszcens vegyület. Kataláz hozzáadásával fluoreszcencia csökkenést tapasztaltunk, ami bizonyítja, hogy a LPO csak H2O2 jelenlétében katalizálja a ditirozinképzést. Kimutattuk, hogy a LPO az L-tirozin mellett D-tirozinból is képez ditirozint, ezáltal a reakció olyan rendszerekben is alkalmas lehet H2O2 detektálására, ahol az Ltirozin koncentráció csökken, például aminosav transzport következtében. Meghatároztuk a LPO és tirozin szükséges és elégséges koncentrációit, melyek mellett a reakció alkalmas lehet H2O2 mennyiségi meghatározására, a reakció idejének és térfogatának ismeretében. Meghatároztuk, hogy a LPO katalizálta ditirozinképzéssel már 0,5 µM H2O2 is detektálható, valamint, hogy a fluoreszcencia 20 µM-os H2O2 koncentrációig lineárisan változik. 60 µM-os H2O2 koncentráció fölött a LPO ditirozinképző enzimaktivitása károsodott. Megállapítottuk, hogy a LPO-katalizálta ditirozinképzés alkalmas a glükózoxidáz által termelt H2O2 detektálására. A humán Nox4 enzimet stabilan kifejező FreeStyle 293F sejtvonal által termelt H2O2-ot szintén hatékonyan mértük a LPO-katalizálta ditirozinképzéssel. Humán vérplazmán végzett kísérletekben kimutattuk, hogy a LPO H2O2 jelenlétében
a
fehérjéket
ditirozin-kötéseken
keresztül,
önmagával
együtt
összekapcsolja. E folyamat in vivo körülmények között hozzájárulhat a LPO antimikrobiális hatásának fokozásához, mivel bakteriális fehérjéket inaktiválhat vagy a baktérium felszínéhez kötve fokozhatja az antimikrobiális hatást. A humán peroxidazint COS-7 sejtekben kifejezve kimutattuk, hogy a többi emlős peroxidázhoz hasonlóan peroxidáz-doménje rendelkezik peroxidáz aktivitással. A
peroxidazin
szöveti
expressziójának
Northern
blot
vizsgálatával
megállapítottuk, hogy az agy, pajzsmirigy és fehérvérsejteken kívül számos szövetben
87
kifejeződik. Ezzel cáfoltuk Mitchell és mtsai feltételezését, mely szerint a humán peroxidazin csak különféle melanómákban fejeződik ki (104). Mivel a PXDN ellen nem volt kapható antitest, nyulak immunizálásával poliklonális anti-PXDN antitestet készítettünk, mellyel COS-7 sejtekben kimutattuk, hogy a PXDN az endoplazmatikus retikulumban található. Kimutattuk, hogy a légúti és pajzsmirigy epitél sejtekhez hasonlóan az urotélium sejtjei is termelnek H2O2-ot. Duox1 knockout egér segítségével bizonyítottuk, hogy az urotéliumban a H2O2 forrása a Duox1 enzim. Immunhisztokémiai festéssel kimutattuk, hogy a Duox1 a húgyhólyagban az urotélium rétegeiben található. Egér húgyhólyagból izolált urotél sejteken végzett kísérletekben kimutattuk, hogy a Duox1 enzim thapsigargin és ATP, citoszolikus kalcium-koncentrációt emelő stimulusok hatására H2O2-ot termel. Primer urotél sejteken kimutattuk, hogy a Duox1 enzim H2O2-termelése TRPV4agonistával is kiváltható. A TRPV4 az urotéliumban legnagyobb mennyiségben kifejeződő tranziens receptor potenciál csatorna, melyről leírták, hogy mechanikai feszülés hatására intracelluláris kalciumemelkedést hoz létre. A Duox1 TRPV4-en keresztüli aktivációja felveti a lehetőséget, hogy az enzim által termelt ROS szerepet játszik az urotélium mechanotranszdukciójában, melynek igazolása további kísérleteket igényel.
88
9. ÖSSZEFOGLALÁS A laktoperoxidáz (LPO) szervezetünk különböző szekrétumaiban található, ahol hipotiocianátot képezve fontos szerepet tölt be az antibakteriális védekezésben. A reakcióhoz szükséges H2O2-ot a Duox enzimek termelik. Az ovoperoxidázról leírták, hogy tengeri sün fertilizációjakor ditirozin-keresztkötések képzésével a fertilizációs burok megszilárdításában vesz részt. A ditirozinképzés az emlős peroxidázok általános tulajdonsága.
Kísérleteinkben
a
LPO
ditirozinképző
aktivitását
vizsgáltuk.
Megállapítottuk, hogy a laktoperoxidáz-katalizálta ditirozinképzés alkalmas lehet a H2O2 mennyiségi meghatározására. A módszerrel sikeresen mértük a glükóz-oxidáz és a Nox4-et stabilan expresszáló FreeStyle 293F sejtek által termelt H2O2-ot. Humán plazmán végzett kísérletekben kimutattuk, hogy a LPO a fehérjékben található tirozin oldalláncokon keresztül a fehérjéket összekapcsolja, mely fehérjekomplexbe, saját tirozin aminosavjain keresztül, önmagát is keresztköti, ami hozzájárulhat a LPO antibakteriális aktivitásához. A peroxidazin (PXDN) az emlős peroxidázok családjának legújabban felfedezett tagja, melynek funkciójáról még keveset tudunk. Mivel a PXDN peroxidáz aktivitását még nem vizsgálták, az enzimet COS-7 sejtekben kifejeztük és kimutattuk, hogy az enzimnek
peroxidáz-doménje
aktív,
valamint
hogy
COS-7
sejtekben
az
endoplazmatikus retikulumba lokalizálódik. Az irodalomban ellentmondásos adatok voltak a PXDN expresszióját illetően, ezért Northern blot módszerrel mi is vizsgáltuk. Kimutattuk, hogy a PXDN mRNS-e számos szövetben, köztük szívben, harántcsíkolt izomban, vastagbélben, lépben, vesében, májban, vékonybélben, méhlepényben és tüdőben is kifejeződik. Kísérleteinkben elsőként mutattuk ki, hogy az urotél sejtek kalcium-stimulus hatására H2O2-ot termelnek. Duox1 knockout urotél sejtek vizsgálatával bizonyítottuk, hogy a H2O2 forrása a Duox1 enzim. A H2O2 termelést thapsigargin, ATP, valamint GSK 1016790A,
TRPV4
specifikus
agonista
citoplazmatikus
[Ca2+]-t
emelő
stimulusokkal is kiváltottuk. Az urotéliumban a Duox1 által termelt H2O2 feltételezett, immunvédekezésben vagy jelátvitelben betöltött funkciójának azonosításához még további vizsgálatok szükségesek.
89
10. SUMMARY
Lactoperoxidase (LPO) is expressed by different mucosal surfaces, where it contributes to the host defense mechanisms by producing hypothiocyanate. The reaction requires H2O2, which is produced by Duox enzymes. During fertilization in sea urchin eggs ovoperoxidase contributes to the hardening of fertilization envelope trought dityrosine bridges, which is a common feature of mammalian peroxidases. Our aim was to study the dityrosine-forming activity of LPO. We concluded that the dityrosineforming activity of LPO is suitable for the quantification of H2O2. With the LPOcatalized dityrosine-formation we successfully measured the H2O2-production of glucose-oxidase and of Nox 4-expressing FreeStyle 293F cells. Using human plasma as a model we showed that LPO crosslinks proteins trought dityrosine bridges and that LPO crosslinks itselves to the protein complexes as well, which could enhance its antibacterial activity. Peroxidasin (PXDN) is the latest recognized member of the mammalian peroxidase family and so far little is known about its function. Since the peroxidase activity of PXDN hasn’t been characterized yet, we expressed PXDN in COS-7 cells and detected peroxidase activity. In COS-7 cells PXDN localized into the endoplasmatic reticule. Conflicting data were published regarding the expression pattern of human PXDN, hence we studied in Northern blot experiments. We detected PXDN in different tissues, including heart, skeletal muscle, colon, spleen, kidney, liver, small intestine, placenta and lung. We showed for the first time that urothelial cells produce H2O2 in a calcium dependent manner. Examining knockout urothelial cells we proved that H2O2 is produced by Duox1. For the activation of H2O2-production of Duox1 we used different calcium-mobilizing stimuli such as thapsigargin, ATP and GSK 1016790A a TRPV4 specific agonist. Future studies are needed to clarify the possible function of H2O2production by urothelial cells in host defence or in signal transduction.
90
11. IRODALOMJEGYZÉK
1.
2.
3.
4.
5.
6. 7.
8.
9. 10. 11. 12. 13.
14.
15. 16.
Oram JD, Reiter B. (1966) The inhibition of streptococci by lactoperoxidase, thiocyanate and hydrogen peroxide. The oxidation of thiocyanate and the nature of the inhibitory compound. Biochem J, 100: 382-388. Dupuy C, Ohayon R, Valent A, Noel-Hudson MS, Deme D, Virion A. (1999) Purification of a novel flavoprotein involved in the thyroid NADPH oxidase. Cloning of the porcine and human cdnas. J Biol Chem, 274: 37265-37269. De Deken X, Wang D, Many MC, Costagliola S, Libert F, Vassart G, Dumont JE, Miot F. (2000) Cloning of two human thyroid cDNAs encoding new members of the NADPH oxidase family. J Biol Chem, 275: 23227-23233. Edens WA, Sharling L, Cheng G, Shapira R, Kinkade JM, Lee T, Edens HA, Tang X, Sullards C, Flaherty DB, Benian GM, Lambeth JD. (2001) Tyrosine cross-linking of extracellular matrix is catalyzed by Duox, a multidomain oxidase/peroxidase with homology to the phagocyte oxidase subunit gp91phox. J Cell Biol, 154: 879-891. Geiszt M, Witta J, Baffi J, Lekstrom K, Leto TL. (2003) Dual oxidases represent novel hydrogen peroxide sources supporting mucosal surface host defense. FASEB J, 17: 1502-1504. Schwarzer C, Machen TE, Illek B, Fischer H. (2004) NADPH oxidase-dependent acid production in airway epithelial cells. J Biol Chem, 279: 36454-36461. Caillou B, Dupuy C, Lacroix L, Nocera M, Talbot M, Ohayon R, Deme D, Bidart JM, Schlumberger M, Virion A. (2001) Expression of reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase (ThoX, LNOX, Duox) genes and proteins in human thyroid tissues. J Clin Endocrinol Metab, 86: 3351-3358. El Hassani RA, Benfares N, Caillou B, Talbot M, Sabourin JC, Belotte V, Morand S, Gnidehou S, Agnandji D, Ohayon R, Kaniewski J, Noel-Hudson MS, Bidart JM, Schlumberger M, Virion A, Dupuy C. (2005) Dual oxidase2 is expressed all along the digestive tract. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 288: G933-942. Mándl J. Az "Oxigéntoxicitás". In: V Ádám (szerk.), Orvosi Biokémia. Medicina, Budapest, 2004: 309-314. Rada B, Leto TL. (2008) Oxidative innate immune defenses by Nox/Duox family NADPH oxidases. Contrib Microbiol, 15: 164-187. Balaban RS, Nemoto S, Finkel T. (2005) Mitochondria, oxidants, and aging. Cell, 120: 483-495. Schrader M, Fahimi HD. (2006) Peroxisomes and oxidative stress. Biochim Biophys Acta, 1763: 1755-1766. Trachootham D, Alexandre J, Huang P. (2009) Targeting cancer cells by ROSmediated mechanisms: a radical therapeutic approach? Nat Rev Drug Discov, 8: 579-591. Quinn MT, Gauss KA. (2004) Structure and regulation of the neutrophil respiratory burst oxidase: comparison with nonphagocyte oxidases. J Leukoc Biol, 76: 760-781. Geiszt M, Kapus A, Ligeti E. (2001) Chronic granulomatous disease: more than the lack of superoxide? J Leukoc Biol, 69: 191-196. Towbin AJ, Chaves I. (2010) Chronic granulomatous disease. Pediatr Radiol, 40: 657-668; quiz 792-653.
91
17. 18.
19.
20. 21. 22. 23.
24. 25.
26. 27.
28.
29.
30.
31.
32.
33. 34.
Baehner RL, Nathan DG. (1967) Leukocyte oxidase: defective activity in chronic granulomatous disease. Science, 155: 835-836. Holmes B, Page AR, Good RA. (1967) Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function. J Clin Invest, 46: 1422-1432. Quie PG, White JG, Holmes B, Good RA. (1967) In vitro bactericidal capacity of human polymorphonuclear leukocytes: diminished activity in chronic granulomatous disease of childhood. J Clin Invest, 46: 668-679. Geiszt M. (2006) NADPH oxidases: new kids on the block. Cardiovasc Res, 71: 289-299. Lambeth JD. (2002) Nox/Duox family of nicotinamide adenine dinucleotide (phosphate) oxidases. Curr Opin Hematol, 9: 11-17. Segal AW, Jones OT. (1978) Novel cytochrome b system in phagocytic vacuoles of human granulocytes. Nature, 276: 515-517. Segal AW, Jones OT, Webster D, Allison AC. (1978) Absence of a newly described cytochrome b from neutrophils of patients with chronic granulomatous disease. Lancet, 2: 446-449. Harper AM, Chaplin MF, Segal AW. (1985) Cytochrome b-245 from human neutrophils is a glycoprotein. Biochem J, 227: 783-788. Wallach TM, Segal AW. (1997) Analysis of glycosylation sites on gp91phox, the flavocytochrome of the NADPH oxidase, by site-directed mutagenesis and translation in vitro. Biochem J, 321 ( Pt 3): 583-585. Bedard K, Krause KH. (2007) The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiol Rev, 87: 245-313. Cheng G, Cao Z, Xu X, van Meir EG, Lambeth JD. (2001) Homologs of gp91phox: cloning and tissue expression of Nox3, Nox4, and Nox5. Gene, 269: 131-140. Parkos CA, Dinauer MC, Walker LE, Allen RA, Jesaitis AJ, Orkin SH. (1988) Primary structure and unique expression of the 22-kilodalton light chain of human neutrophil cytochrome b. Proc Natl Acad Sci U S A, 85: 3319-3323. Ponting CP. (1996) Novel domains in NADPH oxidase subunits, sorting nexins, and PtdIns 3-kinases: binding partners of SH3 domains? Protein Sci, 5: 23532357. Shiose A, Sumimoto H. (2000) Arachidonic acid and phosphorylation synergistically induce a conformational change of p47phox to activate the phagocyte NADPH oxidase. J Biol Chem, 275: 13793-13801. Ago T, Kuribayashi F, Hiroaki H, Takeya R, Ito T, Kohda D, Sumimoto H. (2003) Phosphorylation of p47phox directs phox homology domain from SH3 domain toward phosphoinositides, leading to phagocyte NADPH oxidase activation. Proc Natl Acad Sci U S A, 100: 4474-4479. Nagasawa T, Ebisu K, Inoue Y, Miyano K, Tamura M. (2003) A new role of Pro73 of p47phox in the activation of neutrophil NADPH oxidase. Arch Biochem Biophys, 416: 92-100. Han CH, Lee MH. (2000) Activation domain in P67phox regulates the steady state reduction of FAD in gp91phox. J Vet Sci, 1: 27-31. Nakamura R, Sumimoto H, Mizuki K, Hata K, Ago T, Kitajima S, Takeshige K, Sakaki Y, Ito T. (1998) The PC motif: a novel and evolutionarily conserved sequence involved in interaction between p40phox and p67phox, SH3 domain-
92
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41. 42.
43.
44.
45.
46.
47.
containing cytosolic factors of the phagocyte NADPH oxidase. Eur J Biochem, 251: 583-589. Dang PM, Morel F, Gougerot-Pocidalo MA, El Benna J. (2003) Phosphorylation of the NADPH oxidase component p67(PHOX) by ERK2 and P38MAPK: selectivity of phosphorylated sites and existence of an intramolecular regulatory domain in the tetratricopeptide-rich region. Biochemistry, 42: 4520-4526. Suh YA, Arnold RS, Lassegue B, Shi J, Xu X, Sorescu D, Chung AB, Griendling KK, Lambeth JD. (1999) Cell transformation by the superoxide-generating oxidase Mox1. Nature, 401: 79-82. Banfi B, Clark RA, Steger K, Krause KH. (2003) Two novel proteins activate superoxide generation by the NADPH oxidase NOX1. J Biol Chem, 278: 35103513. Geiszt M, Lekstrom K, Witta J, Leto TL. (2003) Proteins homologous to p47phox and p67phox support superoxide production by NAD(P)H oxidase 1 in colon epithelial cells. J Biol Chem, 278: 20006-20012. Takeya R, Ueno N, Kami K, Taura M, Kohjima M, Izaki T, Nunoi H, Sumimoto H. (2003) Novel human homologues of p47phox and p67phox participate in activation of superoxide-producing NADPH oxidases. J Biol Chem, 278: 2523425246. Ueyama T, Geiszt M, Leto TL. (2006) Involvement of Rac1 in activation of multicomponent Nox1- and Nox3-based NADPH oxidases. Mol Cell Biol, 26: 2160-2174. Geiszt M, Leto TL. (2004) The Nox family of NAD(P)H oxidases: host defense and beyond. J Biol Chem, 279: 51715-51718. Geiszt M, Lekstrom K, Leto TL. (2004) Analysis of mRNA transcripts from the NAD(P)H oxidase 1 (Nox1) gene. Evidence against production of the NADPH oxidase homolog-1 short (NOH-1S) transcript variant. J Biol Chem, 279: 5166151668. Kawahara T, Teshima S, Oka A, Sugiyama T, Kishi K, Rokutan K. (2001) Type I Helicobacter pylori lipopolysaccharide stimulates toll-like receptor 4 and activates mitogen oxidase 1 in gastric pit cells. Infect Immun, 69: 4382-4389. Kawahara T, Kuwano Y, Teshima-Kondo S, Takeya R, Sumimoto H, Kishi K, Tsunawaki S, Hirayama T, Rokutan K. (2004) Role of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 1 in oxidative burst response to Toll-like receptor 5 signaling in large intestinal epithelial cells. J Immunol, 172: 3051-3058. Matsuno K, Yamada H, Iwata K, Jin D, Katsuyama M, Matsuki M, Takai S, Yamanishi K, Miyazaki M, Matsubara H, Yabe-Nishimura C. (2005) Nox1 is involved in angiotensin II-mediated hypertension: a study in Nox1-deficient mice. Circulation, 112: 2677-2685. Gavazzi G, Banfi B, Deffert C, Fiette L, Schappi M, Herrmann F, Krause KH. (2006) Decreased blood pressure in NOX1-deficient mice. FEBS Lett, 580: 497504. Dikalova A, Clempus R, Lassegue B, Cheng G, McCoy J, Dikalov S, San Martin A, Lyle A, Weber DS, Weiss D, Taylor WR, Schmidt HH, Owens GK, Lambeth JD, Griendling KK. (2005) Nox1 overexpression potentiates angiotensin IIinduced hypertension and vascular smooth muscle hypertrophy in transgenic mice. Circulation, 112: 2668-2676.
93
48.
49.
50.
51.
52. 53.
54.
55.
56.
57.
58.
59. 60. 61.
62.
63.
Kikuchi H, Hikage M, Miyashita H, Fukumoto M. (2000) NADPH oxidase subunit, gp91(phox) homologue, preferentially expressed in human colon epithelial cells. Gene, 254: 237-243. Paffenholz R, Bergstrom RA, Pasutto F, Wabnitz P, Munroe RJ, Jagla W, Heinzmann U, Marquardt A, Bareiss A, Laufs J, Russ A, Stumm G, Schimenti JC, Bergstrom DE. (2004) Vestibular defects in head-tilt mice result from mutations in Nox3, encoding an NADPH oxidase. Genes Dev, 18: 486-491. Nakano Y, Longo-Guess CM, Bergstrom DE, Nauseef WM, Jones SM, Banfi B. (2008) Mutation of the Cyba gene encoding p22phox causes vestibular and immune defects in mice. J Clin Invest, 118: 1176-1185. Kiss PJ, Knisz J, Zhang Y, Baltrusaitis J, Sigmund CD, Thalmann R, Smith RJ, Verpy E, Banfi B. (2006) Inactivation of NADPH oxidase organizer 1 results in severe imbalance. Curr Biol, 16: 208-213. Geiszt M, Kopp JB, Varnai P, Leto TL. (2000) Identification of renox, an NAD(P)H oxidase in kidney. Proc Natl Acad Sci U S A, 97: 8010-8014. Shiose A, Kuroda J, Tsuruya K, Hirai M, Hirakata H, Naito S, Hattori M, Sakaki Y, Sumimoto H. (2001) A novel superoxide-producing NAD(P)H oxidase in kidney. J Biol Chem, 276: 1417-1423. Gorin Y, Ricono JM, Kim NH, Bhandari B, Choudhury GG, Abboud HE. (2003) Nox4 mediates angiotensin II-induced activation of Akt/protein kinase B in mesangial cells. Am J Physiol Renal Physiol, 285: F219-229. Hecker L, Vittal R, Jones T, Jagirdar R, Luckhardt TR, Horowitz JC, Pennathur S, Martinez FJ, Thannickal VJ. (2009) NADPH oxidase-4 mediates myofibroblast activation and fibrogenic responses to lung injury. Nat Med, 15: 1077-1081. Banfi B, Molnar G, Maturana A, Steger K, Hegedus B, Demaurex N, Krause KH. (2001) A Ca(2+)-activated NADPH oxidase in testis, spleen, and lymph nodes. J Biol Chem, 276: 37594-37601. Banfi B, Tirone F, Durussel I, Knisz J, Moskwa P, Molnar GZ, Krause KH, Cox JA. (2004) Mechanism of Ca2+ activation of the NADPH oxidase 5 (NOX5). J Biol Chem, 279: 18583-18591. Pachucki J, Wang D, Christophe D, Miot F. (2004) Structural and functional characterization of the two human ThOX/Duox genes and their 5'-flanking regions. Mol Cell Endocrinol, 214: 53-62. Luxen S, Belinsky SA, Knaus UG. (2008) Silencing of DUOX NADPH oxidases by promoter hypermethylation in lung cancer. Cancer Res, 68: 1037-1045. Donko A, Peterfi Z, Sum A, Leto T, Geiszt M. (2005) Dual oxidases. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360: 2301-2308. Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 391: 806-811. Harper RW, Xu C, McManus M, Heidersbach A, Eiserich JP. (2006) Duox2 exhibits potent heme peroxidase activity in human respiratory tract epithelium. FEBS Lett, 580: 5150-5154. Meitzler JL, Ortiz de Montellano PR. (2009) Caenorhabditis elegans and human dual oxidase 1 (DUOX1) "peroxidase" domains: insights into heme binding and catalytic activity. J Biol Chem, 284: 18634-18643.
94
64.
65. 66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
76. 77.
78.
Morand S, Ueyama T, Tsujibe S, Saito N, Korzeniowska A, Leto TL. (2009) Duox maturation factors form cell surface complexes with Duox affecting the specificity of reactive oxygen species generation. FASEB J, 23: 1205-1218. Dupuy C, Deme D, Kaniewski J, Pommier J, Virion A. (1988) Ca2+ regulation of thyroid NADPH-dependent H2O2 generation. FEBS Lett, 233: 74-78. Forteza R, Salathe M, Miot F, Conner GE. (2005) Regulated hydrogen peroxide production by Duox in human airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol, 32: 462-469. Ha EM, Lee KA, Park SH, Kim SH, Nam HJ, Lee HY, Kang D, Lee WJ. (2009) Regulation of DUOX by the Galphaq-phospholipase Cbeta-Ca2+ pathway in Drosophila gut immunity. Dev Cell, 16: 386-397. De Deken X, Wang D, Dumont JE, Miot F. (2002) Characterization of ThOX proteins as components of the thyroid H(2)O(2)-generating system. Exp Cell Res, 273: 187-196. Morand S, Chaaraoui M, Kaniewski J, Deme D, Ohayon R, Noel-Hudson MS, Virion A, Dupuy C. (2003) Effect of iodide on nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase activity and Duox2 protein expression in isolated porcine thyroid follicles. Endocrinology, 144: 1241-1248. Morand S, Agnandji D, Noel-Hudson MS, Nicolas V, Buisson S, Macon-Lemaitre L, Gnidehou S, Kaniewski J, Ohayon R, Virion A, Dupuy C. (2004) Targeting of the dual oxidase 2 N-terminal region to the plasma membrane. J Biol Chem, 279: 30244-30251. Grasberger H, Refetoff S. (2006) Identification of the maturation factor for dual oxidase. Evolution of an eukaryotic operon equivalent. J Biol Chem, 281: 1826918272. Pacquelet S, Lehmann M, Luxen S, Regazzoni K, Frausto M, Noack D, Knaus UG. (2008) Inhibitory action of NoxA1 on dual oxidase activity in airway cells. J Biol Chem, 283: 24649-24658. Wang D, De Deken X, Milenkovic M, Song Y, Pirson I, Dumont JE, Miot F. (2005) Identification of a novel partner of duox: EFP1, a thioredoxin-related protein. J Biol Chem, 280: 3096-3103. Rigutto S, Hoste C, Grasberger H, Milenkovic M, Communi D, Dumont JE, Corvilain B, Miot F, De Deken X. (2009) Activation of dual oxidases Duox1 and Duox2: differential regulation mediated by camp-dependent protein kinase and protein kinase C-dependent phosphorylation. J Biol Chem, 284: 6725-6734. Harper RW, Xu C, Eiserich JP, Chen Y, Kao CY, Thai P, Setiadi H, Wu R. (2005) Differential regulation of dual NADPH oxidases/peroxidases, Duox1 and Duox2, by Th1 and Th2 cytokines in respiratory tract epithelium. FEBS Lett, 579: 49114917. Hill T, 3rd, Xu C, Harper RW. (2010) IFNgamma mediates DUOX2 expression via a STAT-independent signaling pathway. Biochem Biophys Res Commun. Ha EM, Lee KA, Seo YY, Kim SH, Lim JH, Oh BH, Kim J, Lee WJ. (2009) Coordination of multiple dual oxidase-regulatory pathways in responses to commensal and infectious microbes in drosophila gut. Nat Immunol, 10: 949-957. Grasberger H. (2010) Defects of thyroidal hydrogen peroxide generation in congenital hypothyroidism. Mol Cell Endocrinol.
95
79.
80.
81.
82. 83. 84. 85.
86.
87.
88.
89.
90.
91. 92. 93. 94.
95.
Song Y, Ruf J, Lothaire P, Dequanter D, Andry G, Willemse E, Dumont JE, Van Sande J, De Deken X. (2010) Association of duoxes with thyroid peroxidase and its regulation in thyrocytes. J Clin Endocrinol Metab, 95: 375-382. Moreno JC, Bikker H, Kempers MJ, van Trotsenburg AS, Baas F, de Vijlder JJ, Vulsma T, Ris-Stalpers C. (2002) Inactivating mutations in the gene for thyroid oxidase 2 (THOX2) and congenital hypothyroidism. N Engl J Med, 347: 95-102. Zamproni I, Grasberger H, Cortinovis F, Vigone MC, Chiumello G, Mora S, Onigata K, Fugazzola L, Refetoff S, Persani L, Weber G. (2008) Biallelic inactivation of the dual oxidase maturation factor 2 (DUOXA2) gene as a novel cause of congenital hypothyroidism. J Clin Endocrinol Metab, 93: 605-610. Wong JL, Creton R, Wessel GM. (2004) The oxidative burst at fertilization is dependent upon activation of the dual oxidase Udx1. Dev Cell, 7: 801-814. Deits TL, Shapiro BM. (1986) Conformational control of ovoperoxidase catalysis in the sea urchin fertilization membrane. J Biol Chem, 261: 12159-12165. Ha EM, Oh CT, Bae YS, Lee WJ. (2005) A direct role for dual oxidase in Drosophila gut immunity. Science, 310: 847-850. Chavez V, Mohri-Shiomi A, Garsin DA. (2009) Ce-Duox1/BLI-3 generates reactive oxygen species as a protective innate immune mechanism in Caenorhabditis elegans. Infect Immun, 77: 4983-4989. Niethammer P, Grabher C, Look AT, Mitchison TJ. (2009) A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature, 459: 996-999. Wesley UV, Bove PF, Hristova M, McCarthy S, van der Vliet A. (2007) Airway epithelial cell migration and wound repair by ATP-mediated activation of dual oxidase 1. J Biol Chem, 282: 3213-3220. Shao MX, Nadel JA. (2005) Dual oxidase 1-dependent MUC5AC mucin expression in cultured human airway epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 102: 767-772. Csillag C, Nielsen OH, Vainer B, Olsen J, Dieckgraefe BK, Hendel J, Vind I, Dupuy C, Nielsen FC, Borup R. (2007) Expression of the genes dual oxidase 2, lipocalin 2 and regenerating islet-derived 1 alpha in Crohn's disease. Scand J Gastroenterol, 42: 454-463. Davies MJ, Hawkins CL, Pattison DI, Rees MD. (2008) Mammalian heme peroxidases: from molecular mechanisms to health implications. Antioxid Redox Signal, 10: 1199-1234. Hansson M, Olsson I, Nauseef WM. (2006) Biosynthesis, processing, and sorting of human myeloperoxidase. Arch Biochem Biophys, 445: 214-224. Klebanoff SJ. (1970) Myeloperoxidase: contribution to the microbicidal activity of intact leukocytes. Science, 169: 1095-1097. Decoursey TE, Ligeti E. (2005) Regulation and termination of NADPH oxidase activity. Cell Mol Life Sci, 62: 2173-2193. Carpena X, Vidossich P, Schroettner K, Calisto BM, Banerjee S, Stampler J, Soudi M, Furtmuller PG, Rovira C, Fita I, Obinger C. (2009) Essential role of proximal histidine-asparagine interaction in mammalian peroxidases. J Biol Chem, 284: 25929-25937. Tonks NK. (2003) PTP1B: from the sidelines to the front lines! FEBS Lett, 546: 140-148.
96
96. 97. 98. 99. 100.
101. 102.
103.
104.
105.
106. 107.
108. 109.
110.
111. 112.
113.
Klebanoff SJ, Coombs RW. (1996) Virucidal effect of stimulated eosinophils on human immunodeficiency virus type 1. AIDS Res Hum Retroviruses, 12: 25-29. Ruf J, Carayon P. (2006) Structural and functional aspects of thyroid peroxidase. Arch Biochem Biophys, 445: 269-277. Ris-Stalpers C, Bikker H. (2010) Genetics and phenomics of hypothyroidism and goiter due to TPO mutations. Mol Cell Endocrinol. Taurog A, Dorris ML. (1992) Myeloperoxidase-catalyzed iodination and coupling. Arch Biochem Biophys, 296: 239-246. Yoshida A, Taniguchi S, Hisatome I, Royaux IE, Green ED, Kohn LD, Suzuki K. (2002) Pendrin is an iodide-specific apical porter responsible for iodide efflux from thyroid cells. J Clin Endocrinol Metab, 87: 3356-3361. Luczay A. A pajzsmirigyműködés zavarai. In: T Tulassay (szerk.), Gyermekgyógyászati útmutató. Medition, Budakeszi, 2006: 159-167. Nelson RE, Fessler LI, Takagi Y, Blumberg B, Keene DR, Olson PF, Parker CG, Fessler JH. (1994) Peroxidasin: a novel enzyme-matrix protein of Drosophila development. EMBO J, 13: 3438-3447. Horikoshi N, Cong J, Kley N, Shenk T. (1999) Isolation of differentially expressed cDNAs from p53-dependent apoptotic cells: activation of the human homologue of the Drosophila peroxidasin gene. Biochem Biophys Res Commun, 261: 864-869. Mitchell MS, Kan-Mitchell J, Minev B, Edman C, Deans RJ. (2000) A novel melanoma gene (MG50) encoding the interleukin 1 receptor antagonist and six epitopes recognized by human cytolytic T lymphocytes. Cancer Res, 60: 64486456. Cheng G, Salerno JC, Cao Z, Pagano PJ, Lambeth JD. (2008) Identification and characterization of VPO1, a new animal heme-containing peroxidase. Free Radic Biol Med, 45: 1682-1694. Ihalin R, Loimaranta V, Tenovuo J. (2006) Origin, structure, and biological activities of peroxidases in human saliva. Arch Biochem Biophys, 445: 261-268. Fragoso MA, Torbati A, Fregien N, Conner GE. (2009) Molecular heterogeneity and alternative splicing of human lactoperoxidase. Arch Biochem Biophys, 482: 52-57. Ratner AJ, Prince A. (2000) Lactoperoxidase. New recognition of an "old" enzyme in airway defenses. Am J Respir Cell Mol Biol, 22: 642-644. Salathe M, Holderby M, Forteza R, Abraham WM, Wanner A, Conner GE. (1997) Isolation and characterization of a peroxidase from the airway. Am J Respir Cell Mol Biol, 17: 97-105. Moskwa P, Lorentzen D, Excoffon KJ, Zabner J, McCray PB, Jr., Nauseef WM, Dupuy C, Banfi B. (2007) A novel host defense system of airways is defective in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med, 175: 174-183. Boucher RC. (2007) Airway surface dehydration in cystic fibrosis: pathogenesis and therapy. Annu Rev Med, 58: 157-170. Rada B, Lekstrom K, Damian S, Dupuy C, Leto TL. (2008) The Pseudomonas toxin pyocyanin inhibits the dual oxidase-based antimicrobial system as it imposes oxidative stress on airway epithelial cells. J Immunol, 181: 4883-4893. Conner GE, Wijkstrom-Frei C, Randell SH, Fernandez VE, Salathe M. (2007) The lactoperoxidase system links anion transport to host defense in cystic fibrosis. FEBS Lett, 581: 271-278.
97
114. Fischer H. (2009) Mechanisms and function of DUOX in epithelia of the lung. Antioxid Redox Signal, 11: 2453-2465. 115. Midda M, Cooksey MW. (1986) Clinical uses of an enzyme-containing dentifrice. J Clin Periodontol, 13: 950-956. 116. Marquez LA, Dunford HB. (1995) Kinetics of oxidation of tyrosine and dityrosine by myeloperoxidase compounds I and II. Implications for lipoprotein peroxidation studies. J Biol Chem, 270: 30434-30440. 117. Milenkovic M, De Deken X, Jin L, De Felice M, Di Lauro R, Dumont JE, Corvilain B, Miot F. (2007) Duox expression and related H2O2 measurement in mouse thyroid: onset in embryonic development and regulation by TSH in adult. J Endocrinol, 192: 615-626. 118. Gevaert T, Vriens J, Segal A, Everaerts W, Roskams T, Talavera K, Owsianik G, Liedtke W, Daelemans D, Dewachter I, Van Leuven F, Voets T, De Ridder D, Nilius B. (2007) Deletion of the transient receptor potential cation channel TRPV4 impairs murine bladder voiding. J Clin Invest, 117: 3453-3462. 119. Mochizuki T, Sokabe T, Araki I, Fujishita K, Shibasaki K, Uchida K, Naruse K, Koizumi S, Takeda M, Tominaga M. (2009) The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures. J Biol Chem, 284: 21257-21264. 120. Thorneloe KS, Sulpizio AC, Lin Z, Figueroa DJ, Clouse AK, McCafferty GP, Chendrimada TP, Lashinger ES, Gordon E, Evans L, Misajet BA, Demarini DJ, Nation JH, Casillas LN, Marquis RW, Votta BJ, Sheardown SA, Xu X, Brooks DP, Laping NJ, Westfall TD. (2008) N-((1S)-1-{[4-((2S)-2-{[(2,4dichlorophenyl)sulfonyl]amino}-3-hydroxypropanoyl)-1 -piperazinyl]carbonyl}3-methylbutyl)-1-benzothiophene-2-carboxamide (GSK1016790A), a novel and potent transient receptor potential vanilloid 4 channel agonist induces urinary bladder contraction and hyperactivity: Part I. J Pharmacol Exp Ther, 326: 432442. 121. LaFleur GJ, Jr., Horiuchi Y, Wessel GM. (1998) Sea urchin ovoperoxidase: oocyte-specific member of a heme-dependent peroxidase superfamily that functions in the block to polyspermy. Mech Dev, 70: 77-89. 122. Jacob JS, Cistola DP, Hsu FF, Muzaffar S, Mueller DM, Hazen SL, Heinecke JW. (1996) Human phagocytes employ the myeloperoxidase-hydrogen peroxide system to synthesize dityrosine, trityrosine, pulcherosine, and isodityrosine by a tyrosyl radical-dependent pathway. J Biol Chem, 271: 19950-19956. 123. Tenovuo J, Paunio K. (1979) Formation of dityrosine by human salivary lactoperoxidase in vitro. Acta Odontol Scand, 37: 147-152. 124. Thein MC, Winter AD, Stepek G, McCormack G, Stapleton G, Johnstone IL, Page AP. (2009) Combined extracellular matrix cross-linking activity of the peroxidase MLT-7 and the dual oxidase BLI-3 is critical for post-embryonic viability in Caenorhabditis elegans. J Biol Chem, 284: 17549-17563. 125. Serrander L, Cartier L, Bedard K, Banfi B, Lardy B, Plastre O, Sienkiewicz A, Forro L, Schlegel W, Krause KH. (2007) NOX4 activity is determined by mRNA levels and reveals a unique pattern of ROS generation. Biochem J, 406: 105-114. 126. Votyakova TV, Reynolds IJ. (2004) Detection of hydrogen peroxide with Amplex Red: interference by NADH and reduced glutathione auto-oxidation. Arch Biochem Biophys, 431: 138-144.
98
127. Rada B, Leto TL. (2010) Characterization of hydrogen peroxide production by Duox in bronchial epithelial cells exposed to Pseudomonas aeruginosa. FEBS Lett, 584: 917-922. 128. Benov L, Fridovich I. (1996) Escherichia coli exhibits negative chemotaxis in gradients of hydrogen peroxide, hypochlorite, and N-chlorotaurine: products of the respiratory burst of phagocytic cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 93: 49995002. 129. Botteaux A, Hoste C, Dumont JE, Van Sande J, Allaoui A. (2009) Potential role of Noxes in the protection of mucosae: H(2)O(2) as a bacterial repellent. Microbes Infect, 11: 537-544. 130. Allaoui A, Botteaux A, Dumont JE, Hoste C, De Deken X. (2009) Dual oxidases and hydrogen peroxide in a complex dialogue between host mucosae and bacteria. Trends Mol Med, 15: 571-579. 131. Monshausen GB, Bibikova TN, Messerli MA, Shi C, Gilroy S. (2007) Oscillations in extracellular pH and reactive oxygen species modulate tip growth of Arabidopsis root hairs. Proc Natl Acad Sci U S A, 104: 20996-21001. 132. Everaerts W, Vriens J, Owsianik G, Appendino G, Voets T, De Ridder D, Nilius B. (2010) Functional characterization of transient receptor potential channels in mouse urothelial cells. Am J Physiol Renal Physiol, 298: F692-701.
99
12. AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ PUBLIKÁCIÓK
1.
Donkó Á, Péterfi Z, Sum A, Leto T, Geiszt M. (2005) Dual oxidases. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360: 2301-2308.
2.
Donkó Á, Orient A, Szabó PT, Németh G, Vántus T, Kéri G, Őrfi L, Hunyady L, Buday L, Geiszt M. (2009) Detection of hydrogen peroxide by lactoperoxidase-mediated dityrosine formation. Free Radic Res, 43: 440-445.
3.
Péterfi Z, Donkó Á*, Orient A, Sum A, Prókai Á, Molnár B, Veréb Z, Rajnavölgyi É, Kovács KJ, Müller V, Szabó AJ, Geiszt M. (2009) Peroxidasin is secreted and incorporated into the extracellular matrix of myofibroblasts and fibrotic kidney. Am J Pathol, 175: 725-735. * társelsőszerző
13. AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÉZIRAT
1.
Donkó Á, Ruisanchez É, Orient A, Enyedi B, Kapui R, Péterfi Z, de Deken X, Benyó Z, Geiszt M. (2010) Urothelial cells produce hydrogen peroxide through the activation of Duox1. Free Radic Biol Med (átdolgozás alatt)
14. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁHOZ KAPCSOLÓDÓ EGYÉB PUBLIKÁCIÓ
1.
Orient A, Donkó Á, Szabó A, Leto TL, Geiszt M. (2007) Novel sources of reactive oxygen species in the human body. Nephrol Dial Transplant, 22: 12811288.
100
15. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Mindenekelőtt témavezetőmnek, Dr. Geiszt Miklósnak szeretnék köszönetet mondani, aki bevezetett a tudományos gondolkodás módszertanába, végig türelemmel irányította, támogatta munkámat és megteremtette e dolgozat megírásához szükséges nyugodt környezetet. Köszönöm Dr. Hunyady Lászlónak, hogy intézetvezetőként lehetővé tette munkámat és hogy olyan intézetet teremtett, ahol öröm dolgozni. Köszönöm Dr. Ligeti Erzsébetnek, hogy a Celluláris és molekuláris élettan program vezetőjeként, támogatta és figyelemmel kísérte tudományos munkámat. Köszönettel tartozom Dr. Spät Andrásnak, aki korábbi intézetvezetőként és programvezetőként tette lehetővé és támogatta munkámat. Hálás köszönettel tartozom laborunk munkatársainak, Orient Annának, Dr. Péterfi Zalánnak, Dr. Enyedi Balázsnak szakmai segítségükért és az együtt végzett munka örömérért. Külön köszönettel tartozom Molnár Beáta és Szosznyák Tünde asszisztensnőknek támogatásukért és megbizható munkájukért. Köszönöm diákkörös hallgatóim, Kapui Réka és Fülöp Krisztián kísérletekben nyújtott segítségét. Köszönettel tartozom az Enyedi-, a Hunyady-, a Káldi-, a Ligeti-, a Mócsai-, a Spät-, Várnai-labor, és az Élettani Intézet összes dolgozójának minden segítségükért. Köszönöm Dr. Gócza Elen, Dr. Kovács Krisztina, Dr. Nusser Zoltán és Dr. Thomas L. Leto laborvezetőknek, hogy hosszab-rövidebb ideig a laborjukban dolgozhattam, ami alatt sokat tanultam. Köszönöm laboruk minden kedves munkatársának a segítségét és a barátságot, amivel fogadtak. Köszönöm munkájukat kollaborációs partnereinknek Dr. Szabó T. Pálnak, Dr. Benyó Zoltánnak és Dr. Ruiszancsez Évának. Köszönöm Mikesi Árpádnak, az ELTE Immunológia Intézet munkatársának, hogy bevezetett az állatokkal való munka rejtelmeibe. Köszöttel és hálával tartozom szüleimnek, testvéremnek és családom egyéb tagjainak, akik mindenben támogató szeretete nélkül nem juthattam volna el idáig. Külön köszönöm férjemnek, Dr. Szidonya Lászlónak, a dolgozat írásában nyújtott segítségét, támogatását és szeretetét.
101
