NEUROTRANSZMISSZIÓBAN RÉSZTVEVŐ ENZIMEK AKTIVITÁSÁNAK

NEUROTRANSZMISSZIÓBAN RÉSZTVEVŐ ENZIMEK AKTIVITÁSÁNAK MÉRÉSE

14. GYAKORLAT

____________________________________________________________________________________________________________________________________________

14. GYAKORLAT

NEUROTRANSZMISSZIÓBAN RÉSZTVEVŐ ENZIMEK AKTIVITÁSÁNAK MÉRÉSE 1. Vizsgálatok (pszeudo)kolin eszterázzal Bevezetés Az emberi szervezetben két kolin eszterázt különböztethetünk meg. Az acetilkolin eszteráz a neurotranszmisszió működtetésében vesz részt. Egy másik enzim a pszeudokolin eszteráz a plazmában fordul elő. Ez utóbbi enzimet a máj szintetizálja. Az acetilkolin eszteráz szubsztrátja az acetilkolin, a pszeudokolin eszteráz az acilcsopotot illetően kevésbé specifikus. Könnyű hozzáférhetősége miatt méréseinket a pszeudokolin eszterázzal végezzük és szubsztrátként a butiriltiokolint használjuk. Méréstechnikai szempontokból az észterkötés oxigénje ebben a vegyületben kénatomra van cserélve (tioészter). A pszeudokolin eszteráz kémiai reakciói megegyeznek az acetilkolin eszterázzal. Az idegsejtek más idegsejtekkel az úgynevezett szinapszisoknál kapcsolódnak egymáshoz, illetve hatnak egymásra. A legtöbb szinapszisnál a jeleket kémiai transzmitterek közvetítik, amelyek kis, diffúzióra alkalmas molekulák, mint pl. az acetilkolin vagy a norepinefrin (noradrenalin). Az acetilkolin a motoros végkészülékekben, tehát az ideg és a harántcsíkolt izom közötti kapcsolódásnál is, jeltovábbító szerepet tölt be.

Idegimpulzus iránya

Mitokondrium

Szinaptikus rés

Szinaptikus vezikulum Preszinaptikus membrán Receptor

Posztszinaptikus membrán

A kolinerg szinapszis szerkezete. Egy szinaptikus vezikulumban 104 acetilkolin molekula található. Megfelelő jeltovábbításhoz egyszerre 100-300 vezikulumnak kell átlépni a szinaptikus résbe majd reakcióba lépni a posztszinaptikus membránban elhelyezkedő receptorral. A szinaptikus rés kb. 20 nm széles, diffúzióval a vezikulumok ezt a távolságot 0.1 msec alatt teszik meg. Az acetilkolin hatását az acetilkolin eszteráz hidrolízissel szünteti meg.

A kolinerg szinapszis preszinaptikus membránját a posztszinaptikus membrántól egy kb. 20 nm széles tér, a szinaptikus rés, választ el. A preszinaptikus axon végződése számos, acetilkolinnal telt, szinaptikus vezikulumot tartalmaz. Idegimpulzus érkezése a szinaptikus résbe történő acetilkolin kiáramlását idézi elő. Az acetilkolin molekulák ezután a posztszinaptikus membránhoz diffúzió útján jutnak el, ahol a megfelelő receptorokhoz kapcsolódhatnak. A vezikulák a preszinaptikus membrán és a posztszinaptikus membrán közötti utat kb. 0.1 msec alatt teszik meg. Eközben az acetilkolinnak kb. 30 %-át az acetilkolin eszteráz elbontja. A receptorhoz való kötődés a posztszinaptikus membrán depolarizációját vonja maga után. A depolarizációs jel ezután a következő idegsejt elektromosan ingerelhető membránján fut végig. A neuron – neuron interakcióknál elektromotoros vagy kémiai szinapszisok működnek közre. A kémiai sejt − sejt kommunikációnál két lehetőség kínálkozik: a kémiai „hírvivő” közvetlenül ioncsatornához kapcsolódik és annak nyitását vagy zárását okozza (ionotropikus receptorok, Na +-, K+- vagy Ca2+-ionok számára). Vagy a receptorhoz való kötődés után G-proteinek és a posztszinaptikus sejt citoplazmájában jelen levő második messengerek közvetítésével jön működésbe az ion-csatorna (metabotropikus receptorok). Az acetilkolin a nikotin-receptorokon vagy a muszkarin-receptorokon fejti ki hatását. Az acetilkolin egy része a preszinaptikus membránon keresztül visszajut a szintézis helyére, és újra hasznosul. Zömét azonban az acetilkolin eszteráz hidrolizálja és ezzel visszaállítja a posztszinaptikus membrán polarizációját. Az acetilkolin a preszinaptikus axonok végeiben szintetizálódik. Az acetil-CoAról acetilcsoport kerül a kolinra. Ezt a reakciót a kolin acetiltranszferáz (kolin acetiláz) enzim katalizálja.

75


14. GYAKORLAT

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________

A szintetizált acetilkolin egy részét a szinaptikus vezikulumok veszik fel, többi része a citoszolban marad. Az átlagban 100-800 Å átméretű kolinerg szinaptikus vezikulum kb. 10000 acetilkolin molekulát tartalmaz. A vezikulában az acetilkolin koncentráció 100 mM körül, az ATP 10 mM körül van. A posztszinaptikus membrán (véglemez), illetve egy motoros végkészülék lemezének nyugvó potenciálja -75 mV. Speciális receptorok és acetilkolin kölcsönhatásaként erősen megváltozik e membránok ionokkal szemben mutatott permeabilitása. Tized msec idő alatt jelentősen megnő a Na + és K+ áramlása. Nagy mennyiségű Na+ kerül a sejtbe és sokkal kevesebb K+ áramlik ki a sejtből. A beáramló Na+ depolarizálja a posztszinaptikus membránt és egy akciós potenciált vált ki a szomszédos axonban vagy izommebránban. Egy receptorhoz 2 molekula acetilkolin kapcsolódik, konformációs változás jön létre, és kinyílik az ion-csatorna. A2R*

A2R

2A+R

ahol, A acetilkolin molekula, R a zárt ion-csatorna, R* a nyitott ion-csatorna. Egy kb. 0.1 msec ideig nyitva álló csatornán kb. 104 ion áramlik át. Hosszantartó acetilkolin behatásra a receptor deszenzitálódik, vagyis az ion-csatorna bezáródik és hosszabb ideig acetilkolinra nem reagál. Kutatások kimutatták, hogy az idegimpulzus során az acetilkolin a preszinaptikus membránon keresztül kb. 104 acetilkolin molekulát tartalmazó csomagok formájában jut át. Idegimpulzusok nélkül is vannak jelen 0.5 mV nagyságú és 20 msec ideig tartó depolarizációs pulzusok. Ezeket miniatűr véglemez potenciáloknak nevezzük. Ahhoz, hogy a végkészülék teljes depolarizációja létrejöjjön, egyszerre kb. 100 acetilkolint tartalmazó csomagnak (vezikula) milliszekundumnál rövidebb időn belül kell a receptorhoz érkezni. Az acetilkolint tartalmazó csomagok száma függ a preszinaptikus membrán potenciáljától. Más szavakkal, az acetilkolin kiáramlás az enzim-szekréció elektromosan szabályozott formája. Az acetilkolin kibocsátás az extracelluláris folyadék Ca2+ tartalmától is függ. A szinaptikus membrán depolarizációja Ca2+ beáramlást okoz, ami elősegíti a szinaptikus vezikulák és a preszinaptikus membrán átmeneti fúzióját (exocitózis kezdete). Bizonyos idő után a depolarizációs jelet ki kell „kapcsolni”, hogy a posztszinaptikus membrán ingerelhetősége visszaálljon. Az acetilkolint az acetilkolin eszteráz bontja acetátra és kolinra. Az acetilkolin eszteráz a szinaptikus résben helyezkedik el, ahol kollagénhez és glükózaminoglikánokhoz társul. Az enzim móltömege 260 kDa, 22 szerkezettel rendelkezik. Az enzim katalitikus hatása emlékeztet a kimotripszin működésére. Az acetilkolin az enzim aktív centrumában egy specifikus szerin OH-csoportjával reagál és átmenetileg egy kovalens acetil − enzim intermediert alkot, miközben kolin szabadul fel. Az acetil – enzim köztitermék ezután vízzel reagál, acetát képződik és visszakapjuk a szabad enzimet. O H3C

C

CH3 O

CH2

CH2

+

N

CH3

O

CH3 + H2O

H3C

+

C

CH3

HO

CH2

CH2

CH3 + H+

CH3

O

Acetilkolin

+

N

Acetát

Kolin

Az acetilkolin eszteráz gátlószerei, többek között, a fizosztigmin és a neosztigmin (gyógyászatban pupillaszűkítőnek használják). O

H N

C

CH3

O

CH3

CH3

O

N

C

CH3 O

CH3 Fizosztigmin (Eserin)

N

N

CH3

CH3

+

N

CH3

CH3

Neosztigmin

Ezek a vegyületek az acetilkolin eszterázzal, kovalens kötéssel, karbamoilált intermediert képeznek, amelyek vízzel csak nagyon lassan hidrolizálnak, kompetitív vagy nemkompetitív inhibitorai lehetnek az

76


14. GYAKORLAT

____________________________________________________________________________________________________________________________________________

acetilkolin eszteráznak. Ennél sokkal erősebb inhibitorok a szerves fluorofoszfátok, mint pl. a diizopropilfluorofoszfát. CH3 H

C

O O

CH3

CH3

P

O

C

F

H3 C H

O +

H3 C

N

CH2

CH2

O

O

C

CH2

CH2

C

CH3 O

CH2

CH2

+

N

H3 C

CH3

CH3 CH3

Diizopropil-fluorofoszfát

Szukcinilkolin

A diizopropil-fluorofoszfát az acetilkolin eszterázzal, HF kilépése közben, rendkívül stabilis, kovalens foszforil – enzim komplexet alkot. A foszforil csoport az enzim aktív centrumában található szerinhez kötődik. A szerves fluorofoszfátokat és származékait a mezőgazdaságban használják rovarirtásra. A szukcinilkolint a sebészetben műtétek előtt izomrelaxánsnak alkalmazzák. A szérumban található pszeudo-kolineszteráz örökletes hiánya esetében alkalmazásánál súlyos mellékhatásokkal kell számolni. Bizonyos autoimmun megbetegedésnél a szervezet a saját, neuromuszkuláris csatlakozások posztszinaptikus membránjaiban található, nikotin − acetilkolin receptorokkal szemben antitesteket termel. Ezek az antitestek a receptorokhoz kötődve megakadályozzák a receptor és acetilkolin reakcióját vagy a receptor konformáció változását, mely az ion-transzport kiváltásához szükséges. A betegséget myasthenia gravis-nak nevezik. Izomgyengeség, nagyfokú fáradékonyság, a végtagok testközeli izmainak ernyedtsége, nyelési nehézség, jellemző a betegségre. Acetilkolin eszteráz enzimgátlók adása javít a tüneteken. Kortikoszteroidok, immunoszupresszívumok és thymectomia a kór lefutását jótékonyan befolyásolják. Gyakorlaton a pszeudokolin-eszteráz aktivitását mérjük. A végbemenő reakciók: O H3 C

CH3

CH2 CH2 C

S

S-Butiril-tiokolin

+

CH2 CH2 N

CH3

O O

CH3

H2O

O H3 C

CH3

CH2 CH2 C Butirát

HS

+

O

+

CH2 CH2 N

+

N

O

C

O

+

N

C

S

S

+

CH2 CH2 N

O

CH3

O O C O

+

O O

S

5,5'-Ditio-bis-2-nitrobenzoesav (DTNB)

C

CH3 +

N

+

N

CH3

Tiokolin

O

O

O

CH3

S

O

O

O

+

CH3 SH

Vegyes diszulfid

Tionitrobenzoesav (sárga színű)

Anyagok, eszközök Fiziológiás NaCl oldat (144 mmol/l) Sertésszérum (40 x hígított) Ditionitrobenzoesav oldat (0.52 mmol/l, pH 7.4; 100 mmol/l TRIS, 2 mmol/l MgCl2 pufferben oldva) Butiriltiokolin jodid oldat (15.0 mmol/l) Butiriltiokolin jodid oldat (0.833 mmol/l) (A butiriltiokolin jodid törzsoldatot és a hígítást hűtőben kell tárolni!) Prometazin oldat, gátlószer (0.1 mmol/l; Ms: 320.88) Pipetták, kémcsövek Fotométer, szűkített küvetták

77


14. GYAKORLAT

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________

Aktivitásmérés szérumban A (pszeudo)kolin eszteráz aktivitásának mérése kinetikai mérés. A táblázatok oszlopait egyenként, egymást követően kell összemérni és fotométerben a percenkénti abszorbanciaváltozást regisztrálni. Tehát külön a PRÓBA, a VAK, majd az egyes v és v’ oszlopait kell feldolgozni. Aktivitásmérés

PRÓBA

VAK

Szérum, 40  hígított (ml)

0.10

-

Fiziológiás NaCl oldat (ml)

0.10

0.20

Ditionitrobenzoesav oldat (ml)

0.50

0.50

5 perc állás szobahőmérsékleten Butiriltiokolin jodid oldat (15 mmol/l) (ml)

0.30

0.30

5 percig, percenként mérjük az abszorbanciát 405 nm-en

Km és Vmax meghatározása Nem gátolt v reakciósebességek mérése

1.

2.

3.

4.

5.


0.10

0.10

0.10

0.10

0.10


0.35

0.33

0.30

0.25

0.10


0.50

0.50

0.50

0.50

0.50

0.10

0.15

0.30

5 perc állás szobahőmérsékleten Butiriltiokolin oldat, 0.833 mmol/l (ml)

0.05

0.07


Enzimgátlás mérése, KI meghatározása Gátolt v’ reakciósebesség mérése

G.


0.10


0.20

Gátlószer (Prometazin) 0.1 mmol/l (ml)

0.10


0.50

5 perc állás szobahőmérsékleten Butiriltiokolin oldat, 0.833 mmol/l (ml)

0.10


A KI gátlási állandót az enzim − inhibitor komplex disszociációs állandójaként definiálhatjuk. Az a gátlószerkoncentráció (mol/liter), mely, pl. a kompetitív gátlásnál a KM Michaelis – Menten állandó értékét a duplájára növeli. Minél kisebb a KI állandó, annál nagyobb affinitással kötődik a gátlószer az enzimhez.

Feladatok Számítsa ki a szérum enzimaktivitását a percenkénti abszorbancia változásból. Az aktivitást adja meg U/literben és Katal-ban, illetve számítsa ki a fajlagos aktivitást, feltételezve, a szérum 7.2 % fehérjét tartalmaz. Az első évben tanultak alapján (Lineweaver-Burk) számítsa ki a (pszeudo)kolin-eszteráz – butiriltiokolin Km és Vmax állandóját, felhasználva a különböző [S] koncentrációknál mért abszorbancia változásokat (A/min). A számításoknál a reakcióelegy szubsztrátkoncentrációit vegye figyelembe!

78


14. GYAKORLAT

____________________________________________________________________________________________________________________________________________

A gátlási kísérletnél, a reakcióelegy gátlószer koncentrációját figyelembe véve, számítsa ki a gátlószer inhibitorállandóját, KI értékét. A prometazin gátlását tekintsük kompetitív gátlásnak. A nemkompetitív és un-kompetitív gátlások KI értékeit hasonló egyenletekkel lehet kiszámítani. Képletek

V  10 6  h U / liter   A / min  d v

Kompetitiv KI 

 I   v   Km  v  v  K m   S 

ahol: V h  d v KI [I] Km v v’ [S]

a reakcióelegy teljes térfogata (1 ml) a szérumminta hígítása (40  ) a tionitrobenzoesav moláris extinkció koefficiense (13600 mol-1..cm-1) a fény úthossza a küvettában (1 cm) a küvettába mért minta térfogata (0.10 ml) az enzim − inhibitor komplex disszociációs állandója gátlószer (inhibitor) koncentrációja (mmol/l) az enzim − szubsztrát affinitására jellemző állandó (mmol/liter) gátlószer nélkül, [S] szubsztrátkoncentrációnál mért reakciósebesség az [I] gátlószer- és [S] szubsztrátkoncentráció mellett mért reakciósebesség szubsztrátkoncentráció (mmol/l)

Kérdések A reakcióelegy foszfát puffert, ditionitrobenzoesavat, butiriltiokolin jodidot és szérumot tartalmaz. Ismertesse melyik komponensnek mi a szerepe. Ismertesse az enzimaktivitás mérésének lényegét. Mi a kompetitív és nem-kompetitív enzimgátlás közötti különbség? Mi a Km, Vmax és KI állandók fogalma, mik az egységek?

79


14. GYAKORLAT

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________

2. Monoamino oxidáz aktivitásának mérése Bevezetés A monoamino oxidáz (MAO), (amin : oxigén oxidoreduktáz, dezamináló, flavin-tartalmú) a központi idegrendszerben és a perifériás szövetek neuroaktív és vazoaktív aminjainak (dopamin, noradrenalin, adrenalin, gyűjtőnevükön katecholaminok) oxidatív dezaminálását katalizálja a következő reakció szerint: MAO

RCH2NH2 + H2O + O2 Peroxidáz

+

HO

RCHO + NH3 + H2O2

H2O2

O

O

+ H2O

Kinon

Fenol CH3

CH3

3

O

O

+

H2N

N

4

CH3

1

N

O Kinon

4-Aminoantipirin

O

N

N

N

CH3

+

H2O

O Színes termék, konjugált kettőskötésekkel

Az enzim aktivitásának mérése alapulhat a képződő aldehid mennyiségének meghatározásán, alkalmaznak izotópos módszereket is. A gyakorlaton a sztöchiometrikus mennyiségben keletkezett hidrogénperoxid oxigénjével, peroxidáz segédenzimmel közvetítve, fenolt oxidálunk. Az oxidációs termék (kinon) 4-aminoantipirinnel piros színű vegyületet képez (kinonimin; Trinder-reakció), melynek abszorbanciáját mérjük. A színreakció általánosan alkalmazható oxigenázok aktivitásának nyomon követésére. Így pl. alkalmazzák glükóz, koleszterol, foszfolipidek, stb. koncentrációjának mérésére szolgáló tesztekben. A reakcióelegyben levő Na-azid a vizsgált mintákban mindig jelenlevő kataláz aktivitását gátolja, ezzel elérhető, hogy az összes keletkezett H2O2 a színképzéshez rendelkezésre álljon. Az enzim a mitokondrium külső falában helyezkedik el. Nagy mennyiségben található az adrenerg terminálisokban, gliában, a májban és a bél epithelsejtjeiben. Két formája van (MAO A és MAO B). Ezek egymástól szubsztrátigényük, inhibitor specificitásuk, szöveti-, és sejteloszlásuk, valamint immunológiai tulajdonságaik alapján különböztethetők meg. A MAO A a szerotonint oxidálja, irreverzibilis gátlószere a clorgylin. A MAO B-nek jó szubsztrátja a feniletilamin és a benzilamin, gátlószerei a pargylin és deprenyl.

80


14. GYAKORLAT

____________________________________________________________________________________________________________________________________________

OH

OH

HO

HO

HO

HN

NH2

HO

HO

HO

NH2

N CH3

Noradrenalin (Norepinefrin) Adrenalin (Epinefrin) (MAO A és MAO B szubsztrát) (MAO A és MAO B szubsztrát)

NH2

HO

H

Dopamin Szerotonin (MAO A és MAO B szubsztrát) (MAO A szubsztrát) CH3

CH2

NH2

O

CH2

CH2

CH2

N CH2

Cl

C

CH CH3

N Benzilamin (MAO B szubsztrát)

Cl Clorgylin (irreverzibilis MAO A gátló)

C

CH

CH3 Pargylin (irreverzibilis MAO B gátló)

N H3 C

C

CH

Deprenyl (irreverzibils MAO B gátló)

A noradrenalin metabotrop hatásokat közvetít. Hatását nemcsak közvetlen környezetében fejti ki, hanem felszabadulási helyétől eldiffundálva távoli helyeken, nem-szimpatikus úton is. A noradrenerg ingerületátvitel egyik jellegzetessége, hogy az acetilkolinnal ellentétben, a szinaptikus résben nem található transzmittert inaktíváló enzimrendszer. A noradrenalin elsősorban újrafelvétellel (reuptake) és részben neuronális, részben nem-neuronális sejtekben végbemenő intracelluláris enzimatikus bomlás útján alakul át. A noradrenalin újrafelvétele történhet neuronálisan, a felszabadulási helyen és extracellulárisan, a keringés útján, pl. simaizom-, endothel- vagy szívizomsejtek révén. Két re-uptake mechanizmus létezik. A re-uptake 1-et a kokain, amfetamin és a triciklikus antidepresszánsok gátolják, a re-uptake 2-t a kortikoszteron. A katecholaminok újrafelvétele specifikus transzport-fehérjéket igényel. A kokain, az amfetamin és a triciklikus antidepresszánsok a dopamin transzporter fehérjéhez kapcsolódva gátolják az újrafelvételt. Ezzel megnövekszik a neurotranszmitterek koncentrációja a szinaptikus résben és a posztszinaptikus neuron stimulusa időben elnyúlik. A metabolikus lebontásban elsősorban a monoamino oxidáz (MAO) és a katechol-O-metiltranszferáz vesz részt. A noradrenalin és adrenalin többek között szerepet játszik a vérnyomás és szívfrekvencia, a légzés, metabolikus folyamatok és az idegrendszer működésének szabályozásában. Ezeket a hatásokat a katecholaminok az 1-, 2- és a -receptorok családjába tartozó receptorokon keresztül fejtik ki. Az összes 1 típusú receptor Gq proteinen keresztül fejti ki hatását, tehát a foszfolipáz C – inozitol-3-foszfát mechanizmus segítségével. A keletkezett inozitol-3-foszfát az intracelluláris raktárakból Ca2+-ot szabadít fel, Ca2+ csatornák is megnyílnak és a megnövekedett Ca2+-szint következtében a simaizomzat összehúzódik. Az 2 receptorok általában a preszinaptikus axonvégződéseken helyezkednek el. Az 2 receptorok működése Gi proteinhez kapcsolt, tehát aktiválódásuknál elsősorban a cAMP-szint csökken. Ez magyarázza, hogy az 2 receptoroknak a gátlási folyamatokban van jelentős szerepe. A 1-receptorok csak a szívben és a zsírszövetben fordulnak elő, a 2-receptorok az összes többi helyen, főleg a simaizmokon. Az összes -receptor működése Gs proteinhez kapcsolt, így ingerlésük során a cAMP szint emelkedik a sejtekben. A 1-receptorok ingerlésekor a szívfrekvencia és a szív kontraktilitása nő (a pozitív ionotrop hatás eredménye). A zsírszövetekben fokozódik a lipolízis. A 2receptorok izgatása a simaizmok elernyedését vonja maga után. Parkinson-kórban a nigrostriatalis pályák degenerációja és a csökkent dopaminfelszabadulás eredményeként a corpus striatum kolinerg szabályozott jelátvitele túlaktiválódik. A betegség főleg a 60 év feletti lakosságot érinti. Jellemző a betegségre a nyugalmi tremor. A gyógyításban a dopaminerg – kolinerg egyensúly fenntartása a legfontosabb szempont, tehát növelni kell a dopamin koncentrációját, és gátolni kell az acetilkolin felszabadulást. Ez történhet: a dopamin-szintézis fokozásával (dopamin prekurzor adása), az endogén dopamintermelés növelésével (tetrahidrobiopterin adása), a perifériás LDOPA lebontásának gátlásával, a dopaminfelszabadulás fokozásával, a dopamin-lebontás gátlásával

81


14. GYAKORLAT

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________

(MAO-B enzim gátlókkal), illetve a katechol-O-metil-transzferáz gátlásával. Másrészt a muszkarinreceptorokon hatásukat kifejtő antikolinerg szerek adása célravezető.

Nyers mitokondrium készítmény előállítása 300 g friss sertésmájat (vágóhídról) vagy csirkemájat ollóval felaprítunk, 750 ml homogenizáló pufferben szuszpendálunk (2.5 liter készítése: 214 g szacharózt, 930 mg EDTA.Na 2 -ot és 3 g HEPES-t oldunk 2.5 literre desztillált vízzel. Az oldat pH értékét 0.1 N KOH-dal 7.2-re állítjuk be). Késes homogenizátorral maximális fordulattal 1 percig homogenizálunk. A homogenizátumot néhány réteg gézen átszűrjük. A szűrletet 700 g-vel1 15 percig centrifugáljuk. A csapadékot eldobjuk, a szupernatánst 15 percig 8000 g-vel centrifugáljuk. A csapadékot 700-800 ml homogenizáló pufferben felvesszük. Üveg − teflon homogenizátorral rövid ideig homogenizáljuk (részletekben). Ismét centrifugáljuk a homogenizátumot 15 percig 8000 g-vel. Az üledéket homogenizáló pufferben szuszpendáljuk, majd még egyszer centrifugáljuk 15 percig 8000 g-vel (a csapadék mosása). Ezután a csapadékot KCl-tartalmú HEPES pufferben (5.6 g KCl és 1.2 g HEPES 500 ml-re desztillált vízzel oldva, az oldat pH-ját 0.1 N KOH-dal 7.2-re állítjuk be) szuszpendáljuk, 15 percig 8000 g-vel centrifugáljuk. Az üledéket szétporciózzuk és felhasználásig -20 C -on tároljuk.

Anyagok, eszközök Alapoldat (Foszfát puffer, pH 7.4, 100 mmol/l, Fenol 11.0 mmol/l, Na-azid 5.0 mmol/l, 4-Aminoantipirin 0.8 mmol/l, Peroxidáz 1 U/ml) Benzilamin oldat (5.0 mmol/l, 100 mmol/l foszfát pufferben oldva, pH 7.4) Hidrogénperoxid standard oldat (1.0 mmol/l) 37 C -os vízfürdő Centrifuga, centrifugacsövek, kémcsövek Pipetták Fotométer, szűkített küvetták

Mérés PRÓBA

VAK

STANDARD

0.8

0.8

0.8

-

0.1

0.1

Benzilamin oldat (ml)

0.1

-

-

Mitokondrium szuszp. (ml)

0.1

0.1

-

-

-

0.1

Alapoldat (ml) Desztillált víz (ml)

Hidrogénperoxid st. (ml)

A kémcsöveket 20 percre 37 C -os vízfürdőbe helyezzük. 20 perc után a PRÓBA és VAK mintákat centrifugáljuk és a STANDARD-dal mérjük a minták abszorbanciáit 540 nm-en.

Számítás Számítsa ki a mitokondrium szuszpenzió térfogataktivitását valamint a fehérjére vonatkoztatott fajlagos aktivitást. Számolja ki a színreakcióval mért H2O2 moláris extinkció koefficiensét (mol-1..cm-1). A mitokondrium szuszpenzió fehérjetartalma 20 mg/ml. A számítás a következő aránypár átrendezése után kapott egyenlettel végezhető: mol/liter H2O2 standard : A540 standard = Minta koncentráció : A540 minta 1

n  g / (11179 .  105  r )

82


14. GYAKORLAT

____________________________________________________________________________________________________________________________________________

Az aktivitás számításánál az A540 abszorbanciákat a VAK-kal korrigálni kell (PRÓBA – VAK).

Kérdések A reakcióelegy tartalmaz: foszfát puffert, benzilamint, nátriumazidot, fenolt és 4-aminoantipirint. Ismertesse, melyik komponens milyen célt szolgál. Mi a monoamino oxidáz enzim (MAO) aktivitásmérésnek, illetve a színreakciónak az elve? Milyen reakciókat katalizál a monoamino oxidáz?

Transzmitterek és receptorok Neurotranszmitterek fő csoportjai: 1. Acetilkolin. 2. Biogén aminok (adrenalin, dopamin, hisztamin, noradrenalin, szerotonin. 3. Transzmitter aminosavak (aszpartát, GABA, glicin, glutamát, taurin). 4. Neuropeptidek (pl. -MSH, angiotensin II, bradykinin, endorfin, enkefalinok, oxytocin, prolactin, secretin, somatostatin, TRH, vasopressin).

Extracelluláris tér

Adenilátcikláz G-Protein csatolt receptor

RAC/Gs

-Adrenerg Dopaminerg D4 Adenozin A2

RAC/Gi

2-Adrenerg Muszkarin Dopaminerg D2 Adenozin A1 Opioid GABAB

G-Protein ioncsatorna csatolt receptor

Foszfolipáz C G-Protein csatolt receptor

RPLC

Rion

RLG/ion

-Adrenerg (Ca , Na ) 2+ + 2-Adrenerg (Ca , K ) Muszkarin (K+, Ca2+) Dopaminerg D2 (Ca2+, K+) + GABAB (K ) 2+

1-Adrenerg Muszkarin Metabotrop glutamát

RPLC

RAC

Gi

+ -

Gq

AC

PTX ATP

cAMP + Pi

PLC

PIP2

Gi

+

PTX

Intracelluláris tér

+

Nikotin (Na ) GABAA (Cl ) Ionotrop 2+ + Glutamát (Ca , Na )

RLG / ION

Go

DAG + IP3 PKC

+

IONCSATORNA

RION Gs

Gs

Ligand kapuzott ioncsatorna

Ca2+

K Ca2+ Na+ Cl-

K+ Ca 2+ Na + Cl-

PKA

83


14. GYAKORLAT

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________

84

NEUROTRANSZMISSZIÓBAN RÉSZTVEVŐ ENZIMEK AKTIVITÁSÁNAK

Recommend Documents