Pécs Miklós: Biotermék technológia 1.
6. fejezet: Ipari enzimek 2.
Proteázok A proteázok az ipari enzimek egyik legfontosabb csoportja (6200 t tiszta E/év) Peptid kötéseket bont (létrehoz) (hidrolízis, szintézis) Fehérje lebontás: élelmiszer, tejalvadás, mosóenzimek, infúzió, vérrögoldás (fibrin oldás) Fehérje szintézis: aszpartám előállítása
IPARI ENZIMEK 2
Csoportosítás: – termelő szervezetek alapján (baktérium, gomba) – pH optimum alapján (alkalikus, neutrális, savas) – kulcs-aminosav szerint (Ser, Cys, Asp proteázok) 2
Törzsek
Alkalikus proteázok Termelő mikroorganizmusok: Streptomyces nemzetség, Aspergillus nemzetség, B. amyloliquefaciens (szubtilizint termel – szerin-proteáz, reverzibilis acilezésre képes) A mosószer proteázoknál feltétel a kompatibilitás: – detergensekkel – lúgokkal – kelátképzőkkel – perborátokkal Hőstabilitás
Screening pH = 10-es fehérje agaron szélesztéssel Törzsjavítás (génmanipuláció, protein engineering) Célja: az adott törzs több enzimet termeljen 1.) erős promótert teszünk az adott gén elé 2.) multikópiás plazmid: az adott gén több példányban legyen jelen. 3.) protein engineering: a stabilitás érdekében a 222 Met-t (mely instabil) Ser-re cserélték - jobb aktivitást tapasztaltak, de a stabilitás nem lett jobb.
3
Fermentációs technológia
4
Neutrális proteázok
Fed batch fermentáció
Termelő mikroorganizmusok: Bacillus subtilis, S. griseus, Aspergillus orizae Érzékeny: - hőre - stabilizátorokra (CaCl2,NaCl) - alkalikus proteáz gyorsan lebontja
Az NH4 és aminosav koncentrációt alacsonyan kell tartani nagy O2 bevitel kell 48-72 h
Felhasználás: • Élelmiszeripar (kenyér, keksz gyártás) • Bőripar (szőrtelenítés, húsmaradék lemésztése. Irányított folyamat)
1971-ben allergia miatt termék-krízis: a por állagú enzim a levegőben szállt és allergiát okozott. Megoldás: mikrokapszulázás, extruderes granulátum – sima felületű szemcsék, nem porzik. 5
BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék
6
1
Pécs Miklós: Biotermék technológia 1.
6. fejezet: Ipari enzimek 2.
Savas proteázok
Oltóenzim, rennin, rennet, chymosin, gasztriktin Savas proteáz A sajtgyártás legfontosabb enzime, alvasztó enzim, Asp van az aktív centrumban (= aszparaginsav proteáz) 3-4 hetes borjú gyomrában található pre-pro-chymozin formában Két izoenzime van: - chymozin A: Asp (~40%, nagyobb az aktivitás) - chymozin B: Gly (~60%) Genetikailag meghatározott, a borjú gyomrában vagy A, vagy B van jelen.
Cys proteázok Pepszinhez hasonló enzimek (pHopt = 2-4) pl. : papain, bromelin Felhasználás: - emésztést elősegítő enzimek - szója szósz előállítása - glutén hidrolízise (sütőipar)
7
Chymosin-B
8
Rennin Megnövekedett igény, nincs elég borjú gyomor. A hiányzó mennyiség pótlására: 1. állati (pl. csirke) pepszinek (Izrael, Csehország) 2. savas penész proteázok - Mucor mihei, Mucor pusillus, Endothia parasitica E. parasitica enzim: kereskedelmi készítmény, 1967, Supraren (USA, Franciaország) - (pH = 4 - 5,5) - hőstabilitása (viszonylag) nagy (nem jó tulajdonság) - extracelluláris enzim, kicsapódhat Protein engineering-gel próbálják javítani. 9
10
3. Rekombináns DNS technika E. coli - 1980 elején az állati chymozin gént klónozták, RENNETR néven szabadalmaztatták és engedélyeztették - az enzim oldhatatlan, zárványtest (inclusion body) formában van - az összfehérje 15-20%-a rennin Az E. coli élelmiszeripari gyártásban nem alkalmazható mikroba, mert néha patogén, és toxint termelhet. Ezért más törzsek: B. subtilis: ártalmatlan mikroba, de ez is intracelluláris Saccharomyces cerevisiae: gyenge termékképzés
Kluyveromyces lactis: élelmiszeripari mikroba (SCP savón), 1950-60 savóból izolálták A tejiparban használatos β-galaktozidázt ezzel termelte a Gist-Brocades. Extracelluláris enzimtermelés: az élesztő α-faktor leadert, mint szignál szekvenciát beépítették ezáltal a prochymosint extracellulárisan termeli. (1988 F, NL) A törzs kevés extracelluláris fehérjét termel, ezért könnyű a rennint izolálni Prochymosin → chymosin (MAXIRENR) Scale up könnyű, mert ezzel az törzzsel termelték a β-galaktozidázt is (bár az intracelluláris enzim volt).
11
12
BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék
2
Pécs Miklós: Biotermék technológia 1.
6. fejezet: Ipari enzimek 2.
A K. lactis-ba bevitt plazmid Expressziós vektor - laktóz promóter régió - szignál peptid rész - pro-chymosin DNS - laktóz terminátor régió - transzpozon
A termék nem tartalmazhat élő sejtet, ezért benzoesavval alacsony pH-án elölik, és szűrik (ultraszűrés után sterilszűrés, élelmiszer enzim (DNS-t nem tartalmazhat) Közben a prochymosin → chymosin átalakulás végbemegy A termék tartósítását benzoesavval v. NaCl-dal végzik. Régebben plazmidos rekombináns élesztővel termeltették a prochymosint, ma már a prochymosin gént a kromoszómába építették be.
13
Az aktív RENNIN kialakulása
14
MAXIRENR - tisztább, mint a borjú rennin, nincs kísérő enzim (pepszin + egyéb) - a renninnel kémiailag és biológiailag teljesen azonos - ez a kereskedelmi termék az egész világon. - termelése olcsó - állandó tisztaságú, mentes állati szervmaradványoktól (pl. nincs BSE veszély) - mennyisége korlátlan
15
MAXIRENR
16
A RENNIN hatása
- 1988-tól ipari termelés Seclinben (Fr.o.), ez az üzem ISO 9002 minősítéssel rendelkezik rekombináns élesztő tenyésztésére, Kóser engedély (vegetáriánus termék) - engedélyeztetése nehéz volt DNS stabilitás, patogenitás, mutagenitás, toxikusság, etetési teszt, allergia, sajtgyártási teszt, organoleptikus vizsgálatok - EC, EU előírásait betartani (termelésre és termékre egyaránt)
17
BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék
A sajtgyártás kulcslépése a tejfehérje megalvasztása. Sajt: ez az első termék, melynél enzimet és mikrobát is használnak évezredek óta Évente 25*106 liter rennetet forgalmaznak, 140 M USD értékben, olcsó enzim
18
3
Pécs Miklós: Biotermék technológia 1.
6. fejezet: Ipari enzimek 2.
%
Foszfát csoportok molekulánként
32
8
α s2-kazein
8
10-13
β-kazein
32
5
κ-kazein
8
1-2
Fehérjék Kazein α s1-kazein
0,1% Ca jelenlétében a kazein micellát képez Hőstabil P miatt, Ca kötő micella képz.
80 Savó fehérje β-laktoglobulin
12
0
β-laktalbumin
4
0
Immunglobulin
3
0
1
0
Szérum albumin
Ezek ultraszűréssel eltávolíthatók
20 19
A rennin hatása
20
A rennin hatása 1. fázis: A rennin fenilalanin-metionin között végez hasítást, és ez a vágás destabilizálja a micella szerkezetét. 2. fázis: koaguláció, mely a magasabb hőmérsékleten és Ca2+ ionok hatására fokozódik Szétválasztás: túró (fehérje: a 8%-ból 7, zsír, Ca, foszfát) + savó (tejcukor ~7,5% és ~1% fehérje, ásványi sók)
21
22
Sajtérlelés
Fémproteázok
Bizonyos sajtokat érlelnek (4 hét-2 év), az idővel a víztartalom csökken. Közben: kémiai, biokémiai, mikrobiológiai változások zajlanak le.
Zn proteáz, termolizin az aszpartángyártás fontos enzime Az aszpartám egy mesterséges, kis kalóriájú édesítőszer. Felhasználása élelmiszereknél: tej, jam, italok, cukorkák… A fenilalanin metil észterének és aszparaginsavnak az összekapcsolásával keletkezik:
- ha tejcukor maradt a sajtban és ezen a mikrobák elszaporodnak kellemetlen íz - sok szabad zsírsav keserű (szappanszerű) ízt ad - a fehérje bomlás folyamatos, aminosavak, biogén aminok, ammónia 23
BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék
24
4
Pécs Miklós: Biotermék technológia 1.
6. fejezet: Ipari enzimek 2.
Termolizin
Az enzimes eljárás előnyei
Forrása: Bacillus proteoliticus Japán hőforrásból izolálták jó a hőstabilitása A kofaktora Zn2+ ion, a stabilitását 4 Ca2+ biztosítja. Optimális körülmények: pH = 7-7,5 T = 50 °C Izolált enzimként, oldott formában alkalmazzák. Szakaszos eljárás, keverős reaktorban Enantiomer tisztaság: 99,99 %
Nem keletkezik β-aszpartám (keserű) Sztereoszelektív a reakció, csak L-aszpartám keletkezik, alapanyagként DL-Phe (racém) is használható. Nincs racemizáció a szintézis alatt A reakció vizes közegben, enyhe körülmények között végrehajtható.
25
Aszpartám gyártás
26
Aszpartám gyártás
Ahhoz, hogy csak a fenilalanin aminocsoportja reagáljon a az aszparaginsav α-karboxil csoportjával, a rajtuk lévő egyéb funkciós csoportokat blokkolni kell, egyébként random dipeptidek és oligopeptidek képződnek. A Phe metilésztere a karbonsavat blokkolja, az Asp aminocsoportját pedig egy benzoil-oxi-karbonil (BOC) csoporttal védik (ez hidrogénezéssel eltávolítható)
Szubsztrátok: L-aszparaginsav + DL-fenilalanin-OMe (racém, olcsóbb) – A keletkező védett aszpartám adduktot képez a feleslegben lévő D-PheOMe-rel, ami kicsapódik. – Szűrés – Sósavval visszaoldják. – A BOC csoportot lehidrogénezik, a D-PheOMe-t racemizálják és visszaviszik a folyamat elejére.
27
28
Aszpartám gyártás
29
BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék
30
5
Pécs Miklós: Biotermék technológia 1.
6. fejezet: Ipari enzimek 2.
Lipázok
Lipázok
Alapreakció: a zsírok észterkötéseit hidrolizálják, termékek: szabad zsírsavak, mono- és digliceridek, glicerin. Egyensúlyi reakció, visszafelé is megy.
Vannak régióspecifikusak, amelyek csak a szélső zsírsavakat hidrolizálják, a középsőt nem, de vannak erre érzéketlenek is. A szénlánc hossza csak a sebességet befolyásolja. Szerves oldószerekben is jól működnek, igen kis víztartalom mellett. Sőt a hőállóságuk is jobb ebben a közegben 70 °C. Adszorpcióval könnyen immobilizálhatók szerves és szervetlen hordozók felületén (hidrofil-hidrofób jelleg a használt oldószer szerint).
32
31
Lipázok felhasználása
Termelő mikroorganizmusok: Aspergillus nemzetség, Mucor nemzetség, Rhyzopus nemzetség, Candida nemzetség
1. Emésztést elősegíti (pankreász lipáz pótlása)
Általában sejthez kötött enzimek, de Mg2+ ionok hatására leválnak
3. Szappan ipar, kíméletes elszappanosítás (Candida lipáz)
Induktor: olaj, zsírok (szubsztrát), Represszor: glicerin (mint termék), glükóz (katabolit represszió)
4. Átészterezés, észterképzés dinamikus egyensúly a karbonsav csoportok folyamatosan cserélődnek
2. Sajtérlelésben ízjavító (tejzsír irányított bontása)
33
Zsírok átészterezése
34
Zsírok átészterezése
1. Trigliceridek között Élelmiszeripar: pálmamag-olaj átészterezése kakaóvaj-szerű zsiradékká (csokoládé gyártás)
2. Triglicerid és zsírsav között
35
BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék
36
6
Pécs Miklós: Biotermék technológia 1.
6. fejezet: Ipari enzimek 2.
Penicillin aciláz/amidáz
Penicillin aciláz/amidáz
A félszintetikus penicillinek előállítása a fermentált G- penicillin oldalláncának lecserélésével történik. 1. Hidrolízis 2. Új oldallánc (karbonsav) rákötése G penicillin → 6-amino-penicillánsav (6-APA) + fenilecetsav
Karbonsav származék + 6-APA félszintetikus penicillin
Ugyanazzal az enzimmel meg lehet csinálni a két ellentétes reakciót, de itt sav-származékot kell adni (pH, ionizálás!) 37
38
Penicillin aciláz/amidáz Termelő törzsek: Type I: penész típusú, pH ~10, t ~50 °C, inkább V, mint G Type II: baktérium típusú, pH ~8, t ~40 °C. Sokféle van, de az iparban főleg E. coli mutánsok és manipulált törzsek. Fermentáció: Indukció fenil-ecetsav adagolással (5X titer-növekedés) Glükóz: katabolit represszió miatt kis koncentrációban O2 : aerob, de nem túl erős levegőztetés Feldolgozás: - nyugvósejtes tenyészet, - immobilizált enzim
39
BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék
7
