INDUKSI KERAGAMAN GENETIK DENGAN MUTAGEN SINAR GAMMA PADA NENAS SECARA IN VITRO
ERNI SUMINAR
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010 i
ABSTRACT ERNI SUMINAR. Genetic Variability Induced with Gamma Rays Mutagen on Pineapple In Vitro. Under direction of AGUS PURWITO and SOBIR. Improvement of the genetic variability of pineapple plant can be done by mutation induction with gamma rays. The aim of the research was to increase genetic variability on pineapple through gamma irradiation of calli that have been frequently subculture. Medium for calli induction was MS + 1 mg L-1 benzylaminopurine (BAP) + 0.05 mg L-1 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), while the medium for shoot regeneration was MS + 1.5 mg L-1 kinetin + 0.5 mg L-1 NAA. Calli were then irradiated with 0, 15, 25 and 35 Gy gamma irradiation. Completely randomized design with 40 replication were used in this experiment. The result showed that irradiation gamma rays were affected on growth and regeneration on calli. Generally, the 15 Gy induced variance of shoot growth, phenotypic and genetic variability. Gamma irradiation changed the banding pattern of DNAs as they were amplified with five primers of ISSR molecular marker to analysis genetic variability among regenerant. Serial selection based on erect leaves structures and narrow canopy diameter character resulted to seven regenerants mutant with erect leaves structure and narrow canopy diameter without reducing plant height and leaves number compared to those of control regenerants population. Keywords : genetic variability, gamma rays, pineapple, in vitro
ii
RINGKASAN ERNI SUMINAR. Induksi Keragaman Genetik dengan Mutagen Sinar Gamma pada Nenas Secara In Vitro. Dibimbing oleh AGUS PURWITO dan SOBIR. Nenas (Ananas comosus (L.) Merr) merupakan tanaman buah yang potensial untuk dikembangkan karena telah banyak digunakan baik sebagai makanan segar, bahan industri makanan, kosmetik, obat-obatan dan industri tekstil. Produktivitas nenas di Indonesia masih rendah dan rasio bobot buah dengan tanaman hanya berkisar 0.43-0.46, sedangkan di negara maju telah mencapai rasio 0.6. Pusat Kajian Buah Tropika IPB telah memiliki klon harapan nenas yang memiliki kualitas buah unggul, namun produktivitasnya masih rendah. Salah satu kendala dalam meningkatkan produktivitas di lapangan secara agronomi adalah diameter tajuk yang lebar mecapai 1 m, daun yang panjang mencapai 1 m atau lebih, serta kedudukan daun terkulai sehingga memerlukan jarak tanam yang lebar. Upaya untuk mengatasi hal ini salah satunya adalah melalui perakitan varietas nenas unggul yang memiliki kualitas buah baik, struktur tanaman yang tegak, dan diameter tajuk sempit sehingga jarak tanam di lapangan dapat dirapatkan sehingga produktivitas dapat ditingkatkan. Karakter tanaman nenas yang memiliki kedudukan daun tegak dan diameter tajuk sempit belum tersedia di alam dan perlu dilakukan peningkatan keragaman terutama untuk karakterkarakter tersebut, sedangkan sifat lainnya seperti kualitas buah dipertahankan. Pemuliaan mutasi dengan menggunakan mutagen fisik seperti sinar gamma merupakan salah satu alternatif untuk meningkatkan keragaman yang dapat mengubah satu atau beberapa karakter tanpa mengubah karakteristik asalnya. Tujuan akhir diharapkan akan dihasilkan varietas unggul nenas yang memiliki karakter kedudukan daun tegak dengan kualitas buah yang baik. Penelitian ini merupakan bagian dari pemuliaan yang diperlukan dalam perakitan varietas nenas unggul. Percobaan telah dilakukan dengan melalui beberapa tahap, mulai dari pembentukan kalus, iradiasi sinar gamma pada kalus, regenerasi kalus untuk pembentukan tunas, serta analisis keragaman genetik berdasarkan marka morfologi, penanda molekular, dan gabungan antara morfologi dan molekular sehingga diperoleh informasi bahwa pemberian mutagen sinar gamma dapat menyebabkan perubahan baik morfologi maupun pada tingkat DNA. Kegiatan penelitian terdiri dari empat kegiatan yaitu persiapan dan perbanyakan bahan tanam dan inisiasi kalus telah dilaksanakan selama 6 bulan di Laboratorium Kultur Jaringan PKBT IPB, selanjutnya dilakukan induksi mutasi dengan mutagen sinar gamma dengan dosis 0 Gy, 15 Gy, 25 Gy, dan 35 Gy pada kultur kalus in vitro. Kegiatan ini dilakukan di BATAN Jakarta dengan. Regenerasi kalus dilakukan dalam media induksi tunas (MS + 1.5 mg L-1 kinetin + 0.5 mg L-1 NAA dan dilakukan pembesaran tunas dalam MS0. Parameter yang diamati, terdiri dari : a) Persentase kalus berwarna hijau (%), iii
b) Persentase kalus yang mampu membentuk tunas (%), c). Jumlah bakal tunas (buah), dan d) jumlah daun. Kegiatan berikutnya adalah pengujian daya regenerasi tunas mutan pada tahap multiplikasi dan pembesaran secara in vitro. Media multiplikasi yang digunakan yaitu media MS dengan penambahan 1 mg L-1 BAP. Parameter yang diamati terdiri dari : a) jumlah tunas dan b) jumlah daun. Tunas-tunas yang mampu bermultiplikasi, selanjutnya dilakukan subkultur ke dalam media MS0 untuk pembesaran. Parameter yang diamati terdiri dari : a) jumlah tunas, b) jumlah daun, dan c) tinggi tunas. Untuk pengujian keragaman genetik yang terjadi akibat pemberian mutagen sinar gamma, dilakukan dengan menggunakan penanda morfologi yang dapat dilihat dari perubahan bentuk tanaman secara visual, sedangkan pengujian pada tingkat DNA dilakukan dengan menggunakan penanda molekular ISSR dan dilakukan analisis data dengan program NTSYS ver. 2.02. Berdasarkan analisis ragam pada tahap pertumbuhan kalus setelah diiradiasi menunjukkan bahwa pemberian mutagen sinar gamma dapat mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan kalus dalam pembentukan tunas baik pada media induksi maupun pada media multiplikasi dan pembesaran tunas selanjutnya. Terjadi perubahan morfologi yang dapat dilihat secara visual, yaitu pada karakter jumlah daun, bentuk daun, bentuk tunas, tinggi tunas, warna daun, kedudukan daun tegak, dan diameter tajuk. Perubahan yang terjadi pada tingkat DNA dapat dilihat dari pola pita DNA yang teramplifikasi dengan menggunakan marka molekular ISSR. Hasil seleksi pertama dilakukan pada satu karakter yaitu kedudukan daun tegak dan diperoleh genotipe mutan sebanyak 24, namun memiliki nilai rata-rata jumlah daun yang lebih rendah daripada tanaman kontrol (normal). Untuk mendapatkan mutan yang memiliki struktur kedudukan daun tegak, diameter tajuk lebih sempit dengan jumlah daun dan tinggi tunas yang tidak berbeda nyata dengan kontrol maka dilakukan seleksi kedua berdasarkan pada dua karakter sekaligus (kedudukan daun tegak dan diameter tajuk < 0.9 cm) maka diperoleh tujuh regeneran mutan yang memiliki struktur kedudukan daun tegak dan diameter tajuk lebih sempit daripada regeneran kontrol tetapi memiliki karakter tinggi tunas dan jumlah daun yang tidak berbeda nyata dengan regeneran kontrol. Mutan-mutan ini berasal dari populasi dengan pemberian mutagen sinar gamma dosis 15 Gy.
Kata kunci : keragaman genetik, sinar gamma, Inter Simple Sequence Repeat (ISSR)
iv
DAFTAR ISI
Halaman DAFTAR TABEL ……………………………………………………… xiii DAFTAR GAMBAR ……………………………………………………
xiv
DAFTAR LAMPIRAN …………………………………………………
xv
PENDAHULUAN Latar Belakang ……………………………………………………… Kerangka Pemikiran ………………………………………………… Tujuan Penelitian …………………………………………………….
1 4 5
TINJAUAN PUSTAKA Biologi Tanaman Nenas ……………………………………………… Pemuliaan TanamanNenas …………………………………………… Kultur In Vitro pada Nenas …………………………………………... Induksi Mutasi pada Kultur In Vitro………………………………….. Mutagen Sinar Gamma ………………………………………………. Penanda Morfologi …………………………………………………… Penanda Molekuler ISSR ……………………………………………..
6 8 9 11 13 15 15
BAHAN DAN METODE Bahan tanaman ……………………………………………………….. Metode Penelitian ……………………………………………………. Analisis Data …………………………………………………………
17 17 22
HASIL DAN PEMBAHASAN Kondisi Umum Pertumbuhan Kalus ........................................................ Pengaruh Pemberian Mutagen Sinar Gamma terhadap Regenerasi Kalus Nenas In Vitro …………………………………………………………... Kemampuan Regenerasi Tunas Mutan pada Tahap Multiplikasi dan Pembesaran secara in vitro ……………………………………………… Keragaman Mutan Genetik dengan Menggunakan Penanda Morfologi, Molekular ISSR dan Gabungan .............................................................. Seleksi, Analisis Perbandingan Nilai Rata-rata dengan Uji-t dan Analisis Perbandingan Nilai Varians Populasi Kontrol dan Mutan dengan Uji F .
25 26 30 37 44
SIMPULAN DAN SARAN.........................................................................
47
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................
48
LAMPIRAN
57
v
DAFTAR TABEL
Halaman
1
Susunan nukleotida, kandungan G/C dari 17 primer berulang ISSR yang Digunakan untuk Seleksi Primer …………………….
22
Nilai F-hitung karakter fenotipik dalam media regenerasi pada 8 MST...…………………………………………………………
27
Nilai F-hitung karakter fenotipik dalam media pembesaran (MS0) pada 8 MST…………....…………………………………
29
Jumlah tunas dan jumlah daun regeneran hasil iradiasi sinar gamma dalam media multiplikasi pada 8 MST…………………..
31
Keragaman 16 regeneran contoh pada nenas in vitro hasil perlakuan radiasi sinar gamma ….……………………………….
35
6
Jumlah pita hasil amplifikasi lima primer pada analisis ISSR ….
39
7
Nilai koefisien keragaman tertinggi dan terendah pada penanda morfologi, ISSR dan data gabungan …………………………….
43
Pengamatan karakter kuantitatif regeneran mutan hasil iradiasi sinar gamma dalam media pembesaran (MS0) pada umur 16 MST sebelum dan setelah seleksi S1 (kedudukan daun tegak) dan S2 (kedudukan daun tegak dan diameter tajuk<0.9 cm) ………….………………………………………………………..
45
2
3
4
5
8
vi
DAFTAR GAMBAR Halaman 1
Skema kerangka pemikiran penelitian induksi mutasi nenas klon PK secara in vitro ....................................................................................
4
2
[A] Deskripsi tanaman klon PK di lapangan; [B] Karakteristik buah nenas klon PK; [C] Plantlet in vitro nenas klon PK ………………
17
3
Diagram alir penelitian.. …………………………………………….
18
4
Tahapan perbanyakan bahan tanam dan inisiasi kalus………………
25
5
Morfologi kalus 8 mingggu setelah iradiasi dalam media induksi tunas ………………………………………………………………..
26
Histogram rata-rata persentase kalus hijau, persentase kalus membentuk tunas, dan jumlah tunas dalam media regenerasi akibat pemberian mutagen sinaar gamma pada 8 MST ……………………
28
Histogram rata-rata jumlah tunas dan daun regeneran dalam media MS0 pada 8 MST…………..………………………………………..
30
Keragaman karakter morfologi regeneran mutan putatif in vitro dalam media pembesaran (MS0) pada 8 MST ……...………………
33
Keragaman bentuk daun regeneran hasil induksi mutasi dengan sinar gamma…….......………………………………………………
36
6
7
8
9
10
Dendrogram kemiripan morfologi hasil analisis gerombol dengan metode pengelompokan UPGMA berdasarkan karakter morfologi dari 16 regeneran nenas in vitro ……………………………………
37
11
Pola pita 16 regeneran kontrol dan mutan……………………..……..
40
12
Pola pita 16 regeneran kontrol dan mutan……………………..……..
40
13
Dendrogram kemiripan genotipik hasil analisis gerombol dengan metode pengelompokan UPGMA berdasarkan pola pita ISSR dari 16 regeneran nenas in vitro …………………………………………
42
Dendrogram UPGMA dari hasil analisis data gabungan penanda morfologi dan penanda molekular ISSR pada 16 regeneran nenas in vitro…….………………………………………………………….
43
14
vii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
Komposisi Media MS (Murashige dan Skoog 1962) ………………
57
2
Deskripsi tanaman nenas klon harapan PK IPB …………………….
58
3
Deskripsi buah nenas klon harapan PK IPB ………………………..
59
4
Komposisi larutan dan bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi DNA, analisis ISSR, dan elektroforesis ………………………..…..
60
5
Komposisi peraksi dan buffer untuk analisis DNA tanaman nenas .
62
6
Matriks koefisien kemiripan morfologi (KM) antar 16 regeneran nenas in vitro ………………………………………………………..
63
Matriks koefisien kemiripan genetik (KG) penanda ISSR antar 16 regeneran nenas in vitro ……………………………………………
64
Matriks koefisien kemiripan data gabungan penanda morfologi dan penanda ISSR antar 16 regeneran nenas in vitro …………………..
65
Data biner gabungan morfologi dan pita DNA dari 5 primer ISSR pada 16 regeneran kontrol dan mutan ……………………………….
66
Dokumentasi genotipe terpilih dari populasi M-15 …………………
68
7
8
9
10
viii
