INDUKSI MUTASI KROMOSOM DENGAN KOLKISIN PADA TANAMAN STEVIA (Stevia rebaudiana Bertoni) KLON ZWEETENERS SECARA IN VITRO
Oleh: ASEP RODIANSAH A34302032
PROGRAM STUDI HORTIKULTURA FAKULTAS PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2007
RINGKASAN ASEP RODIANSAH. Induksi Mutasi Kromosom dengan Kolkisin pada Tanaman Stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) Klon Zweeteners secara In vitro. (Dibimbing oleh Ni Made Armini Wiendi) Tujuan penelitian ini adalah untuk mempelajari pengaruh perendaman kolkisin terhadap penggandaan kromosom tanaman Stevia rebaudiana Bertoni secara in vitro. Penelitian in vitro dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi Tanaman, Departemen Agronomi dan Hortikultura Institut Pertanian Bogor, Darmaga Bogor. Uji histologi dilakukan di Laboratorium Sitologi Herbarium Bogoriense LIPI Bogor. Bahan tanaman yang digunakan adalah planlet tanaman Stevia rebaudiana Bertoni M klon Zweeteners. Eksplan yang digunakan adalah mata tunas aksilar dari planlet in vitro berumur 4 minggu, media MS tanpa zat pengatur tumbuh untuk perbanyakan eksplan, MS + 1.5 mg/l BAP dan 0.5 mg/l IAA untuk penanaman eksplan setelah perendaman dengan kolkisin dan MS + 0.1 mg/l NAA untuk perakaran. Bahan untuk uji sitologi adalah planlet tanaman stevia, asam asetat 45%, HCl 1 N, aquades, Orsein 2%, Hidroksikuinolin 0.002 M dan cat kuku yang tak berwarna Penelitian disusun dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktor tunggal berupa kombinasi konsentrasi kolkisin dengan lama perendaman. terdapat sebelas perlakuan yaitu: P1 (perendaman dengan air selama 24 jam), P2 (perendaman dengan air selama 48 jam), P3 (perendaman dengan air selama 72 jam), P4 (perendaman dengan 0.02% larutan kolkisin selama 24 jam), P5 (perendaman dengan 0.02% larutan kolkisin selama 48 jam), P6 (perendaman dengan 0.02% larutan kolkisin selama 72 jam), P7 (perendaman dengan 0.04% larutan kolkisin selama 24 jam), P8 (perendaman dengan 0.04% larutan kolkisin selama 48 jam), P9 (perendaman dengan 0.06% larutan kolkisin selama 24 jam), P10 (perendaman dengan 0.06% larutan kolkisin selama 48 jam) dan P11 (perendaman dengan 0.06% larutan kolkisin selama 72 jam).
Kondisi kultur tanaman stevia pada awal perlakuan secara umum beragam, terjadi kontaminasi hingga 90% pada perlakuan 0.04% 72 jam, pada minggu kedua semua eksplan berkalus. Perlakuan
kombinasi
konsentrasi
kolkisin
dan
lama
perendaman,
berpengaruh nyata terhadap persentase eksplan hidup, jumlah tunas per eksplan, jumlah daun per eksplan dan persentase tunas yang berakar.Semua eksplan yang diberi perlakuan kombinasi konsentrasi kolkisin dan lama perendaman menunjukan hasil yang lebih kecil dibandingkan dengan eksplan yang direndam air. Perlakuan 0.06% kolkisin selama 72 jam, menghasilkan persentase tunas berakar yang terkecil pada minggu ke-2 dan ke-3 MST, dibandingkan dengan perlakuan lain. Hasil uji sitologi menunjukan bahwa kolkisin dapat menginduksi terjadinya mutasi kromosom pada sel tunas stevia secara in vitro. Mutasi dengan kolkisin menghasilkan kimera pada planlet yang terbentuk. Perlakuan yang menghasilkan planlet dengan jumlah kromosom melebihi jumlah alaminya adalah perlakuan perendaman 0.02% kolkisin selama 24 jam, 0.04% kolkisin selama 24 jam, kolkisin 0.04% selama 48 jam dan kolkisin 0.06% selama 72 jam. Jumlah kromosom pada planlet yang dihasilkan beragam, dari 15 hingga 50 kromosom per sel. Diperoleh 10 planlet yang memiliki sel dengan jumlah kromosom yang lebih tinggi dari normal dan 39 planlet yang lebih rendah dari normal.
INDUKSI MUTASI KROMOSOM DENGAN KOLKISIN PADA TANAMAN STEVIA (Stevia rebaudiana Bertoni) KLON ZWEETENERS SECARA IN VITRO
Skripsi Sebagai salah satu syarat Untuk memperoleh gelar Sarjana Pertanian Pada Fakultas Pertanian Institut Pertanian Bogor
ASEP RODIANSAH A34302032
PROGRAM STUDI HORTIKULTURA FAKULTAS PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2007
LEMBAR PENGESAHAN
Judul Skripsi
:
INDUKSI
MUTASI
KROMOSOM
DENGAN
KOLKISIN PADA TANAMAN STEVIA (Stevia rebaudiana
Bertoni)
KLON
SECARA IN VITRO Nama Mahasiswa
: Asep Rodiansah
NRP
: A34302032
Menyetujui, Dosen Pembimbing
Dr. Ir. Ni Made Armini Wiendi, MS NIP 131 694 525
Mengetahui, Dekan Fakultas Pertanian
Prof. Dr. Ir. Supiandi Sabiham, M.Agr.Sc. NIP 130 422 698 Tanggal lulus:
ZWEETENERS
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bandung, Jawa Barat Pada tanggal 24 Juni 1984, sebagai putra ke lima pasangan Bapak Sahim dan Ibu Hasanah (Alm.) Penulis menyelesaikan Pendidikan di Sekolah Menengah Umum Negeri 12 Bandung pada tahun 2002. Selama di SMU penulis mendapatkan beasiswa berprestasi dari Departemen Pendidikan Nasional. Pada tahun yang sama penulis diterima sebagai mahasiswa Program Studi Hortikultura, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor melalui jalur Undangan Seleksi Masuk Istitut Pertanian Bogor (USMI). Selama kuliah, penulis mendapatkan kesempatan magang di PT Aldepos pada bulan juni 2004. Penulis juga pernah mendapatkan penghargaan sebagai penyaji terbaik (setara medali emas) pada PIMNAS XVIII Bidang Kewirausahaan yang diselenggarakan oleh dikti DIKTI
pada tanggal 12-15 Juli
2005 di
Universitas Andalas Padang. Pada tahun 2006 penulis berkesempatan menjadi asisten praktikum mata kuliah Dasar-dasar Bioteknologi untuk Pemuliaan Tanaman, Bioteknologi Tanaman dan Dasar-dasar Hortikultura.
KATA PENGANTAR Puji syukur penulis panjatkan kekhadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian ini tanpa hambatan yang berarti. Judul penelitian ini adalah Induksi Mutasi Kromosom dengan Kolkisin pada Tanaman Stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) Klon Zweeteners secara In Vitro. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada semua fihak yang telah membantu selama melakukan penelitian ini, antara lain : 1. Dr. Ir. Ni Made Armini Wiendi, MS selaku dosen pembimbing skripsi yang telah banyak memberikan pengarahan dan penjelasan berkaitan dengan penelitian ini. 2. Dr. Ir. Agus Purwito, MSc dan Ir. Diny Dinarti, MSi selaku dosen penguji. 3. Dr. Ir. Sobir, MS,selaku dosen pembimbing akademik. 4. Dr. Ir. Yudiwanti, MS dan Muhamad syukur, SP, Msi yang telah membantu dalam perancangan percobaan. 5. Bapak Ujang Hafid selaku karyawan Laboratorium Sitologi Herbarium Bogoriense LIPI yang telah membantu dalam analisis sitologi. 6. Vina, Urip, Yogo, Ari dan Mas Topan yang telah membantu dalam teknis pelaksanaan penelitian. 7. Natasya di Kuala Lumpur, Ilham di Wolonggong dan Köhl di Hamburg yang telah membentu dalam mencari literatur. 8. Yudi dan Ari teman seperjuangan penelitian. 9. Orang Tua beserta keluarga, Ayah, Mama (Alm.), Teh Kokom, Teh Wawat, Soleha dan semua anggota keluarga atas do’a, dukungan, bantuan dan motivasi yang selalu diberikan Akhir kata semoga penelitian ini dapat bermanfaat bagi masyarakat dan civitas akademika. Bogor, Januari 2007 Penulis
DAFTAR ISI Halaman
PENDAHULUAN .......................................................................................... Latar Belakang ..................................................................................... Tujuan .................................................................................................. Hipotesis...............................................................................................
1 1 3 3
TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................ Tanaman Stevia.................................................................................... Perbanyakan Stevia .............................................................................. Kandungan Kimia Daun Stevia............................................................ Induksi Mutasi dengan Mutagen Kimia............................................... Mitosis Sel Somatik ............................................................................. Pengamatan Kromosom ......................................................................
4 5 5 6 6 8 9
BAHAN DAN METODE .............................................................................. Waktu dan Tempat penelitian .............................................................. Bahan dan Alat Penelitian.................................................................... Metode Penelitian ................................................................................ Pelaksanaan Penelitian ......................................................................... Pengamatan ..........................................................................................
11 11 11 12 13 16
HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................................... Kondisi Umum .................................................................................... Persentase Eksplan Hidup .................................................................. Jumlah Tunas ...................................................................................... Jumlah Daun ....................................................................................... Persentase Eksplan Berakar ................................................................ Analisis Sitologi Tanaman Stevia Hasil Induksi Mutasi dengan Kolkisin .........................................................
17 17 19 20 24 25 26
KESIMPULAN .............................................................................................. Kesimpulan .......................................................................................... Saran ....................................................................................................
32 32 32
DAFTAR PUSTAKA .....................................................................................
33
LAMPIRAN....................................................................................................
36
DAFTAR TABEL Nomor
Halaman Teks
1. Kesalahan yang Banyak Terjadi Dalam Pengamatan Mitosis dan Penyebabnya (Jurčák 1999) ...................................................
10
2. Rekapitulasi Hasil Uji F Pengaruh Perendaman Kolkisin terhadap Pertumbuhan Vegetatif Stevia rebaudiana Bertoni Secara In Vitro ..........
17
3. Tingkat Kontaminasi Kultur Stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) Selama Pengamatan ...................................................................................
18
4. Pengaruh Perendaman Kolkisin terhadap Persentase Eksplan Hidup Tanaman Stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) Secara In Vitro...................
19
5. Pengaruh Perendaman Kolkisin terhadap Rata-rata Jumlah Tunas per Eksplan Pada Tanaman Stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) Secara In Vitro ............................................................................................
21
6. Pengaruh Perendaman Kolkisin terhadap Rata-rata Jumlah Daun per Eksplan Tanaman Stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) Secara In Vitro ................... 24 7. Pengaruh Perendaman Kolkisin terhadap Persentase Tunas berakar Tanaman Stevia rebaudiana Bertoni Secara In Vitro .................................
25
8. Jumlah kromosom Tanaman Stevia Hasil Induksi Mutasi dengan Kolkisin ........................................................................................
28
Lampiran 1. Komposisi Media Murashige-Skoog (Gunawan, 1992) ...............................
37
2. Sidik Ragam Pengaruh Perendaman Kolkisin terhadap Persentase Eksplan Hidup Tanaman Stevia ( Stevia rebaudiana Bertoni) Secara In Vitro ……
38
3. Sidik Ragam Pengaruh Perendaman Kolkisin terhadap Rata-rata Jumlah Tunas per Eksplan Tanaman Stevia ( Stevia rebaudiana Bertoni) Secara In Vitro ……………………………………………………………
39
4. Sidik Ragam Pengaruh Perendaman Kolkisin terhadap Rata-rata Jumlah Daun per Eskplan Tanaman Stevia ( Stevia rebaudiana Bertoni) Secara In Vitro ............................................................................................
40
5. Sidik Ragam Pengaruh Perendaman Kolkisin terhadap Persentase Tunas Berakar Tanaman Stevia ( Stevia rebaudiana Bertoni) Secara In Vitro ..........................................................................................................
41
6. Jumlah Kromosom Pada Beberapa Sampel Tanaman Stevia Hasil Induksi Mutasi dengan Kolkisin .................................................................
41
DAFTAR GAMBAR
Nomor
Halaman Teks
1. Stuktur Kimia Kolkisin (Matthew, 1998) …………………….................
7
2. Kontaminasi pada Kultur Stevia: (A) kontaminasi oleh bakteri pada 3 MST (panah biru) dan (B ) kontaminasi oleh cendawan pada 4 MST (panah biru) ...............................................................................................
18
3. Perkembangan Eksplan Stevia Pada Perlakuan 0.06% Kolkisin selama 72 Jam : (A) eksplan yang berkembang pada 3 MST dan (B) eksplan yang mati pada 3 MST ..............................................................................
20
4. Keragaan Tunas Stevia Pada Minggu Ke-5 MST : (A) tunas normal dari perlakuan perendaman dengan air selama 72 jam dan (B) tunas abnormal dari perlakuan kolkisin 0.06% selama 72 jam ............................................
21
5. Keragaan Tunas Stevia setelah 5 MST di Media MS + 0.1 mg/l IAA (A) tunas dengan daun normal dari perlakuan perendaman air selama 72 jam (panah merah), (B) tunas dengan jumlah daun perbuku (panah merah) dan (C) tunas dengan 3 mata tunas aksilar (panah merah) dan 3 daun dengan dua dari tiga daun petiolnya bersatu (panah biru). (B) dan (C) dihasilkan dari perlakuan perendaman 0.06% kolkisin selama 72 jam .............................................................................................
23
6. Waktu Pembelahan Sel Ujung Akar pada Tanaman Stevia: (A) sampel akar diambil pada jam 06.00 WIB (B) sampel akar diambil pada jam 09.00 WIB .................................................................................................
26
7. Kimera Pada Tingkat Organ yang Terjadi pada Perlakuan Perendaman 0.02% Kolkisin selama 24 Jam : (A) sel dengan 2n = 22 (lingkaran biru) dan (B) sel dengan 2n = 36 (lingkaran biru). ............................................
27
8. Kimera Pada Tingkat Jaringan yang Terjadi pada Perlakuan Perendaman 0.04% Kolkisin selama 48 Jam : Sel kiri 2n = 36 (lingkaranmerah), sel kanan 2n = 50 (persegi merah) .............................................................
27
9. Hasil Uji Sitologi 1: (A) sel dari akar planlet kontrol (MS0) dengan jumlah kromosom 2n = 22, (B) sel dari akar planlet yang diberi perlakuan perendaman dengan air selama jam 24 dengan jumlah kromosom 2n = 22 ..................................................................................
29
10. Hasil Uji Sitologi 2 : (A) sel dari akar planlet yang diberi perlakuan perendaman dengan 0.02% kolkisin selama 24 jam dengan jumlah kromosom 2n = 36 dan (B) sel dari akar planlet dengan perlakuan 0.04% kolkisin 24 jam dengan jumlah kromosom 2n = 50 ...................
29
11. Hasil Uji Sitologi 3 : (A) sel dari akar planlet yang diberi perlakuan perendaman dengan 0.06% kolkisin selama 24 jam dengan jumlah kromosom 2n = 20 dan (B) sel dari akar planlet dengan perlakuan air selama 48 jam dengan jumlah kromosom 2n = 22 ....................................
29
12. Hasil Uji Sitologi 4 : (A) sel dari akar planlet yang diberi perlakuan perendaman dengan 0.02% kolkisin selama 48 jam dengan jumlah kromosom 2n = 18 dan (B) sel dari akar planlet yang diberi perlakuan perendaman dengan 0.04% kolkisin selama 48 jam dengan jumlah kromosom 2n = 43 .....................................................................................
30
13. Hasil Uji Sitologi 5: (A) sel dari planlet yang diberi perlakuan perendaman dengan 0.06% kolkisin selama 48 jam dengan jumlah kromosom 2n = 19 dan (B) sel dari planlet yang diberi perlakuan perendaman dengan air selama 72 jam dengan jumlah kromosom 2n = 22 .......................................................................................................
30
14. Hasil Uji Sitologi 6 : (A) sel dari planlet yang diberi perlakuan perendaman dengan 0.02% kolkisin selama 72 jam dengan jumlah kromosom 2n = 18 dan (B) sel dari planlet yang diberi perlakuan 0.06% kolkisin 72 jam dengan jumlah kromosom 2n = 42 .....................
30
15. Hasil Uji Sitologi 7: (A) sel dari planlet yang diberi perlakuan perendaman dengan 0.04% kolkisin selama 72 jam dengan jumlah kromosom 2n = 18 dan (B) sel dari planlet yang diberi perlakuan perendaman dengan 0.02% kolkisin selama 24 jam dengan jumlah kromosom 2n = 29 ...................................................................................
31
PENDAHULUAN Latar Belakang Konsumsi gula nasional pada periode tahun 2005/2006 mencapai 3.8 juta ton, sedangkan produksi nasional hanya mencapai 2.2 juta ton/tahun (USDA, 2005). Kekurangan produk gula sebesar 1.6 juta ton diatasi dengan melakukan impor. Rendahnya daya beli sebagian besar masyarakat Indonesia mendorong industri makanan dan minuman menggunakan pemanis sintetik untuk menekan biaya produksi. Pemanis sintetik yang dikonsumsi di Indonesia diperkirakan lebih dari 5.000 ton/tahun dan umumnya berupa siklamat yang diduga bersifat karsinogenik (Mubiyanto, 1990). Di sisi lain konsumsi gula yang berlebihan terjadi pada masyarakat golongan menengah ke atas, hal tersebut mengakibatkan timbul masalah kesehatan misalnya obesitas, diabetes dan penyakit lain yang ditimbulkan oleh komplikasi dari kedua penyakit tersebut. Rasa takut dan kecurigaan masyarakat terhadap pemanis sintetik serta penyakit-penyakit akibat kelebihan gula menyebabkan masyarakat mencari pemanis alami berkalori rendah. Stevia merupakan tanaman yang menghasilkan pemanis alami yang aman untuk dikonsumsi. Menurut Adinegoro (1986) daun stevia mengandung steviosida, suatu senyawa glikosida yang mempunyai tingkat kemanisan 200-300 kali dibandingkan dengan gula tebu. Mubiyanto (1990) melaporkan bahwa rasa manis siklamat sebesar 30 kali gula tebu. Jika rendemen glikosida yang didapat dari daun tanaman stevia sebesar 2.5%, dengan produksi daun kering sekitar 2.5 ton/ha/tahun, maka diperlukan 20.000-30.000 ton daun stevia untuk mengganti pemanis sintetik di Indonesia. Menurut
Pratiwi
(1995)
gula
steviosida
pada
tanaman
stevia
diakumulasikan terutama dalam daun, oleh sebab itu salah satu faktor produksi yang perlu diperhatikan adalah pemilihan klon dengan jumlah daun dan kandungan steviosida yang tinggi. Faktor lain yang mempengaruhi produksi daun stevia adalah lamanya penyinaran. Tanaman stevia adalah tanaman hari pendek, berasal dari daerah subtropika, sehingga klon-klon yang ada di Indonesia mempunyai masa vegetatif yang lebih pendek dari pada masa vegetatif di daerah asalnya. Kondisi lingkungan yang berbeda ini menyebabkan produksi daun stevia
2
yang rendah dengan kandungan gula yang rendah pula. Penanaman dengan teknik budidaya dan varietas yang baik seperti di Jepang, rata-rata produksi daun kering adalah 3 ton /ha untuk tahun pertama, 5 ton/ha untuk tahun kedua, 6 ton /ha untuk tahun ketiga, dan 4 ton /ha untuk tahun keempat. Usaha yang dapat dilakukan untuk mendapatkan varietas dengan sifat-sifat yang lebih baik dari tanaman adalah dengan melakukan pemuliaan (Makmur, 1992). Pemulian tanaman secara konvensional terhambat karena tanaman stevia bukan tanaman asli Indonesia, sehingga materi genetiknya terbatas. Guna mendapatkan bahan persilangan, tetuanya harus diintroduksi dari Amerika Latin terutama Paraguay. Stevia bersifat self incompatible, sehingga menjadi kendala untuk mendapatkan galur murni dan tanaman hasil silangan yang stabil jika tanaman ini diperbanyak dengan benih (Mubiyanto, 1990). Perbaikan kualitas genetik tanaman merupakan salah satu tujuan dari teknik kultur in vitro, yaitu melalui mutasi. Mutasi dapat terjadi secara alami maupun buatan. Mutasi buatan bisa diinduksi baik secara fisik maupun kimia. Mutasi buatan dapat diinduksi secara kimiawi dengan menggunakan kolkisin yang telah banyak digunakan untuk menginduksi duplikasi kromosom pada beberapa tanaman (Allard, 1989). Tanaman yang diperlakukan dengan kolkisin menunjukan ekspresi gen yang lebih besar pada keragaan fenotipe dan kandungan senyawa kimianya lebih tinggi. Keragaan fenotipe tanaman yang lebih besar ini terjadi karena adanya penggandaan jumlah kromosom pada tanaman tersebut menjadi 2 kali atau lebih. Contohnya pada Datura, biji yang direndam 0.2% kolkisin selama satu hari, menunjukan tanaman dengan keragaan lebih besar dan jumlah ploidinya menjadi 4X (Blakslee and Avery, 1937). Induksi poliploidi pada tanaman stevia menggunakan kolkisin, diharapkan mampu memperbaiki klon tanaman stevia, sehingga diperoleh klon baru yang memiliki keragaan morfologi yang lebih besar dan mampu memproduksi bobot kering daun dalam jumlah yang lebih tinggi, dengan kandungan steviosida yang tinggi.
3 2
Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari pengaruh perendaman kolkisin terhadap penggandaan kromosom tanaman Stevia rebaudiana Bertoni M secara in vitro. Penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan satu galur tanaman baru yang telah mengalami penggandaan kromosom dengan produksi daun dan steviosida yang tinggi.
Hipotesis Hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah: 1. Paling sedikit terdapat satu perlakuan yang memberikan pengaruh nyata terhadap penggandaan kromosom tanaman Stevia rebaudiana Bertoni M secara in vitro. 2. Paling sedikit terdapat satu galur tanaman Stevia rebaudiana Bertoni M yang mengalami penggandaan kromosom.
TINJAUAN PUSTAKA Tanaman Stevia Tanaman stevia (Stevia rebaudiana Bertoni M.) berasal dari distrik Amabai dan Igaugu, di daerah perbatasan Paraguay, Brazil dan Argentina di Amerika Selatan. Di Indonesia tanaman Stevia dikenal pada tahun 1977 (Adinegoro, 1986). Stevia rebaudiana Bertoni M. adalah salah satu spesies tanaman dari famili Compositae dengan jumlah kromosom 2n = 22. Tanaman ini merupakan semak semusim berbatang basah, dengan tinggi tanaman sekitar 50-120 cm. Batang berbentuk bulat, berbulu, bercabang, berwarna hijau, dan semi berkayu. Daun tanaman stevia merupakan daun tunggal berhadapan, bentuk daun bulat telur, ujung tumpul, pangkal runcing, tepi daun rata, panjang 3-6.5 cm, lebar 0.81.9 cm. Sistem pertulangan daun menyirip, berbulu, tangkai daun pendek dan berwarna hijau. Bunga stevia termasuk bunga majemuk, letak malai bunga di pucuk terminal dan di ketiak daun, satu agregat terdiri dari 2-6 bunga. Bunga berbentuk terompet, kelopak berbentuk tabung, berbulu, terbagi lima, tangkai benang sari dan putik pendek dengan kepala sari berwarna putih tetapi self incompatible. Panjang bunga sekitar 7-15 mm. Buah stevia berbentuk silindris dan berwarna putih dengan biji berbentuk kotak, tanpa endosperma, berambut dan berwarna coklat. Akar stevia berwarna putih kotor dengan perakaran dangkal dan percabangan akar yang keras (Mohede dan Van Son, 1999). Di daerah asalnya, tanaman stevia tumbuh liar pada iklim tropis dan subtropis basah, dengan ketinggian tempat di atas 700 m dpl, dengan rata-rata suhu udara 24oC dan curah hujan rata-rata antara 1400–1600 mm/tahun. Pertumbuhan tanaman ini akan terhambat jika suhu udara dibawah 15oC. Tanaman stevia tumbuh baik pada tanah dengan pH 6.5-7.5 dan kedalaman air tanah yang dangkal (Mohede dan Van Son, 1999). Stevia dapat ditanam di dalam polybag berkapasitas 5 L, menggunakan tanah oksisol dengan dosis pupuk 0.9 g urea/tanaman, 0.9 g TSP/tanaman dan 0.75 g KCl/tanaman merupakan dosis pupuk terbaik bagi pertumbuhan dan hasil tanaman stevia klon BPP 72. Pupuk diberikan pada 3 HST (Gunawan, 1994).
5
Menurut Karsono (1995) pembuatan media tanam untuk penanaman dalam polybag, dilakukan seminggu sebelum tanam, komposisi media terdiri dari tanah lapisan atas, pasir dan pupuk kandang yang matang dan dikeringanginkan dan dicampur dengan perbandingan 3:2:1 (V/V/V). Pupuk dasar yang digunakan adalah 1 g TSP/polybag diberikan dengan mencampur kedalam media, pupuk susulan berupa 1 g urea/tanaman dan 1 g KCl /tanaman diberikan satu minggu setelah tanam (MST). Penyiraman pada minggu pertama dilakukan dua hari sekali, minggu selanjutnya penyiraman dilakukan satu minggu sekali. Menurut Mohede dan Van Son (1999) penambahan dosis pupuk pada budidaya stevia hanya
meningkatkan
hasil
panen,
tidak
bisa
meningkatkan
rendemen
steviosidanya
Perbanyakan Stevia Tanaman stevia dapat diperbanyak melalui benih, pisah anakan, stek dan melalui kultur jaringan. Tanaman stevia yang berasal dari stek dan kultur jaringan mempunyai pertumbuhan yang lebih seragam dibandingkan tanaman asal biji. Pusat Penelitian Bioteknologi Perkebunan Bogor telah berhasil memperbanyak tanaman stevia dengan menggunakan teknik kultur jaringan. Dari tiap ujung tunas yang dikulturkan dapat diperoleh 10 tunas baru dalam waktu 50 hari (Pratiwi, 1995). Menurut Gunawan (1992) pada perbanyakan stevia dengan teknik kultur jaringan, eksplan yang diambil adalah pucuk berukuran 2 mm, dengan komposisi media Linsmainer dan Skoog. Eksplan ditumbuhkan di dalam media I (media induksi tunas) yaitu media Linsmainer dan Skoog yang ditambahkan 10 mg/l kinetin, pucuk diinkubasi selama 50 hari. Pucuk majemuk yang terbentuk, kemudian dipisah-pisahkan menjadi beberapa kelompok, dengan masing-masing kelompok terdiri dari 2-4 pucuk dan ditumbuhkan pada media baru dengan komposisi nutrisi yang sama. Setelah 30 hari, pucuk dipisah-pisahkan lagi, kemudian dipindahkan ke dalam media II (media pemanjangan pucuk), yaitu media Linsmainer dan Skoog yang ditambahkan 1 mg/l kinetin. Pucuk yang panjangnya telah mencapai 3-5 cm, diakarkan pada media III (media pengakaran), yaitu media Linsmainer dan Skoog yang ditambahkan 0.1 mg/l NAA.
6
Kandungan Kimia Daun Stevia Menurut Adinegoro (1986) hasil ekstraksi stevia secara umum disebut sebagai pemanis stevia kasar, karena rasa manisnya dipengaruhi oleh beberapa komponen glikosida yang terkandung di dalamnya. Glikosida yang berhasil ditemukan dalam ekstrak daun stevia yaitu steviosida, steviolbisida, rebaudiosida A, B, C, D, E. Kandungan terbanyak dari glikosida adalah steviosida yaitu sebesar 5-15%, kandungan rebaudiosida A sebesar 3–6%, dan komponen glikosida yang lain merupakan komponen terkecil. Pemanis alami yang berasal dari stevia aman bagi kesehatan. Hal ini dibuktikan dengan laporan mengenai tidak adanya efek negatif pada penduduk Paraguay yang telah menggunakan daun stevia sebagai bahan pemanis dalam makanan dan minuman mereka sejak lebih dari seratus tahun yang lalu. Penelitian di Jepang melaporkan bahwa kelinci dan tikus percobaan yang diberi ekstrak daun stevia maupun steviosida murni tidak menimbulkan efek negatif terhadap pertumbuhan, tingkah laku, reproduksi serta sifat lainnya (Adinegoro, 1986).
Induksi Mutasi dengan Mutagen Kimia Sejumlah zat kimia yang mempengaruhi ploidi dari genom suatu spesies diantaranya acenapthene, cloral hidrat, cloride ethyl mercury, kolkisin, ethyl metane sulfonat (EMS) dan sulfanilamida. Kolkisin yang didapat dari ekstrak tanaman Krokus merupakan zat yang paling efektif dalam menginduksi mutasi pada genom tanaman. Kolkisin mudah larut dalam air dan bisa menginduksi selsel poliploid pada konsentrasi yang tidak beracun, selain itu kolkisin mempunyai spektrum yang luas bagi spesies tanaman. Aktifitas kolkisin adalah menggagalkan pembentukan benang–benang gelendong dalam sitoplasma sehingga kromosom membelah tapi tidak menuju ekuator, akibatnya pada waktu telofase kromosom ganda hanya ada pada satu sel sehingga jumlah kromosomnya menjadi 2 kali. Hanya sel – sel tetraploid atau kadang-kadang oktaploid yang mampu membelah membentuk jaringan (Allard, 1989). Menurut
Matthew
(1998)
kolkisin
dihasilkan oleh tanaman krokus (Colchicum autumale) yang termasuk famili Liliaceae dan mempunyai rumus kimia C22H25O6N6, dengan humus bangun seperti pada Gambar 1.
7
Gambar 1. Stuktur kimia kolkisin (Matthew, 1998). Poespodarsono (1988) melaporkan bahwa kepekaan masing–masing spesies tanaman terhadap perlakuan kolkisin sangat berbeda. Larutan pada konsentrasi 0.5–1.0% dapat diteteskan pada tunas dengan dosis dua atau tiga minggu sekali. Sulistianingsih et al. (2004) melaporkan bahwa perlakuan waktu perendaman tanaman anggrek dendrobium hibrida selama 6 jam dengan konsentrasi kolkisin 0.02% menghasilkan jumlah kromosom yang banyak yaitu 2n=96.667, lebih besar dibandingkan dengan kontrol (2n=28). Pada penelitian Soejono dan Suskandari (1996) tentang pengaruh waktu
perendaman dan
konsentrasi kolkisin terhadap pertumbuhan protokorm anggek Dendrobium Jayakarta, menunjukkan bahwa waktu perendaman yang lebih lama dengan konsentrasi kolkisin yang lebih tinggi memberikan nilai ketegaran yang lebih tinggi pula. Kombinasi waktu perendaman sembilan hari dengan konsentrasi kolkisin 0.03% menghasilkan tingkat ketegaran yang tinggi. Jauhariah (1995) meneliti tentang pengaruh pemberian kolkisin terhadap perubahan jumlah kromosom, stuktur anatomi daun dan kandungan gula stek tanaman Stevia rebaudiana Bertoni. Hasil penelitian yang diperoleh adalah perlakuan perendaman selama satu jam pada konsentrasi kolkisin 0.004% sudah dapat menginduksi timbulnya tetraploid, tetapi perlakuan perendaman selama dua jam pada konsentrasi kolkisin 0.02 % akan memberikan pertumbuhan terbaik pada stek dan kandungan gula Stevia rebaudiana Bertoni. Murfadalina (1997) melaporkan bahwa konsentrasi larutan kolkisin dan waktu perendaman berpengaruh terhadap jumlah kromosom, indeks stomata dan kandungan protein tanaman polong kapri pada konsentrasi 5 ppm dan 10 ppm, dengan lama perendaman satu jam.
8
Hindarti (2002) melaporkan bahwa terdapat pengaruh nyata antara lama perendaman dan konsentrasi kolkisin pada jumlah kromosom, lebar daun, tinggi tanaman, bobot segar, diameter umbi, volume umbi, bobot siung, dan kandungan protein, tetapi tidak berpengaruh terhadap jumlah siung bawang putih. Handro et al. (2003) melaporkan bahwa perlakuan perendaman kolkisin dengan konsentrasi 10-3 M selama 72 jam pada kultur agregat sel Stevia rebaudiana menghasilkan sel poliploid yang tertinggi. Terdapat hubungan antara ukuran agregat sel dengan keragaan distribusi kromosom, semakin kecil ukuran agregat sel maka semakin besar poliploidi yang terjadi. Keragaan distribusi kromosom menunjukan bahwa dalam satu garis terdapat sel yang tetap diploid dan ada yang mengalami tetraploid bahkan aneuploid. Hansen et al. (1995) meneliti tentang pengaruh konsentrasi kolkisin (0.40.6%) dan lama perendaman 0-5 hari terhadap penggandaan kromosom pada kultur ovul tanaman bit gula. Hasil penelitian menunjukan bahwa konsentrasi kolkisin yang terbaik untuk menghasikan tanaman diploid adalah sebesar 0.4% dengan lama perendaman 2.5 hari. Konsentrasi kolkisin yang tinggi dan waktu perendaman yang lama menunjukan efek toksik terhadap pembentukan embrio.
Mitosis Sel Somatik Kromosom adalah bagian inti sel yang mengandung materi genetik yang berperan dalam pewarisan sifat suatu individu. Kromosom terbuat dari benangbenang kromatin yang berisi untaian basa nukleotida yang membentuk untaian DNA. Pada fase pembelahan sel bagian kromatin akan terkondensasi, menebal dan dapat menyerap senyawa acetoorcein atau acetocarmine sebagai pewarna. Kromosom dapat dilihat setelah pewarnaan dibawah mikroskop cahaya biasa (Shepperd, 2006). Syukur (2006) melaporkan bahwa mitosis merupakan proses yang kontinyu, guna memudahkan pengamatan para ahli sitologi membagi menjadi lima fase utama yaitu interfase, profase, metafase, anafase dan telofase. Pada tahap metafase kondensasi kromosom berlanjut terus sampai mencapai batas maksimal, kromosom terlihat lebih pendek dan lebih tebal dibanding fase lain, sehingga merupakan fase paling ideal untuk studi sitotaksonomi. Morfologi
9
kromosom pada metafase mitosis memperlihatkan panjang kromosom, posisi sentromer dan jumlahnya dapat dihitung dan menjadi dasar analisis kariotipe.
Pengamatan Kromosom Menurut Jurčák (1999) Pengamatan kromosom memerlukan waktu dan teknik yang tepat untuk mendapatkan hasil yang baik. Metode untuk pengamatan kromosom dapat menggunakan teknik pewarnaan yang dikenal dengan metode squashing. Metode tersebut menggunakan aceto carmine sebagai pewarna. Larutan jenuh aceto carmine di buat dengan memanaskan 100 ml asam asetat 45%, setelah mencapai suhu 90-95 0C ditambahkan 1-2 g serbuk carmine dan digoyang-goyangkan selama 10 menit dan disaring untuk mendapatkan larutan tanpa penggumpalan serbuk carmine. Menurut Sarsidi (2006) larutan pewarna dapat digunakan aceto orcein dengan mengganti serbuk carmine dengan serbuk orcein dengan prosedur yang sama dengan pembuatan larutan aceto carmine. Materi biologi yang digunakan untuk pengamatan kromosom pada tanaman adalah ujung akar dan ujung pucuk. Ujung akar merupakan bagian yang terbaik untuk pengamatan mitosis, karena akar tidak berklorofil dan mudah menyerap pewarna aceto carmine. Pada pengamatan mitosis untuk menghitung jumlah kromosom, waktu pemotongan akar merupakan faktor kritis yang sangat menentukan keberhasilan. Waktu pembelahan sel tiap tanaman berbeda-beda dan tidak konstan sepanjang hari, sebagai contoh untuk bawang bombay, waktu pemotongan dan fiksasi ujung akar yang baik adalah pada pagi hari. Beberapa spesies tanaman memerlukan suhu tertentu dan lama penyinaran yang berbeda, sehingga untuk mendapatkan waktu yang tepat diperlukan pengamatan yang berulang-ulang pada waktu yang berbeda (Jurčák 1999). Keahlian dalam menguasai teknik pewarnaan mempengaruhi hasil pengamatan, diperlukan ketelitian dalam mengerjakan tahapan pewarnaan sehingga menghasilkan preparat amatan. Beberapa kasus kesalahan dan penyebabnya dalam pengamatan mitosis sel dicantumkan dalam Tabel 1 (Jurčák 1999).
10
Tabel 1. Kesalahan yang Banyak Terjadi Dalam Pengamatan Mitosis Sel dan Penyebabnya (Jurčák 1999). Kesalahan
Penyebab
Inti terwarnai dengan jelas, tetapi Pemotongan material tanaman tidak tahapan mitosis tidak terlihat. pada waktu yang tepat. Kromosom tidak jelas.
1. Waktu fiksasi terlalu pendek. 2. Konsentrasi
pewarna
terlalu
rendah. 3. pewarna yang digunakan sudah rusak
atau
terlalu
lama
disimpan. 4. Suhu selama pewarnaan terlalu rendah. 5. Waktu
pewarnaan
terlalu
pendek . Beberapa sel menumpuk satu sama lain.
1. Waktu
melunakan
jaringan
terlalu pendek. 2. Pembuatan
larutan
untuk
maserasi tidak tepat. 3. Kurang tenaga ketika menekan gelas objek. Sel
meristem
pecah,
tahapan
mitosis atau kromosom tidak dapat dilihat.
1. Gelas penutup bergeser jauh ketika ditekan. 2. Gelas penutup ditekan terlalu keras atau berulang-ulang.
Lensa mikroskop tergores atau Permukaan peyangga tidak rata. pecah
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan dari bulan Februari 2006 sampai dengan bulan September 2006. Percobaan in vitro dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Tanaman, Departemen Agonomi dan Hortikultura Fakultas Pertanian, IPB, Bogor. Percobaan uji sitologi yaitu penghitungan jumlah kromosom dilakukan di Laboratorim Sitologi Herbarium Bogoriense LIPI, Bogor.
Bahan dan Alat Penelitian
Bahan Bahan tanaman : bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah plantlet tanaman Stevia rebaudiana Bertoni M klon Zweeteners yang berumur 4 minggu yang ditumbuhkan secara in vitro pada media MS0 (Murashige dan Skoog tanpa zat pengatur tumbuh). Klon ini merupakan klon yang diintroduksi dari Belanda. Eksplan yang digunakan berupa mata tunas aksilar dari plantlet. Media kultur jaringan : media dasar dari komposisi MS tanpa zat pengatur tumbuh untuk perbanyakan eksplan, MS+1.5 mg/l BAP+0.5 mg/l IAA untuk induksi tunas, MS+0.1 mg/l NAA untuk menginduksi perakaran. Sebagai sumber karbohidrat digunakan gula 30 g/l dan pemadat agar-agar 6 g/l dengan pH larutan media diatur menjadi 5.9. Bahan yang digunakan untuk uji sitologi : Planlet tanaman stevia, asam asetat 45%, HCl 1 N, aquades, Orsein 2%, Hidroksikuinolin 0.002 M dan cat kuku yang tak berwarna. Bahan-bahan lain yang diperlukan saat penanaman eksplan : alkohol 70% dan spirtus Alat Peralatan yang digunakan di laboratorium : timbangan, labu takar, gelas kimia, laminar air flow cabinet, pengaduk, autoklaf, pH meter, botol kultur,
12
magnetic stirer, panci perebus, pipet, cawan petri, gunting, pinset, scalple, stoples, hand sprayer, rak kultur, penggaris, kertas label, alat pengering dan kamera. Peralatan yang digunakan untuk uji sitologi : mikroskop dan perlengkapannya, silet, botol bekas cat kuku, lemari es, pensil dengan ujung berpenghapus, pemanas air, pinset dan gelas kimia.
Metode Penelitian Penelitian disusun dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktor tunggal, yaitu kombinasi konsentrasi kolkisin dengan lama perendaman. Terdapat 11 perlakuan dengan masing-masing perlakuan terdiri dari tiga ulangan, pada setiap ulangan terdiri dari 10 botol kultur dengan dua eksplan per botol, sehingga jumlah total eksplan sebanyak 660 eksplan. Sebagai unit terkecil dalam penelitian ini adalah eksplan. Model statistika yang digunakan sebagai berikut: Yij = µ + αi + εijk Keterangan : Yij
: Nilai pengamatan pada perlakuan kolkisin ke-i pada ulangan ke j
µ
: Nilai tengah umum
εijk
: Pengaruh galat dari satuan percobaan ke-i, pada ulangan ke-j
Perlakuan : P1
: Perendaman dengan air selama 24 jam
P2
: Perendaman dengan air selama 48 jam
P3
: Perendaman dengan air selama 72 jam
P4
: Perendaman dengan konsentrasi 0.02% larutan kolkisin selama 24 jam
P5
: Perendaman dengan konsentrasi 0.02% larutan kolkisin selama 48 jam
P6
: Perendaman dengan konsentrasi 0.02% larutan kolkisin selama 72 jam
P7
: Perendaman dengan konsentrasi 0.04% larutan kolkisin selama 24 jam
P8
: Perendaman dengan konsentrasi 0.04% larutan kolkisin selama 48 jam
P9
: Perendaman dengan konsentrasi 0.06% larutan kolkisin selama 24 jam
P10
: Perendaman dengan konsentrasi 0.06% larutan kolkisin selama 48 jam
P11
: Perendaman dengan konsentrasi 0.06% larutan kolkisin selama 72 jam
13
Data yang diperoleh dianalisis dengan uji F pada taraf 5%. Apabila terdapat beda nyata dari nilai tengahnya dilakukan uji lanjut dengan menggunakan DMRT (Duncan Multiple Range Test) pada taraf 5%.
Pelaksanaan Penelitian
Pembuatan Media dan Sterilisasi Pembuatan media tanam MS sebanyak satu liter adalah dengan cara memipet sejumlah larutan stok seperti tercantum dalam Tabel Lampiran 1 ke dalam gelas kimia atau botol kultur, kemudian dimasukkan ke dalam labu takar. Gula pasir seberat 30 g dilarutkan dalam botol kultur dengan sedikit air kemudian dimasukkan dalam labu takar yang telah berisi larutan stok, lalu ditambahkan 1.5 ml BAP 1000 ppm dan 0.5 ml IAA 1000 ppm, selanjutnya ditambahkan aquades sampai tanda tera (satu liter) dan pH diukur dan diatur agar sesuai dengan kondisi tumbuh eksplan. Dalam penelitian ini pH yang digunakan adalah 5.9. Untuk mendapatkan pH yang diinginkan dilakukan penambahan KOH 1 N jika pH larutan dibawah 5.9 dan dilakukan penambahan HCL 1 N jika pH diatas 5.9, setelah diatur pHnya larutan ini kemudian dituang ke dalam dalam panci, selanjutnya ditambahkan agar-agar 7 g/l. Larutan media dipanaskan untuk melarutkan agar – agar sambil diaduk sampai mendidih, kemudian dituangkan ke dalam botol kultur sebanyak 25 ml/botol (volume botol 200 ml). Selanjutnya botol ditutup plastik dan diikat dengan karet gelang. Media disterilisasi menggunakan autoklaf dengan tekanan 17.5 ψ, 1210 C selama 20 menit. Sterilisasi alat seperti pisau, pinset, scalpel, cawan petri, botol kultur kosong, dan botol berisi air steril disterilisasi menggunakan autoklaf dilakukan selama satu jam pada suhu 121o C dan tekanan 17.5 ψ.
Sub Kultur Planlet Planlet yang sudah steril disub kultur ke dalam media MS0. Tunas dipotong–potong pada masing–masing buku dengan ukuran ± 5 mm kemudian ditanam didalam media MS0. Pada saat penanaman, semua peralatan yang
14
digunakan disemprot alkohol 70%, sebelum dimasukan ke dalam laminar air flow cabinet Alat–alat yang digunakan untuk memindahkan eksplan, sebelum digunakan dibakar dahulu sampai panas kemudian didiamkan dulu sampai dingin. Pada setiap botol ditanam 5 eksplan. Inkubasi kultur dilakukan pada ruangan dengan penyinaran ± 650 lux, 16 jam/hari dan suhu ± 23o C. Setelah 4 MST planlet yang dihasilkan dijadikan sumber propagul.
Pembuatan Larutan Kolkisin Sebelum dibuat larutan dengan konsentrasi 0.02, 0.04 dan 0.06%, terlebih dahulu dibuat larutan stok dengan konsentrasi 2% (1 g/50ml aquabides steril). Pembuatan larutan kolkisin dilakukan di dalam laminar air flow cabinet. Pada saat kolkisin dibuka blower dimatikan sejenak, lalu kolkisin dimasukan ke dalam aquabidest steril. Setelah botol berisi kolkisin ditutup blower dinyalakan kembali, kemudian larutan dikocok hingga larut. Larutan disterilkan dengan menggunakan microfilter. Pada waktu membuat larutan stok kolkisin digunakan juga alat pengaman seperti sarung tangan karet dan masker khusus dengan filter udara. Larutan kolkisin yang sudah jadi ditempatkan dalam labu erlenmeyer tertutup dan disimpan pada suhu 4 ˚C Pembuatan larutan perlakuan dilakukan dengan menggunakan teknik pengenceran. Pembuatan 100 ml larutan konsentrasi 0.02% dilakukan dengan memipet larutan stok kolkisin sebanyak 1 ml, kemudian dimasukan ke dalam botol yang berisi 99 ml aquades steril. Larutan tadi dikocok hingga larut sempurna. Pembuatan 100 ml larutan konsentrasi 0.04% dilakukan dengan memipet larutan stok kolkisin sebanyak 2 ml, kemudian dimasukan ke dalam botol yang berisi 98 ml aquades steril. Larutan kolkisin 0.06 % dilakukan dengan memipet larutan stok kolkisin sebanyak 3 ml, kemudian dimasukan ke dalam botol yang berisi 97 ml aquades steril. Sebagai kontrol digunakan air steril.
Perendaman dengan Larutan Kolkisin dan Penanaman Eksplan Planlet yang telah disubkultur selama 4 MST dipotong–potong dengan 1 buku tunas dengan ukuran ± 5 mm, bagian buku yang mengandung mata tunas
15
aksilar dipisahkan dan dimasukan ke dalam larutan kolkisin dengan konsentrasi masing-masing 0.0, 0.02, 0.04 dan 0.06 %, kemudian setelah 24 jam sebagian eksplan diambil dan ditanam di dalam media pertunasan yaitu MS yang ditambah ZPT (zat pengatur tumbuh) IAA dan BAP dengan konsentrasi masing-masing 0.5 mg/l dan 1.5 mg/l. Penanaman ke media pertunasan ini diulang 24 jam berikutnya sampai 72 jam setelah perendaman. Alat–alat yang digunakan untuk memindahkan eksplan, sebelum digunakan di bakar dahulu sampai panas kemudian didiamkan dulu sampai dingin. Pada setiap botol ditanam dua eksplan. Inkubasi kultur dilakukan pada ruangan dengan penyinaran ± 650 lux, 16 jam/hari dan suhu ± 23oC.
Pemindahan ke Media Perakaran Pada proses pengakaran, tunas berumur 11 MST diambil pucuknya, berukuran panjang ± 3 cm. Tunas ditanam di dalam media pengakaran yaitu MS yang ditambah 0.1 mg/l NAA. Pada setiap botol ditanam lima pucuk.
Uji Sitologi Penghitungan jumlah kromosom menggunakan metode squashing. Bahan yang diambil adalah ujung akar dan pucuk planlet yang sudah berumur 4 MST di dalam media perakaran. Ukuran tanaman yang diambil ± 1 cm dari ujung akar dan pucuk. Pengambilan preparat dilakukan selama 22 jam dari pukul 04.00-13.00 WIB pada hari pertama dan dari pukul 14.00-01.00 WIB pada hari berikutnya, dengan selang waktu pengambilan preparat setiap satu jam sekali, untuk mendapatkan tahap mitosis yang tepat. Setelah Mengetahui waktu yang tepat waktu yang tepat, analisis sampel yang lain dilakukan pada jam yang sama ketika metafase terdeteksi. Semua perlakuan dilakukan uji sitologi dengan sampel yang diambil secara acak. Perlakuan kolkisin 0.04% selama 72 jam tetap disertakan dalam uji sitologi. Pengambilan material : ujung akar dipotong sepanjang ± 1 cm kemudian dimasukkan ke dalam air untuk menghilangkan kotorannya. Potongan bahan tanaman tersebut kemudian dimasukan ke dalam botol berisi hidroksiquinolin
16
0.002 M (0.32 g/l aquades). Selanjutnya botol tersebut disimpan pada suhu 20oC selama 3–5 jam. Fiksasi : potongan ujung akar dimasukkan ke dalam air bersih kemudian dibuang tudung akarnya dengan pisau silet, potongan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam larutan asam asetat 45% selama 10 menit. Selanjutnya potongan diangkat dan dimasukan ke dalam larutan yang terdiri dari 1 N HCl dan asam asetat 45% dengan perbandingan 3:1 (v/v) pada suhu 80oC selama 3–5 menit. Potongan bahan tanaman tadi diangkat dan dimasukkan ke dalam pewarna Orsein 2%, selanjutnya dipindahkan pada gelas preparat yang ditetesi Orsein 2%. Potongan ujung akar tersebut dipotong lagi sehingga berukuran 1–2 mm dari ujung akar dan sisanya dibuang. Gelas penutup kemudian dipasang, dipukul– pukul perlahan–lahan dengan pangkal pensil berkaret dan dipanaskan sebentar. Selanjutnya gelas penutup ditekan halus dengan jempol dan pinggirnya direkat dengan cat kuku tak berwarna dan siap diamati di bawah mikroskop. Setelah terlihat penyebaran kromosom dilakukan penghitungan jumlah kromosom dan dibuat dokumentasinya. Foto yang dihasilkan diperbesar dengan menggunakan Adobe Photo Shop versi 7.0 dan kembali dihitung jumlah kromosomnya. Sampel yang diamati jumlah kromosomnya adalah sebanyak 6 sampel per perlakuan. Pengamatan Pengamatan di laboratorium dilakukan setiap minggu selama 9 MST. Peubah yang diamati yaitu jumlah eksplan terkontaminasi, jumlah tunas, jumlah daun, persentase eksplan hidup, persentase tunas berakar dan jumlah kromosom.
HASIL DAN PEMBAHASAN Kondisi Umum Perendaman kolkisin berpengaruh sangat nyata terhadap pertumbuhan vegetatif planlet Stevia rebaudiana Bertoni secara In Vitro, seperti tercantum dalam Tabel 2. Tabel rekapitulasi sidik ragam selengkapnya dicantumkan pada Tabel Lampiran 2-6. Tabel 2. Rekapitulasi Hasil Uji F Pengaruh Perendaman Kolkisin terhadap Pertumbuhan vegetatif Stevia rebaudiana Bertoni Secara In Vitro. Parameter Pengamatan Eksplan Hidup (%)
Jumlah Tunas
Jumlah Daun
Planlet Berakar
Umur eksplan (MST) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 2 3 4
Perlakuan kolkisin tn ** * ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** **
Keterangan : tn Tidak berbeda nyata pada uji F dengan taraf 5% * Berbeda nyata pada uji F dengan taraf 5 % ** Berbeda sangat nyata Pada uji F dengan taraf 1%
KK (%) 20.47 11.08 13.71 11.14 9.42 7.77 9.59 9.59 11.29 31.21 32.59 29.5 17.64 11.3 11.21 10.03 11.97 11.09 8.59 25.08 34.74 24.49 15.56 11.56 11.82 7.74 7.31 18.43 15.22 11.16
18
Eksplan yang telah direndam sesuai perlakuan ditanam langsung pada media perbanyakan tanpa mengalami pencucian dengan air. Persentase kultur terkontaminasi setelah penanaman di media induksi tunas cukup tinggi pada beberapa perlakuan, seperti tercantum pada Tabel 3. Tabel 3. Tingkat Kontaminasi Kultur Stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) Selama Pengamatan. Perlakuan
Persentase (%) kontaminasi pada minggu ke- MST
Kolkisin (%)
Lama Perendaman (jam)
1
3
5
7
9
Air
24
10.00
10.00
13.33
13.33
13.33
Air
48
10.00
10.00
10.00
10.00
13.33
Air
72
0.00
3.33
3.33
3.33
3.33
0.02
24
10.00
10.00
20.00
23.30
26.70
0.02
48
0.00
0.00
3.30
13.30
16.70
0.02
72
0.00
0.00
3.30
3.30
6.70
0.04
24
3.30
3.30
3.30
3.30
3.30
0.04
48
3.30
3.30
13.30
33.30
33.30
0.04
72
90.00
90.00
90.00
90.00
90.00
0.06
24
0.00
0.00
0.00
0.00
6.70
0.06
48
3.30
6.70
10.00
10.00
13.30
0.06
72
6.70
10.00
10.00
10.00
10.00
Kontaminasi disebabkan oleh bakteri dan cendawan seperti yang terlihat pada Gambar 2. Kontaminasi pada minggu pertama dan kedua disebabkan oleh bakteri, dicirikan dengan terdapatnya lapisan lendir di permukaan media. Sedangkan kontaminasi cendawan dicirikan dengan adanya benang-benang hifa.
A B Gambar 2. Kontaminasi pada Kultur Stevia : (A) kontaminasi oleh bakteri pada 3 MST (panah biru) dan (B ) kontaminasi oleh cendawan pada 4 MST (panah biru).
19
Kontaminasi pada kultur stevia diduga karena faktor eksternal, yaitu kurang terjaganya kebersihan larutan yang digunakan untuk merendaman eksplan. Pada minggu ke-3 MST kontaminasi disebabkan oleh cendawan. Cendawan masuk ke dalam botol kultur karena penanganan botol yang kurang baik pada saat pengamatan dan semakin kendornya karet penutup sehingga terjadi kontak dengan udara. Gunawan (1992) mengemukakan bahwa jika kontaminasi sudah memenuhi seluruh botol kultur , eksplan yang tertutup kontaminasi akhirnya mati, dapat disebabkan oleh serangan langsung akibat tertutup oleh cendawan/bakteri atau tidak langsung akibat persenyawaan toksik yang dihasilkan cendawan /bakteri.
Persentase Eksplan Hidup Kolkisin berpengaruh sangat nyata terhadap persentase eksplan hidup berdasarkan uji F. Pada minggu ke-3 sampai minggu ke-9 MST, perlakuan kolkisin mengakibatkan jumlah eksplan yang hidup lebih kecil dibandingkan dengan perendaman air, seperti tercantum dalam Tabel 4. Tabel 4. Pengaruh Perendaman Kolkisin Terhadap Persentase Eksplan Hidup Tanaman Stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) Secara In Vitro. Perlakuan
Persentase (%) Eksplan Hidup pada Minggu ke- (MST)
Lama Perendaman (jam) Kolkisin (%) 1 3 5 7 Air 24 3.94ab 11.00a 37.78b 60.22a Air 48 3.83b 10.39a 46.00a 59.22a Air 72 4.00a 12.56a 36.45b 61.28a 0.02 24 0.00c 1.83b 17.94cd 40.89bcd 0.02 48 0.00c 2.00b 18.33cd 34.33cd 0.02 72 0.00c 2.79b 19.45c 39.78bcd 0.04 24 0.00c 2.17b 21.55c 45.72b 0.04 48 0.00c 2.39b 25.44c 43.78bc 0.06 24 0.00c 1.67b 21.33c 39.11bcd 0.06 48 0.00c 2.11b 20.33c 37.67bcd 0.06 72 0.00c 0.50b 11.89d 33.33d Uji F ** ** ** ** Keterangan : ** Berbeda sangat nyata pada uji F dengan taraf 1% * Huruf yang sama pada tiap nilai rataan pada kolom yang sama menunjukan tidak berbeda nyata berdasarkan uji DMRT 5%
9 84.83a 81.50a 79.61a 60.78bc 57.17bc 66.17b 59.89bc 63.11b 59.83bc 63.45b 51.94c **
20
Pada minggu ke-3 MST, persentase eksplan hidup pada perlakuan perendaman 0.06% kolkisin selama 72 jam menunjukan nilai yang paling kecil, namun tidak berbeda nyata dengan perlakuan kolkisin yang lain pada minggu selanjutnya berasarkan uji lanjut DMRT. Sel dalam jaringan yang diberi perlakuan kolkisin diduga banyak yang mengalami keracunan, konsentrasi kolkisin yang tinggi dan lama waktu perendaman yang lebih lama, mengakibatkan proses difusi kolkisin lebih jauh masuk ke dalam jaringan eksplan, sehingga sel banyak yang mati dan eksplan mencoklat seperti terlihat pada Gambar 3 .
A B Gambar 3. Perkembangan Eksplan Stevia pada Perlakuan 0.06 % kolkisin selama 72 jam: (A) eksplan yang berkembang pada 3 MST dan (B) eksplan yang mati pada 3 MST. Hansen et al (1995) meneliti tentang pengaruh konsentrasi kolkisin (0.40.6%) dan lama perendaman 0-5 hari terhadap penggandaan kromosom pada kultur ovul tanaman bit gula. Hasil penelitian menunjukan bahwa konsentrasi kolkisin yang terbaik untuk menghasilkan tanaman diploid adalah sebesar 0.4% dengan lama perendaman 2.5 hari. Konsentrasi kolkisin yang tinggi dan waktu perendaman yang lama menunjukan efek toksik terhadap pembentukan embrio.
Jumlah Tunas Berdasarkan pengamatan visual pada perlakuan kolkisin 0.06% selama 72 jam, beberapa eksplan menghasilkan tunas yang tidak normal seperti pada Gambar 4. Keragaan morfologi tunas yang abnormal tersebut memiliki batang kecil, tampak tidak kokoh, berwarna hijau pucat, bergelombang dan daun tidak berkembang sempurna. Pada akhir pengamatan tunas yang abnormal banyak yang mati dan tunas yang bertahan tidak tumbuh menjadi planlet normal.
21
A
B
Gambar 4. Keragaan Tunas Stevia pada Minggu ke-5 MST: (A) tunas normal dari perlakuan perendaman dengan air selama 72 jam dan (B) tunas abnormal dari perlakuan kolkisin 0.06% selama 72 jam. Jumlah tunas yang dihasilkan oleh eksplan yang diberi perlakuan kolkisin lebih sedikit dibandingkan dengan perlakuan perendaman air, seperti tercantum pada Tabel 5. Tabel 5. Pengaruh Perendaman Kolkisin terhadap Rata-rata Jumlah Tunas per Eksplan pada Tanaman Stevia rebaudiana Bertoni Secara In Vitro. Perlakuan
Rata-rata Jumlah Tunas pada Minggu ke- (MST)
Lama Perendaman Kolkisin (%)
(jam)
1
3
Air
24
2.00a
6.22a
Air
48
2.00a
5.66a
Air
72
2.00a
0.02
24
0.02
7
9
14.11b
17.66a
10.83b
16.05b
17.67a
5.28a
12.55a
18.78a
19.39a
1.00b
3.00b
7.28def
11.61c
13.95b
48
0.78b
2.22b
6.06f
8.27e
10.78cd
0.02
72
1.22b
2.44b
6.61ef
8.61de
9.89d
0.04
24
1.11b
2.67b
7.67def
10.00cde
11.00cd
0.04
48
1.00b
2.61b
8.61cd
11.50c
13.50bc
0.06
24
1.33ab
3.33b
7.95de
0.06
48
1.22b
2.22b
7.78def
10.67cd
14.39b
0.06
72
0.66b
1.78b
6.83def
10.05cde
11.72bcd
**
**
**
Uji F
5 9.94bc
9.89cde
Keterangan : ** Berbeda sangat nyata pada uji F dengan taraf 1% * Huruf yang sama pada tiap nilai rataan pada kolom yang sama menunjukan tidak berbeda nyata berdasarkan uji DMRT 5%
**
12.78bc
**
22
Pada minggu ke-5 dan ke-7 tanaman kontrol menunjukan beda nyata dimana perlakuan perendaman dengan air selama 72 jam memiliki nilai tertinggi. Hal ini diduga tumbuhan tunas yang tidak rata akibat bakal tunas yang muncul bersamaan, sehingga terjadi persaingan antar bakal tunas untuk berkembang, namun pada akhir pengamatan tidak berdeda nyata. Pada minggu ke-5, perlakuan kolkisin 0.02% selama 48 jam menunjukan rata-rata jumlah tunas per eksplan lebih kecil dan berbeda nyata, dengan perlakuan kolkisin 0.04% selama 48 jam dan perlakuan kolkisin 0.06% selama 24 jam. Pada minggu ke-7 perlakuan kolkisin 0.04% selama 48 jam menunjukan nilai lebih besar dan berbeda nyata dengan perlakuan kolkisin 0.02% selama 48 jam dan 0.02% kolkisin selama 72 jam. Pada akhir pengamatan perlakuan kolkisin 0.06% selama 48 jam lebih besar dan berbeda nyata dibandingkan dengan perlakuan kolkisin 0.02% selama 48 jam dan 0.02% kolkisin selama 72 jam. Nilai yang lebih tersebut disebabkan selang konsentrasi yang digunakan terlalu sempit, sehingga kalau dibandingkan dengan perlakuan kolkisin yang lainnya menunjukan hasil yang tidak berbeda nyata. Jumlah tunas yang lebih sedikit diduga disebabkan karena kolkisin menginduksi mutasi kromosom sel secara parsial, akibatnya terjadi kerusakan pada jaringan eksplan, sehingga eksplan gagal membentuk tunas, tunas yang terbentuk abnormal dan pertumbuhanya lambat. Kosmiatin dan Masrika (2005) melaporkan bahwa embrio hasil persilangan kacang hijau dan kacang hitam yang berumur 2-3 minggu, ditanam di dalam Media Knudson dan Knudson
+ 1 mg/l BA, dengan menambahkan
kolkisin sebesar 0.00, 0.05, 0.15 dan 0.25% ke dalam media. Hasil penelitian menunjukan, embrio yang ditanam gagal berkecambah, untuk setiap ulangan, embrio tidak mati tetapi gagal membentuk tunas. Ajijah dan Bermawi (2003) melaporkan bahwa perlakuan kolkisin 1% pada tanaman kencur tipe Cileungsi besar cenderung memberikan pengaruh penekanan terhadap jumlah tunas. Pada pengamatan visual yang lain, perlakuan perendaman dengan kolkisin 0.06% selama 72 jam terdapat tunas yang mengalami perubahan fenotipe akibat kimera, seperti pada Gambar 5.
23
Perubahan fenotipe mengindikasikan adanya kimera. Pada Gambar 5 menunjukan terdapat 3 helai daun pada satu buku, dengan ukuran lebih besar. Pada tunas yang lain terdapat tiga mata tunas aksilar dalam satu buku dengan tiga daun, dua dari tiga daun petiolnya bersatu, tetapi pada tunas aksilar diatasnya mempunyai 1 daun.
A
B
C Gambar 5. Keragaan Tunas Stevia setelah 4 MST di media MS + 0.1 mg/l NAA : (A) tunas dengan daun normal dari perlakuan perendaman air selama 72 jam (panah merah), (B) tunas dengan jumlah daun perbuku (panah merah) dan (C) tunas dengan 3 mata tunas aksilar (panah merah) dan 3 daun dengan dua dari tiga daun petiolnya bersatu (panah biru). (B) dan (C) dihasilkan dari perlakuan perendaman 0.06% kolkisin selama 72 jam. Kimera disebabkan karena jaringan eksplan mengalami mutasi parsial akibatnya tanaman mengalami malformasi, dan jumlah mata tunas aksilar yang berbeda baik dengan tunas lain yang berasal dari eksplan yang sama maupun dengan cabang tunas yang berkembang diatasnya. Blakeslee dan Avery (1937) melaporkan bahwa perlakuan kolkisin 0.4% selama satu hari pada biji Datura dapat menginduksi kimera dan mengakibatkan deformasi yang bervariasi pada tanaman akibat perubahan jumlah kromosom, daun mengalami malformasi, permukaan daun kasar dan batang yang kerdil.
24
Jumlah Daun Jumlah daun terus mengalami kenaikan setiap minggu seiring dengan pertambahan dan pertumbuhan tunas. Pada minggu ke-8 MST, daun mulai mengalami senescence dan bagian bawah tunas mencoklat, hal ini disebabkan karena umur tanaman sudah terlalu tua, sehingga harus di subkultur ke dalam media perakaran. Jumlah daun per eksplan menunjukan perbedaan yang sangat nyata pada hasil uji F. Pada uji lanjut tidak ada perbedaan antar perlakuan kolkisin, namun menunjukan berbeda nyata antara perlakuan perendaman kolkisin dengan perlakuan perendaman air, seperti tercantum pada Tabel 6. Jumlah daun dipengaruhi oleh jumlah tunas yang berkembang, semakin banyak tunas yang berkembang, mengakibatkan jumlah daun semakin banyak. Permadi et al. (1991) melaporkan bahwa pada tanaman bawang merah, pemberian kolkisin menekan tinggi tanaman dan jumlah daun pada tanaman generasi pertama. Tabel 6. Pengaruh Perendaman Kolkisin terhadap Rata-rata Jumlah Daun per Eksplan pada Tanaman Stevia rebaudiana Bertoni Secara In Vitro. Perlakuan
Rata-rata Jumlah Daun pada minggu ke- (MST)
Kolkisin
Lama Perendaman
(%)
(jam)
1
3
5
7
9
Air
24
3.94ab
11.00a
37.78b
60.22a
84.83a
Air
48
3.83b
10.39a
46.00a
59.22a
81.50a
Air
72
4.00a
12.56a
36.45b
61.28a
79.61a
0.02
24
0.00c
1.83b
17.94cd
40.89bcd
60.78bc
0.02
48
0.00c
2.00b
18.33cd
34.33cd
57.17bc
0.02
72
0.00c
2.79b
19.45c
39.78bcd
66.17b
0.04
24
0.00c
2.17b
21.55c
45.72b
59.89bc
0.04
48
0.00c
2.39b
25.44c
43.78bc
63.11b
0.06
24
0.00c
1.67b
21.33c
39.11bcd
59.83bc
0.06
48
0.00c
2.11b
20.33c
37.67bcd
63.45b
0.06
72
0.00c
0.50b
11.89d
33.33d
51.94c
**
**
**
Uji F
**
**
Keterangan : ** Berbeda sangat nyata pada taraf 1% * Huruf yang sama pada tiap nilai rataan pada kolom yang sama menunjukan tidak berbeda nyata berdasarkan uji DMRT 5%
25
Persentase Tunas Berakar Tabel 7 menunjukan persentase berakar tunas di media MS + 0.1 mg/l NAA, tunas mengalami keragaman dalam hal kecepatan berakar meskipun tunas berasal dari eksplan yang sama. Perlakuan 0.06% kolkisin selama 72 jam, menghasilkan persentase tunas berakar yang terkecil pada minggu ke-2 dan ke-3 MST, dibandingkan dengan perlakuan lain. Hal demikian diduga karena tunas belum mengalami pemulihan dari pengaruh tekanan akibat perendaman kolkisin sehingga pertumbuhan perakarannya lambat. Menurut Ajijah dan Bermawi (2003) tanaman kencur yang telah diberi perlakuan kolkisin 1%,
terjadi pemulihan
pertumbuhan tanaman setelah generasi ke-2. Pada minggu ke-4 persentase berakar perlakuan 0.06% kolkisin selama 72 jam tidak berbeda nyata dengan perlakuan air selama 48 jam. Hal ini diduga tunas sudah mengalami pemulihan pertumbuhan. Tabel 7. Pengaruh Perendaman Kolkisin Terhadap Persentase Tunas Berakar Tanaman Stevia rebaudiana Bertoni Secara In Vitro. Perlakuan
Presentase Tunas Berakar Pada Minggu ke- (MST)
Kolkisin (%)
Lama Perendaman (jam)
Air
24
Air
3
4
77.77a
91.01a
93.33a
48
48.89dc
66.68bcd
71.12bc
Air
72
68.89ba
80.00abcd
86.67ab
0.02
24
60.00abc
86.67ab
95.56a
0.02
48
57.78bc
84.45abc
91.11a
0.02
72
68.89ba
82.22abcd
95.56a
0.04
24
73.33ba
82.22abcd
88.89a
0.04
48
55.55bcd
64.45cd
80.00ab
0.06
24
46.67cd
75.55abcd
82.22ab
0.06
48
37.78d
61.66d
82.22ab
0.06
2
72 19.99e 40.00e Uji F ** ** Keterangan : ** Berbeda sangat nyata pada uji F dengan taraf 1% * Huruf yang sama pada tiap nilai rataan pada kolom yang sama menunjukan tidak berbeda nyata berdasarkan uji DMRT 5%
55.56c **
26
Analisis Sitologi Tanaman Stevia Hasil Induksi Mutasi dengan Kolkisin Menurut
Sastrosumarjo (2006) morfologi kromosom pada metafase
memperlihatkan panjang kromosom dan posisi sentromer, kromosom bisa dihitung jumlahnya . Berdasarkan hasil uji sitologi terhadap planlet, bagian akar lebih mudah diamati dibadingkan dengan bagian pucuk, bagian pucuk terlalu tebal sehingga banyak sel yang menumpuk, selain itu preparat yang dihasilkan kurang jelas karena bagian pucuk mengandung klorofil. Kelemahan preparat dari bagian akar adalah selnya mudah pecah. Tanaman stevia mengalami metafase pada pukul 08.00-09.00 pagi, tepatnya pukul 08.45 WIB, karena pada saat pengambilan sampel sebelum jam 8 dan sesudah jam 9 tidak ditemukan terdapat benangbenang kromatid yang menebal pada preparat yang diamati, yang terlihat jelas hanya inti sel saja, seperti pada Gambar 6.
A B Gambar 6. Waktu Pembelahan Sel Ujung Akar pada Tanaman Stevia : (A) sampel akar diambil pada jam 06.00 WIB (B) sampel akar diambil pada jam 09.00 WIB. Pada pengamatan jumlah kromosom ditemukan kimera pada organ yang berbeda dalam satu planlet. Kimera tersebut dihasilkan dari perlakuan perendaman dengan 0.02% larutan kolkisin selama 24 jam, pada sampel akar yang berbeda tetapi berasal dari planlet yang sama, terdapat sel dengan jumlah kromosom 36 Gambar 7.
dan ada yang sel dengan jumlah kromosom 22 seperti pada
27
A B Gambar 7. Kimera Pada Tingkat Organ yang Terjadi pada Perlakuan Perendaman 0.02% Kolkisin selama 24 jam : (A) sel dengan 2n = 22 (lingkaran biru) dan (B) sel dengan 2n = 36 (lingkaran biru). Kimera terjadi juga pada tingkat jaringan, pada sel yang berasal dari akar yang sama ditemukan sel dengan jumlah kromosom yang berbeda. Kimera tersebut dihasilkan dari perlakuan 0.04% kolkisin selama 48 jam, pada satu preparat terdapat sel dengan jumlah kromosom 36 dan 50 seperti pada Gambar 8.
Gambar 8. Kimera Pada Tingkat Jaringan yang Terjadi pada Perlakuan Perendaman 0.04% Kolkisin selama 48 jam : Sel kiri 2n = 36 (lingkaran merah), sel kanan 2n = 50 (persegi merah). Jumlah kromosom pada sel stevia normal adalah 2n = 22 (Sastrosumarjo, 2006). Berdasarkan hasil uji sitologi, jumlah kromosom pada masing-masing perlakuan menunjukkan keragaman, seperti yang tercantum pada Tabel 8. Ditemukan preparat dengan jumlah kromosom dibawah 2n = 22, hal tersebut diduga letak persebaran kromosom dalam sel menumpuk. Tunas yang mengalami
28
pertambahan jumlah kromosom melebihi jumlah alaminya dihasilkan pada perlakuan perendaman 0.02% kolkisin selama 24 jam, 0.04% kolkisin selama 24 jam, kolkisin 0,04% selama 48 jam dan kolkisin 0.06% selama 72 jam, pada perlakuan tersebut didapatkan 10 planlet yang terbukti mengalami pertambahan jumlah kromosom dan 39 planlet yang jumlah kromosomnya lebih sedikit dari pada tanaman yang normal. Variasi jumlah kromosom yang dihasilkan disebabkan karena kolkisin diserap oleh eksplan berbeda, tidak semua tunas yang dihasilkan terbukti mengalami penambahan jumlah kromosom. Handro et al (1993) mengemukakan bahwa dalam satu agregat kalus yang telah direndam dengan kolkisin 10-3 M selama 72 hari, menunjukan perbedaan karakteristik dari bentuk dan jumlah ploidi sel didalamnya, tergantung pada kekompakan agregatnya. Tabel 8. Jumlah Kromosom Tanaman Stevia Hasil Induksi Mutasi dengan Kolkisin. Perlakuan Kolkisin (%) Kontrol (MS0) Air Air Air 0.02 0.02 0.02 0.04 0.04 0.04
Lama Perendaman (jam) 24 48 72 24 48 72 24 48 72
Jumlah Kromosom 22 18.83 ± 2.99 20.50 ± 1.87 20.00 ±1.41 24.33 ±6.77 19.33 ±2.16 20.17 ±1.6 27.17 ±11.3 38.83 ±11.2 20.83 ±2.32
0.06 0.06 0.06
24 48 72
20.33 ±1.03 20.67 ±1.51 23.83 ±8.98
Gambar 9-15. menampilkan foto dua dimensi dari sampel preparat yang diambil pada masing-masing perlakuan. Gambar 10 (A) dan (B), Gambar 12 (B), Gambar 14 (B) dan Gambar 15 (B) secara visual, gambar tersebut menunjukan jumlah kromosom yang lebih banyak dibandingkan dengan kontrol. Pada Gambar 15 (B) menunjukan sel mengalami pemanjangan ukuran dan dengan jumlah kromosom yang lebih banyak dibandingkan dengan kontrolnya.
29
A
B
Gambar 9. Hasil Uji Sitologi 1 : (A) sel dari akar planlet kontrol (MS0) dengan jumlah kromosom 2n = 22, (B) sel dari akar planlet yang diberi perlakuan perendaman dengan air selama jam 24 dengan jumlah kromosom 2n = 22.
A
B
Gambar 10. Hasil Uji Sitologi 2 : (A) sel dari akar planlet yang diberi perlakuan perendaman dengan 0.02% kolkisin selama 24 jam dengan jumlah kromosom 2n = 36 dan (B) sel dari akar planlet dengan perlakuan 0.04% kolkisin 24 jam dengan jumlah kromosom 2n = 50.
A A
B B
Gambar 11. Hasil Uji Sitologi 3 : (A) sel dari akar planlet yang diberi perlakuan perendaman dengan 0.06% kolkisin selama 24 jam dengan jumlah kromosom 2n = 20 dan (B) sel dari akar planlet dengan perlakuan air selama 48 jam dengan jumlah kromosom 2n = 22.
30
A
B
Gambar 12. Hasil Uji Sitologi 4 : (A) sel dari akar planlet yang diberi perlakuan perendaman dengan 0.02% kolkisin selama 48 jam dengan jumlah kromosom 2n = 18 dan (B) sel dari akar planlet yang diberi perlakuan perendaman dengan 0.04% kolkisin selama 48 jam dengan jumlah kromosom 2n = 43.
A
B
Gambar 13. Hasil Uji Sitologi 5 : (A) sel dari planlet yang diberi perlakuan perendaman dengan 0.06% kolkisin selama 48 jam dengan jumlah kromosom 2n = 19 dan (B) sel dari planlet yang diberi perlakuan perendaman dengan air selama 72 jam dengan jumlah kromosom 2n = 22.
A
B
Gambar 14. Hasil Uji Sitologi 6 : (A) sel dari planlet yang diberi perlakuan perendaman dengan 0.02% kolkisin selama 72 jam dengan jumlah kromosom 2n = 18 dan (B) sel dari planlet yang diberi perlakuan 0.06% kolkisin 72 jam dengan jumlah kromosom 2n = 42.
31
A
B
Gambar 15. Hasil Uji Sitologi 7 : (A) sel dari planlet yang diberi perlakuan perendaman dengan 0.04% kolkisin selama 72 jam dengan jumlah kromosom 2n = 18 dan (B) sel dari planlet yang diberi perlakuan perendaman dengan 0.02% kolkisin selama 24 jam dengan jumlah kromosom 2n = 29.
KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Perlakuan kombinasi konsentrasi kolkisin dan lama perendaman, berpengaruh nyata terhadap persentase eksplan hidup, jumlah tunas per eksplan, jumlah daun per eksplan dan persentase tunas yang berakar. Semua eksplan yang diberi perlakuan kombinasi konsentrasi kolkisin dan lama perendaman menunjukan hasil yang lebih kecil dibandingkan dengan eksplan yang direndam air. Perlakuan 0.06% kolkisin selama 72 jam, menghasilkan persentase tunas berakar yang terkecil pada minggu ke-2 dan ke-3 MST, dibandingkan dengan perlakuan lain. Hasil uji sitologi menunjukan bahwa kolkisin dapat menginduksi terjadinya mutasi kromosom pada sel tunas stevia secara in vitro. Mutasi dengan kolkisin menghasilkan kimera pada plantlet yang terbentuk. Perlakuan yang menghasilkan planlet dengan jumlah kromosom melebihi jumlah alaminya adalah perlakuan perendaman 0.02% kolkisin selama 24 jam, 0.04% kolkisin selama 24 jam, kolkisin 0.04% selama 48 jam dan kolkisin 0.06% selama 72 jam. Jumlah kromosom pada planlet yang dihasilkan beragam, dari 15 hingga 50 kromosom per sel. Diperoleh 10 planlet yang memiliki sel dengan jumlah kromosom yang lebih tinggi dari normal dan 39 planlet yang lebih rendah dari normal. Saran Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk meneliti keragaan dan hasil panen tanaman dilapangan pada setiap perlakuan. Selain itu juga perlu diuji sitologi tanaman yang ditanam dilapang. Sebaiknya perlu dilakukan uji kadar steviosida bagi tanaman yang terbukti mengalami penggandaan kromosom.
DAFTAR PUSTAKA Adinegoro, H. 1986. Perancangan Proses Ekstraksi Daun Stevia (Stevia rebaudiana Bertoni). Thesis. Program Pasca Sarjana IPB. Bogor. 89 hal. Ajijah, N dan N. Bermawi. 2003. Pengaruh kolkisin terhadap pertumbuhan dan produksi dua tipe kencur (Kampferia galanga Linn.). Bul. TRO. XIV: 4655. Alard, R. W. 1989. Pemuliaan Tanaman 2. Diterjemaahkan oleh M. Mulyani. Bina Aksara. Jakarta . 246 hal. Armini, N. M., G. A. Wattimena dan L.W. Gunawan. 1991. Perbanyakan tanaman. Hal 17-149. Dalam: Tim Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman (Eds.). Bioteknologi Tanaman 1. Pusat Antar Universitas Bioteknologi. IPB. Bogor. 309 hal. Blakeslee, A. F. And A. G. Avery. 1973. Methods of inducing doubling of Chromosom in Plants by Treatment with Colchicine. J. Hered. 28: 393411. Gunawan, I. 1994. Pengaruh beberapa tingkat kadar air tanah oksisol cikarawang dan dosis pupuk NPK terhadap pertumbuhan dan hasil tanaman stevia (Stevia rebaudiana Bertoni M.). Skripsi. Jurusan Budidaya Pertanian. Fakultas Pertanian IPB. Bogor. 63 hal. Gunawan, L. W. 1992. Teknik Kultur Jaringan Tanaman. Departemen Pendidikan Tinggi. Pusat Antar Universitas Bioteknologi Institut Pertanian Bogor. Bogor. 165 hal. Handro, W., C. M. Ferreira and E. I. S. Floth. Chromosomal variability and growth rate in cell suspension cultures of Stevia rebaudiana (Bert.) Bertoni. http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_aset=V-WA-AB-MsS...( 29 Maret 2006) Hansen, N. H. And S. B. Andresen. 1998. In vitro chromosome doubling with colchicine during microspore culture in wheat (Triticum aestivum L.). Euphytica 102: 101-108. Hartmann, H.T., D.E. Kester, F.T. Davies. Jr. and R.L. Geneve. 1997. Plant Propagation Principles and Practice. 6th Ed. Prentice Hall International, New Jersey. 647 p. Hindarti, N. W. 2002. Lama perendaman dan konsentrasi kolkisin pada poliploidisasi bawang putih. skripsi. Fakultas Pertanian Universitas Pembangunan Nasional “Veteran”. Yogyakarta.
34
Jauhariah, A. Y. 1995. Pengaruh lama pemberian kolkisin terhadap perubahan jumlah kromosom, stuktur kromosom daun dan gula pada Stevia rebaudiana Bertoni M. Skripsi. Jurusan Biologi Fakultas MIPA UGM. Yogyakarta. Jurčák. J. 1999. A Modification to the acetocarmine method of chromosomes colouring in the school Practice. Biol. 37: 7-14. Karsono. 1995. Pengaruh perlakuan gelap dan pupuk kalium terhadap pertumbuhan dan produksi Stevia rebaudiana Bertoni M. Skripsi. Jurusan Budidaya Pertanian. Fakultas Pertanian IPB. Bogor. 57 hal. Kosmiatin. M dan I. Mariska. 2005. Kultur embrio dan penggandaan kromosom hasil persilangan kacang hijau dan kacang hitam. J. Biotek. Pertan. 10: 2432 . Leblanc, O., M. Douneas, M. Hernandez, S. Belo, V. Garcia, J. Berthaud and Y. Savidan. 1995. chromosome doubling in Tripsacum : the Production of Artificial, Sexual Tetraploid Plants. Plant Breeding 114: 226-230. Matthew, J. D. 1998. Colchicine. http://www.phc.vcu.edu/feature/old feature/colchicine/colchicine.htm/+Matthew+J.+Dowd++with=colchisine. (16 september 2005). Mohede, J. and R. T. M. Van Son. 1999. Stevia rebaudiana Bertoni. p. 207-211. In: C. C. De Guzman and J. S. Siemonsma (Eds.). Plant Resources of South East Asia 13th ed. Spices. PROSEA. Bogor. Mubiyanto, B. O. 1990. Analisis Pertumbuhan Tanaman Stevia rebaudiana Bertoni Pada Tiga Tinggi Tempat. Desertasi. Fakultas Pasca Sarjana IPB. Bogor. 175 hal. Murfadalina.1997. Pengaruh Kolkisin dan Lama Perendaman Terhadap Jumlah Kromosom, Indeks Stomata dan kandungan Protein Polong Kapri (Pisum sativum). Skripsi. Jurusan Biologi Fakultas MIPA UGM.Yogyakarta. Makmur, A. 1992. Pengantar Pemuliaan Tanaman. Rineka Cipta. Jakarta. 79 hal. Pratiwi, T. 1995. Pengaruh Radiasi Sinar Gamma Terhadap Variasi Somaklonal Tanaman Stevia (Stevia rebaudiana Bertoni).Thesis. Program Pasca Sarjana IPB. Bogor. 57 hal. Permadi, A. H., D. Cahyani dan S. Syarif. 1991. Cara pembelahan, lama perendaman dan konsentrasi kolkisin pada poliploidisasi bawang merah Sumenep. Zuriat 2 (2) : 17-26. Poespodarsono, S. 1988. Dasar-dasar Ilmu Pemuliaan Tanaman.Departemen Pendidikan dan Kebudayaan.Dirjen DIKTI. Pusat Antar Universitas Bioteknologi IPB. Bogor.169 hal.
35
Sastrosumarjo, S. 2006. Perilaku kromosom, hal.38-63. Dalam: S. Sastrosumarjo (Ed). Sitogenetika Tanaman. Departemen Agronomi dan Hortikultura Fakultas pertanian IPB. 268 hal. Sheppherd, V. 2006. Mitosis in plant cells. p.197-226. In: W. V. Dashek and Marcia Harrison (Eds). Plant Cell Biology. Science Publisher. New Jersey. 494 p. Soejono, S. dan K. Sukandari. 1996. Pengaruh perendaman dan konsentrasi kolkisin terhadap pertumbuhan potokrom anggrek Denrobium Jayakarta. J. Hort. 6: 56-59. Sulistianingsih, R., Z. A. Suyanto dan E. N. Anggia. 2004. Peningkatan kualitas anggrek dendrobium hibrida dengan pemberian kolkhisin. Ilmu Pertanian 11 (1): 13-21. Syukur, M. 2006.Variasi jumlah kromosom. p.93-122. Dalam: S. Sastrosumarjo (Ed). Sitogenetika Tanaman. Departemen Agronomi dan Hortikultura Fakultas pertanian IPB. 268 hal. USDA. 2005. Tabel 2 Konsumsi, Pangsa, dan Pertumbuhan Konsumsi dari Negara Konsumen Utama (2004-2006). http://www.ipard.com/art_perkebun/feb01-06_wrs.asp. (28 Mei 2006). Welsh. J. R., 1991. Dasar-Dasar Genetika dan Pemuliaan Tanaman. Erlangga. Jakarta. 224 hal.
LAMPIRAN
37
Tabel lampiran 1. Komposisi Media Murashige-Skoog (Gunawan, 1992). Konsentrasi Stok
Jenis Senyawa
Larutan Stok (g/l)
Volume
Konsentrasi
dalam
Senyawa
Media
dalam Media
(ml/l)
(ppm)
A
NH4NO3
82.500
20
1650.000
B
KNO3
95.000
20
1900.000
C
KH2PO4
34.000
5
170.000
H3BO3
1.240
6.200
KI
0.166
0.830
NaMoO4.2H2O
0.050
0.250
CoCl.6H2O
0.005
0.025
D
CaCl.2H2O
88.000
5
440.000
E
MgSO4.7H2O
74.000
5
370.000
MgSO4.4H2O
4.460
22.300
ZnSO4.7H2O
1.720
8.600
CuSO4.5H2O
0.005
0.025
Na2EDTA.2H2O
3.730
FeSO4.7H2O
2.780
Myo
Myo-Inositol
10.000
10
100.000
Vitamin
Thiamin
0.010
10
0.100
Niacin
0.050
0.500
Pyridoxine
0.050
0.500
Glycin
0.200
2.000
Gula
30.000
F
10
37.300 27.800
38
Tabel
Umur Planlet (MST) 1
2
3
4
5
6
7
8
9
Lampiran 2. Sidik Ragam Pengaruh Perendaman Kolkisin terhadap Presentase Eksplan Hidup Tanaman Stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) Secara In Vitro. Sumber Keragaman Perlakuan Galat Total Koreksi Perlakuan Galat Total Koreksi Perlakuan Galat Total Koreksi Perlakuan Galat Total Koreksi Perlakuan Galat Total Koreksi Perlakuan Galat Total Koreksi Perlakuan Galat Total Koreksi Perlakuan Galat Total Koreksi Perlakuan Galat Total Koreksi
db 10 22
JK 696.97 1366.667
KT 69.697 62.1212
F Hit 1.12
Pr>F 0.39
R² 0.3377
KK (%) 8.1791
32 10 22
2063.636 3754.545 2300
375.455 104.545
3.59
0.0059
0.6201
11.081
32 10 22
6054.545 4784.848 3383.333
478.485 153.788
3.11
0.0127
0.5858
13.71
32 10 22
8168.182 4630.303 2116.667
463.03 96.2121
4.81
0.001
0.6863
11.143
32 10 22
6746.97 4316.667 1466.667
431.667 66.6667
6.48
0.0001
0.7464
9.4211
32 10 22
5783.333 5430.303 966.6667
543.03 43.9394
12.36
0.0001
0.8489
7.7707
32 10 22
6396.97 6046.97 1416.667
604.697 64.3939
9.39
0.0001
0.8102
9.5946
32 10 22
7463.636 7183.333 1350
718.333 61.3636
11.71
0.0001
0.8418
9.592
32 10 22
8533.333 8271.212 1766.667
827.121 80.303
10.3
0.0001
0.824
11.287
32
10037.88
39
Tabel Lampiran 3. Sidik Ragam Pengaruh Perendaman Kolkisin terhadap Ratarata Jumlah Tunas Tanaman Stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) Secara In Vitro . Umur Planlet (MST) 1
2
3
4
5
6
7
8
9
Sumber Keragaman Perlakuan Galat Total Koreksi Perlakuan Galat Total Koreksi Perlakuan Galat Total Koreksi Perlakuan Galat Total Koreksi Perlakuan Galat Total Koreksi Perlakuan Galat Total Koreksi Perlakuan Galat Total Koreksi Perlakuan Galat Total Koreksi Perlakuan Galat Total Koreksi
db 10 22
JK 7.13 3.64
KT 0.71 0.17
F Hit 4.32
Pr>F 0.002
R² 0.66
KK (%) 31.21
32 10 22
10.77 11.34 5.84
1.13 0.27
4.27
0.0022
0.66
32.60
32 10 22
17.19 72.78 22.18
7.28 1.01
7.22
0.0001
0.77
29.50
32 10 22
94.95 108.04 23.84
10.80 1.08
9.97
0.0001
0.82
17.65
32 10 22
131.88 117.39 19.70
11.74 0.90
13.11
0.0001
0.86
11.30
32 10 22
137.09 190.68 28.11
19.07 1.28
14.92
0.0001
0.87
11.21
32 10 22
218.79 318.13 30.71
31.81 1.40
22.79
0.0001
0.91
10.03
32 10 22
348.84 286.31 53.28
28.63 2.42
11.82
0.0001
0.84
11.98
32 10 22
339.60 297.34 52.18
29.73 2.37
12.54
0.0001
0.85
11.09
32
349.52
40
Tabel Lampiran 4. Sidik Ragam Pengaruh Perendaman Kolkisin terhadap Ratarata Jumlah Daun per Eksplan Tanaman Stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) Secara In Vitro Umur Planlet
Sumber
(MST)
Keragaman
db
JK
KT
F Hit
Pr>F
R²
(%)
1
Perlakuan
10
100.91
10.09
1193.97
0.0001
1.00
8.59
Galat Total Koreksi
22
0.19
0.01
32
101.09
Perlakuan
10
188.97
18.90
140.12
0.0001
0.98
25.08
Galat Total Koreksi
22
2.97
0.13
32
191.94
Perlakuan
10
593.28
59.33
24.38
0.0001
0.92
34.74
Galat Total Koreksi
22
53.54
2.43
32
646.82
Perlakuan
10
1815.37
181.54
23.31
0.0001
0.91
24.49
Galat Total Koreksi
22
171.36
7.79
32
1986.73
Perlakuan
10
3237.80
323.78
21.17
0.0001
0.91
15.56
Galat Total Koreksi
22
336.41
15.29
32
3574.21
Perlakuan
10
3652.81
365.28
21.47
0.0001
0.91
11.56
Galat Total Koreksi
22
374.37
17.02
32
4027.18
Perlakuan
10
3250.56
325.06
11.46
0.0001
0.84
11.83
Galat Total Koreksi
22
623.80
28.35
32
3874.35
Perlakuan
10
3983.75
398.37
20.69
0.0001
0.90
7.74
Galat Total Koreksi
22
423.68
19.26
32
4407.43
Perlakuan
10
3518.49
351.85
15.01
0.0001
0.87
7.31
Galat Total Koreksi
22
515.61
23.44
32
4034.10
2
3
4
5
6
7
8
9
KK
41
Tabel
Lampiran
Umur Planlet (MST) 2
3
4
5.
Sumber Keragaman Perlakuan Galat Total Koreksi Perlakuan Galat Total Koreksi Perlakuan Galat Total Koreksi
Sidik Ragam Pengaruh Perendaman Kolkisin terhadapPresentase Eksplan Berakar Tanaman Tanaman Stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) Secara In Vitro.
db
JK
KT
F Hit
Pr>F
R²
10 22
8676.649 2340.86
867.665 106.403
8.15
0.0001
0.7875
KK (%) 18.434
32 10 22
11017.51 6556.421 2798.414
655.642 127.201
5.15
0.0007
0.7009
15.224
32 10 22
9354.835 4297.988 1926.697
429.799 87.5771
4.91
0.0009
0.6905
11.162
32
6224.685
Tabel lampiran 6. Jumlah Kromosom Sample Tanaman Stevia Hasil Induksi Mutasi dengan Kolkisin.
Perlakuan
Jumlah Kromosom Sel Sampel Tanaman ke-
Kolkisin (%) Kontrol (MS0)
Lama Perendaman (jam)
Air
24
Air
1
2
3
4
5
6
20
18
22
15
16
22
48
22
17
21
21
22
20
Air
72
21
20
19
20
18
22
0.02
24
20
29
36
22
20
19
0.02
48
18
16
19
20
22
21
0.02
72
18
20
20
19
22
22
0.04
24
25
22
50
22
22
22
0.04
48
45
43
41
36
18
50
0.04
72
22
19
23
17
22
22
0.06
24
20
21
20
20
22
19
0.06
48
19
22
20
19
22
22
0.06
72
19
20
19
42
21
22
22
