INDUKSI KERAGAMAN GENETIK DENGAN SINAR GAMMA PADA JERUK SIAM PONTIANAK (Citrus nobilis var. microcarpa) SECARA IN VITRO
ANDRI INDRAYASA A24061354
DEPARTEMEN AGRONOMI DAN HORTIKULTURA FAKULTAS PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2011
RINGKASAN ANDRI INDRAYASA. Induksi Keragaman Genetik dengan Sinar Gamma pada Jeruk Siam Pontianak (Citrus nobilis var. microcarpa) secara In Vitro . (Di bawah bimbingan AGUS PURWITO dan ALI HUSNI). Di antara berbagai jenis jeruk, jeruk siam mendominasi produksi jeruk di Indonesia. Tetapi, jenis jeruk ini masih memiliki jumlah biji yang relatif banyak, warna kulit yang kurang menarik, dan kulitnya sulit dikupas. Teknik pemuliaan konvensional pada jeruk memerlukan waktu yang cukup lama dan biaya yang besar, serta dibatasi oleh heterozigositas yang tinggi, tipe reproduktif melalui embrio nuselar dan juga juvenilitas. Pemuliaan mutasi dengan menggunakan mutagen fisik seperti sinar gamma merupakan salah satu alternatif untuk meningkatkan keragaman yang dapat mengubah satu atau lebih karakter tanpa mengubah karakteristik asalnya. Penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan varietas unggul jeruk siam Pontianak yang memiliki karakter agronomi dan kualitas buah yang lebih baik. Percobaan ini telah dilakukan melalui beberapa tahap, mulai dari perbanyakan kalus embriogenik, iradiasi sinar gamma pada kalus, pendewasaan embrio somatik, perkecambahan embrio somatik, analisis keragaman genetik berdasarkan karakter morfologi dan analisis stomata sehingga diperoleh informasi bahwa pemberian mutagen sinar gamma dapat menyebabkan perubahan baik morfologi maupun jumlah kromosom. Kegiatan persiapan dan perbanyakan bahan tanam telah dilaksanakan selama 3 bulan di Laboratorium Kultur Jaringan, kelompok peneliti Biologi Sel dan Jaringan, BB-Biogen, selanjutnya kalus tersebut diiradiasi di BATAN Jakarta dengan dosis 0, 10, 20, 30, dan 40 Gy. Regenerasi kalus menjadi planlet (tanaman lengkap) dilakukan melalui jalur embriogenesis somatik. Pendewasaan embrio somatik primer (fase globular) menjadi embrio somatik dewasa (Fase hati, fase torpedo, dan fase kotiledon) dilakukan pada media MW dengan penambahan ABA dengan konsentrasi 1.0, 1.5, 2.0, dan 2.5 mg/l. Untuk meningkatkan frekuensi pendewasaan embrio somatik diberikan penambahan 500 mg/l Ekstrak
viii
Malt pada media kultur. Perkecambahan embrio somatik dilakukan dalam media MW dengan penambahan 0.5 mg/l GA3. Untuk pengujian keragaman genetik yang terjadi akibat iradiasi sinar gamma, dilakukan dengan cara pengamatan morfologi yang diamati dari perubahan bentuk tanaman secara visual. Pendugaan jumlah kromosom dilakukan dengan pengamatan terhadap jumlah kloroplas di dalam sel penjaga pada stomata. Selanjutnya dilakukan analisis data dengan program NTSYS ver. 2.02. Hasil analisis ragam pada tahap pertumbuhan kalus setelah iradiasi menunjukkan bahwa pemberian mutagen sinar gamma dapat mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan kalus dalam proliferasi maupun pendewasaan serta perkecambahan embrio somatik. Perubahan morfologi yang terjadi dapat dilihat secara visual, yaitu pada karakter jumlah daun, bentuk daun, bentuk ujung daun, tinggi planlet, warna daun, dan ketegapan tanaman. Perubahan yang terjadi pada tingkat kromosom dapat dilihat berdasarkan jumlah kloroplas yang terdapat pada sel penjaga pada stomata. Berdasarkan hasil analisis jumlah kloroplas di dalam sel penjaga diperoleh calon mutan yang diduga merupakan tanaman triploid yaitu regeneran yang berasal dari pemberian iradiasi sinar gamma pada dosis 10 Gy (regeneran M-10/1).
INDUKSI KERAGAMAN GENETIK DENGAN SINAR GAMMA PADA JERUK SIAM PONTIANAK (Citrus nobilis var. microcarpa) SECARA IN VITRO
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Pertanian pada Fakultas Pertanian Institut Pertanian Bogor
OLEH ANDRI INDRAYASA A24061354
DEPARTEMEN AGRONOMI DAN HORTIKULTURA FAKULTAS PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2011
Judul : INDUKSI KERAGAMAN GENETIK DENGAN SINAR GAMMA PADA JERUK SIAM PONTIANAK (Citrus nobilis var. microcarpa) SECARA IN VITRO Nama : ANDRI INDRAYASA NIM : A.24061354
Menyetujui, Dosen Pembimbing Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Ir. Agus Purwito, MSc. Agr
Dr. Ali Husni, MSi
NIP : 19611101 198703 1 003
NIP: 19641209 199203 1 002
Mengetahui: Ketua Departemen Agronomi dan Hortikultura Fakultas Pertanian Institut Pertanian Bogor
Dr. Ir. Agus Purwito, MSc. Agr NIP : 19611101 198703 1 003
Tanggal Lulus :
RIWAYAT HIDUP
Penulis bernama lengkap Andri Indrayasa, dilahirkan di Bandung pada tanggal 12 Februari 1988 dan merupakan anak kedua dari tiga bersaudara dari pasangan Bapak Indra Koswara dan Ibu Nurhayati Jenjang pendidikan yang ditempuh penulis diantaranya pada tahun 1992 menempuh pendidikan di TK Bandung Institut dan lulus pada tahun 1994. Pendidikan dasar di tempuh pada tahun 1994 di SDN Taruna Karya I Kota Bandung dan lulus tahun 2000. Pada tahun 2000 penulis menempuh pendidikan di SMPN 46 Bandung dan lulus tahun 2003. Pada tahun 2003 penulis menempuh pendidikan di SMAN 26 Bandung dan lulus tahun 2006. Pada tahun 2006, penulis diterima sebagai mahasiswa Instititut Pertanian Bogor melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Tahun 2007, penulis memasuki Departemen Agronomi dan Horikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Selama kuliah penulis aktif dalam organisasi daerah Bandung (PAMAUNG) periode 2007/2008, Dewan Perwakilan Mahasiswa (DPM) Fakultas Pertanian komisi internal periode 2007/2008 dan komisi pengawas BEM periode 2008/2009, serta sebagai anggota Koperasi Mahasiswa (KOPMA) IPB. Selain itu penulis pun pernah menjadi asisten mata kuliah Metode Statistik dan Rancangan Percobaan serta asisten praktikum mata kuliah Pembiakan Tanaman. Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana pada Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, penulis melakukan penelitian yang berjudul “Induksi Keragaman Genetik dengan Sinar Gamma pada Jeruk Siam Pontianak (Citrus nobilis var. microcarpa) secara In Vitro” dibimbing oleh Dr. Ir. Agus Purwito, MSc, Agr. dan Dr. Ali Husni, MSi.
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala nikmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi ini. Pada kesempatan ini, penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang membantu dalam penyusunan skripsi ini, dan secara khusus kepada: 1. Dr. Ir. Agus Purwito, MSc.Agr dan Dr. Ali Husni, MSi selaku dosen pembimbing, yang telah banyak memberikan bimbingan dan saran dalam proses penelitian sampai penyusunan skripsi. 2. Ibu Maryati Sari selaku pembimbing akademik yang telah membimbing penulis selama menjalani studi. 3. Dr. Dewi Sukma, SP, MSi. sebagai penguji. 4. Ayah dan ibu beserta seluruh keluarga besar yang selalu mendukung dalam segala aktivitas penulis. 5. Tanoto Foundation yang telah memberikan beasiswa kepada penulis selama kuliah. 6. Seluruh jajaran karyawan dan staf BB-Biogen yang telah banyak membantu penulis dalam kegiatan penelitian. 7. Teman-teman Agronomi dan Hortikultura angkatan 43 yang telah memberikan motivasi dan saran. 8. Semua pihak yang telah membantu dalam penyelesaian skripsi. Penulis menyadari akan segala kekurangan dalam penyusunan skripsi ini, namun demikian penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi perkembangan kemajuan penelitian pada umumnya, khususnya pada tanaman jeruk.
Bogor, 25 Februari 2011
Penulis
DAFTAR ISI
Halaman DAFTAR TABEL ...................................................................................................... viii DAFTAR GAMBAR ................................................................................................... ix DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................................. x PENDAHULUAN ........................................................................................................ 1 Latar Belakang ..................................................................................................... 1 Tujuan .................................................................................................................. 3 Hipotesis............................................................................................................... 3 TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................................... 4 Tanaman Jeruk ..................................................................................................... 4 Jeruk Siam Pontianak ........................................................................................... 5 Budidaya Jeruk Siam Pontianak........................................................................... 7 Embriogenesis Somatik pada Jeruk ..................................................................... 8 Buah Jeruk Tanpa Biji .......................................................................................... 9 Induksi Mutasi pada Kultur Jaringan ................................................................. 10 Mutagen Sinar Gamma ...................................................................................... 12 BAHAN DAN METODE ........................................................................................... 14 Tempat dan Waktu ............................................................................................. 14 Bahan dan Alat ................................................................................................... 14 Metode Percobaan .............................................................................................. 14 Pelaksanaan ........................................................................................................ 17 Analisis Data ...................................................................................................... 22 HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................................... 24 1. Proliferasi Kalus Embriogenik Hasil Iradiasi ........................................... 26 2. Pendewasaan Embrio Somatik .................................................................. 30 3. Perkecambahan Embrio Somatik .............................................................. 33 4. Pertumbuhan Regeneran Mutan ................................................................ 34 5. Evaluasi Keragaman Genetik .................................................................... 37 KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................................... 43 Kesimpulan ........................................................................................................ 43 Saran................................................................................................................... 43 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................. 44 LAMPIRAN ................................................................................................................ 49
2
DAFTAR TABEL
Nomor
Halaman
1.
Klasifikasi Ilmiah Jeruk Siam (Sari, 2004) ............................................... 5
2.
Kelebihan dan kekurangan penggunaan berbagai jenis jaringan yang digunakan untuk mutasi (Roose dan Williams, 2007). ........................... 12
3.
Pengaruh dosis iradiasi dan konsentrasi biotin terhadap luas kalus jeruk siam Pontianak (cm2) pada 2 MST. ............................................... 28
4.
Pengaruh dosis iradiasi dan konsentrasi biotin terhadap luas kalus jeruk siam Pontianak (cm2) pada 4 MST. ............................................... 29
5.
Pengaruh dosis radiasi dan konsentrasi ABA pada media pendewasaan embrio somatik (MW dan MW + 500 mg/l EM) setelah 4 MST............ 32
6.
Pengaruh dosis iradiasi terhadap perkecambahan embrio somatik pada 4 MST. ............................................................................................ 33
7.
Keragaman regeneran jeruk siam Pontianak secara in vitro hasil perlakuan sinar gamma. .......................................................................... 36
8.
Jumlah kloroplas didalam sel penjaga pada regeneran mutan terseleksi. ................................................................................................ 39
9.
Kisaran, rataan, ragam fenotipik (σ2f) dan standar deviasi ragam fenotipik (Sd σ2f) dari variable yang diamati. ........................................ 41
DAFTAR GAMBAR
Nomor
Halaman
1.
(a) buah, dan (b) tanaman jeruk siam Pontianak. ...................................... 6
2.
Diagram alir percobaan. .......................................................................... 22
3.
Kalus embriogenik hasil perbanyakan (a) penampakan kalus di botol kultur, dan (b) penampakan secara mikroskopik pada perbesaran 10 X. ........................................................................................................ 24
4.
Kondisi umum planlet di Laboratorium Kultur Jaringan Kelompok Peneliti Biologi Sel dan Jaringan, BB-Biogen. ....................................... 25
5.
Eksplan kalus jeruk siam Pontianak yang terkontaminasi (a) bakteri dan (b) cendawan. ................................................................................... 26
6.
Embrio somatik abnormal (a) kompak, (b) roset dan kompak. ............... 26
7.
Tahap pendewasaan embrio somatik jeruk siam Pontianak, (a) fase globular, (b) fase hati, (c) fase torpedo, (d) dan fase kotiledon. ............. 31
8.
Perkembangan embrio somatik, a) dan b) tahap pendewasaan, c) tahap perkecambahan embrio somatik jeruk siam Pontianak. ............ 34
9.
Karakter morfologi regeneran mutan dalam media pembesaran ( MW + 500 mg/l EM). ........................................................................... 35
10.
Panjang dan lebar stomata serta kloroplas di dalam sel penjaga pada stomata jeruk siam Pontianak. ................................................................ 38
11.
Dendogram regeneran jeruk in vitro berdasarkan karakter morfologi. ... 40
12.
Regeneran-regeneran mutan yang telah disambung, (a) M-10/5, (b) K-0/2, dan (c) M-10/4. ...................................................................... 42
DAFTAR LAMPIRAN
Nomor
Halaman
1.
Komposisi Media MW (Morrel dan Wetmore, 1961) .............................. 50
2.
Data biner pengamatan morfologi pada 15 regeneran kontrol dan mutan....................................................................................................... 51
3.
Deskripsi Jeruk Siam Pontianak .............................................................. 52
4.
Sidik ragam luas kalus pada 2 MST ........................................................ 53
5.
Sidik ragam luas kalus pada 4 MST ........................................................ 53
6.
Sidik ragam jumlah kloroplas di dalam sel penjaga ................................ 53
7.
Rekapitulasi hasil uji kehomogenan ragam terhadap beberapa varibel pada regeneran 0 dan 10 Gy.................................................................... 53
PENDAHULUAN Latar Belakang Jeruk merupakan salah satu buah yang paling digemari di Indonesia. Hal ini ditandai dengan semakin meningkatnya konsumsi jeruk di Indonesia dari tahun ke tahun. Konsumsi buah jeruk pada tahun 1995-2004 mengalami peningkatan sebesar 12.15% per tahun (Hutabarat dan Setyanto, 2008). Total konsumsi jeruk Indonesia pada tahun 2004 mencapai 2 161.90 ribu ton (Hutabarat dan Setyanto, 2008) sedangkan produksi jeruk dalam negeri hanya 2 071.08 ribu ton (Deptan, 2009). Rendahnya produksi jeruk di Indonesia antara lain disebabkan tingkat produktivitasnya masih rendah. Produktivitas kebun jeruk di Indonesia masih jauh dari kebun-kebun di negara lain yaitu hanya 12.22 ton per hektar sedangkan Australia dan Amerika Serikat masing-masing mencapai 19.38 dan 37. 81 ton per hektar (FAO, 2007) Di antara berbagai jenis jeruk, jeruk siam mendominasi produksi jeruk di Indonesia. Namun, jenis jeruk ini mempunyai limbah atau bagian yang tidak dikonsumsi paling tinggi di antara jenis lainnya. Limbah tersebut berupa serasah sisa yang dimakan, kulit buah, dan biji. Jenis jeruk ini juga peka terhadap hama dan penyakit serta cekaman lingkungan (Sukarmin dan Ihsan, 2008). Selain itu menurut Husni (2008) jeruk jenis ini rasanya cukup manis tetapi belum sesuai dengan kategori yang diinginkan pasar dunia untuk dikonsumsi dalam keadaan segar. Jeruk siam masih mempunyai biji yang relatif banyak (14-24 biji per buah) dan mempunyai warna kulit yang belum begitu menarik sehingga kalah bersaing dengan jeruk yang diproduksi negara lain. Kebutuhan pasar dunia terhadap buah jeruk yang dikonsumsi segar saat ini perlu memenuhi kategori buah yang tidak berbiji (seedless), mudah dikupas (easy peeling), dan mempunyai tipe mandarin dengan warna yang menarik (pigmented) (Husni, 2010). Oleh karena itu, perlu dilakukan perbaikan mutu buah melalui pemuliaan untuk meningkatkan porsi buah yang dapat dimakan serta memenuhi trend kebutuhan pasar dunia. Perbaikan sifat genetik dan agronomi tanaman dapat dilakukan melalui pemuliaan. Secara konvensional, perbaikan sifat dilakukan dengan persilangan antar varietas, spesies, genera atau kerabat yang lebih jauh yang memiliki sifat
2
yang diinginkan (Soedjono, 2003). Namun teknik pemuliaan konvensional memerlukan waktu yang cukup lama dan biaya yang besar. Menurut Sukarmin dan Ihsan (2008) untuk mendapatkan varietas unggul baru jeruk diperlukan tahapan yang panjang dan waktu yang cukup lama, yaitu 6-15 tahun. Menurut Agisimanto dan Sutarto (2008) perbaikan genetik Citrus spp melalui hibridisasi dihambat dan dibatasi oleh sifat heterozigositas yang tinggi, tipe reproduktif melalui embrio nuselar dan juga juvenilitas, yang berujung kepada kebutuhan seleksi yang besar. Menurut Suryowinoto (2000) salah satu alternatif pemecahan masalah yaitu melalui teknik kultur jaringan atau teknik in vitro yang salah satunya dengan cara induksi mutasi. Dalam
penelitian
ini
dilakukan
induksi
mutasi
dengan
iradiasi
menggunakan sinar gamma untuk menginduksi keragaman pada tanaman jeruk siam. Menurut Sutjahjo et al. (2007) teknik in vitro melalui variasi somaklonal dan perlakuan mutasi fisik seperti iradiasi sinar gamma pada jaringan atau sekelompok sel (kalus) merupakan alternatif untuk mendapatkan varian yang diinginkan. Selanjutnya Agisimanto dan Sutarto (2008) menambahkan bahwa radiasi seperti sinar gamma paling banyak digunakan untuk menghasilkan karakter yang diinginkan untuk pemuliaan tanaman. Teknik ini sudah banyak digunakan pada berbagai spesies tanaman, terutama yang memiliki variasi genetik yang sempit, untuk memperbaiki karakter spesifik di dalam kultivar lokal yang adaptif pada lingkungan spesifik. Iradiasi pengion seperti sinar gamma merupakan mutagen yang paling efektif untuk pemuliaan tanaman, karena menginduksi perubahan lebih banyak bila dibandingkan secara kimia karena kemampuan penetrasinya lebih jauh ke dalam jaringan. Kosmiatin et al. (2010) melaporkan adanya peningkatan keragaman genetik pada tanaman jeruk batang bawah Japhanese Citroen (JC) untuk ketahanan terhadap cekaman alumunium (Al) hasil iradiasi sinar gamma pada dosis 0-30 Gy.
3
Tujuan • Mempelajari pengaruh perlakuan biotin pada beberapa konsentrasi terhadap proliferasi kalus embriogenik yang telah diiradiasi. • Mempelajari pengaruh perlakuan ABA pada beberapa konsentrasi terhadap pendewasaan embrio somatik yang telah diiradiasi. • Meningkatkan keragaman genetik jeruk siam dengan menggunakan mutagen sinar gamma. • Mendapatkan informasi mengenai keragaman genetik hasil iradiasi melalui analisis morfologi dan jumlah kloroplas di dalam sel penjaga pada regeneran yang dihasilkan. Hipotesis • Pemberian dosis iradiasi yang berbeda dapat meningkatkan keragaman genetik jeruk siam Pontianak. • Terdapat konsentrasi biotin yang terbaik untuk proliferasi kalus embriogenik jeruk siam Pontianak hasil radiasi sinar gamma. • Terdapat interaksi antara dosis iradiasi dan konsentrasi biotin terhadap perkembangan kalus jeruk siam Pontianak. • Terdapat konsentrasi ABA yang terbaik untuk pendewasaan embrio somatik jeruk siam Pontianak hasil radiasi sinar gamma.
TINJAUAN PUSTAKA Tanaman Jeruk Tanaman jeruk adalah tanaman buah tahunan yang berasal dari Asia. Cina dipercaya sebagai tempat pertama kali jeruk tumbuh. Sejak ratusan tahun yang lalu, jeruk sudah tumbuh di Indonesia baik secara alami atau dibudidayakan. Tanaman jeruk yang ada di Indonesia adalah peninggalan Belanda yang mendatangkan jeruk manis dan keprok dari Amerika dan Italia (Menegristek, 2000). Jeruk merupakan sumber vitamin C yang sangat baik. Jus jeruk mengandung asam askorbat 20-60 mg per 100 ml. Vitamin lain yang tak kalah penting adalah vitamin A, tiamin, niasin, riboflavin, asam pantotenat, biotin, asam folat, inositol, dan tokoferol. Kandungan vitamin A berkisar antara 250-420 IU, tiamin 70-120 µg, asam folat 1.2 µg, dan inositol 135 mg setiap 100 ml jus (BBPascapanen, 2009). Jenis jeruk lokal yang dibudidayakan di Indonesia adalah jeruk Keprok (Citrus reticulata/nobilis L.), jeruk Siam (C. microcarpa L. dan C.sinensis L.) yang terdiri atas Siam Pontianak, Siam Garut, Siam Lumajang, jeruk manis (C. auranticum L. dan C. sinensis L.), jeruk sitrun/lemon (C. medica), jeruk besar (C. maxima Herr.) yang terdiri atas jeruk Nambangan-Madium dan Bali. Jeruk untuk bumbu masakan yang terdiri atas jeruk nipis (C. aurantifolia), jeruk Purut (C. hystrix) dan jeruk sambal (C. hystix ABC) (Menegristek, 2000). Indonesia merupakan negara tropis di mana berbagai jenis jeruk banyak dijumpai dan dibudidayakan mulai dari dataran rendah hingga dataran tinggi. Bahkan beberapa jenis jeruk tersebut telah menjadi unggulan daerah maupun nasional seperti jeruk manis Pacitan dari daerah Pacitan, Jawa Timur; jeruk manis Waturejo dari Jawa Tengah; keprok SoE dari Nusa Tenggara Timur; Keprok Batu 55 dari Batu, Jawa Timur; Siam Madu, Keprok Maga, dan Beras Sitepu dari Medan, Sumut; Siam Pontianak dari Kalimantan Barat; dan Pamelo Nambangan, Sri Nyonya, serta Magetan dari Magetan, Jawa Timur (Martasari dan Mulyanto, 2008).
5
Jeruk siam memiliki ciri khas yang tidak dimiliki jeruk keprok lainnya. Dilihat sekilas memang tidak jauh berbeda. Perbedaannya terletak pada kulitnya yang tipis dan mengkilap. Disamping itu, kulit jeruk siam menempel lebih lekat dengan dagingnya, sedangkan pada jeruk keprok lainnya terdapat ruang pemisah yang lebih jelas. Jeruk siam memiliki ukuran yang ideal, tidak terlalu besar dan tidak terlalu kecil (Setiawan, 1992). Jeruk Siam Pontianak Jeruk Pontianak yang dikenal sebagai jeruk siam ini memiliki ciri antara lain buahnya berwarna hijau kekuningan, mengkilat, dan permukaannya halus (Gambar 1). Ketebalan kulitnya sekitar 2 mm. Berat tiap buah sekitar 75.6 g. Bagian ujung buah berlekuk dangkal. Daging buahnya bertekstur lunak dan mengandung banyak air dengan rasa manis yang segar. Setiap buah mengandung sekitar 20 biji. Tabel 1 menunjukkan klasifikasi ilmiah dari jeruk siam Pontianak. Jeruk siam tumbuh berupa pohon berbatang rendah dengan tinggi 2-8 meter (Gambar 1). Umumnya tanaman ini tidak berduri. Batangnya bulat atau setengah bulat dan memiliki percabangan yang banyak dengan tajuk yang sangat rindang. Ciri khas lainnya tanaman ini adalah dahannya kecil dan letaknya berpencar tidak beraturan. Daunnya berbentuk bulat telur memanjang, elips, atau lanset dengan pangkal tumpul dan ujung meruncing seperti tombak. Permukaan atas daun berwarna hijau tua mengkilat sedangkan permukaan bawah hijau muda. Panjang daun 4-8 cm dan lebar 1.5-4 cm. Tangkai daunnya bersayap sangat sempit sehingga bisa dikatakan tidak bersayap (Sarwono, 1994).
Tabel 1. Klasifikasi Ilmiah Jeruk Siam (Sari, 2004) Kerajaan Divisio Kelas Subkelas Ordo Familia Genus Spesies
Plantae Spermatophyta Dicotyledonae Rosidae Eutales Rutaceae Citrus Citrus nobilis var. Microcarpa
6
Bunga jeruk merupakan bunga lengkap yang terdiri atas ovarium (bakal buah), kepala putik, kepala sari, mahkota, dan tangkai putik (Sukarmin dan Ihsan, 2008). Kelopak bunga berjumlah 4-5, ada yang menyatu ada yang tidak. Mahkota bunga kebanyakan berjumlah 4-5 dan berdaun lepas. Tonjolan dasar bunga beringgit atau berlekuk di dalam benang-sari (Sarwono, 1994). Cairan nektar diproduksi oleh jaringan bagian atas bunga jantan. Nektar diproduksi sampai 48 jam sesudah bunga mekar. Bunga jeruk mekar pagi hari pukul 09.00 hingga pukul 16.00. Sementara itu kepal putik sudah matang/reseptif sebelum bunga mekar, sedangkan bunga jantan matang beberapa jam sesudah bunga mekar. Degan demikian kemungkinan terjadinya penyerbukan sendiri cukup besar. Persentase bunga jadi buah setiap jenis berbeda, Washington Navel Orange (WNO) paling sedikit, yaitu 0.04%, Valencia 1.5%, sedangkan limau tertinggi dapat mencapai 6.5%. Melihat kecilnya persentase fruit set buah jeruk, peran serangga penyerbuk sangat penting, terutama dalam mengatasi masalah inkompatibel sendiri (Ashari, 1995).
A
B
Gambar 1. (a) buah, dan (b) tanaman jeruk siam Pontianak. Salah satu masalah utama bagi perbenihan jeruk adalah adanya sifat poliembrioni pada benih jeruk, yaitu benih mempunyai embrio lebih dari satu. Embrio yang dihasilkan dapat berupa embrio zigotik dan nucellar. Embrio zigotik berasal dari peleburan pollen dan ovum, sedangkan embrio nucellar merupakan hasil perkembangan dari sel nuselus tanaman induk (Herdiyanto et al., 2008).
7
Budidaya Jeruk Siam Pontianak Tanaman jeruk bisa berbuah di daerah-daerah basah, setelah periode kering singkat. Tanaman membentuk tunas-tunas baru dengan bunga. Jeruk siam Pontianak berbunga pada bulan Oktober-November, dan musim berbuahnya pada bulan Juni-Agustus (Sarwono, 1994). Iklim yang cocok untuk penanaman jeruk siam adalah iklim tipe B dan C, berdasarkan penggolongan Smith dan Ferguson. Idealnya pada iklim ini curah hujan optimal sekitar 1 500 mm/tahun. Di samping itu, jeruk siam memerlukan banyak sinar matahari. Jenis jeruk ini memberikan hasil yang optimum di daerah kering dengan pengaturan air (irigasi) yang baik (Pracaya, 2002). Bibit jeruk yang biasa ditanam berasal dari perbanyakan vegetatif berupa penyambungan tunas pucuk. Bibit yang baik adalah yang bebas penyakit, mirip dengan induknya (true to type), subur, berdiameter batang 2-3 cm, permukaan batang halus, akar serabut banyak, akar tunggang berukuran sedang dan memiliki sertifikasi penangkaran bibit (Pracaya, 2002). Jarak tanam yang digunakan bervariasi dari satu lokasi yang lainnya. Kebun jeruk di dataran rendah (lahan basah) jarak tanamnya relatif lebih jarang dibanding kebun jeruk di dataran tinggi, karena 40% dari lahan basah terpakai untuk keperluan pembuatan drainase dan pembuatan jalan. Di pulau Jawa biasa digunakan jarak tanam 7 x 7 meter atau 8 x 8 meter. Tetapi jarak tanam yang dianjurkan untuk jeruk siam adalah 6 x 6 meter. Jarak tanam yang lebih besar umumnya tidak memberi pengaruh terhadap tanaman kecuali rendahnya populasi tanaman per hektarnya. Sebelum penanaman, lubang tanam yang sudah dibuat diisi dengan pupuk kandang/kompos yang dicampur tanah lapisan atas (Sarwono, 1994). Tanaman jeruk baru menghasilkan buah setelah berumur 3 - 4 tahun dan puncak produksi pada umur tahun ke 8-9. Pembersihan atau penyiangan paling tidak harus dilakukan dua kali dalam satu tahun, diantaranya satu kali bersamaan dengan pemupukan, lainnya menjelang panen. Dengan penyiangan yang baik diharapkan pupuk yang diberikan efektif termanfaatkan untuk pohon jeruk. Pemangkasan pohon ditujukan pada dahan dan ranting kering. Pemupukan juga dikerjakan secara intensif. Untuk tanaman umur setahun, diberi pemupukan N dan
8
P (Urea dan TSP) sebanyak 2 kali. Untuk tanaman berumur 2 tahun diberi 3-4 kali pemupukan dengan jenis yang sama (Pracaya, 2002). Hama yang banyak menyerang tanaman jeruk ini adalah Avid citricidus dan kutu daun. Tapi serangga ini bisa dibasmi dengan mempergunakan insektisida. Sedang penyakit yang sering muncul adalah penyakit cendawan Phitophthora, tapi bisa diatasi dengan penyemprotan fungisida BB (Bubur Bordo 2 %) (Sarwono, 1994). Embriogenesis Somatik pada Jeruk Regenerasi tanaman dapat dilakukan melalui dua cara, yaitu organogenesis (melalui pembentukan organ langsung dari eksplan) dan embriogenesis somatik (melalui pembentukan embrio somatik). Dibandingkan dengan embriogenesis, organogenesis mempunyai keunggulan, yaitu peluang terjadinya mutasi lebih kecil, metodenya lebih mudah, dan tidak memerlukan subkultur berulang sehingga tidak menurunkan daya regenerasi dari kalus. Namun demikian, untuk keperluan pemuliaan tanaman, embriogenesis lebih dianjurkan karena tanaman yang diperoleh berasal dari satu sel somatik sehingga peluang terjadinya khimera lebih rendah (Gray, 2005). Menurut Husni (2010) sifat ini menguntungkan untuk manipulasi genetik secara in vitro karena perubahan genetik yang terjadi akibat mutasi, transformasi genetik melalui fusi protoplas dan rekayasa genetik pada satu sel akan menghasilkan mutan atau hibrida dengan utuh tanpa adanya khimera. Selain itu embrio somatik primer (massa proembrio) yang diperoleh dapat dilipatgandakan dengan cepat menjadi embrio sekunder sehingga memungkinkan dilakukannya manipulasi in vitro tanpa dibatasi oleh ketersediaan material eksplan. Menurut Gray (2005) embrio somatik biasanya berasal dari sel tunggal yang kompeten dan berkembang membentuk fase globular, hati, torpedo dan akhirnya menjadi embrio somatik dewasa yang siap dikecambahkan membentuk planlet. Tahapan akhir dan yang paling kritis ialah saat terjadinya tanaman baru yang berasal dari individu sel. Dalam hal ini, tanaman baru dapat dihasilkan dari sel-sel kalus atau suspensi sel tunggal. Teknologi untuk menghasilkan regenerasi merupakan masalah yang penting. Keseimbangan unsur-unsur kimia dan hormon
9
haruslah tepat agar dapat menstimulasi diferensiasi bagian-bagian tanaman yang berasal dari sel-sel totipoten. Kebanyakan dalam diferensiasi ini hanya diperoleh salah satu bagian tanaman, bagian akar, atau bagian tunas. Setiap bagian tanaman membutuhkan kondisi tertentu agar dapat beregenerasi (Welsh, 1991). Pada jeruk siam (simadu dan Pontianak), induksi kalus embriogenik (putih-hijau bergranul dengan permukaan mengkilat) dapat diperoleh dari eksplan nuselus yang diisolasi dari buah muda yang berumur 30-90 hari setelah antesis yang ditanam pada medium MW + BA 3 mg/l + EM 500 mg/l + sukrosa 3%. Proses pendewasaan kalus embriogenik dilakukan pada media MW + EM 500 mg/l dengan penambahan ABA. Untuk tahap perkecambahan sehingga menghasilkan bibit somatik (planlet) dilakukan dengan penambahan GA3 pada konsentrasi 0.5 mg/l (Husni et al., 2010). Buah Jeruk Tanpa Biji Tanpa biji (seedless) adalah karakter utama pada buah yang dikonsumsi segar dan penting untuk industri minuman karena biji pada buah dapat memberikan aroma yang tidak sedap dan rasa pahit (bitterness). Pemuliaan buah khususnya jeruk pada saat ini terkonsentrasi untuk mengembangkan kultivar unggul baru jeruk yang tanpa biji (Ollitrault et al., 2007). Mutagenesis merupakan cara yang efisien untuk mengembangkan buah tanpa biji karena sterilitas adalah salah satu efek dari perlakuan mutagen yang sering terjadi (Ollitrault et al., 2007). Hensz (1971) dalam Olitrault et al. (2007) mengembangkan ‘Star Ruby’ grapefuit tanpa biji menggunakan iradiasi pada benih
dengan
menggunakan
termal
neutrón.
Setelah
Hensz
sukses
mengembangkan kultivar tanpa biji menggunakan iradiasi, metode ini kemudian digunakan pada berbagai kultivar yang perbanyakannya menggunakan biji. Hearn (1984) menghasilkan ‘Pineapple’ orange dan ‘Duncan’ grapefruit tanpa biji dengan mutagen sinar gamma pada benih. Hearn juga berhasil mengembangkan ‘Foster’ grapefruit menggunakan iradiasi mata tunas dengan menggunakan sinar gamma. Chen et al. (1991) dalam Ollitrault et al. (2007) menggunakan iradiasi sinar gamma pada ‘Jin Cheng’ orange dan terjadi aberasi kromosom. Di Afrika Selatan, upaya mengembangkan kultivar jeruk tanpa biji juga sudah dilakukan
10
menggunakan mutagen sinar gamma pada eksplan mata tunas (Ollitrault et al., 2007). Varietas komersial penting pada jeruk seperti Washington Navel Orange (WNO), Marsh Grapefruit, Shamouti Orange, dan Salustiana Orange merupakan hasil dari pemuliaan mutasi. Sutarto et al. (2009) melaporkan jeruk tanpa biji didapatkan pada jeruk mandarin ( Citrus reticulata L. Blanco) cv. SoE dan pumello (Citrus grandis L. Osbeck) cv. Nambangan pada dosis 20 dan 40 Gy dengan menggunakan eksplan bud wood. Iradiasi sinar gamma menginduksi karakter buah seperti sifat tanpa biji, warna kulit, warna daging buah, dan ketebalan endocarp. Teknik mutasi induksi seperti mutagen fisik atau kimia adalah cara terbaik untuk meningkatkan keragaman spesies tanaman karena mutasi alami frekuensi terjadinya sangat rendah. Teknik mutasi sangat berkontribusi pada pemuliaan tanaman dan telah banyak menghasilkan varietas yang produktivitasnya tinggi dan memiliki nilai ekonomi. Verietas baru jeruk umumnya muncul dari hasil perpindahan benih antar lokasi dan mutasi mata tunas. Hanya sedikit varietas baru yang diperoleh dari program pemuliaan (Martasari et al., 2004). Spesies jeruk mempunyai heterozigositas yang tinggi, kebanyakan sifatnya adalah poligenik yaitu dikontrol oleh banyak gen. Probabilitas gen-gen yang berekombinasi pada hibrida untuk menyusun kembali karakter-karakter penting dari varietas tradisional terdahulu sangat rendah. Pemuliaan jeruk dihambat dengan tingginya juvenilitas pada bibit nuselar dan zigot. Berbagai kesulitan yang muncul dari penyerbukan silang konvensional untuk perakitan varietas baru sebagian dapat diatasi dengan strategi baru program pumuliaan jeruk melalui iradiasi, fusi protoplas, dan produksi tanaman jeruk transgenik (Martasari et al. 2004). Induksi Mutasi pada Kultur Jaringan Pada dasarnya evolusi tanaman terjadi karena mutasi yang terus menerus di alam. Oleh karena itu banyak yang beranggapan bahwa keragaman yang ada sekarang terutama disebabkan oleh mutasi (Lubis, 2005). Mutasi adalah perubahan pada materi genetik suatu organisme yang terjadi secara tiba-tiba, acak, dan merupakan dasar bagi sumber variasi yang bersifat terwariskan (heritable).
11
Mutasi dapat terjadi secara spontan (spontaneous mutation) dan dapat juga terjadi melalui induksi (induced mutation). Secara mendasar tidak terdapat perbedaan antara mutasi yang terjadi secara alami dan mutasi hasil induksi. Keduanya dapat menimbulkan variasi genetik untuk dijadikan dasar seleksi tanaman, baik seleksi secara alami (evolusi) maupun seleksi buatan (pemuliaan) (BATAN, 2005). Menurut Crowder (2006) mutasi adalah suatu proses dimana suatu gen mengalami perubahan struktur. Dalam arti luas, mutasi dihasilkan dari segala macam tipe perubahan bahan genetik yang mengakibatkan perubahan penampakan fenotipe yang diturunkan yang bukan dihasilkan dari proses seksual. Batasan ini termasuk keragaman kromosom dan position effect maupun mutasi gen. Banyak tanaman yang ditumbuhkan dengan teknik kultur jaringan tidak sama dengan tipe tetuanya. Perbedaan ini merupakan kejadian umum yang berhubungan dengan kultur jaringan dari sel-sel tunggal, yang disebut keragaman somaklonal. Tanaman regeneran memperlihatkan perbedaan-perbedaan morfologi, ketahanan penyakit dan sistem enzimnya. Teknik kultur jaringan telah digunakan untuk mengembangkan tanaman tebu dan kentang yang tahan terhadap penyakit. Tanaman-tanaman ini tidak selalu memiliki daya produksi lebih tinggi dibandingkan varietas komersial, tetapi dapat digunakan sebagai tetua dalam suatu program pemuliaan (Crowder, 2006). Kombinasi antara teknik kultur jaringan dengan induksi mutasi dengan sinar gamma dapat menghasilkan keragaman genetik yang lebih tinggi daripada tanaman yang tumbuh dari biji. Sistem kultur itu sendiri sering menyebabkan perubahan-perubahan nukleotida yang disebabkan karena zat yang terkandung dalam medium tersebut, seperti giberelin, auksin, garam mineral, dan sebagainya (Crowder, 2006). Mutasi merupakan salah satu metode pemuliaan untuk meningkatkan keragaman genetik tanaman. Dosis iradiasi yang diberikan untuk mendapatkan mutan tergantung pada jenis tanaman, fase tumbuh, ukuran, kekerasan, dan bahan yang akan dimutasi (Soedjono, 2003). Tabel 2 menunjukkan kelebihan dan kekurangan penggunaan berbagai jenis jaringan yang digunakan bahan yang akan dimutasi. Kecepatan mutasi bervariasi sesuai dengan dosis mutagen. Makin tinggi
12
dosis mutagen, makin sering terjadi mutasi dan makin sering terjadi kerusakan gen yang tidak diharapkan (Welsh, 1991).
Tabel 2. Kelebihan dan kekurangan penggunaan berbagai jenis jaringan yang digunakan untuk mutasi (Roose dan Williams, 2007). Jaringan target
Polen Benih Kalus embriogenik Ruas batang Mata tunas
Kemudahan untuk digunakan Baik Baik Sulit Sulit Baik
Waktu untuk mengevaluasi Lama Lama Lama Lebih pendek Lebih pendek
Peluang Mengidentifikasi terjadinya mutant khimera Tidak ada Sulit Rendah Beragam Rendah Mudah Tinggi Mudah Tinggi Mudah
Keberhasilan radiasi untuk meningkatkan keragaman populasi sangat ditentukan oleh radiosensitivitas genotipe yang diradiasi. Radiosensitivitas dapat diukur berdasarkan nilai LD50 (lethal dose 50%) yaitu dosis yang menyebabkan kematian 50% populasi bahan tanaman (Herison et al; 2008). Menurut Sutarto et al. (2009) radiosensitivitas pada jeruk berkisar pada 40-100 Gy, tergantung pada spesies dan varietas yang digunakan. Kosmiatin et al. (2010) melaporkan kalus embriogenik jeruk batang bawah (JC) yang diiradiasi sinar gamma dengan dosis 0-30 Gy menunjukkan sensitivitas yang tinggi pada dosis 30 Gy. Mutagen Sinar Gamma Mutagen dapat dikelompokkan menjadi mutagen fisik dan kimia. Mutagen kimia yang sering digunakan yakni ethylenscimine (EL), diethylsulphate (DES), ethylmethane sulphonate (EMS), ethyl nitroso urea (ENH), dan methyl nitroso urea (MNH) serta kelompok azida. Mutagen fisik yang sering digunakan adalah sinar-X, gamma (Co60), netron cepat (Nf), dan thermal neutron (Nth) (Soedjono, 2003). Saat ini mutagen yang paling banyak digunakan adalah sinar gamma. Sinar gamma ditemukan tahun 1900 oleh Paul Ulrich Villard yang dapat menyebabkan ketidakstabilan inti sel. Panjang gelombang sinar gamma lebih pendek dan energy per photon lebih besar dari pada sinar-X, sehingga potensial untuk merubah susunan genetik tanaman (Van Harten, 1998). Menurut Roose dan William (2007)
13
iradiasi menggunakan sinar ultra violet (UV) dapat digunakan, walaupun kemampuan penetrasi ke dalam jaringan lebih rendah bila dibandingkan dengan radiasi pengion sinar-X dan sinar gamma. Menurut Crowder (1996) sinar gamma yang dipancarkan dari isotop radioaktif mempunyai panjang gelombang lebih pendek dari sinar X, daya tembusnya lebih kuat, dikenal sebagai sinar kuat, penting untuk menginduksi perubahan genetik. Faktor yang mempengaruhi terbentuknya mutan antara lain adalah besarnya dosis iradiasi. Dosis iradiasi diukur dalam satuan Gray (Gy), 1 Gy sama dengan 0.10 krad yakni 1 J energy per kilogram iradiasi yang dihasilkan. Dosis iradiasi dibagi tiga, yaitu tinggi (>10 k Gy), sedang (1-10 k Gy), dan rendah (< 1 k Gy). Perlakuan dosis tinggi akan mematikan bahan yang dimutasi atau mengakibatkan sterilitas. Dosis iradiasi yang diberikan untuk mendapatkan mutan tergantung pada jenis tanaman, fase tumbuh, ukuran, kekerasan, dan bahan yang akan dimutasi (Soedjono, 2003).
BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian dilaksanakan dari bulan Januari sampai November 2010. Iradiasi sinar gamma dilakukan di Pusat Penelitian dan Pengembangan Teknologi Isotop dan Radiasi, Badan Tenaga Nuklir Nasional (BATAN), Pasar Jumat, Jakarta. Kultur in vitro dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan Kelompok Peneliti Biologi Sel dan Jaringan, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Bogor. Analisis stomata dilakukan di Laboratorium Mikro Teknik, Departemen Agronomi dan Hortikultura, IPB. Bahan dan Alat Eksplan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kalus embriogenik jeruk siam steril yang berasal dari nuselus muda jeruk siam pontianak yang telah tersedia di Laboratorum. Media dasar yang digunakan adalah media MW (Morel dan Wetmore, 1961). Zat pengatur tumbuh dan vitamin yang menjadi perlakuan dalam penelitian ini adalah ABA dan biotin. Bahan lain yang digunakan meliputi ekstrak malt, alkohol, aquades, spirtus, dan agar-agar. Alat yang digunakan antara lain Irradiator Gamma Chamber 4000 A, otoklaf, laminar air flow cabinet, Erlenmeyer, labu takar, pipet, pH meter, stirrer, timbangan analitik, cawan petri, pinset, sudip, gunting, bunsen, botol kultur, dan alumunium foil. Metode Percobaan Penelitian ini terdiri dari empat percobaan yaitu: 1. Proliferasi Kalus Embriogenik Hasil Iradiasi Rancangan percobaan yang digunakan yaitu Rancangan Acak Lengkap (RAL) dua faktor yaitu dosis iradiasi sebagai faktor pertama dengan dosis 0, 10, 20, 30, dan 40 Gy dan konsentrasi biotin sebagai faktor kedua dengan konsentrasi
15
0.05, 0.10, 0.15, 0.20, dan 0.25 mg/l. Setiap perlakuan diulang sebanyak 10 kali sehingga terdapat 250 satuan percobaan. Yijk = μ + αi + βj + (αβ)ij + ε ijk Keterangan: Yijk
= respon pengamatan pengaruh dosis radiasi ke-i, konsentrasi biotin ke-j, dan ulangan ke-k
μ
= rataan umum
αj
= nilai tambah pengaruh dosis radiasi ke-i
βk
= nilai tambah pengaruh konsentrasi biotin ke-j
(αβ)ij
= nilai tambah pengaruh interaksi dosis radiasi ke-i dengan konsentrasi biotin ke-j
εijk
= galat percobaan
2. Pendewasaan Embrio Somatik Percobaan ini adalah percobaan RAL faktorial dengan 2 faktor. Dosis iradiasi sinar gamma sebagai faktor pertama dan konsentrasi ABA sebagai faktor kedua dan diulang sebanyak 10 kali sehingga terdapat 250 satuan percobaan. Percobaan ini dilakukan dengan tujuan untuk menentukan konsentrasi ABA yang tepat untuk mendewasakan embrio somatik. Setiap populasi kalus yang telah diperbanyak kemudian disubkultur ke dalam media pendewasaan embrio somatik yaitu media MW dengan penambahan 1, 1.5, 2, dan 2.5 mg/l ABA dan pada media MW + 500 mg/l EM dengan penambahan 0, 1, 1.5, 2, dan 2.5 mg/l ABA selama 4 minggu untuk mendewasakan embrio somatik (pre-embrio dan globular) menjadi fase hati, torpedo, dan kotiledon. Yijk = μ + αi + βj + (αβ)ij + ε ijk Keterangan: Yijk
= respon pengamatan pengaruh dosis radiasi ke-i, konsentrasi ABA ke-j, dan ulangan ke-k
μ
= rataan umum
αj
= nilai tambah pengaruh dosis radiasi ke-i
βk
= nilai tambah pengaruh konsentrasi ABA ke-j
16
(αβ)ij
= nilai tambah pengaruh interaksi dosis radiasi ke-i dengan konsentrasi ABA ke-j
εijk
= galat percobaan
3. Perkecambahan Embrio Somatik Rancangan yang digunakan pada percobaan ini yaitu Rancangan Acak Lengkap faktor tunggal. Perbedaan dosis iradiasi digunakan sebagai perlakuan dan diulang sebanyak 10 kali. Percobaan ini bertujuan untuk mengecambahkan embrio somatik dewasa menjadi individu baru tanaman yang lengkap, mempunyai daun dan akar (bibit somatik) atau biasa disebut dengan planlet. Embrio somatik yang berada pada tahap kotiledon, selanjutnya dilakukan subkultur ke dalam media MW + 500 mg/l EM + 0.5 mg/l GA3 untuk perkecambahan. Yij = μ + αi + ε ij Keterangan: Yij
= respon pengamatan pengaruh dosis radiasi ke-i, dan kelompok ke-j
μ
= rataan umum
αj
= nilai tambah pengaruh dosis radiasi ke-i
εij
= galat percobaan
4. Pertumbuhan Regeneran Mutan Rancangan yang digunakan pada percobaan ini yaitu Rancangan Acak Lengkap faktor tunggal. Regeneran mutan terseleksi digunakan sebagai perlakuan. Benih embrio somatik (planlet) yang diperoleh dalam media perkecambahan kemudian disubkultur kedalam media MW + 500 mg/l EM untuk pemanjangan dan pembesaran tunas selama 4 MST. Yij = μ + αi + ε ij Keterangan: Yij
= respon pengamatan pengaruh regeneran mutan ke-i, dan ulangan ke-j
μ
= rataan umum
αj
= nilai tambah pengaruh regeneran mutan ke-i
17
εij
= galat percobaan
Pelaksanaan Persiapan Peralatan dan Pembuatan Media Sebelum digunakan, botol kultur yang akan diisi media dan peralatan tanam in vitro dicuci dengan detergen, kemudian disterilkan dalam otoklaf pada tekanan 17.5 psi dan suhu 121o C selama satu jam. Botol bekas kultur sebelumnya yang terkontaminasi, terlebih dahulu disterilkan dalam otoklaf sebelum dicuci dengan detergen. Laminar air flow cabinet dinyalakan satu jam sebelum digunakan dengan blower dalam keadaan hidup. Penyemprotan alkohol 70% pada bagian dalam laminar dilakukan agar kesterilan laminar lebih terjamin. Setiap satu liter media dibuat dengan cara mencampurkan larutan stok dengan jumlah volume tertentu seperti yang tercantum dalam Tabel Lampiran 1. Gula pasir sebanyak 30 g ditambahkan pada campuran larutan stok. Aquades ditambahkan sampai volume campuran mencapai 1 liter. Pengadukan dilakukan dengan magnetic stirrer, dan pH campuran ditera agar mencapai nilai 5,8 dengan menambahkan HCl 1 N atau KOH 1 N. Selanjutnya ke dalam campuran ditambahkan 2.5 mg phytagel sebagai pemadat. Campuran dimasak dan terus diaduk sampai mendidih. Setiap satu liter media dibuat untuk 40 botol. Alumunium foil penutup botol diberi kode, kemudian media disterilisasi dalam autoclave selama 20 menit. Media yang telah disterilisasi disimpan di ruang media pada suhu 16o C. Tahap I: Perbanyakan Kalus Embriogenik Kalus jeruk siam Pontianak steril yang berumur 1 bulan diperbanyak dalam media MW + 500 mg/l EM. Penanaman dilakukan pada laminar air flow cabinet. Untuk menghindari kontaminasi, bagian dalam laminar disemprot dengan alkohol 70% sebelum digunakan. Semua alat dan bahan yang akan digunakan dalam penanaman juga disemprot dengan alkohol 70% sebelum dimasukkan ke dalam laminar. Alat yang digunakan untuk penanaman yaitu pinset dan cawan petri yang telah disterilisasi, pada saat akan digunakan untuk penanaman alat-alat
18
yang digunakan dicelupkan ke dalam alkohol 96% kemudian dibakar pada api bunsen selama kurang lebih satu menit, sedangkan cawan petri cukup dibakar sebentar agar kesterilannya lebih terjamin. Hal yang sama dilakukan beberapa kali saat menanam. Penanaman dimulai dengan mengeluarkan bahan tanaman dari dalam botol menggunakan pinset yang telah dingin, kemudian dimasukkan ke dalam botol yang baru. Setiap botol kultur diisi 5 gerombol kalus embriogenik dengan ukuran 0.15 – 0.20 cm. Botol ditutup kembali menggunakan alumunium foil. Kode perlakuan dan tanggal tanam ditulis pada tutup botol. Semua kalus dalam botol diinkubasi di ruang kultur selama 4 minggu dengan suhu 16o C, kelembaban udara 60%, dan penyinaran selama 16 jam per hari dengan intensitas cahaya 1000 lux. Tahap II: Iradiasi Sinar Gamma pada Kalus Embriogenik Kalus jeruk hasil perbanyakan yang telah berumur 4 MST diberi perlakuan iradiasi sinar gamma di Pusat Penelitian dan Pengembangan Teknologi Isotop dan Radiasi Badan Tenaga Nuklir Nasional, Pasar Jumat, Jakarta menggunakan Irradiator Gamma Chamber 4000 A. Radiasi sinar gamma irradiator tersebut bersumber dari 60Co. Botol dalam keadaan tertutup dimasukkan ke dalam tabung irradiator. Setelah tabung ditutup, irradiator diaktifkan sehingga kalus dalam botol terkena radiasi sinar gamma dari
60
Co yang berada pada bagian dasar
irradiator. Dosis iradiasi 0, 10, 20, 30, dan 40 Gy. Laju dosis iradiasi pada saat perlakuan adalah 0.96481 kgray/jam (96.481 krad/jam). Lama iradiasi untuk setiap dosis iradiasi disesuaikan dengan laju dosis yang digunakan. Pada saat iradiasi dilakukan, kalus jeruk yang mendapatkan dosis iradiasi 0 Gy sebagai kontrol tidak diiradiasi dan tetap disimpan di ruang kultur. Tahap III: Regenerasi Kalus Embriogenik yang Telah Diiradiasi Kalus embriogenik yang telah diiradiasi kemudian diregenerasikan melalui jalur embriogenesis somatik. Tahapan embriogenesis somatik pada penelitian ini yaitu proliferasi, pendewasaan, dan perkecambahan embrio somatik, serta pertumbuhan regeneran mutan.
19
Proliferasi kalus embriogenik Setelah diiradiasi, semua kalus disubkultur termasuk kalus perlakuan dan kontrol disubkultur pada media proliferasi kalus embriogenik yaitu MW + 500 mg/l EM dengan penambahan 0.50, 0.10, 0.15, 0.20, 0.25 mg/l biotin selama empat minggu. Prosedur penanaman sama dengan prosedur penanaman saat perbanyakan bahan tanaman. Pada penutup botol dituliskan kode perlakuan dan tanggal tanam.
Pendewasaan embrio somatik Kalus embriogenik yang telah membentuk sturuktur embrio somatik primer (PEM dan fase gloubular) disubkultur ke media pendewasaan embrio somatik yaitu media MW dengan penambahan 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 mg/l ABA dan media MW + 500 mg/l EM dengan penambahan 0.0, 1.0, 1.5, 2.0, dan 2.5 mg/l ABA selama 4 minggu. Prosedur penanaman sama dengan prosedur penanaman saat perbanyakan bahan tanam. Pada penutup botol dituliskan kode perlakuan dan tanggal tanam.
Perkecambahan embrio somatik Embrio somatik yang telah dewasa (fase hati, fase torpedo, dan fase kotiledon) kemudian dipindahkan ke media perkecambahan yaitu MW + 500 mg/l EM + 0.5 mg/l GA3 selama 4 minggu. Setiap botol terdiri dari 5 embrio somatik dewasa. Prosedur penanaman sama dengan prosedur penanaman saat perbanyakan bahan tanam. Pada penutup botol dituliskan kode perlakuan dan tanggal tanam.
Pertumbuhan regeneran mutan Embrio somatik yang telah berkecambah menjadi individu yang lengkap kemudian dipotong batangnya lalu ditanam pada media MW + 500 mg/l EM selama 4 minggu. Setiap botol terdiri dari satu regeneran mutan (planlet). Planlet yang telah disubkultur dipindahkan ke ruang kultur dengan suhu 16o C.
20
Tahap IV: Evaluasi Keragaman Genetik Pengujian Keragaman Genetik Mutan Terseleksi dengan Menggunakan Penanda Morfologi Data karakter morfologi terhadap jumlah daun, bentuk daun, kedudukan daun, dan warna daun diubah menjadi data biner dengan skoring data berdasarkan kriteria-kriteria yang sudah ditetapkan pada setiap variabel. Bila ada nilai pada kriteria tersebut diskor “1” atau tidak ada nilai diskor “0”. Berdasarkan pada keragaman morfologi yang muncul, selanjutnya dihitung matrik kesamaan antar galur mutan yang dihitung berdasarkan Dice algoritme yang terdapat dalam paket program NTSYSpc (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System) versus 2.02 (Rohlf, 1998).
Analisis Stomata Pengamatan stomata dilakukan di akhir pengamatan, yaitu pada 4 MST. Stomata diamati dengan menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 400 kali. Luas bidang pandang mikroskop pada perbesaran 400 kali adalah 0.28 mm2. Penghitungan jumlah stomata dilakukan pada satu bidang pandang di dalam satu preparat. Rata-rata jumlah stomata setiap perlakuan merupakan hasil rata-rata jumlah stomata/bidang pandang dari 7 daun, kemudian hasilnya dikonversi menjadi jumlah stomata/ mm2. Ukuran stomata diukur berdasarkan panjang dan lebar stomata. Setiap preparat daun jeruk siam diukur satu stomata. Ukuran stomata setiap perlakuan merupakan hasil rata-rata dari 15 stomata yang dipilih secara acak. Selain itu diamati juga jumlah kloroplas di dalam sel penjaga. Setiap daun mutan diamati 5 stomata untuk dihitung jumlah kloroplas di dalam sel penjaganya. Pengamatan Pengamatan dilakukan setiap minggu dengan peubah yang diamati yaitu : 1. Percobaan Proliferasi Embrio Somatik Hasil Iradiasi
21
-
Luas Kalus, pengukuran luas kalus dilakukan pada 2 dan 4 MST. Pengukuran luas dilakukan dengan cara menghitung panjang dan lebar kalus dari bawah botol kultur menggunakan penggaris.
-
Warna Kalus, diamati secara visual
2. Percobaan Pendewasaan Embrio Somatik -
Jumlah Embrio Somatik, menghitung jumlah embrio somatik (fase globular, fase hati, fase torpedo, dan fase kotiledon) yang tumbuh setelah 4 MST.
Penghitungan
dilakukan
di
dalam
laminar
dengan
cara
mengeluarkan embrio dari botol kultur lalu dipindahkan ke dalam cawan petri. 3. Percobaan Perkecambahan Embrio Somatik -
Jumlah benih somatik (planlet) yang dihasilkan.
4. Pertumbuhan Regeneran Mutan -
Tinggi planlet (cm), pengukuran planlet dilakukan setelah 4 MST pada media pembesaran tunas (MW + 500 mg/l EM). Proses pengukuran menggunakan penggaris dengan cara menempelkan alat ukur ke dinding botol kultur yang dimulai dari pangkal batang hingga daun tertinggi dari planlet.
-
Jumlah daun, Jumlah daun yang tumbuh dihitung setelah 4 MST pada media pembesaran tunas (MW +500 mg/l EM). Perhitungan berdasarkan daun yang telah terbuka penuh yang muncul pertama kali.
-
Warna daun, secara visual Jumlah akar, Menghitung jumlah akar yang tumbuh setelah 4 MST pada media pembesaran tunas (MW + 500 mg/l EM).
-
Bentuk daun (normal, roset)
-
Bentuk ujung daun (lancip, membulat)
-
Jumlah
kloroplas
dan
stomata,
pengamatan
jumlah
kloroplas
menggunakan mikroskop cahaya dengan pembesaran 100x10 sedangkan pengamatan jumlah stomata menggunakan pembesaran 40x10. -
Ukuran stomata, panjang dan lebar stomata diukur menggunakan software DP2-BSW.
22
Tahap I Perbanyakan kalus embriogenik (MW + 500 mg/l EM)
Tahap II Iradiasi sinar gamma (0, 10, 20, 30, 40 Gy)
Tahap III Regenerasi ‐ Proliferasi embrio somatik (0.50, 0.10, 0.15, 0.20, 0.25 mg/l biotin) ‐ Pendewasaan embrio somatik (1.0, 1.5, 2.0, 2.5 mg/l ABA dan 0 dan500 mg/l EM) ‐ Perkecambahan embrio somatik (MW + 500 mg/l EM + 0.5 mg/l GA3) ‐ Pertumbuhan regeneran mutan (MW + 500 mg/l EM)
Tahap IV Evaluasi keragaman genetik ‐ Pengujian keragaman genetik berdasarkan analisis morfologi ‐ Analisis stomata Gambar 2. Diagram alir percobaan.
Analisis Data Data kuantitatif yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan uji tstudent dan uji F. Untuk membandingkan dua nilai tengah digunakan uji t-student sedangkan untuk membandingkan tiga nilai tengah atau lebih digunakan uji F. Perlakuan yang berpengaruh nyata dan sangat nyata pada uji F, diuji lanjut menggunakan DMRT (Duncan Multiple Range Test). Untuk mengetahui perlakuan yang menghasilkan keragaman paling tinggi, dilakukan uji keragaman fenotipik dari masing-masing perlakuan dosis radiasi. Keragaman fenotipik (σ2f) dihitung melalui perbandingan ragam fenotipik dengan standar deviasi ragam fenotipik (Sd σ2f) variabel yang diamati. Nilai ragam fenotipik dihitung menurut Steel & Torrie (1995) sebagai berikut:
23
σ2f Standar deviasi ragam fenotipik (Sd σ2f) dihitung berdasarkan rumus Anderson dan Brancoft (1952) dikutip Darajat (1987) sebagai berikut: Sd σ2f Kriteria penilaian terhadap luas atau sempit dihitung sebagai berikut (Darajat, 1987): Apabila σ2f > 2 Sd σ2f, berarti keragaman fenotipiknya luas Apabila σ2f < 2 Sd σ2f, berarti keragaman fenotipiknya sempit Data biner hasil pengamatan morfologi dilakukan analisis dengan menggunakan UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Aritmatic Means) dengan fungsi SIMQUAL menjadi dendogram dengan menggunakan program NTSYSpc 2.02 for windows (Rohlf, 1998). Hasil analisis tersebut dapat diketahui hubungan kekerabatan antara tanaman yang satu dengan yang lain berdasarkan jarak genetik.
HASIL DAN PEMBAHASAN Kondisi Umum Percobaan Kalus jeruk siam Pontianak yang dipergunakan dalam penelitian ini yaitu kalus yang telah tersedia di laboratorium Biologi Sel dan Jaringan, BB-Biogen. Kalus tersebut berasal dari nuselus yang diisolasi dari buah muda jeruk siam Pontianak yang telah berumur 30-90 hari setelah anthesis. Kalus merupakan sel kompeten yang belum terdiferensiasi. Kalus tersebut telah berumur 5 tahun sejak inisiasi dan dilakukan subkultur setiap satu bulan secara periodik untuk menjaga viabilitasnya. Untuk mendapatkan kalus embriogenik yang mengandung preembrio (PEM) dari jeruk siam dilakukan subkultur pada media MW + 500 mg/l EM (Ekstrak Malt) tanpa penambahan zat pengatur tumbuh. Media ini merupakan media yang sangat responsif terhadap pembentukan kalus embriogenik pada tanaman jeruk siam (Husni et al., 2010). Hasil subkultur kalus pada media yang sama setiap empat minggu diperoleh kalus embriogenik yang ditandai dengan banyaknya PEM pada populasi sel/kalus yang dihasilkan (Gambar 3). Kalus yang dihasilkan terlihat sangat embriogenik dengan warna kalus putih mengkilap walaupun media yang digunakan tidak mengandung zat pengatur tumbuh. Banyaknya jumlah PEM yang dihasilkan diduga disebabkan oleh kondisi kalus yang diperoleh pada tahap awal sangat juvenil dan viable.
A
B
Gambar 3. Kalus embriogenik hasil perbanyakan (a) penampakan kalus di botol kultur, dan (b) penampakan secara mikroskopik pada perbesaran 10 kali. Secara umum, pertumbuhan dan perkembangan eksplan setelah perlakuan iradiasi sinar gamma menunjukkan respon yang cukup baik. Hal ini ditunjukkan
25
dengan tidak terjadinya kematian akibat dosis iradiasi yang diberikan. Kondisi lingkungan di dalam ruang penyimpanan eksplan cukup terkontrol. Penyinaran menggunakan lampu neon 20 watt selama 24 jam sehari dengan intensitas ratarata 1900 lux. Suhu di dalam ruangan selalu dijaga pada kisaran 16-20o C. Namun demikian serangga seperti semut masih ada yang masuk ke dalam ruangan dan sering hinggap diatas botol eksplan, hal ini menyebabkan resiko kontaminasi yang dihadapi eksplan semakin tinggi akibat dari jamur dan bakteri yang dibawa oleh serangga dapat masuk ke dalam celah botol. Gambar 4 menunjukkan kondisi umum planlet di ruang kultur laboratorium Biologi Sel dan Jaringan BB-Biogen.
Gambar 4. Kondisi umum planlet di Laboratorium Kultur Jaringan Kelompok Peneliti Biologi Sel dan Jaringan, BB-Biogen. Kontaminasi merupakan gangguan utama yang terjadi pada eksplan yang ditanam secara in vitro.
Kontaminasi pada media mengganggu pertumbuhan
eksplan bahkan dapat menyebabkan kematian. Kontaminasi disebabkan oleh cendawan dan bakteri yang tumbuh di permukaan media atau disekeliling eksplan. Keberadaan cendawan ditandai dengan munculnya cendawan berwarna putih, hijau, dan hitam di permukaan media. Kontaminasi pada kultur jaringan dapat disebabkan oleh adanya kesalahan manusia pada saat penanaman seperti spora cendawan masuk ke dalam botol karena botol terlalu lama dibiarkan terbuka pada saat penanaman. Gambar 5 menunjukkan eksplan kalus yang terkontaminasi cendawan dan bakteri.
26
A
B
Gambar 5. Eksplan kalus jeruk siam Pontianak yang terkontaminasi (a) bakteri dan (b) cendawan. Pada saat regenerasi khususnya tahap pendewasaan dan perkecambahan embrio somatik ada beberapa embrio yang berkembang abnormal (Gambar 6) baik pada kontrol maupun yang diberi iradiasi. Embrio abnormal tersebut tidak membentuk salah satu fase perkembangan embrio somatik (fase globular, fase hati, fase torpedo, atau fase kotiledon) sehingga tidak mampu beregenerasi menjadi tanaman yang lengkap.
A
B
Gambar 6. Embrio somatik abnormal (a) kompak, (b) roset dan kompak.
1.
Proliferasi Kalus Embriogenik Hasil Iradiasi Kalus adalah kumpulan sel yang meristematik, karena berasal dari
jaringan embriogenik yang sel-selnya masih terus membelah pada sebagian besar kultur kalus. Meristematik menurut Hunault (1979) dalam George et al. (2008)
27
didefinisikan sebagai kelompok dari sel isodiametrik, yaitu sel dengan meristem atau jaringan yang berpotensi untuk pertumbuhan totipotensi. Jaringan meristem memungkinkan pertumbuhan organ tanaman, seperti tunas dan akar, ataupun seluruh atau sebagian tanaman lain. Embrio somatik mempunyai sifat bipolar, dimana pada satu bagian akan tumbuh tunas dan pada bagian lainnya tumbuh akar. Regenerasi kalus hasil iradiasi sinar gamma yang tepat sangat menentukan keberhasilan kalus beregenerasi menghasilkan tunas dalam jumlah yang banyak. Kalus embriogenik harus melalui beberapa tahapan sebelum beregenerasi menjadi tunas. Pada penelitian ini tahapan regenerasi yang dilalui yaitu
proliferasi
kalus
embriogenik
hasil
iradiasi,
pendewasaan
dan
perkecambahan embrio somatik, serta pertumbuhan regeneran mutan (planlet). Proliferasi kalus embriogenik bertujuan untuk meningkatkan jumlah embrio somatik primer (PEM dan globular) dan melihat pengaruh vitamin biotin yang digunakan sebagai perlakuan. Vitamin disintesa pada tanaman normal untuk kebutuhan pertumbuhan dan perkembangannya. Vitamin dibutuhkan oleh tanaman sebagai katalis dari berbagai macam proses metabolik. Pada saat sel dan jaringan ditumbuhkan secara in vitro, beberapa vitamin menjadi faktor pembatas untuk pertumbuhan sel. Biotin (vitamin H) digunakan dalam jumlah sedikit pada media kultur yang berkisar antara 0.01-1.0 mg/l (Bhojwani dan Razdan dalam ElShiaty, 2004). Hasil penelitian Al-Khayri dalam El-Shiaty (2004) menyatakan bahwa pertumbuhan kalus terbaik pada kelapa pada media MS dengan penambahan 0.5 mg/l thiamine dan 2.0 mg/l biotin. Hasil penelitian Badawy et al. (2009) pada kultur supensi phoenix dactylifera L. Cv. Sakkoty kalus embriogenik terbaik didapat dengan penambahan biotin dengan konsentrasi 2.5 mg/l. Hasil uji F menunjukkan konsentrasi biotin tidak memberikan pengaruh yang nyata terhadap perkembangan kalus. Berdasarkan rata-rata luas kalus tertinggi setelah 2 MST terdapat pada konsentrasi 0.15 mg/l biotin (Tabel 3) namun setelah 4 MST pertambahan luas kalus yang terbaik terdapat pada konsentrasi 0.05 mg/l biotin (Tabel 4). Menurut George (2008) pertumbuhan diawali dengan fase pembelahan sel secara lambat, fase pembelahan dan
28
proliferasi masa sel kalus secara cepat dan fase dimana proliferasi masa sel kalus bertahap menurun hingga pada akhirnya terjadi kematian pada sel kalus. Pengaruh iradiasi sinar gamma setelah 4 minggu dapat diamati dari perubahan warna dan pertumbuhan serta perkembangan kalus. Kalus yang mendapat perlakuan iradiasi sebagian besar kondisinya baik dan tidak menunjukkan gejala-gejala kerusakan. Kalus sebelum diiradiasi berwarna putih mengkilap dan remah (friable), namun setelah iradiasi beberapa individu sel mengalami perubahan warna seperti putih kekuningan dan kuning kecoklatan namun struktur kalus tetap remah. Pada dosis 10 Gy beberapa populasi kalus mengalami kecoklatan, namun setelah disubkultur selama 4 minggu terbentuk struktur kalus baru yang embriogenik. Berdasarkan hasil pengaruh iradiasi sinar gamma terhadap pertumbuhan dan perkembangan kalus diperoleh bahwa respon kalus terhadap iradiasi ada yang positif dan negatif. Hasil uji F pada taraf 5% berbeda nyata pada perlakuan dosis iradiasi. Dosis iradiasi pada 10, 20, dan 30 Gy dapat menghambat pertumbuhan dan perkembangan kalus. Pertumbuhan dan perkembangan kalus hasil perlakuan iradiasi 40 Gy pada 4 MST memberikan respon yang positif yang ditandai dengan kalus yang lebih luas dibandingkan dengan kontrol.
Tabel 3. Pengaruh dosis iradiasi dan konsentrasi biotin terhadap luas kalus jeruk siam Pontianak (cm2) pada 2 MST. Dosis iradiasi (Gy) 0 10 20 30 40 Rata-rata KK (%)
Biotin (mg/l) 0.05
0.1
0.15
0.49efg 0.70bcdefg 1.15a 0.37g 0.38g 0.52defg 0.54cdefg 0.61bcdefg 0.65bcdefg 0.89abcde 0.60cdefg 0.67bcdefg 0.96abc 0.88abcdef 0.67bcdefg 0.66 0.63 0.73 …………………… 57.67
0.2
0.25
0.77abcdefg 0.67bcdefg 0.45fg 0.42g 0.72bcdefg 0.73bcdefg 0.93abcd 0.45fg bcdefg 0.66 1.05ab 0.68 0.66 ………………….
Rata-rata 0.76ab 0.43c 0.66b 0.68b 0.86a
Keterangan: Angka yang diikuti oleh huruf yang berbeda berarti berbeda nyata berdasarkan uji DMRT dengan alfa 0,05
29
Tabel 4. Pengaruh dosis iradiasi dan konsentrasi biotin terhadap luas kalus jeruk siam Pontianak (cm2) pada 4 MST. Dosis iradiasi (Gy) 0 10 20 30 40 Rata-rata KK (%)
Biotin 0.05
0.1
0.15
0.76ghij 0.80ghij 2.26a 0.49ij 0.66ghij 0.59hij defghij cdefghi 0.96 1.12 1.17cdefghi 1.76abc 0.94efghij 1.66abcde 1.71abc 1.57abcdef 1.09cdefghij 1.20 1.05 1.17 …………………… 55.90
0.2
0.25
1.75abc 1.10cdefghij 0.57hij 0.38j cdefghi 1.22 1.38bcdefg 0.90fghij 1.67abcd 1.26cdefgh 1.98ab 1.14 1.30 ………………….
Rata-rata 1.36ab 0.54c 1.19b 1.17b 1.52a
Keterangan: Angka yang diikuti oleh huruf yang berbeda berarti berbeda nyata berdasarkan uji DMRT dengan alfa 0,05
Keragaman luas kalus embriogenik jeruk siam Pontianak yang dinyatakan oleh nilai koefisien keragaman (KK) yang tinggi dengan nilai 57.67% pada umur 2 MST dan 55.90% pada umur 4 MST.
Nilai KK lebih besar dari 30%
menunjukkan adanya keragaman yang tinggi (Gomez dan Gomez, 1995). Pada minggu ke empat setelah subkultur, sebagian embrio telah mencapai fase globular, yaitu pada perlakuan 0 Gy pada media MW + 500 mg/l EM. Interaksi antara dosis iradiasi sinar gamma dan konsentrasi biotin memberikan pengaruh yang sangat nyata terhadap perkembangan kalus jeruk siam Pontianak. Pertambahan luas kalus tertinggi pada umur 2 MST terdapat pada perlakuan 0 Gy*0.15 mg/l biotin namun tidak berbeda nyata dengan perlakuan 40 Gy*0.25 mg/l, 40 Gy*0.05 mg/l, 30 Gy*0.20 mg/l, 30 Gy*0.05 mg/l, 40 Gy*0.10 mg/l, dan 0 Gy*0.20 mg/l (Tabel 3). Pertambahan luas kalus tertinggi pada umur 4 MST terdapat pada perlakuan 0 Gy* 0.15 mg/l biotin namun tidak berbeda nyata dengan perlakuan 40 Gy*0.25 mg/l, 30 Gy*0.05 mg/l, 0 Gy*0.20 mg/l, 40 Gy*0.05 mg/l, 30 Gy*0.25 mg/l, 30 Gy*0.15 mg/l, 40 Gy*0.10 mg/l (Tabel 4). Perkembangan kalus embriogenik hasil iradiasi memiliki respon yang berbeda terhadap konsentrasi biotin yang diberikan, hal tersebut diduga disebabkan karena terjadinya mutasi pada kalus hasil iradiasi sehingga terjadi perubahan respon terhadap konsentrasi biotin yang diberikan pada media kultur. Bila dilihat dari luas kalus tanpa diberi iradiasi, respon kalus embriogenik terhadap konsentrasi biotin yang diberikan juga berbeda. Pertambahan luas kalus
30
tertinggi pada dosis iradias 0 Gy terdapat pada kalus dengan penambahan konsentrasi 0.15 mg/l biotin namun tidak berbeda nyata dengan konsentrasi 0.2 mg/l biotin baik pada umur 2 maupun 4 MST. Hasil ini sesuai dengan yang dilaporkan oleh El-Shiaty et al. (2004) yang menggunakan biotin dengan konsentrasi tinggi (5 mg/l) untuk meningkatkan inisiasi dan proliferasi kalus kelapa. 2.
Pendewasaan Embrio Somatik Untuk mendorong pertumbuhan dan perkembangan PEM dan globular
yang dihasilkan menjadi embrio somatik dewasa dilakukan pemindahan ke media MW dengan penambahan asam
absisik (ABA) untuk membantu proses
embriogenesis secara normal. Selain itu, ABA juga berfungsi sebagai pencegahan terhadap pertumbuhan prematur pada embrio. Husni et al. (2010) melaporkan bahwa semakin tinggi konsentrasi ABA yang terkandung dalam media kultur maka semakin banyak embrio somatik yang dewasa. Pada proses pendewasaan, embrio somatik berhenti berproliferasi, ukurannya meningkat, dan mulai mengakumulasi cadangan nutrisi seperti karbohidrat, protein dan lemak. Embrio dirangsang untuk menjadi dewasa dengan menggunakan asam absisik (ABA) dan meningkatkan potensial osmotik (Egerstsdotter, 1999). Menurut Renukdas et al. (2006) peningkatan efisiensi pendewasaan embrio somatik dapat dilakukan dengan penambahan etilen antagonis pada konsentrasi tinggi (10 µM) seperti spermidine, ABA, dan AgNO3. Media yang digunakan untuk pendewasaan sama dengan pada tahap proliferasi, namun dengan penambahan zat pengatur tumbuh seperti ABA, meningkatkan potensial osmotik, dan dalam beberapa kasus digunakan auksin dan/atau sitokinin. Sukrosa dan polyethylene glycol (PEG) biasanya digunakan untuk meningkatkan potensial osmotik (Egerstsdotter, 1999). Dosis ABA yang tinggi (0.5 mg/l) pada fase perkembangan embrio dapat mempercepat perkembangan embrio menjadi fase torpedo dan kotiledon. ABA juga dapat menginduksi embriogenesis somatik dan pendewasaan embrio somatik pada beberapa tanaman seperti wortel dan kelapa (Ghanati dan Ishka, 2009). Gambar 7 menunjukkan fase perkembangan
31
embrio somatik (fase globular, fase hati, fase torpedo, dan fase kotiledon) pada jeruk siam Pontianak Dari hasil penelitian yang dilakukan tidak terjadi pendewasaan pada embrio somatik yang diberi dosis 20, 30, dan 40 Gy pada setiap konsentrasi ABA baik pada media kultur yang diberi EM maupun yang tidak. Kemampuan kalus beregenerasi dipengaruhi oleh kondisi eksplan (kalus) dan komposisi media (George, 2008). Kondisi kalus pada saat diregenerasikan telah mengalami tekanan akibat iradiasi sinar gamma. Menurut Biswas dalam Sutjahjo et al. (2007) kalus yang mengalami tekanan seleksi yang lebih berat akan mengalami kerusakan fisiologi dan gangguan metabolisme. Hal inilah yang menyebabkan sulitnya beregenerasi pada kalus yang mengalami tekanan iradiasi pada dosis 20, 30, dan 40 Gy.
Sehubungan hal tersebut, embrio somatik
yang digunakan pada
percobaan selanjutnya hanya yang diberi perlakuan iradiasi sinar gamma pada dosis 0 dan 10 Gy. .
A
B
C
D
Gambar 7. Tahap pendewasaan embrio somatik jeruk siam Pontianak, (a) fase globular, (b) fase hati, (c) fase torpedo, (d) dan fase kotiledon. Berdasarkan hasil pendewasaan embrio somatik dengan penambahan ABA dalam media MW diperoleh bahwa hanya struktur embrio somatik primer (PEM dan globular) yang diiradiasi dengan dosis 10 Gy pada media dengan pengambahan 2.5 mg/l ABA yang dapat tumbuh dan berkembang menjadi embrio somatik dewasa (Tabel 6). Hal ini ditandai dengan adanya struktur torpedo dan kotiledon pada media tersebut. Untuk meningkatkan frekuensi pendewasaan embrio somatik tahap globular dilakukan penambahan dengan 500 mg/l Ekstrak Malt (EM) pada media
32
kultur. Penambahan EM pada media yang telah mengandung 2 mg/l dan 2.5 mg/l ABA dapat meningkatkan frekuensi pendewasaan menjadi lebih tinggi. Penambahan EM pada media yang telah mengandung 2 mg/l ABA menghasilkan embrio somatik dewasa sebanyak 6 embrio somatik (1 fase hati, 3 fase torpedo, dan 2 fase kotiledon) dan pada 2.5 mg/l ABA sebanyak 5 embrio somatik (1 fase torpedo, dan 4 fase kotiledon) dari dosis iradiasi 0 Gy. Sedangkan penambahan EM pada dosis iradiasi 10 Gy dengan media kultur yang telah mengandung 1.5 mg/l ABA menghasilkan 9 embrio somatik dewasa (7 fase hati, dan 2 fase torpedo). Hal ini menandakan bahwa proembrio yang diiradiasi memiliki respon yang berbeda bila dibandingkan dengan kontrol. Tabel 5. Pengaruh dosis radiasi dan konsentrasi ABA pada media pendewasaan embrio somatik (MW dan MW + 500 mg/l EM) setelah 4 MST Dosis Radiasi (Gray) 0
10
0
10
Konsentrasi (mg/l) ABA Ekstrak Malt 1 0 1.5 0 2 0 2.5 0 1 0 1.5 0 2 0 2.5 0 0 500 1 500 1.5 500 2 500 2.5 500 0 500 1 500 1.5 500 2 500 2.5 500
Globular
Hati
Torpedo
Kotiledon
8 6 12 16 8 13 24 22 4 3 11 19 23 0 3 12 15 9
1 7 -
1 3 1 1 2 -
4 2 4 -
Penambahan berbagai macam ekstrak organik pada media kultur sering memberikan respon pertumbuhan yang diinginkan. Bahan organik kompleks tersebut antara lain protein hidrolisat, air kelapa, ekstrak ragi, ekstrak malt, pisang, jus jeruk, dan jus tomat. Ekstrak malt mempunyai peran khusus dalam
33
kultur jeruk. Ekstrak malt merupakan sumber karbohidrat utama yang telah digunakan untuk menginisiasi embriogenesis pada jaringan nuselus oleh Rangan et al. dalam Thorpe (2008). Ekstrak malt diketahui mempunyai peran dalam multiplikasi embrio somatik pada Citrus sinensis (Das et al. dalam Thorpe, 2008), dan pada Citrus spp. yang lain (Jumin dalam Thorpe, 2008). Ekstrak malt juga meningkatkan efisiensi perkecambahan fase kotiledon pada sour orange (Carimi et al dalam Thorpe, 2008). Ekstrak malt biasa digunakan pada media kultur jeruk dengan konsentrasi 0.5 – 1 g/l (Thorpe, 2008). 3.
Perkecambahan Embrio Somatik Embrio
somatik
yang
telah
dewasa
(torpedo
dan
kotiledon)
dikecambahkan dalam media MW + 0.5 mg/l GA3. Media tersebut merupakan media terbaik untuk perkecambahan embrio somatik jeruk siam (Husni et al., 2010). Pengaruh dosis iradiasi terhadap perkecambahan embrio somatik mulai terlihat setelah 4MST (Tabel 7). Pada perlakuan yang tanpa diberi iradiasi mampu mengecambahkan embrio somatik lebih banyak (17 planlet) dibanding dengan yang diberi iradiasi (12 planlet). Hal ini diduga telah terjadi kerusakan jaringan yang ringan sehingga sel-sel masih sanggup melanjutkan pertumbuhannya dengan daya regenerasi yang berbeda dibanding dengan kontrol.
Tabel 6. Pengaruh dosis iradiasi terhadap perkecambahan embrio somatik pada 4 MST. Dosis Iradiasi (Gy) 0 10
Jumlah Planlet (Benih Somatik) 17 12
Penambahan GA3 ke dalam media kultur jaringan tanaman berfungsi untuk meningkatkan pertumbuhan kultur sel yang tingkat kepadatannya rendah, mempertinggi pertumbuhan kalus, dan untuk memperpanjang planlet yang mengalami perkecambahan (George et al., 2008). Menurut Wattimena (1988) GA3 berfungsi dalam pemanjangan batang dengan memacu sel-sel penyusun batang. GA3 dalam medium dapat memacu terbentuknya tunas melalui perannya
34
dalam pemecahan pati oleh enzim amylase serta mengaktifkan auksin pada ujung batang. Perkecambahan embrio somatik dapat distimulasi dengan menambahkan GA3 pada media kultur. Pada beberapa tanaman, GA3 dapat menginduksi tumbuhnya akar pada embrio somatik (Santalum album dan Panax ginseng), pada tanaman yang lain dapat menginduksi regenerasi tunas (George et al., 2008). Gambar 8 menunjukkan perkembangan embrio somatik jeruk siam Pontianak dari tahap pendewasaan hingga perkecambahan menjadi tanaman yang lengkap.
A
C
B
Gambar 8. Perkembangan embrio somatik, a) dan b) tahap pendewasaan, c) tahap perkecambahan embrio somatik jeruk siam Pontianak. 4.
Pertumbuhan Regeneran Mutan Regeneran yang mampu berkecambah selanjutnya disubkultur kedalam
media pembesaran tunas yaitu MW + 500 mg/l EM selama 4 minggu. Setelah 4 minggu regeneran mutan menunjukkan adanya perbedaan morfologi masingmasing individu pada karakter tinggi planlet (tinggi, sedang, pendek), jumlah daun, bentuk ujung daun (runcing, membulat, roset), bentuk daun (normal, roset), ketegapan tanaman (terkulai dan tegak), dan warna daun (hijau tua, hijau muda) akibat radiasi sinar gamma.
35
K-0/1
K-0/2
K-0/3
K-0/4
K-0/5
K-0/6
K-0/7
M-10/1
M-10/2
M-10/3
M-10/4
M-10/5
M-10/6
M-10/7
M-10/8
Gambar 9. Karakter morfologi regeneran mutan dalam media pembesaran ( MW + 500 mg/l EM). Sinar gamma banyak bersifat merusak namun dari hasil penelitian ini terdapat regeneran yang mampu tumbuh dan berkembang dengan baik. Terdapat 15 tanaman yang morfologi tunas dan daun mengalami perubahan (Gambar 9). Tanaman hasil perlakuan radiasi memperlihatkan respon yang berbeda-beda. Pengaruh yang ditampilkan bersifat individual, namun terdapat gambaran umum
36
perubahan terhadap beberapa peubah hasil perlakuan radiasi sinar gamma (Tabel 8). Dari hasil penelitian terdapat regeneran yang mampu tumbuh dan memiliki karakter agronomi yang diharapkan, yaitu tanaman tinggi, tegak, dan jumlah daun relatif banyak.
Tabel 7. Keragaman regeneran jeruk siam Pontianak secara in vitro hasil perlakuan sinar gamma. regeneran
Perubahan setelah 4 MST Tinggi Jumlah Jumlah Planlet Daun Akar
K-0/1
0.1
1
1
K-0/2
0
0
0
K-0/3
0
8
0
K-0/4
0
5
0
K-0/5
0
1
0
K-0/6
0.1
0
0
K-0/7
0
4
1
M-10/1
0.4
3
0
M-10/2
0
2
1
M-10/3
0.2
0
1
M-10/4
0
2
2
M-10/5
0.2
3
1
M-10/6
0
1
1
M-10/7
0.4
1
0
M-10/8
1.4
0
0
Karakter khusus mutant Daun sedikit, pendek, daun hijau tua, bentuk normal,ujung daun membulat, tegap,berakar Daun sedikit, pendek,daun hijau tua, bentuk daun keriting,ujung daun membulat, tegap Daun banyak, pendek, daun hijau tua, normal, membulat, tanaman tegap Daun banyak, pendek, daun hijau muda, keriting, ujung membulat, tanaman tegap Daun sedikit, pendek, daun hijau muda, normal, runcing, tanaman tegap Daun sedikit, pendek, daun hijau muda, keriting, runcing, tanaman tegap Daun banyak, pendek, daun hijau muda, normal, membulat, tanaman tegap,berakar Daun sedikit, tinggi, daun hijau muda, bentuk daun normal, membulat, tanaman tegap Daun sedikit, pendek, daun hijau tua, normal, membulat, tanaman tegap,berakar Daun sedikit, pendek, daun hijau muda, keriting, membulat, tanaman tegap,berakar Daun sedikit, tunas pendek, daun hijau muda, keriting, membulat, tanaman tegap,berakar Dua batang menempel, berakar Daun sedikit, tanaman pendek, daun hijau muda, normal,membulat, tanaman tegap,berakar Daun sedikit, hijau muda, keriting,dan membulat, tanaman tegap dan tinggi Tanaman tegap dan tinggi, daun sedikit, hijau tua, keriting, runcing
Regeneran M-10/7 memiliki jumlah daun yang sedikit dengan bentuk daun keriting roset, dan tanaman tinggi. Keragaman yang diinduksi dari iradiasi sinar gamma dan kultur in vitro bersifat spontan dan random sehingga sifat yang dimunculkan dari suatu karakter tertentu terkadang tidak dikehendaki karena
37
bersifat merugikan, seperti yang terjadi pada tanaman nanas yang diiradiasi sinar gamma dalam kultur in vitro menyebabkan terjadinya abnormalitas daun bahkan daun tidak dapat tumbuh sama sekali sehingga tanaman tidak dapat tumbuh dengan sempurna (Suminar, 2010). Mutasi dapat menyebabkan perubahan karakteristik seperti ukuran, proses fisiologi, kandungan kimia atau produktivitas, yang sulit diidentifikasi. Pengaruhnya kadang-kadang pengukuran sulit dilakukan karena seringkali suatu populasi tanaman lebih baik daripada tanaman secara individual (Sleper & Poehlman dalam Suminar, 2010). Hasil uji t-student tidak memberikan pengaruh yang nyata terhadap karakter tinggi tunas, namun berpengaruh nyata terhadap jumlah daun (Tabel 10). Rata-rata jumlah daun pada regeneran yang tidak diberikan iradiasi sinar gamma lebih banyak (8.20) dari pada jumlah daun regeneran yang diberi perlakuan iradiasi dengan dosis 10 Gy (3.88). Semakin tinggi dosis radiasi sinar gamma menyebabkan jumlah daun berkurang bahkan tidak tumbuh samasekali. Jika radiasi merusak materi genetik dan sel, akan menyebabkan proses transkripsi tidak dapat berjalan normal sehingga molekul organik yang diperlukan untuk pembelahan sel tidak dapat disintesis, akhirnya pembelahan sel akan terhenti dan sel kehilangan viabilitasnya (Neary et al. dalam Tangpong et al., 2009). 5.
Evaluasi Keragaman Genetik
Analisis stomata Pengamatan terhadap anatomi daun umumnya mengutamakan pengamatan terahadap jumlah stomata persatuan luas, panjang, lebar, dan jumlah kloroplas di dalam sel penjaga. Stomata adalah porus atau lubang-lubang yang terdapat pada epidermis yang masing-masing dibatasi oleh sel-sel penutup (guard cell). Stomata mulai berkembang menjelang aktifitas meristematik pada epidermis usai dan terus berkembang selama beberapa waktu, disaat daun memanjang dan meluas karena pembesaran sel. Hasil uji t-student pada populasi planlet yang diiradiasi dan tidak untuk karakter kerapatan, panjang, dan lebar stomata, serta jumlah kloroplas di dalam sel penjaga tidak memberikan pengaruh yang nyata (Tabel 10). Hal tersebut dikarenakan nilai keragaman yang tinggi pada setiap variabel yang diamati.
38
Berdasarkan rata-rata dosis iradiasi dapat meningkatkan kerapatan stomata dan jumlah kloroplas di dalam sel penjaga, namun mempunyai ukuran stomata (panjang dan lebar) yang lebih lebih kecil dibanding kontrol. Stomata berfungsi sebagai pintu masuknya CO2 ke dalam daun untuk berlangsungnya fotosíntesis dan menguapkan air (transpirasi). Semakin banyak stomata pada daun atau semakin tinggi kerapatan stomata, maka semakin besar ruang pada daun untuk melepaskan air. Hasil penelitian Usman et al. (2008) panjang dan lebar stomata dapat secara langsung mempengaruhi tingkat ploidi pada tanaman jeruk. Tanaman poliploid mempunyai ukuran stomata yang lebih besar dibandingkan dengan tanaman diploid.
kloroplas
(16) Length 18511.19 nm (17) Length 20023.88 nm
Gambar 10. Panjang dan lebar stomata serta kloroplas di dalam sel penjaga pada stomata jeruk siam Pontianak. Pengamatan jumlah kloroplas dilakukan di daerah sel penjaga (guard cell) pada stomata (Gambar 10). Kloroplas berbentuk butiran-butiran yang berwarna hijau yang berperan dalam proses fotosíntesis. Kromosom mempunyai molekul unit DNA, selain kromosom organel kloroplas juga mengandung DNA. Jumlah kromosom pada suatu sel identik dengan jumlah kloroplas pada sel penjaga stomata. Hasil uji-F memberikan pengaruh yang nyata terhadap jumlah kloroplas di dalam sel penjaga pada setiap individu dari regeneran-regeneran mutan terseleksi (Tabel 9). Rata-rata jumlah kloroplas tertinggi berdasarkan uji lanjut DMRT terdapat pada regeneran M-10/1 namun tidak berbeda nyata dengan regeneran K0/6, M-10/2, dan M-10/6. Rata-rata jumlah kloroplas terendah terdapat pada
39
regeneran K-0/7, namun tidak berbeda nyata dengan regeneran K-0/2, K-0/4, M10/3, M-10/4, dan M-10/5. Tanaman yang memiliki jumlah kloroplas lebih banyak berpengaruh pada penyerapan energi cahaya yang lebih banyak. Pertumbuhan tanaman akan lebih optimal karena semakin efektifnya proses mekanisme fotosíntesis. Rata-rata jumlah kloroplas di dalam sel penjaga pada stomata telah digunakan untuk menduga jumlah kromosom pada jeruk ‘Kinnow’ mandarin (Citrus reticulata L.) dan ‘Succari’ sweet oranges (Citrus sinensis L. Osbeck) oleh Usman et al. (2008). Regeneran M-10/1 dengan rata-rata jumlah kloroplas pada salah satu sel penjaganya 13.4 diduga tanaman triploid (2n=3x=27).
Tabel 8. Jumlah kloroplas didalam sel penjaga pada regeneran mutan terseleksi. Nomor Regeneran
∑Kloroplas dalam Sel Penjaga
K-0/1 K-0/2 K-0/3 K-0/4 K-0/5 K-0/6 K-0/7 M-10/1 M-10/2 M-10/3 M-10/4 M-10/5 M-10/6 M-10/7 M-10/8
7.4cdef 4.2fg 6.8def 5.8efg 9.6cbd 11.0ab 4.0fg 13.4a 10.4abc 4.6fg 6.0efg 4.4fg 11.6ab 8.4bcde 6.4def
Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf yang berbeda pada kolom yang sama berarti berbeda nyata berdasarkan uji DMRT dengan alfa 0,05
Pengujian Keragaman Genetik Mutan Terseleksi dalam MW + EM 500 mg/l dengan Menggunakan Pengamatan Morfologi Pengamatan yang dilakukan terhadap karakter morfologi jumlah daun, bentuk tunas, bentuk ujung daun, tinggi tunas, kedudukan daun, dan warna daun yang diubah menjadi data biner dengan skoring data berdasarkan kriteria-kriteria
40
yang sudah ditetapkan pada setiap variabel. Bila ada nilai pada kriteria tersebut diskor “1” atau tidak ada nilai diskor “0”. K-0/1 K-0/3 K-0/2 M-10/3 M-10/4 M-10/5 K-0/4 K-0/7 M-10/1 M-10/2 M-10/6 K-0/5 K-0/6 M-10/7 M-10/8
1
2
0.47
0.53
0.59
0.65
0.71
0.77
0.82
0.88
0.94
Koefisien kemiripan Gambar 11. Dendogram regeneran jeruk in vitro berdasarkan karakter morfologi. Hasil pengamatan terhadap karakter-karakter tersebut di atas menunjukkan adanya keragaman penampilan fenotipik yang beragam, selanjutnya dilakukan análisis dengan NTSYS versi 2.02 terhadap 15 regeneran yang mewakili keragaman bentuk yang diperoleh. Matriks koefisien kemiripan morfologi antara 15 regeneran kontrol dan mutannya diturunkan dari matriks simqual menunjukkan rentang nilai kemiripan berkisar antara 0.47 – 0.94 (47% - 94%) atau keragaman morfologi 6% - 53 % (Gambar 11). Dari gambar tersebut dapat diperoleh bahwa pengelompokkan berdasarkan analisis fenotipik yang dilakukan diperoleh dua kelompok besar dari 15 regeneran yang diuji. Kelompok satu terdiri dari K-0/1, K-0/2, K-0/3, K-0/4, K-0/5, K-0/6, K-0/7, M-10/1, M-10/2, M-10/3, M-10/4, M10/5, dan M-10/6. Kelompok dua terdiri dari M-10/7 dan M-10/8. Rentang keragaman morfologi tertinggi terdapat pada regeneran K-0/1 dan M-10/8 dengan keragaman fenotipik sebesar 53%.
Rentang keragaman fenotipik terendah
terdapat pada regeneran M-10/3 dan M-10/4 yang memiliki bentuk morfologi secara visual mirip dengan keragaman fenotipik sebesar 6%. Rentang keragaman morfologi yang cukup tinggi pada regeneran kontrol terjadi akibat adanya
41
keragaman somaklonal sebagai akibat dari metode regenerasi yang menggunakan jalur embriogenesis somatik dan akibat dari eksplan awal yang digunakan telah mengalami subkultur berulang yang cukup lama (+ 5 tahun). Untuk mengetahui adanya variasi dari suatu populasi harus dilakukan pengukuran dan analisis mengikuti kaidah statistika. Populasi yang bervariasi mempunyai ciri-ciri khusus yang dapat dilihat dari nilai rata-rata, ragam, dan standar deviasi. Tabel 9. Kisaran, rataan, ragam fenotipik (σ2f) dan standar deviasi ragam fenotipik (Sd σ2f) dari variable yang diamati. No. Variabel 1
Dosis radiasi (Gray) 0 10 0 10 0 10 0 10 0 10 0
Kisaran
σ2f
Kriteria Keragaman
0.04 0.12 0.55 0.44 3.22 5.05 893 675.43 500.94 597.67 0.39
Luas Luas Luas Luas Luas Luas Luas Luas Luas Luas Luas
2 3
Jumlah stomata
4
Panjang stomata (nm) Lebar stomata (nm) Jumlah kloroplas di dalam sel 10 4.4-13.4 8.15 11.28 0.75 Luas penjaga Keterangan : Angka-angka rataan yang diberi tanda (*) pada variabel yang sama berarti berbeda nyata menurut uji t-student pada taraf 5%
6
0.96 0.10 1.24 0.29 8.2 17.31 3.875* 3.84 63.45 372.87 64.43 408.29 20544 28708164 19795.8 9238107 16447.7 9033810 15860 7233506 6.49 5.45
2*(Sd σ2f)
tinggi tunas (cm) jumlah daun
5
0.5-1.5 0.5-2.1 2.0-14.0 2.0-7.0 35-91 36-93 12203-30654 14301.6-24557 9747.96-20721.6 12142.9-19428.6 4.0-11.0
Rataan
Iradiasi sinar gamma menyebabkan keragaman pertumbuhan regeneran. Tabel 10 menunjukkan bahwa variabel tinggi tunas, jumlah daun, jumlah stomata, panjang stomata, lebar stomata, dan jumlah kloroplas di dalam sel penjaga mempunyai keragaman fenotipik yang luas pada regeneran mutan yang diiradiasi sinar gamma maupun kontrol. Pada planlet yang tanpa diberi perlakuan iradiasi keragaman terjadi akibat adanya keragaman somaklonal. Keragaman somaklonal adalah keragaman genetik yang dihasilkan melalui kultur jaringan (Grosser et al., 2007). Keragaman pada eksplan disebabkan adanya sel-sel bermutasi maupun adanya polisomik dari jaringan tertentu. Variasi ini berasal dari keragaman genetik dari eksplan dan keragaman genetik yang terjadi di dalam kultur in vitro.
42
Menurut Purwati dan Sudjindro (2009) faktor-faktor yang mempengaruhi terbentuknya
keragaman
somaklonal
pada
kultur
jaringan
adalah
fase
pertumbuhan awal, genotipe, zat pengatur tumbuh, sumber jaringan eksplan dan protokol atau prosedur regenerasi planlet. Iradiasi
sinar
gamma
dapat
menyebabkan
terjadinya
keragaman
pertumbuhan planlet. Pengaruh yang signifikan berdasarkan analisis statistika diantara populasi regeneran mutan dalam media in vitro menunjukkan adanya keragaman. Nilai standar deviasi dari masing-masing regeneran mutan menunjukkan besarnya tingkat keragaman dalam populasi regeneran mutan tersebut. Menurut Welsh (1991), jika dua atau lebih genotipe ditumbuhkan pada kondisi lingkungan yang sama (kondisi in vitro) sehingga menghasilkan pertumbuhan yang berbeda, maka kedua individu tersebut mempunyai genotipe yang berbeda.
A
B
C
Gambar 12. Regeneran-regeneran mutan yang telah disambung, (a) M-10/5, (b) K-0/2, dan (c) M-10/4. Sampai saat ini beberapa regeneran mutan yang dihasilkan telah dipindahkan ke lapang dengan cara disambung (grafting) dengan batang bawah JC (Gambar 12). Penyambungan regeneran mutan dengan batang bawah ini bertujuan untuk melihat keragaan dan karakter dari masing-masing regeneran hasil iradiasi secara in vivo. Regeneran mutan yang telah dilakukan penyambungan dengan batang bawah yaitu K-0/2, M-10/4, dan M-10/5.
43
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa: 1. Dosis iradiasi dan interaksi antara dosis iradiasi dan konsentrasi biotin memberikan pengaruh yang nyata terhadap proliferasi kalus jeruk siam namun konsentrasi biotin tidak memberikan pengaruh yang nyata. 2. Penambahan 2.0 mg/l dan 1.5 mg/l ABA serta EM 500 mg/l dalam media merupakan konsentrasi yang paling baik digunakan untuk mendewasakan embrio somatik yang diiradiasi maupun yang tidak diiradiasi. 3. Pemberian mutagen sinar gamma dosis 10 Gy pada kultur kalus in vitro dapat mempengaruhi pertumbuhan regeneran (planlet) dan meningkatkan keragaman fenotipik dan genetik pada jeruk siam pontianak. Pemberian mutagen sinar gamma menyebabkan perubahan pada morfologi daun, pertumbuhan bibit somatik, anatomi stomata, dan jumlah kromosom. Saran Perlu pengamatan lebih lanjut terhadap regeneran mutan yang telah disambung dengan batang bawah sehingga akan diperoleh data mengenai karakter dari masing-masing regeneran mutan secara in vivo terutama karakter buah (warna kulit dan jumlah biji).
DAFTAR PUSTAKA
Agisimanto, D. dan I. Sutarto. 2008. Induksi Mutagenesis dan Aplikasi Penanda PCR Mempercepat Penemuan Calon Varietas Unggul Jeruk Baru. Prosiding Seminar Nasional Jeruk 2007. Pusat Penelitian dan Pengembangan Hortikultura. Jakarta. 235-246. Ashari, S. 1995. Hortikultura Aspek Budidaya. Cetakan Pertama. UI-Press. Jakarta. 485 hal. Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pascapanen Pertanian. 2009. Jus Jeruk Siam : Di Balik Rasa Pahit Temukan Manfaat yang Menakjubkan. Warta Penelitian dan Pengembangan Pertanian Vol 31, No.2: 8-9. Badan Tenaga Nuklir Nasional. 2005. Pustek Nuklir Bahan dan Radiometri PSD (Pertanyaan yang Sering Ditanyakan/FAQ). http.//www.batan-bdg.go.id. [21 November 2010]. Badawy, E.M., A.M.Habib, A.A.El-Banna, and G.M.Yousry. 2009. Effect of some factors on somatic embryos formation from callus suspensions culture in phoenix dactylifera L. Cv. Sakkoty. 4th Conference on Recent Technologies in Agriculture. 593-599. Crowder, L.V. 2006. Genetika Tumbuhan. Cetakan Kelima. Penerjemah Kuardiarti, L. Universitas Gajah Mada Press. Yogyakarta. 499 hal. Darajat, A.A. 1987. Variabilitas dan Adaptasi Genotipe Terigu pada Berbagai Lingkungan Tumbuh di Indonesia. Disertasi. Universitas Padjajaran Bandung. Bandung. Direktorat Jenderal Hortikultura, Departemen Pertanian. 2009. Statistik Produksi. http://www.hortikultura.deptan.go.id. 23 September 2009. Egertsdotter, U. 1999. Somatic Embriogenesis in picea suspensions culture, p.5160. In Hall D.R. (Ed.), Plant Cell Culture Protocols. Humana Press. New Jersey. El-Shiaty, O.H., S.F.El-Sharabasy, and A.H.Abd El-Kareim. 2004. Effect of some amino acids and biotin on callus and proliferation of date palm (Phoenix dactylifera L.) Sewy cultivar. Arab J.Biotech. Vol. 7 (2): 256-272. FAOSTAT. 2007. Database. Food and Agriculture Organization of The United Nation. http://faostat.fao.org/site/340/DesktopDefaulth.aspx?PageID=340. 23 September 2009. George, E.F., M.A. Hall, and G.J. De Klerk. 2008. Plant Propagation by Tissue Culture 3rd Edition. Netherlands:500 p.
45
George, E.F., and P.D. Sherrington. 1984. Plant Propagation by Tissue Culture. Handbook and Directory of Comercial Laboratories. Exegetics Limited. England:706 p. Ghanati, F. and M.R. Ishka. 2009. Investigation of the interaction between absisic acid (ABA) dan excess benzyladenine (BA) on the formation of shoot in tissue culture of tea (Camelia sinensis L.). International Journal of Plant Production 3 (4): 7-14. Gomez, K.A., dan A.A.Gomez. 1995. Prosedur Statistik untuk Penelitian Pertanian. Terjemahan dari: Statistical Procedures for Agricultural Research. Penerjemah: E.Sjamsudin dan J.S.Baharsjah. Penerbit Universitas Indonesia. Jakarta. 698 hal. Gray, D. J. 2005. Propagation from nonmeristematic tissues: nonzygotic embryogenesis, p. 187-200. In Robert N. Trigiano and Dennis J. Gray (Eds.). Plant Development and Biotechnology. CRC Press. New York. Grosser, J.W., X.X. Deng, and R.M. Goodrich. 2007. Somaclonal variation in sweet orange, p 219-234. In Khan, I.A (Ed). Citrus: Genetic, Breeding, and Biotechnology. CAB International. Cambridge. Hardiyanto, Mila, dan S. Lestari. 2008. Identifikasi batang bawah jeruk JC (Japanche Citroen) zigotik dan nucellar berdasarkan morfologi dan analisis isozim. Prosiding Seminar Nasional Jeruk 2007. Pusat Penelitian dan Pengembangan Hortikultura. Jakarta. 181-196. Herison, C., Rustikawati, S.H.Sutjahjo, dan S.I.Aisyah. 2008. Induksi mutasi melalui iradiasi sinar gamma terhadap benih untuk meningkatkan keragaman populasi dasar jagung (Zea mays L.). Jurnal Akta Agrosia vol.11 no1:57-62. Husni, A. 2010. Fusi Protoplas Interspesies antara Jeruk Siam Simadu dengan Jeruk Mandarin Satsuma. Disertasi. Program Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor. Bogor. 161 hal. Husni, A., A. Purwito, I. Mariska, dan Sudarsono. 2010. Regenerasi jeruk siam melalui embriogenesis somatik. Jurnal AgroBiogen 6(2):75-83. Husni, A., M. Kosmiatin, I. Mariska, dan C. Martasari. 2008. Studi Isolasi Protoplas Pada Jeruk Siam. Prosiding Seminar Nasional Jeruk 2007. Pusat Penelitian dan Pengembangan Hortikultura. Jakarta. 197-208. Hutabarat, B. dan A. Setyanto, 2008. Komoditas Jeruk Indonesia di Persimpangan Jalan Pasar Domestik dan Internasional. Prosiding Seminar Nasional Jeruk 2007. Pusat Penelitian dan Pengembangan Hortikultura. Jakarta. 1-30. Kosmiatin, M., R. Yunita, dan A. Husni. 2010. Peningkatan toleransi alumunium pada jeruk batang bawah dengan teknik seleksi in vitro berulang. Jurnal AgroBiogen 6(1):33-39.
46
Lubis, K. 2005. Pemuliaan mutasi pada tanaman hias. e-USU Repository. Universitas Sumatera Utara:1-4 p. Martasari, C., D. Agisimanto, dan H.M. Yusuf. 2004. Pemuliaan mutasi tanaman jeruk keprok. Prosiding Seminar Nasional Jeruk 2004. Pusat Penelitian dan Pengembangan Hortikultura. Jakarta. 140-151. Martasari, C. dan Mulyanto, H. 2008. Teknik identifikasi varietas jeruk. IPTEK Hortikultura No.4:6-12. Menegristek. 2000. Jeruk. Kantor Deputi Menegristek Bidang Pendayagunaan dan Pemasyarakatan Ilmu Pengetahuan dan Teknologi. Jakarta. 16 hal. Miglani, G.S. 2006. Mendelian Genetics. In Dashek, W.V. and Harison, M. (Eds.). Plant Cell Biol Sci. Publisher. USA. Ollitrault, P., F. Luro, and M. Yamamoto. 2007. Seedlessness and ploidy manipulations, p. 197-218. In Khan, I.A (Ed). Citrus: Genetic, Breeding, and Biotechnology. CAB International. Cambridge. Pracaya. 2002. Jeruk Manis: Varietas, Budidaya, dan Pascapanen. Cetakan ke-X. Penebar Swadaya. Jakarta. 159hal. Purwati, R.D. dan Soedjindro. 2009. Variasi ketahanan genotipe kenaf (Hisbiscus cannabinus L.) terhadap nematode puru akar (Meloidogyne incognita). Jurnal Penelitian Tanaman Industri 15(2): 60-65. Renukdas, N.N., M.L.Mohan, S.S.Khuspe, and S.K.Rawal. 2006. Influence of phytohormones, culture conditions, and ethylene antagonist on somatic embryo maturation and plant regeneration in papaya. International Journal of Agricultural Research 1 (2): 151-160. Rohlf, F.J. 1998. Ntsys-pc: Numerical Taxonomic and Multivariate Analysis System. Version 2.0. User Guide, Exeter Publishing Co.Ltd. Roose, M.L., and T.E.Williams. 2007. Mutation breeding, p. 345-352. In Khan, I.A (Ed). Citrus: Genetic, Breeding, and Biotechnology. CAB International. Cambridge. Samanhudi. 2008. Perbanyakan cepat jeruk keprok tawangmangu secara in vitro untuk mendukung pengembangan agribisnis jeruk di Indonesia. Prosiding Seminar Nasional Jeruk 2007. Pusat Penelitian dan Pengembangan Hortikultura. Jakarta. 209-218. Sari, E. S. 2004. Pentingnya pengujian kandungan gula pada jeruk Pontianak (Citrus nobilis var. microcarpa) sebagai jaminan kualitas rasa. Unit PSMB Dinas Perindag. Pontianak. Sarwono, B. 1994. Jeruk dan Kerabatnya. Revisi ke-VII. Penebar Swadaya. Jakarta. 194 hal.
47
Soedjono, S. 2003. Aplikasi mutasi induksi dan variasi somaklonal dalam pemuliaan tanaman. Jurnal Litbang Pertanian. 22(2): 70-78. Steel, R.G.D., Torrie J.H. 1995. Prisnsip dan Prosedur Statistika. PT Gramedia. Jakarta. Sukarmin dan F. Ihsan. 2008. Teknik persilangan jeruk (Citrus sp.) untuk perakitan varietas unggul baru. Buletin Teknik Pertanian. 13(1):12-15. Suminar, E. 2010. Induksi Keragaman Genetik dengan Mutagen Sinar Gamma pada Nenas (Ananas comosus (L.) Merr.) secara In Vitro. Tesis. Program Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor. Bogor. 69 hal. Suryowinoto, M. 2000. Pemuliaan Tanaman Secara In Vitro. Edisi V. Kanisius. Yogyakarta. 252 hal. Sutarto, I., D.Agisimanto., dan A.Supriyanto. 2009. Development of promising seedless citrus mutants through gamma irradiation, p. 306-308. In Q.Y.Shu (Ed.). Induced Plant Mutations in the Genomics Era. Food and Agriculture Organization of the United Nations. Roma. Sutjahjo, S.H., A. Kadir., dan I. Mariska. 2007. Efektivitas polietilena glikol sebagai bahan penyeleksi kalus nilam yang diiradisasi sinar gamma untuk toleransi terhadap cekaman kekeringan. Jurnal Ilmu-ilmu Pertanian. 9:4857. Tangpong, P., T.Taychasinpitak, C. Jompuk, and P. Jompuk. 2009. Effect of acute and cronic irradiation in vitro culture of anubias congensis N. E. Browm. Thorpe, T., C. Stasolla, E.C. Yeung, G-J.de Klerk, A. Roberts, and E.F.George. 2008. The components of plant tissue culture media II: organic additions, osmotic an pH effects, and supports systems in George E.F., M.A. Hall, dan G-J. De Klerk (Eds.). Plant Propagation by Tissue Culture 3rd Edition. Springer. Netherlands. Trisnawati, W. 2008. Mutu dan Preferensi Panelis Sari dan Sirop Buah Jeruk Siam Selama Penyimpanan. Prosiding Seminar Nasional Jeruk 2007. Pusat Penelitian dan Pengembangan Hortikultura. Jakarta. 460-468. Usman, M., B. Fatima, and K.A.Gillani. 2008. Exploitation of potential target tissues to develop polyploids in citrus. Pak.J.Bot.,40(4):1755-1766. Van Harten, A.M. 1998. Mutation Breeding: Theory and Practical Application. Cambridge University Press. 353p. Walpole, R.E. 1997. Pengantar Statistika. Edisi ke-3. PT Gramedia Pustaka Utama. Jakarta. 516 hlm. Wattimena, G.A. 1988. Zat Pengatur Tumbuh Tanaman. Pusat Antar Universitas, Institut Pertanian Bogor. 121 hal.
48
Welsh, J.R. 1991. Dasar-dasar Genetika dan Pemuliaan Tanaman. Penerjemah : J.P. Mogea. Erlangga. Jakarta. 224 p.
49
LAMPIRAN
50
Lampiran 1. Komposisi Media MW (Morrel dan Wetmore, 1961) Bahan Kimia Unsur Hara Makro NH4NO3 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4 Unsur Hara Mikro H3BO3 Na2MoO4.2H2O KI CoCl.6H2O MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O CuSO4.5H2O Na2EDTA.2H2O FeSO4.7H2O Vitamin Calcium Panthotenat Myoinositol Nicotinic Acid Pyridoxine HCl (B6) Thiamine (B1) Biotine
MS (mg L-1) 1 650 1 900 440 370 170 22.3 8.6 6.2 0.83 0.025 0.25 0.025 37.3 27.8 0.5 50 0.5 0.5 0.5 0.05
51
Lampiran 2. Data biner pengamatan morfologi pada 15 regeneran kontrol dan mutan Karakter perubahan Jumlah daun
Subkarakter
Regeneran K-0/1
K-0/2
K-0/3
K-0/4
K-0/5
K-0/6
K-0/7
M-10/1
M-10/2
M-10/3
M-10/4
M-10/5
M-10/6
M-10/7
M-10/8
lambat (0-3) Cepat (>3)
1 0
1 0
0 1
0 1
1 0
1 0
0 1
1 0
1 0
1 0
1 0
1 0
1 0
1 0
1 0
perubahan tinggi tunas
lambat (0-0.3) Cepat (>0.3)
1 0
1 0
1 0
1 0
1 0
1 0
1 0
0 1
1 0
1 0
1 0
1 0
1 0
0 1
0 1
Warna daun
hijau tua hijau muda
1 0
1 0
1 0
0 1
0 1
0 1
0 1
0 1
1 0
0 1
0 1
0 1
0 1
0 1
1 0
Bentuk daun
Normal keriting
1 0
0 1
1 0
0 1
1 0
0 1
1 0
1 0
1 0
0 1
0 1
0 1
1 0
0 1
0 1
Bentuk ujung daun
membulat runcing
1 0
1 0
1 0
1 0
0 1
0 1
1 0
1 0
1 0
1 0
1 0
1 0
1 0
1 0
0 1
Ketegapan tanaman
tegap terkulai
1 0
1 0
1 0
1 0
1 0
1 0
1 0
1 0
1 0
1 0
1 0
1 0
1 0
1 0
1 0
Akar
ada tidak ada
0 1
0 1
1 0
0 1
1 0
0 1
0 1
0 1
0 1
0 1
0 1
1 0
0 1
0 1
0 1
52
Lampiran 3. Deskripsi Jeruk Siam Pontianak
Keputusan Menteri Pertanian Nomor : 466/kpts/PO.210/9/2003 Tanggal : 15 September 2003 Asal Tanaman
: Kalimantan Barat
Bentuk batang
: Silindris
Bentuk percabangan
: Melengkung ke atas
Bentuk daun
: Oval, pangkal daun tumpul dengan ujung daun meruncing dan bergerigi
Ukuran daun
: Panjang 6.5 cm dan lebar 3.0 cm
Warna daun
: Bagian atas hijau tua, bagian bawah hijau muda
Panjang tangkai daun
: 1-1.3 cm
Jumlah bunga per tandan
: 4 – 5 kuntum
Jumlah buah per dompol
: 3 – 6 buah
Umur mulai berbuah
: 3 – 4 tahun
Warna kulit buah matang
: Hijau kekuningan
Ukuran buah
: Panjang 7.1 cm, diameter 7.6 cm
Jumlah juring per buah
: 10-12 juring
Jumlah biji per buah
: 14-24 biji (setiap juring 0-2 biji)
Warna daging buah
: Orange
Kulit buah
: Tipis (1 – 1.5 mm)
Bentuk buah
: Bulat, dengan ujung buah tumpul datar
Rasa
: Manis
Aroma buah
: Agak harum
Tekstur daging buah
: Halus
Kadar gula
: 12.5 oBrix
Kadar asam
: 5.6 %
Bobot per buah
: 113.84 gram
Produksi
: 100 – 200 buah (33 kg) / ha/ tahun (umur 3-4 tahun)
53
Lampiran 4. Sidik ragam luas kalus pada 2 MST Sumber Keragaman Rad Bio rad*bio Galat Percobaan Umum KK : 57.67 %
Derajat bebas 4 4 16 204 228
Jumlah Kuadrat 4.69 0.26 4.73 28.60 38.58
Kuadrat Tengah 1.17 0.06 0.29 0.14
F-hitung
Pr > F
8.36 0.46 2.11
<.0001 0.765 0.009
F-hitung
Pr > F
16.2 1.12 3.29
<.0001 0.347 <.0001
F-hitung
Pr > F
8.22
<.0001
Lampiran 5. Sidik ragam luas kalus pada 4 MST Sumber Keragaman Rad Bio rad*bio Galat Percobaan Umum KK : 55.9 %
Derajat bebas 4 4 16 199 223
Jumlah Kuadrat 26.56 1.84 21.58 81.54 130.69
Kuadrat Tengah 6.64 0.46 1.35 0.41
Lampiran 6. Sidik ragam jumlah kloroplas di dalam sel penjaga Sumber Keragaman Jumlah kloroplas Galat percobaan Umum KK : 32.59 %
Derajat bebas 17 70 87
Jumlah Kuadrat 734.89 368 1102.89
Kuadrat Tengah 43.23 5.26
Lampiran 7. Rekapitulasi hasil uji kehomogenan ragam terhadap beberapa varibel pada regeneran 0 dan 10 Gy Variabel jumlah daun Tinggi tanaman panjang stomata lebar stomata Jumlah kloroplas jumlah stomata
Test statistik 4.101 0.342 3.108 1.249 0.565 1.184
P-value 0.056 0.083 0.146 0.79 0.066 0.843
