Imunohematologie a vyšetřovací metody v imunohematologii
Sláviková M., Holusková I., Galuszková D. Transfuzní oddělení FN Olomouc
Co je imunohematologie? • Základní kámen transfuzní medicíny a všech ostatních oborů používajících transfuzní substituční léčbu • Co vyšetřuje imunohematologie? – antigeny a protilátky související s procesy (aktivace komplementu, hemolýza) • Proč se tato vyšetření dělají: – aby se zabránilo nežádoucím účinkům transfuze (potransfuzní hemolytické reakce, aloimunizace) – aby se prokázaly a léčily protilátkami způsobené patologické stavy nesouvisející s transfuzí (např. AIHA)
Co je krevní skupina? • Definice: vrozený znak na povrchu erytrocytů, detekovatelný specifickou protilátkou • Nevyskytuje se pouze na erytrocytech – výskyt i na jiných buňkách (např. trombocyty)
Antigenní systémy na erytrocytech • Známo více než 300 antigenů • 30 antigenních systémů • Antigeny na erytrocytech mohou být řazeny mezi: – Proteiny – Glykoproteiny (protilátky rozeznávají primárně polypeptidový řetězec) – Glykoproteiny (protilátky rozeznávají primárně karbohydrátový region) – Glykolipidy (protilátky rozpoznávají část karbohydrátu)
Antigenní systémy na erytrocytech
Cukry
- glykosylující
membránové proteiny a lipidy
(Glyko) Proteiny Receptory/adhez.molekuly
??? Membránový transport
Enzymy
Regulace komplementu
Klasifikace antigenních systémů • 1. 2. 3. 4.
Antigeny na erytrocytech řadíme, do některé ze 4 skupin: Krevně skupinový systém – skládá se z antigenů, které jsou kódovány jedním genovým lokusem Kolekce – serologicky, biochemicky nebo geneticky podobné antigeny, které nesplňují zařazení do krevně skupinových systémů Série 700 – antigeny s nízkou frekvencí výskytu Série 900 – antigeny s vysokou frekvencí výskytu
Terminologie a klasifikace • ISBT klasifikace erytrocytárních skupinových systémů No.
System name
System symbol
Gene name(s)*
Chromosomal CD location numbers
001
AB0
AB0
AB0
9q34.2
002
MNS
MNS
GYPA, GYPB, GYPE
4q31.21
http://blood.co.uk/ibgrl/
CD235
Skupinové systémy na erytrocytech • • • • • • • • • • • • • • • •
AB0 MNS P Rh LUTHERAN KELL LEWIS DUFFY KIDD DIEGO Yt Xg SCIANNA DOMBROCK COLTON LANDSTEINER-WIENER
• • • • • • • • • • • • • •
CHIDO/RODGERS H Kx GERBICH CROMER KNOPS INDIAN Ok RAPH JOHN MILTON HAGEN I GLOBOSIDE GILL Rh-ASSOCIATED GLYCOPROTEIN
Krevně skupinové kolekce (200) AKTUÁLNÍ KOLEKCE
ZASTARALÉ KOLEKCE
205: 207: 208: 209: 210: 212:
201 Gerbich
COST Ii Er GLOB Lec; Led VEL
202 Cromer
203 Indian 204 Auberger
206 Gregory 211 Wright
Antigeny s nízkou frekvencí výskytu (série 700) • • • • • • • • • •
BATTY CHRISTIANSEN BILES BOX TORKILDSEN PETERS REID JENSEN LIVESAY MILNE
Antigeny s vysokou frekvencí výskytu (série 901) • • • • •
LANGERIES AUGUST Jra EMM ANTON
Krevně skupinové systémy: AB0 systém Rh systém Kell systém
AB0 systém • Historická fakta: • První krevně skupinový systém objevený u člověka • Nezávisle na sobě jej objevili Landsteiner (1901), Janský (1907) a Moss (1910) • V roce 1902 Descatello a Sturli prokázali čtvrtou skupinu, ve které byly krvinky aglutinovány séry všech ostatních skupin. Tato skupina byla nazvána AB. To, že Landsteiner neurčil čtvrtou základní krevní skupinu, bylo zřejmě způsobeno tím, že žádná z jeho vyšetřovaných osob neměla tuto krevní skupinu (Daniels, 2002).
K. Landsteiner
J. Janský
W. L. Moss
AB0 antigeny
Frekvence výskytu krevní skupiny AB0 • Frekvence výskytu AB0 v ČR: • A – 41% B – 18% AB – 9% 0 – 32% • Střední Evropa: • A – 48 % B – 9% AB – 4% 0 – 39%
Chybění H antigenu • Velmi vzácné • Příčina: absence enzymu H - transferáza • Úplná deficience H – antigenu: BOMBAY (0h fenotyp); hh gene
• Částečná deficience H – antigenu: PARABOMBAY; Hh gen • Jedinci s 0h mají silné anti-H, -A a -B protilátky v jejich séru. Transfuze pouze erytrocyty 0h.
Podskupiny antigenu A (A1 a A2)
• Detekce za pomoci lektinu z Dolichos biflorus nebo monoklonálního anti-A1 reagentu → detekce podskupiny A1 • Velmi vzácené varianty: slabé A ( včetně A3, Am, Ax, Abantu, Ael and Aend)
Slabé B a AB • Weak B • Slabé reakce s anti-B séry • Podskupiny B se vyskytují v populaci s vysokým výskytem krevní skupiny B (Afrika, Čína)
• • • •
Získané B Enzymové defekty enzymů U infekcí GIT Polyaglutinabilita erytrocytů
• Weak AB • Velmi vzácné – může se vyskytovat u získaného B antigenu
AB0 systém u novorozenců • Anti – A, anti – B u novorozenců detekujeme až ve 3–6 měsíci po expozici antigenům z vnějšího prostředí • Protilátky anti – A a anti – B detekované u novorozenců jsou třídy IgG (přenos přes placentu od matky)
Klinický význam AB0 systému • Klinický význam pro transfuze • Univerzální dárce krve • Dárce krevní skupiny 0 (lépe 0 RhD negativní) • Univerzální příjemce • Příjemce s krevní skupinou AB
Rh systém • Po AB0 systému druhý nejdůležitější antigenní systém • r. 1940 objeven Landsteinerem a Wienerem • Zahrnuje 50 antigenů mezi než se řadí antigeny: D, C, c, E, e • RhD gen produkuje antigen D • RhCE gen produkuje antigen CE
Klinický význam Rh systému • Aloprotilátky anti-D, anti-E, anti-e, Anti-C, anti-c jsou třídy IgG → KLINICKY VÝZNAMNÉ • RhD antigen nejsilnější imunogenní antigen
Kell systém • Antigeny: • K – Kell (POZOR! Po antigenu RhD druhý nejsilněji imunogenní antigen! • k – Cellano • KLINICKÝ VÝZNAM: • Protilátky třídy IgG – KLINICKY VÝZNAMNÉ • Ve srovnání s protilátkami z jiných systému působí destrukci prekurzorů erytrocytů, které rozkládají → nízká hladina bilirubinu
Biologické (netransfuzní) aspekty krevních skupin • Onkologie • mnoho prací korelujících AB0 a různé malignity • statistická nerovnováha–převaha skupiny A nad 0: Ca slinných žláz 1.64, Ca ovaria 1.28, Ca žaludku 1.22, Ca kolorektální 1.11 • „nové antigeny“ na nádorových buňkách (T, Tn, sialyl-Le(x), A-like • zeslabení až ztráta A a nebo B antigenů na erytrocytech někdy předchází projev akutní leukemie
Biologické (netransfuzní) aspekty krevních skupin • Koagulace • mnoho prací korelujících AB0 a koagulaci • skupina 0 má vyšší sklon ke krvácení než A • např. rel.incidence 0:A u krvácejících gastroduod. vředů je 1.5 • skupina A má vyšší tendenci k trombóze než 0 • např. rel.incidence A:0 trombózy u žen, beroucích PAC je 3.1 • dárci KS A mají statisticky vyšší hodnoty f.VIII než dárci 0
Biologické (netransfuzní) aspekty krevních skupin • Infekce • mnoho prací korelujících krevní skupiny a infekce • rozdílné frekvence AB0 skupin ve světě jsou vysvětlovány vlivem pandemií moru a neštovic • cholera, TBC … častěji u skupiny 0 • lepra … častěji u A a B • gonorrhoea, Strept.pneum., E.coli … častěji u B • malárie – rezistence u Duffy(null) … proto v africké populaci vyselektován tento fenotyp /jinde naprosto raritní/
Vyšetřovací metody v imunohematologii erytrocytů • SEROLOGICKÉ TESTY • Detekce protilátek v séru • Detekce erytrocytárních antigenů (fenotyp)
• DNA TECHNIKY • Stanovení genotypu
Faktory ovlivňující sílu reakce antigen-protilátka • TEPLOTA – Protilátky způsobující destrukci erytrocytů in vivo reakční optimum při 37 °C • IONTOVÁ SÍLA – LISS (Low Ionic Strenght Saline) • pH 7 – 7.5
• KVANTITATINÍ ZASTOUPENÍ ANTIGENU NA POVRCHU ERYTROCYTŮ
Jak vyšetřujeme antigeny erytrocytů a protilátky proti nim? Dobré zprávy: • erytrocyty jsou červené (odpadá barvení, značení aj.) • principy testů jsou jednoduché • standardizovaná komerční diagnostika (monoklonální protilátky) usnadňují detekci antigenů Špatné zprávy: • antigenů erytrocytů je hodně (více než 200, řazeny do zatím známých 29 systémů, několika kolekcí a individuálně (LFA a HFA) • některé důležité antigeny mají variantní a slabé formy • protilátky mohou být velmi slabé • diagnostické erytrocyty jsou obtížně standardizovatelné
Serologické testy • SOLNÝ TEST
– Reakční prostředí = fyziologický roztok – Detekce protilátek třídy IgM
• COOMBSŮV TEST
– Detekce protilátek třídy IgG – Reakce s AGH (ANTIGLOBULINUM HUMANUM) = anti-IgG + antiC3d
• PŘÍMÝ COOMBSŮV TEST • NEPŘÍMÝ COOMBSŮV TEST • ENZYMOVÉ TESTY
Reakce antigenu s protilátkou
Erytrocyt s antigenem
Protilátka proti antigenu
- vazba na erytrocyt - aglutinace erytrocytů - ev. aktivace komplementu
Přímá aglutinace erytrocytů • Průkaz protilátek třídy IgM nebo komplemetem senzibilizovaných erytrocytů in vivo
Nepřímý antiglobulinový test • Průkaz protilátek třídy IgG → KLINICKY VÝZNAMNÉ PROTILÁTKY • Použití polyspecifického AGH (ANTIGLOBULINUM HUMANUM) anti-IgG; anti-C3d • Inkubace při 37 °C • NEPODKROČITELNÉ MINIMUM!!!
Nepřímý antiglobulinový test - princip
Sérum se specifickou protilátkou + reagentem → promytí
Nepřímý antiglobulinový test test-princip
Přidané AGH podporuje aglutinaci erytrocytů
Enzymové testy • Často používané v serologii krevních skupin – DOPLŇKOVÉ TESTY • PROTEÁZY (BROMELIN, FICIN, PAPAIN) → štěpí specificky peptidovou vazbu • TRYPSIN, CHYMOTRYPSIN – více specifičtější • NEURAMINIDÁZY → štěpí zbytky kys. sialilové • Erytrocyty upravené za pomoci enzymu používány v imunohematologii ke screeningu protilátek a také k jejich následné identifikaci • Záchyt aloprotilátek z Rh systému event. rozlišení aloprotilátek ve směsi (enzym-senzitivní antigeny)
Enzymový test-princip
Enzymový test-princip
Sklíčková metoda
Zkumavková technika
Mirkotitrační plotna
Automatizace provozu na TO FNOL
Prováděná imunohematologická vyšetření na TO FNOL • Předtransfuzní vyšetření • Přešetření potransfuzní reakce • Kompletní imunohematologické vyšetření
• Prenatální vyšetření • Diagnostika hemolytického onemocnění plodu/novorozence
tepelná Specifická aloprotilátka
chladová
tepelná Autoprotilátková reakce
Specifická autoprotilátka
Pozitivní protilátkový nález
PAT pozitvní + autoprotilátky
Chladové protilátky
Nespecifické autoprotilátky
chladová
Předtransfúzní vyšetření • Definice Zahrnuje soubor organizačních opatření, laboratorních zkoušek a kontrol prováděných před podáním transfuzních přípravků nebo v situaci, kdy je jejich podání pravděpodobné.
Vzorek + žádanka o TP
6 ml K3EDTA
Typy požadavků • Plánovaný požadavek - obvykle na následující den • Statim - vyšetření je prováděno mimo rutinní provoz laboratoří, přípravek je vydán do 2 hodin od doručení vzorku na TO • Vitální indikace - přípravek je vydán bez testu slučitelnosti (univerzální dárce, popř. stejnoskupinová krev, pokud je k dispozici dřívější vyšetření)
Předtransfúzní vyšetření Příjem krevního vzorku + Žádanka o transfúzní přípravky Vyšetření KS AB0 a Rh systému
Negativní screening nepravidelných antierytrocytárních protilátek
Výběr vhodného transfúzního přípravku Zkouška kompatibility – negativní
Výsledek: vydání kompatibilního transfúzního přípravku
-
Předtransfúzní vyšetření pozitivní protilátkový nález Příjem krevního vzorku + Žádanka o transfúzní přípravky Vyšetření KS AB0 a Rh systému
Pozitivní screening nepravidelných antierytrocytárních protilátek
Identifikace nepravidelných antierytrocytárních protilátek Typování relevantních antigenů na erytrocytech pacienta
Výběr vhodného transfúzního přípravku
Provedení zkoušky kompatibility Výsledek - kompatibilní
Výsledek – inkompatibilní
Interpretace výsledků • Kompatibilní erytrocytární transfúzní přípravek: kompatibilita (shoda) transfúzního přípravku (erytrocyty dárce) se sérem příjemce (pacienta) • Kompatibilita v AB0 a RhD systému!!
• Inkompatibilní erytrocytární transfúzní přípravek: inkompatiblita mezi erytrocyty dárce a sérem příjemce • Příčiny inkompatibility: - Autoprotilátková reakce - AIHA: INKOMPATIBILNÍ x VITÁLNÍ INDIKACE
Specifická aloprotilátka/-ky • Specifická aloprotilátka/-ky (tepelná/chladová) - Jasně určená specifita aloprotilátky - Vybrat erytrocytární TP bez přítomnosti antigenu specifické aloprotilátky • Klinická závažnost protilátek proti erytrocytům
Sepcifita Rh protilátky
Klinická závažnost ANO
Kell protilátky
ANO
Duffy protilátky
ANO
Kidd protilátky Anti-S, -s
ANO ANO
Anti-A1, -P1, -N
VZÁCNĚ
Anti-M (chladové povahy)
VZÁCNĚ
Anti-M (reagující při 37 °C)
NĚKDY ANO
Anti-Lea, -Lea+b Anti-Leb
VZÁCNĚ NE
Platnost předtransfúzního vyšetření • 72 hodin od odběru vzorku (vzhledem k riziku možné imunizace) • V případě „dokřížení“ dalšího TP lze použít jen 48 starý krevní vzorek (vzorek starší než 48 hodin – nemusí poskytnout validní výsledek na sloupcové aglutinaci)
Výdej požadovaných transfúzních přípravků • Expedice vydává na základě požadavku kliniky transfúzní přípravky pracovníkovi, který doručí žádanku na výdej transfúzního přípravku • Pro transport jednotlivých přípravků musí být použit termobox CAVE: pro různé typy přípravků je nutno použít různé termoboxy!!!
Kompletní imunohematologické vyšetření • Kompletní imunohematologické vyšetření je indikováno v případě klinického podezření na diagnózu AIHA (autoimunní hemolytická anemie), dále je toto vyšetření prováděno na doporučení lékaře TO FNOL ( např. při nálezu pozitivity PAT a autoprotilátek).
Kompletní imunohematologické vyšetření - princip • Základní princip: • Imunohematologická laboratorní diagnostika autoimunitní hemolytické anemie se skládá z těchto laboratorních vyšetření: • Screening nepravidelných tepelných(chladových) antierytrocytárních protilátek a autoprotilátek • Přímý antiglobulinový test na průkaz vazby antierytrocytární autoprotilátky na vlastní erytrocyty pacienta • Eluční test z erytrocytů pacienta • Průkaz volné antierytrocytární protilátky a určení její specifity tzv. autoabsorpční test
Prenatální vyšetření • Perinatální vyšetření lze rozdělit na: – Vyšetření před porodem (prenatální, antenatální vyšetření) – Vyšetření po porodu (postnatální vyšetření)
• Přešetřujeme: – AB0 RhD (pozor D weak/variant- imunoprofylaxe matky) – Screening nepravidelných tepelných antierytrocytárních protilátek a autoprotilátek – Idnetifikace + stanovení titru
Prenatální vyšetření - význam • Smyslem souboru perinatálních imunohematologických vyšetření je včasné odhalení fetomaternální inkompatibility, která představuje rizikový faktor pro zdravý vývoj plodu a novorozence a může vyústit v závažné klinické postižení, kterým je hemolytické onemocnění novorozence. • V krajních případech může vést až ke vzniku fetálního hydropsu a intrauterinní smrti plodu. Včasná a přesná diagnostika je proto nezbytně nutná pro volbu optimální terapeutické strategie.
Účel prenatálního a postnatálního vyšetření • CÍL: prevence HON • ÚČEL: určení potenciálně rizikových těhotných z hlediska HON
Hemolytické onemocnění plodu/novorozence • Patří mezi závažné stavy v perinatologickém období • Potupy pro prenatální a postnatální vyšetření jsou v ČR jsou nejednotné • Nutno zavést jednotný algoritmus pro přešetřování imunohematologického testování v těhotenství a po porodu
Erytrocytární aloimunizace v těhotenství • Aloimunizace matky • Transplacentární přenos protilátek do fetálního krevního řečiště • Imunní destrukce senzibilizovaných krevních buněk • Klinická manifestace fetální cytopenie
Klinicky významné protilátky • Anti-D, -c, -K, -E, -C, -e, -Ce, -cE, -Fy(a), -Jk(a) • Anti-A, anti-B Těhotné s prokázanými klinicky významnými protilátkami by měly být sledovány ve speciálním režimu optimálně definovaném konsensuálním názorem příslušných odborných společností.
Klinicky nevýznamné protilátky • Anti-P1, -Le(a), -Le(b), -H, -I, -HI, -N, Lutheran • Protilátky reagující s celým panelem diagnostických erytrocytů i s vlastními erytrocyty (panspecifické protilátky) • Chladové protilátky • Protilátky reagující pouze v enzymových testech
Zvažovat individuálně • Anti-S, -s, -M, -Cw, -Ex, -Fy(b), -k, Kp(a,b), -Js(a,b), -PP1Pk, -U, Jk(b), Tj(a), -Yt(a), -LW, -Diego /Di(b)/, Gerbich, -Wr(a), -Jr(a)
DĚKUJI ZA POZORNOST
