Automatizace v imunohematologii

Masarykova univerzita Lékařská fakulta

Automatizace v imunohematologii Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant

Vedoucí diplomové práce:

Autor:

Mgr. Simona Kudlíková

Šárka Králová

Brno, duben 2013 1

Jméno a příjmení autora: Šárka Králová Název bakalářské práce: Automatizace v imunohematologii Pracoviště: Hematologicko-transfúzní oddělení, Slezská nemocnice v Opavě Vedoucí bakalářské práce: Mgr. Simona Kudlíková Rok obhajoby bakalářské práce: 2013 Souhrn: Automatizace laboratorních testů redukuje chyby spojené s ručním provedením testů a subjektivní interpretací výsledků. Automatizace je odůvodněná v oblasti imunohematologie, neboť zde jakákoli lidská chyba může mít dramatické následky pro pacienty. Zavádění automatizovaných přístrojů při vyšetřování krve zvyšuje bezpečnost pacientů i rychlost samotného úkonu. V první části své práce se zaměřuji na teoretické poznatky, vysvětluji základní imunohematologické pojmy, vztah mezi antigenem a protilátkou, popisuji rozsah vyšetření v imunohematologické laboratoři, zabývám se jednotlivými skupinovými systémy a rozdíly v rozsahu imunohematologického vyšetření dárců krve a krevních složek a pacientů. V praktické části vypracovávám přehled nejčastěji používaných automatizovaných systémů, popisuji principy stanovení a přístrojové vybavení. V závěrečné části uvádím přehled rozmístění analyzátorů jednotlivých firem v rámci České republiky a porovnávám stupeň automatizace jednotlivých analyzátorů.

Klíčová slova: antigen, protilátka, erytrocyt, krevní skupina, automatizace Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem. 2

Prohlášení autora: Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením Mgr. Simony Kudlíkové a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje. V Brně dne 25. 4. 2013

Vlastnoruční podpis autora

3

Touto cestou bych velmi ráda poděkovala vedoucí mé práce Mgr. Simoně Kudlíkové za její velkou pomoc, čas a ochotu při zpracování mé diplomové práce. Její cenné rady, připomínky a bohaté zkušenosti byly pro mě velkým přínosem. Taktéž děkuji mé rodině za velkou trpělivost a podporu během celého mého studia.

4

Použité symboly a zkratky AGH

antiglobulinum humanum (sérum proti lidské bílkovině)

AIHA

autoimunní hemolytická anémie

ČR

Česká republika

ČLS JEP

České lékařská společnost Jana Evangelisty Purkyně

DG-Gel cards gelové karty firmy Grifols HON

hemolytické onemocnění novorozenců

ID-Gel karty gelové karty firmy DiaMed Ig

imunoglobulin

KS

krevní skupina

LIS

laboratorní informační systém

LISS

roztok o nízké iontové síle

LISS/NAT

nepřímý antiglobulinový test v roztoku o nízké iontové síle

MP

microplate (mikrotitrační deska)

NAT

nepřímý antiglobulinový test

PAT

přímý antiglobulinový test

NAT

nepřímý antiglobulinový test

PC

personal computer (počítač)

Rh

Rhesus faktor, skupinový systém Rh

RhD

antigen D skupinového systému Rh

5

Cíl práce Cílem mé diplomové práce je zmapovat současné možnosti automatizace v klinických laboratořích, seznámit se s některými technologiemi, které jsou používány k vyšetřování vzorků v imunohematologických laboratořích a porovnat stupeň automatizace analyzátorů. Tato práce je vypracována jako literární rešerše, ale také na základě osobních zkušeností z laboratoří, které jsem navštívila a práce na sestavě Swig-Saxo-Lyra na Transfuzní stanici v Opavě, kde pracuji a zúčastnila jsem se jejího zavádění do provozu.

6

Obecná část 1. Základní pojmy v imunohematologii 1.1. Imunohematologie je obor vnitřního lékařství zabývající se studiem a diagnostikou vzájemných interakcí imunitního systému a krve. Zabývá se zejména detekcí antigenů erytrocytů, leukocytů, trombocytů a protilátek proti nim. Historie hematologie a transfuzního lékařství je spjata s vývojem celého vnitřního lékařství. Na počátku 20. století byly objeveny principy imunohematologie, které umožnily rozvoj oboru transfuzního lékařství a dalších oborů medicíny s transfuzí souvisejícími. „Krev každého jedince je unikátní, kromě jednovaječných dvojčat je totiž téměř nemožné najít jinou osobu „stejné krve“, tedy takovou, kde by nebyl žádný rozdíl v antigenní struktuře jednotlivých krevních buněk a složek plazmy. Rozdílnosti antigenů jsou rozpoznatelné imunitním systémem, který reaguje na nález cizorodého antigenu ve vlastním prostředí snahou o jeho odstranění, provázenou tvorbou protilátek. A právě tato část interakce imunitního systému - vztahy antigenů a protilátek - je předmětem imunohematologického zkoumání a praktické využití poznatků umožňuje zajištění optimální terapie (prevenci hemolytických transfuzních reakcí.)“ (Vnitřní lékařství, Písačka M., 2012) Rutinní imunohematologické vyšetření se provádí zejména k zajištění kompatibilních převodů transfuzních přípravků a v diagnostice a monitorování různých aloimunních a autoimunních cytopenií (např. HON) a autoimunitních stavů (např. AIHA). Se zajištěním kompatibilních transfuzních přípravků samozřejmě neodmyslitelně souvisí imunohematologické vyšetření dárců krve a jiných krevních elementů. V současné době (rok 2012) je známo 329 antigenů erytrocytů, několik desítek antigenů leukocytů a trombocytů. V oblasti HLA systému se imunohematologie prolíná s transplantační imunologií. (Transfuzní lékařství, Řeháček V., Masopust J., 2013)

7

Reakce antigen - protilátka je základní reakce v imunohematologii. 1.2. Antigen je substance, kterou imunitní systém rozpozná a reaguje na ni. Nachází se na povrchu buněk nebo je rozpustný v tělních tekutinách. Jako antigeny mohou působit různé chemické struktury. K tomu, aby na něj imunitní systém reagovat, musí být ve formě makromolekul. Antigeny jsou nejčastěji proteiny, polysacharidy, ale také lipidy a lipoproteiny. V imunohematologii se uplatňují především antigeny vázané na povrchu erytrocytů. 1.3. Epitop je malá oblast antigenu, která reaguje s vazebným místem příslušné protilátky. 1.4. Paratop je oblast variabilní části protilátky, která se specificky váže na epitop antigenu. 1.5. Protilátky jsou glykoproteiny (kromě proteinové složky tvořené aminokyselinami obsahují také složku cukernou), které vznikají jako odpověď na reakci se specifickým antigenem. Jsou to imunoglobuliny tvořené dvěma identickými těžkými a dvěma lehkými řetězci spojenými disulfidickými můstky. Mají strukturu ve tvaru písmene „Y“. Každá protilátka se váže ke specifickému antigennímu epitopu na základě komplementarity ve variabilní oblasti (Fab fragment) imunoglobulinu. Druhá část protilátky se nazývá konstantní (fragment Fc) a podle ní rozeznáváme pět tříd imunoglobulinů: IgG, IgM, IgA, IgD a IgE.V imunohematologii se setkáváme především s protilátkami třídy IgG a IgM. 1.5.1. Charakteristika jednotlivých imunoglobulinů Molekula IgG se vyskytuje jako monomer. IgG je nejvíce zastoupenou imunoglobulinovou třídou v lidském séru, vyskytuje se ve čtyřech podtřídách označovaných IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Jednotlivé podtřídy se liší silou vazby ke komplementu. IgG1 a IgG3 se váží ke komplementu silně, IgG2 jen v určitých případech, IgG4 neváže komplement vůbec. Protilátky IgG mohou procházet placentou a způsobovat např. hemolytické onemocnění novorozenců. IgM se skládá z pěti základních imunoglobulinových jednotek - tvoří pentametr. Dobře váže komplement, který může aktivovat až k hemolýze. Má deset vazebných míst. Protilátky IgM neprocházejí placentou. Ig A se vyskytuje ve dvou podtřídách, IgA1 a IgA2. Neváže komplement, ale může reagovat s antigeny v krevním oběhu. IgE se účastní především v obraně proti parazitárním infekcím a jeho hladina v séru se zvyšuje při alergických reakcích. Ig D je přítomen v séru zdravých lidí ve stopovém množství a jeho funkce není objasněna. 1.5.2. Rozeznáváme protilátky polyklonální a monoklonální Polyklonální protilátky jsou směsí imunoglobulinových molekul, jejichž vazebná místa nesou specifitu proti různým epitopům na celé molekule antigenu. Charakterizuje je vysoká avidita a obvykle i vysoká specifita. 8

Monoklonální protilátky jsou produktem jednoho klonu B lymfocytů, vykazují jedinečnou specifitu, vysokou afinitu, avšak nižší aviditu. 1.5.3. Afinita protilátky je veličina vyjadřující sílu vazby mezi jedním epitopem antigenu a vazebným místem protilátky. (Základy vyšetření v klinické imunologii, Litzman J., aj, 2011) 1.5.4. Avidita protilátky vyjadřuje sílu interakce polyvalentní protilátky s polyvalentním antigenem. (Základy vyšetření v klinické imunologii, Litzman J., aj, 2011) 1.5.5. Specifita je založena na skutečnosti, že antigen reaguje pouze s těmi lymfocyty a protilátkami jejichž tvorbu vyvolal. S ostatními lymfocyty a protilátkami obyčejně nereaguje.

2. Průběh základní reakce v imunohematologii, reakce antigen x protilátka v tekutém, polotekutém nebo gelovém prostředí lze v závislosti na čase rozdělit do dvou fází: Primární fáze - fáze senzibilizace - probíhá velmi rychle, uskutečňují se vazby jednotlivých epitopů antigenů s vazebnými místy protilátek. Tato fáze reakce není viditelná pouhým okem. Sekundární fáze - uplatňuje se multivalence antigenu (větší počet epitopů) a polyvalence protilátky. Dochází k vytváření prostorového komplexu velkého počtu molekul antigenů a protilátek o vysoké molekulové hmotnosti. Tyto komplexy jsou viditelné pouhým okem. (Základy vyšetření v klinické imunologii, Litzman J., aj, 2011) 2.1. Sekundární fázi reakce antigenu s protilátkou lze prokázat aglutinační reakcí. Aglutinační reakce je reakce korpuskulárního antigenu (aglutinogen) s protilátkou (aglutininem). V imunohematologii se jedná o erytrocytární antigeny. Aby nastala sekundární fáze reakce antigen x protilátka, je nutné, aby protilátka překonala elektronegativní zónu erytrocytu, tzv. zeta potenciál. Protilátka musí překlenout vzdálenost 7 - 8 nm a navázat se ještě na jiný erytrocyt. Velká molekula IgM, která má vzdálenost mezi vazebnými místy pro antigen 35 nm, může aglutinovat erytrocyty mnohem snadněji, než molekula IgG, která má tuto vzdálenost pouze 14 nm. Pokud vazebné síly překonají odpudivé síly zeta potencionálu, dojde ke vzniku aglutinátů, které jsou viditelné makroskopicky. Pomocí aglutinačních technik je možné vyšetřovat jak antigeny na erytrocytech, tak protilátky v séru nebo plazmě. Při přímé aglutinaci se uplatňují především protilátky IgM, které mohou svými Fab fragmenty překlenout odpudivé síly mezi erytrocyty a spojit tak antigeny na sousedních erytrocytech. IgM jsou pro tuto vlastnost označovány jako kompletní protilátky. Této vlastnosti se využívá k vyšetření antigenů krevních skupin pomocí monoklonálních nebo polyklonálních protilátek. IgG protilátky jsou označovány jako inkompletní, erytrocyty pouze senzibilizují, ale neaglutinují. K průkazu sekundární fáze reakce antigen x inkompletní protilátka je třeba použít testy antiglobulinové nebo enzymové. 2.1.1. Antiglobulinové testy ( AGH testy, Coombsovy testy) jsou nejdůležitějšími imunohematologickými testy. Lze je provádět jako:

9

2.1.1.1 Přímý antiglobulinový test (PAT) - používá se k průkazu protilátek navázaných in vivo na povrchu erytrocytů. Má uplatnění při průkazu HON, stanovení diagnózy AIHA, detekci imunitního typu hemolýzy. 2.1.1.2. Nepřímý antiglobulinový test (NAT) slouží k průkazu protilátek proti erytrocytům v séru nebo plazmě pacienta. Tímto testem lze prokázat klinicky významné nepravidelné protilátky proti erytrocytům. Je základním testem při vyšetřování testu kompatibility erytrocytárních transfuzních přípravků a také se jim prokazují antigeny některých krevních skupin. 2.1.2. Enzymové testy slouží také k průkazu senzibilizujících protilátek. Enzymy snižují elektronegativní náboj erytrocytů, odstraňují některé antigeny nebo molekuly vody z povrchu erytrocytů, snižují množství kyseliny sialové na erytrocytární membráně. Nejčastěji používané enzymy jsou bromelin, papain, ficin. 2.1.3. Hodnocení výsledků aglutinační reakce kvalitativní - průkaz přítomnosti protilátky proti danému antigenu. kvantitativní – stanovení nejvyššího ředění séra s prokazatelnou aglutinací (tzv. titrace). Pro stanovení síly reakce je všeobecně zavedený postup k hodnocení aglutinací: od negativního výsledku až po 4+ aglutinaci. Je důležitý správný přístup k odečítání a hodnocení reakcí (síla třepání, makroskopické nebo mikroskopické odečítání).

3. V imunohematologických laboratořích se provádí široké spektrum vyšetření: vyšetření krevní skupiny AB0 a RhD určování dalších erytrocytárních antigenů screening protilátek proti erytrocytům test kompatibility (předtransfuzní vyšetření) identifikace nepravidelných protilátek proti erytrocytům screeningové imunohematologické vyšetření těhotných žen vyšetření novorozence – prevence HON imunohematologické vyšetření dárců krve imunohematologická diagnostika autoimunní hemolytické anemie speciální imunohematologická vyšetření

10

3.1. ABO systém a H systém V roce 1901Karl Landsteiner popsal tři krevní skupiny A, B a C (později označeny A, B, 0), pozoroval malou skupinu lidí, a proto se mu nepodařilo zachytit čtvrtou krevní skupinu – skupinu AB. Tu popsali v roce 1902 Alfred von Decastelo a Adriano Sturli. „První, kdo správně rozdělil lidskou krev do čtyř krevních skupin, byl český psychiatr Jan Jánský. Svůj objev publikoval ve Sborníku klinickém v roce 1907 v článku „Hematologické studie u psychotiků“. Krevní skupiny označil číslicemi I, II, III a IV.“(Hematologie a transfuzní lékařství II, Penka M.,Tesařová E.,2012) 3.1.1. Antigeny AB0 jsou z chemického hlediska oligosacharidy, které jsou součástí membránových glykoproteinů a glykolipidů nebo jsou rozpuštěny v sekretech. Antigeny AB0 jsou nepřímými produkty tří alel AB0 genu, tyto geny kódují enzym glykosyltransferázu, která katalyzuje přenos specifického monosacharidu na prekurzorový H řetězec. Monosacharidy účastnící se stavby oligosacharidového řetězce AB0 antigenu jsou: N-acetyl-D glukosamin, N-acetyl-D-galaktosamin, D-glukóza, D-galaktóza, D-manóza a L-fukóza.

Obrázek č.1 Připojení jednotlivých sacharidů krevních skupin k prekurzorovému řetězci (zdroj: Skripta Imunohematologie, Čermáková Z., Kořistka M., Malušková Z.,2008) Prekurzorový H antigen je kódován H genem, který syntetizuje H-transferázu a tím umožňuje spojení fukózy a galaktózy na oligosacharidovém řetězci. H antigen je receptorem pro další sacharidy specifické pro krevní skupinu A nebo B.

11

Skupina 0 vzniká připojením sacharidu L-fukózy k prekurzorovému řetězci. Terminálním a imunodominantním monosacharidem navázaným na H-prekurzor je u skupiny A N-acetyl-D-galaktosamin, jehož připojení katalyzuje A transferáza syntetizovaná genem A. U krevní skupiny B tomu je podobně, gen B syntetizuje B transferázu a ta připojuje D-galaktózu k prekurzorovému H antigenu. „Vzhledem k existenci více prekurzorových struktur a více navzájem kompetujících transferáz je glykosylační proces výstavby ABH antigenů složitý a zatím ne zcela charakterizovaný.“ (Transfuzní lékařství, Řeháček V., Masopust J., 2013) ABH antigeny jsou geneticky nezávislé, většinou jsou syntetizovány na erytrocytárních prekurzorech v hematopoetické tkáni. Jen malá část antigenů je na erytrocyty absorbovaná z plazmy. Frekvence výskytu AB0 fenotypů v naší populaci: A

40%

B

18%

0

34%

AB

8%

Tabulka č. 1 Frekvence AB0 fenotypů (zdroj:Transfuzní lékařství, Řeháček V., Masopust J.,2013) 3.1.2. Protilátky v systému AB0 V AB0 systému se vyskytují přirozené protilátky - aglutininy anti-A, anti-B, eventuelně anti-A,B, vznikají přirozenou imunizací během prvních let života substancemi podobnými antigenům A, B. Každý jedinec má v plazmě protilátku proti antigenu, který nenese na svých erytrocytech. AB0 protilátky jsou většinou třídy IgM, ale mohou být také IgG a IgA (především u imunizovaných osob). Protilátky v AB0 systému hrají důležitou roli při vyšetření k zajištění kompatibility transfuzních přípravků a vzniku fetomaternální inkompatibility. Souvisení s nimi i rejekce transplantovaných orgánů.

12

Tabulka č. 2 Podává přehled antigenů a přirozených protilátek v AB0 systému: Skupina AB0

Antigeny na erytrocytech

Protilátky v séru

Genotyp

0

žádné

anti-A,B

0/0

A

A

anti-B

A/A nebo A/0

B

B

anti-A

B/B nebo B/0

AB

AaB

žádné

A/B

Tabulka č.2 AB0 antigeny, protilátky, genotypy (zdroj:skripta Imunohematologie, Čermáková Z. Kořístka M., Malušková A, 2008) 3.1.3. Diagnostika v AB0 systému je založena na detekci antigenů (aglutinogenů) přímou aglutinací pomocí monoklonálních diagnostických sér ( anti-A, anti-B) a vyšetření přirozených protilátek (aglutininů) pomocí známých (diagnostických) erytrocytů 0, A1, A2, B nebo jen A1 a B.

3.2. Rh systém Byl objeven Landsteinerem a Wienerem v roce 1939 v souvislosti s potransfuzní reakcí u ženy po porodu. V roce 1940 byl systém nazván Rhesus a protilátka anti-Rhesus (odvozeno od opice Macacus rhesus s jejíž krví byly prováděny pokusy). Přesto, že se později prokázalo, že lidské a zvířecí protilátky mají rozdílnou specifitu, zůstalo označení zachováno. Rh systém je nejpolymorfnějším systémem. V současné době je známo přibližně 50 antigenů Rh systému. Původní Rhesus faktor je označován jako antigen D a protilátka anti-Rh jako protilátka anti-D. 3.2.1. Antigeny Rh systému K nejvýznamnějším antigenům Rh systému patří antigeny D, C, c, E a e. Jsou kódovány dvěma geny RhD a RhCE, jejichž produkty jsou RhD a RhCcEe proteiny. Proteiny procházejí 12 krát erytrocytární membránou, vytvářejí 6 kliček, na kterých jsou lokalizovány Rh antigeny. Antigen D se skládá z více než 30 epitopů. Rh antigeny jsou exprimovány pouze na erytrocytech. Erytrocyty, které nesou na svém povrchu antigen D, jsou označovány jako RhD pozitivní, RhD negativní jedinci mají pouze RhCcEe proteiny, RhD protein chybí. Antigen D se může kvantitativně nebo kvalitativně zeslaben (D weak, D variant). C/c a E/e antigeny jsou produkovány RhCE genem. K základním Rh antigenům patří také antigen Cw, vyskytující se s nízkou frekvencí. 13

3.2.2. Protilátky v Rh systému Přirozené protilátky se vyskytují vzácně. Imunní protilátky anti-D, -C, -E, -c, -e, -Cw se tvoří po setkání s antigenem (imunizace těhotenstvím, transfuzí, transplantací), jsou třídy IgG, neaktivují komplement a jsou klinicky významné. Nejčastěji se vyskytuje protilátka anti-D. 3.2.3. Diagnostika v Rh systému Diagnostika Rh antigenů se provádí přímou aglutinací IgM protilátkami. Pro detekci slabých forem D antigenu se používají protilátky anti-D IgG a vyšetřují se NAT testem. Podle současných doporučení (pro typování antigenu Rh D na erytrocytech u příjemců transfuze krve a žen z prenatálních poraden), diagnostika anti-D by neměla detekovat parciální fenotyp DVI. Antigen D sestává z více epitopů a podle tohoto modelu, postrádají erytrocyty DVI všechny epitopy kromě tří. To znamená, že jedinci s fenotypem DVI mohou tvořit protilátku anti-D proti chybějícím epitopům po imunizaci RhD pozitivními erytrocyty během gravidity nebo po transfuzi krve. K zajištění náležitých terapeutických opatření by měli mít erytrocyty DVI u pacientů status „RhD negativní“. Naproti tomu krev dárce musí být testována s anti-D, které detekuje DVI, erytrocyty musí mít status „Rh pozitivní“ a krevní konzerva nesmí být transfundována Rh negativnímu pacientovi nebo pacientovi s parciálním D.

3.3. Kell systém Byl poprvé popsán v roce 1946 a dosud bylo identifikováno 33 antigenů. 3.3.1. Antigeny Kell systému Ze 33 antigenů tohoto systému jsou klinicky nejvýznamnější antigeny: K (Kell), k (Cellano), Kp(a) (Penny), Kp(b) (Rautenberg), Js(a) (Sutter) a Js(b) ( Matthews). (Výskyt nejdůležitějších Kell antigenů: viz tabulka č.3) Produkt KEL genu - Kell glykoprotein prostupuje 1 krát erytrocytární membránou, je asociován s XK proteinem, který prochází membránou 10 krát a nachází se na něm antigen Kx. Výskyt nejdůležitějších Kell antigenů v kavkazské populaci Antigen

K

k

Kpa

Kpb

Jsa

Jsb

Frekvence (%)

9

99,8

2,3

100

0,01

100

Tabulka č.3 Výskyt Kell antigenů v kavkazské populaci (zdroj:skripta Imunohematologie, Čermáková Z., Kořístka M., Malušková A.,2008)

14

3.3.2. Protilátky v Kell systému Kell antigen je vysoce imunogenní. Protilátky v Kell systému jsou vždy klinicky významné a mohou být příčinou těžkých hemolytických potransfuzních reakcí a HON. 3.4. Další skupinové systémy Mezi další skupinové systémy patří například systémy: Duffy, Kidd, MNS, Lewis, Lutheran, Diego, Yt, Xg, Scianna, Dombrock, Colton a další.

3.5. Screening nepravidelných erytrocytárních protilátek Screeningové vyšetření nepravidelných protilátek proti erytrocytům se provádí u těhotných a u všech předtransfuzních vyšetření (tj. u příjemců transfuzních přípravků obsahujících erytrocyty). Principem je serologická detekce neznámé protilátky pomocí známého antigenu (diagnostické erytrocyty), výsledkem této reakce je aglutinace erytrocytů. Vyšetřované protilátky jsou především třídy IgG a IgM. Používá se screeningový panel diagnostických erytrocytů krevní skupiny 0 (obvykle 3 nebo 4 typy erytrocytů), který je certifikovaný a je u něj známá skladba antigenů klinicky významných krevních skupinových systémů (Rh, MNSs, Duffy, Kell, Kidd, Lewis, Lutheran, P). U dárců krve a krevních derivátů jsou nižší požadavky na citlivost, je možné vyšetřovat screeningovými erytrocyty ve směsi („poolované“). U novorozenců, dětí do 4 měsíců věku, případně intrauterinní transfuze se provádí screening protilátek ze séra nebo plazmy matky. 3.5.1. Vyšetření nepravidelných protilátek proti erytrocytům Vyšetření nepravidelných protilátek lze provádět různými testy, základním požadavkem je detekce klinicky významných protilátek. Tento požadavek splňuje nepřímý antiglobulinový test s inkubací při 37°C. V současné době je doporučována metoda LISS-NAT (erytrocyty jsou resuspendovány v roztoku o nízké iontové síle – LISS). Lze použít i další doplňující testy, např. enzymové, PAT, testy v solném prostředí, které však nejsou povinné. Vyšetření je možné provádět ve zkumavkách, mikrotitračních deskách, sloupcovou aglutinací apod. 3.5.1.1. Aglutinační testy v solném prostředí zachycují kompletní protilátky (IgM). 3.5.1.2. Přímý antiglobulinový test je určen k detekci protilátek a složek komplementu navázaných na povrchu erytrocytu. Pozitivní PAT informuje o senzibilizaci vyšetřovaných erytrocytů. 3.5.1.3. Nepřímý antiglobulinový test (NAT) detekuje inkompletní protilátky (IgG), přítomné v séru nebo plazmě. Test se skládá ze tří fází: nejprve probíhá fáze senzibilizace, případné protilátky se navážou na diagnostické erytrocyty. Po té se erytrocyty důkladně promyjí (odstranění nenavázaných protilátek). Nakonec se k senzibilizovaným erytrocytům přidá AGH sérum, obsahující polyspecifické sérum anti-IgG + C3d. Protilátka anti-IgG (je součástí AGH séra) se naváže na protilátky IgG navázané na erytrocyty a dojde k aglutinaci. Při vyšetřování NAT gelovou aglutinací je postup jiný (viz dále).

15

3.5.1.4. Enzymové testy detekují inkompletní protilátky (IgG) v séru nebo plazmě. Používají se enzymy s proteolytickou aktivitou (papain, bromelin, ficin), jejich účinkem se redukuje negativní náboj mezi erytrocyty, čímž se zmenší vzdálenost mezi nimi a IgG protilátky následně reagují aglutinací. Enzymové testy nejsou vhodné k detekci protilátek v systému Duffy a MNS a naopak jsou výhodné pro detekci některých protilátek, např. protilátek systému Rh, Kidd, Lewis. Enzymové testy mohou být jednostupňové a dvoustupňové. Při jednostupňovém testu se enzym přidává k vyšetřovanému séru a diagnostickým erytrocytům. U dvoustupňového testu jsou erytrocyty enzymem ošetřeny předem.

3.6. Identifikace protilátek proti erytrocytům Při zachycení pozitivity protilátek screeningovým testem je třeba určit její specifitu (identifikaci). Identifikace protilátek se provádí pomocí diagnostického panelu erytrocytů. Postup je stejný, jako u screeningového vyšetření, panel však obsahuje 10 a více typů erytrocytů s vhodným antigenním zastoupením. Důležitá je kombinace fenotypů, aby byla umožněna identifikace nejčastějších protilátek. Je vhodné identifikaci doplnit enzymovým testem, provádět vyšetření při různých inkubačních teplotách. Součástí testu je vyšetření autologní kontroly.

3.7. Test kompatibility (zkouška slučitelnosti) Test kompatibility je základním testem před podáním erytrocytových transfuzních přípravků. Dochází při něm k reakci mezi vyšetřovaným sérem nebo plazmou příjemce a erytrocyty dárce transfuzního přípravku. Test kompatibility je možné provádět serologicky nebo elektronicky. 3.7.1. Při serologickém vyšetřování se používají testy, které detekují klinicky významné protilátky, lze je provést v co nejkratším čase a nedetekují protilátky bez klinického významu. V současné době je doporučováno stanovení metodou LISS-NAT sloupcovou aglutinací. Test kompatibility enzymovým testem není povinným vyšetřením. 3.7.2. Postup elektronického testu kompatibility musí být přísně validován (s vedenými záznamy o imunohematologických vyšetřeních příjemce i dárce). (Hematologie a transfuzní lékařství II, Penka M., Tesařová E., 2012). 3.7.3. Hodnocení testu kompatibility Negativní serologický test kompatibility potvrzuje správnost výběru vhodného transfuzního přípravku - AB0 kompatibilita, nepřítomnost protilátek, které nebyly zachyceny screeningovým vyšetřením (např. protilátek s nízkou frekvencí výskytu, leukocytárních protilátek, pozitivitu PAT u dárce). Ve vyjímečných případech se vydává transfuzní přípravek bez provedení testu kompatibility:

16

Vitální indikace, kdy hrozí nebezpečí z prodlení. Následně se provede kompletní předtransfuzní vyšetření a o výsledku je informováno klinické oddělení. Masivní transfuze, tj. podání více než 10 TU erytrocytů během 24 hodin nebo více než 5 TU erytrocytů během 2-3 hodin. U dalších transfuzních přípravků se pouze ověří krevní skupina (ABO a RhD). Pokud je prokázána specifická protilátka proti erytocytům, stanoven její klinický význam a provedeno dourčení antigenu korespondujícího protilátce s negativním výsledkem, volí se vhodné erytrocytární přípravky: buď negativní pro daný antigen nebo kompatibilní v NAT. Dle doporučení ČLS JEP ze dne 1. 3. 2011: „U novorozenců a dětí do 4 měsíců věku bez známek hemolytického onemocnění, bez pozitivity PAT při narození a při negativním screeningu protilátek není nutné provádět test kompatibility.“

3.8. Screeningové imunohematologické vyšetření těhotných žen Všechny ženy jsou v graviditě vyšetřovány obvykle 2 krát, v prvním trimestru kolem 12. týdne těhotenství a podruhé ve 28. týdnu. Mezi screeningová imunohematologická vyšetření patří stanovení krevní skupiny v AB0 a RhD systému a detekce nepravidelných protilátek proti erytrocytům. Vyšetřením se vyčlení ženy, kterým je po porodu, eventuelně ještě v těhotenství aplikován anti-D globulin. Vyšetření krevní skupiny a protilátek se provádí ve stejném rozsahu jako u příjemce transfuzních přípravků při předtransfuzním vyšetření. U ženy RhD negativní je větší riziko vzniku hemolytického onemocnění novorozence. Kromě protilátky anti-D se na vzniku HON mohou podílet i další protilátky, např anti-c, anti-E, anti-K, anti-A, anti-B a další. V případě pozitivního nálezu screeningového vyšetření se provádí identifikace protilátky, stanovení jejich klinického významu a určí se množství protilátky (titr). Je nutné sledování růstu titru během těhotenství, provádí se další specializovaná vyšetření ke snížení rizika poškození plodu. (Doporučení Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP č. STL2010_06 ze dne 1. 3. 2010 verze 3 (2010_06): Imunohematologická vyšetření v těhotenství a po porodu) Všem ženám RhD negativním by měl být během těhotenství nebo po porodu RhD pozitivního dítěte aplikován anti-D imunoglobulin ke snížení rizika vzniku HON při dalších těhotenstvích.

3.9. Vyšetření novorozenců-prevence HON Hemolytické onemocnění novorozence je charakterizováno zkráceným přežíváním erytrocytů plodu a novorozence, způsobené navázáním protilátek na jejich povrch. Protilátky tvoří matka po setkání s erytrocyty plodu (např. při fetomaternálním krvácení) , které nesou antigeny zděděné po otci jež matka na svých erytrocytech nemá. Imunní protilátky tvořené matkou jsou třídy IgG, mohou procházet placentou a po té se vázat na erytrocyty plodu. Senzibilizované erytrocyty jsou vychytávány ve slezině monocyto-makrofágovým systémem, uvolněný nekonjugovaný bilirubin není dostatečně eliminován z fetálního oběhu (není konjugován 17

s kyselinou glukuronovou) a protože je rozpustný v tucích a má afinitu k nervovým buňkám, může dojít k poškození CNS. 3.9.1. Imunohematologické vyšetření novorozence U novorozenců matek RhD negativních a novorozenců se známkami hemolytického onemocnění se vyšetřuje krevní skupina v AB0 a RhD systému a v indikovaných případech přímý antiglobulinový test. Vyšetření krevní skupiny AB0 se omezuje pouze na vyšetření aglutinogenů (aglutininy nejsou dostatečně vyvinuty). Vyšetření aglutinogenů se provádí 2 krát, dvěma různými klony diagnostických sér. (Doporučení Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP č. STL2010_06 ze dne 1. 3. 2010 verze 3 (2010_06): Imunohematologická vyšetření v těhotenství a po porodu. 3.9.2. Hemolytické onemocnění novorozence lze rozdělit na: AB0 HON Rh HON HON s protilátkami proti antigenům jiných krevních skupin 3.9.2.1. AB0 HON bývá způsobeno IgG protilátkami anti-A nebo anti-B většinou u matky krevní skupiny 0. IgG protilátky mohou procházet transplacentárně, vázat se na erytrocyty plodu a způsobit jejich zkrácené přežívání. AB0 HON se může projevit již u prvního těhotenství, mívá mírnější průběh. 3.9.2.2. Rh HON bývá většinou způsobeno protilátkou anti-D, anti-c, anti E, může jít také o kombinaci protilátek. Rh HON se vyskytuje u matek RhD negativních, jejichž plod zdědil po otci antigen RhD pozitivní. Matka tvoří IgG protilátky proti RhD pozitivním erytrocytům plodu, to znamená proti antigenům, které nemá na svých erytrocytech. V prvním těhotenství se většinou Rh HON nevyskytuje, při dalších těhotenstvích s RhD pozitivním plodem stoupá titr IgG protilátek, které procházejí transplacentárně a způsobují poškození erytrocytů novorozence a jejich následnou hemolýzu. 3.9.2.3. HON při protilátkách proti antigenům jiných krevních skupin má různý průběh a intenzitu. Záleží na typu protilátky, počtu těhotenství, fenotypu otce apod. Zvláštní pozornost si zasluhuje protilátka anti-Kell, která se váže na kmenové buňky v kostní dřeni a způsobuje tím útlum krvetvorby plodu.

3.10. Imunohematologické vyšetření dárců krve „Závazná imunohematologická vyšetření dárců krve a jejich složek stanovuje vyhláška č.143/2008 Sb. (v platném znění). Jsou to: vyšetření krevní skupiny AB0, RhD, screening nepravidelných protilátek proti erytrocytům. Tato vyšetření se neprovádějí u suroviny pro další výrobu, nejsou-li taková vyšetření zpracovatelem požadována.“ (Doporučení Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP č. STL 2012-09 ze dne 19. 04. 2012, Imunohematologická vyšetření dárců krve a krevních složek).

18

3.10.1. Vyšetření krevní skupiny v AB0 systému Vyšetření AB0 skupiny dárce se sestává z vyšetření aglutinogenů (antigenů A a B) na erytrocytech a aglutininů (pravidelných protilátek AB0 systému) v plazmě dárce. Vyšetření se provádí 2 krát ze dvou nezávislých vzorků, k vyšetření antigenů A a B se používají monoklonální diagnostická séra odlišných klonů, aglutininy se vyšetřují pomocí nejméně dvou diagnostických erytrocytů A1 a B, vhodné je zařadit kontrolu s vlastními nebo 0 erytrocyty. U opakovaných dárců je možné krevní skupinu vyšetřovat zjednodušeně (pomocí séra anti-A, anti-B a anti-D) a výsledek kontrolovat s předešlým záznamem. 3.10.2. Vyšetření antigenu RhD Antigen D je vyšetřován ze dvou nezávislých vzorků pomocí monoklonálních diagnostických sér anti-D třídy IgM různých klonů. Diagnostické sérum má detekovat variantní antigen DVI jako D pozitivní. Dárce s výsledkem D negativní v základním testu je nutné dovyšetřit NAT testem k průkazu slabého antigenu. (Je vhodné zařadit kontrolu falešné pozitivity „Rh kontrola“.) Slabé D: vyšetřuje se u RhD negativních dárců ze 2 nezávislých vzorků, diagnostickými séry anti-D s 2 různými klony, a to metodou NAT či jinou metodou srovnatelné citlivosti (určenou pro detekci slabého D). Diagnostická séra by měla zachytávat minimálně variantu DVI. V případě pozitivního výsledku s oběma diagnostickými séry pro vyšetření slabého D se dárce označí jako Dw/v, transfuzní přípravek jako RhD pozitivní; při jasné negativitě s oběma séry se dárce i transfuzní přípravek označí jako RhD negativní. V případě diskrepantního výsledku (s jedním diagnostickým sérem pozitivní reakce, s druhým diagnostickým sérem negativní reakce) se dárce označí jako Dw/v, transfuzní přípravek jako RhD pozitivní. V případě, že je znám typ slabého D či varianty, měla by se tato informace zaznamenat do dokumentace dárce. (Doporučení Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP č. STL2012_09 ze dne 19. 04. 2012: Imunohematologická vyšetření dárců krve a krevních složek). 3.10.3. Vyšetření dalších erytrocytárních antigenů U dárce erytrocytů se vyšetřuje Rh fenotyp: C, c, E, e, případně i Cw, přítomnost či nepřítomnost antigenu Kell (při pozitivním nálezu i antigen Cellano). U dárců krevní skupiny 0 je vhodné určit fenotyp i v dalších antigenních systémech. 3.10.4. Screening nepravidelných protilátek proti erytrocytům Přítomnost nepravidelných protilátek proti erytrocytům se detekuje screeningovým testem za použití dvou až tří diagnostických erytrocytů nebo erytrocyty ve směsi metodou NAT nebo podobně citlivou metodou. V případě pozitivního nálezu protilátek se provádí identifikace protilátky. Výsledek vyšetření pak rozhodne o vhodnosti dárce pro další dárcovství krve a krevních derivátů.

3.11. Speciální imunohematologická vyšetření Patří většinou do kompetence specializovaných pracovišť (krajských transfuzních stanic, Ústavu hematologie a krevní transfuze v Praze, transplantačních center, apod). Vyšetřují 19

antigeny vzácných krevních skupin, provádějí imunohematologická vyšetření leukocytů, trombocytů, identifikaci nepravidelných protilátek proti erytrocytům. Vysoce specializovaná centra se věnují i molekulárně genetickým vyšetření.

3.12. Autoimunní hemolytické anemie (AIHA) AIHA jsou hemolytické stavy způsobené protilátkami proti vlastním erytrocytům. Za normálních okolností je tolerance vůči antigenům vlastního těla navozena T- buněčnou tolerancí. V případě AIHA může ztráta imunotolerance vznikat různými mechanismy: nerozpoznání vlastních antigenů erytrocytů, molekulární nebo antigenní mimikry, T nebo B buněčná aktivace, chyba v centrální nebo periferní toleranci. 3.12.1. Dělení autoimunních hemolytických anemií Autoimunní hemolytické anemie lze rozdělit do 4 skupin: 3.12.1.1 AIHA s tepelnými protilátkami je definována zkráceným přežíváním erytrocytů způsobeným přítomností protilátek s tepelným optimem při 37°C. Tepelné protilátky jsou nejčastěji třídy IgG (IgG1 a IgG3), namířené většinou proti antigenům Rh systému. Navázané protilátky vedou k destrukci erytrocytů extravaskulárně ve slezině. Podle rychlosti vzniku a intenzity hemolýzy může mít onemocnění příznaky od chronické i kompenzované hemolýzy až po akutní život ohrožující stavy. U většiny pacientů je pozitivní PAT (senzibilizace IgG nebo IgG+C3 složkou komplementu nebo jen C3). Jen u malé části pacientů je PAT negativní. NAT je pozitivní pokud zůstávají v séru volné antierytrocytární protilátky nenavázané na erytrocyty. 3.12.1.2. AIHA s chladovými protilátkami je spojena s protilátkami reagujícími při teplotách nižších než 32°C. Příčina poruchy je nejasná. Chladové protilátky jsou nejčastěji třídy IgM a mají schopnost aktivovat komplement, způsobují intravaskulární hemolýzu. Patologické chladové protilátky bývají přítomny ve vysokých titrech, ve většině případů se jedná o protilátku anti-I. PAT je pozitivní - polyvalentní AGH sérum váže komplement. U pacientů s vysokým titrem protilátek může být problematické vyšetření krevní skupiny. 3.12.1.3. Paroxysmální chladová hemoglobinurie je vzácné onemocnění s přítomnosti hemoglobinurie po chladové expozici. Příčinou je tzv. Donathův-Landsteinerův hemolyzin, (většinou protilátka anti-P třídy IgG vážící komplement). PAT je pozitivní, je pozitivní Donathův-Landsteinerův test. 3.12.1.4. Hemolytické anemie indukované léky vznikají imunitními mechanismy vyvolávanými léky. Je popsáno přibližně 100 léků, které mohou být příčinou této anemie.

20

Speciální část …..Automatizace je mnohem víc, než pouhá instalace instrumentu do laboratoře……….. „Na kvalitu základních imunohematologických vyšetření jsou kladeny vysoké nároky pro jejich přímý vliv na život a zdraví příjemců transfuze, proto je trendem vývoj a zavádění spolehlivých automatických imunohematologických analyzátorů a využití výpočetní techniky (databáze minulých vyšetření, registry vzácných dárců aj.).“ (Vniřní lékařství, Písačka M.,2012,58) 1. Význam a rozvoj automatizace 1.1. Mechanizace je nahrazení ruční, fyzické práce prací stroje. V laboratoři to znamená převedení práce manuální (prováděné ve většině případů laborantkou) na práci poloautomatizovanou nebo plně automatizovanou. 1.2. Rozvoj automatizace v imunohematologii nastal až po roce 2000 a byl umožněn rozvojem výpočetní techniky. Mezi výhody automatizace patří: redukce chyb spojených s manuální manipulací redukce chyb spojených se subjektivním hodnocením výsledků zvýšení míry bezpečnosti prováděných úkonů možnost pozitivní identifikace vzorků a reagencií možnost kontroly parametrů testu objektivní hodnocení výsledků vyšetření časová a personální úspora možnost sledovatelnosti a uchovávání dat Automatizace poskytuje míru bezpečnosti, která není k dispozici při srovnání s manuálními technikami. Dává jistotu pro pracovníky laboratoře, lékaře i pacienty.

1.3. Mé osobní zkušenosti s procesem automatizace Když jsem v roce 1988 nastupovala jako zdravotní laborantka na Hematologicko-transfuzním oddělení v Opavě, stála v laboratoři na vozíčku jedna robustní kovová centrifuga Janetzki a jediný výdobytek mechanizace - centrifuga Albína, ve které bylo možné centrifugovat kovový stojánek s aglutinačními zkumavkami. V expedici byla obrovská lednice s dřevěnými rošty naplněná krevními konzervami ve skleněných lahvích. Na každé láhvi byla gumičkou připevněna „penicilinka“ se vzorkem dárcovské krve. Vyšetření zkoušky kompatibility se provádělo ve zkumavkách, inkubace Coombsova testu trvala šedesát minut a výsledek se odečítal mikroskopicky. Když jsme „měli štěstí“ a skleněné zkumavky nám při třetím propírání nepraskly, mohli jsme se trápit odečítáním erytrocytového sedimentu natřeného 21

na sklíčko, v mikroskopu. Stačilo, aby někdo nechal otevřené okno a krvinky se „krásně lepily k sobě“. Příprava transfuzí třeba pro tři pacienty někdy zabrala i celé dopoledne. O nějakém počítači jsme si mohli nechat jenom zdát. Ale dělali jsme pro pacienty to nejlepší, co jsme uměli. Dneska na to vzpomínám s úsměvem…………. …………ale vývoj medicíny a imunohematologie šel dál. Skleněné láhve byly vyměněny za „pytlíky“, které u nás zpočátku opravdu nevzbuzovali důvěru. Dnes je systém jednorázových odběrových souprav dotažen téměř k dokonalosti…. . ………místo skleněných zkumavek, které jsme museli neustále popisovat, jsme začali používat k vyšetření krevní skupiny u prenatálních poraden „elegantní“ mikrotitrační destičky, do kterých jsme si sami kapali diagnostická séra………… ………..když kolem roku 1994 moje tehdejší paní primářka MUDr.Vladimíra Heinzová přivezla ze zahraničního sjezdu „gelovou kartu“, nedovedli jsme si vůbec představit, že za 20 let bude gelová aglutinace jednou ze základních technik v imunohematologii……. …………a dnes? Mám tu čest neustále pracovat na Transfuzní stanici v Opavě. „Albína“ už dávno skončila někde na skládce železného odpadu a naše laboratoř imunohematologie je vybavena moderními přístroji, moderními lednicemi, moderními centrifugami, poloautomatizovaným systémem Swing, Saxo, Lyra………. ……………..a časem snad i plně automatizovaným analyzátorem………..

2. Automatizované a poloautomatizované techniky V imunohematologii jsou v současné poloautomatizované techniky:

době

používány

tyto

automatizované

nebo

Aglutinace na mikrotitračních deskách Techniky sloupcové aglutinace, které používají k separaci gelové nebo skleněné mikročástice Capture - techniky pevné fáze Některé přístroje kombinují více technik najednou, lze tak pokrýt více vyšetření z jednoho vzorku různými technologiemi. Požadavky na krevní vzorek Pro dosažení optimálních výsledků by mělo být testování prováděno s čerstvě odebraným vzorkem nebo vzorkem, odebraným v souladu s doporučenou laboratorní praxí. Pokud sérum nebo plazma není použita bezprostředně po oddělení, měla by být skladována maximálně 48 hodin při 2°C – 8°C. Odběr by měl být přednostně proveden do citrátu, EDTA nebo CPD-A.

22

Tabulka č. 4 Porovnává jednotlivé imunologické techniky: Tradiční

Gel

Pevná fáze

Reakční komora

zkumavka

Karta s mikrozkumavkami

jamky mikrotitrační desky

Reakční matrix

ne

Dextran-akrylamid gel

Jamky mikrotitrační desky, polystyren

Potřeba promývání

ano

ne

ano

Potřeba centrifugace

ano

ano

ano

Stabilní reakce

ne

ano (2-3 dny)

ano (2 dny)

Odečet reakce

kvantitativní,

kvantitativní,

semikvantitativní,

+ až ++++

+ až ++++

silně pozit, pozit, negat

ne

ano

ano

Možnost automatizace

Tabulka č.4 Porovnání jednotlivých imunohematologických (zdroj:Prezentace: Automatizace v imunohematologii, Zedníček O.)

technik

2.1. Aglutinace na mikrotitračních deskách Aglutinace na mikrotitračních deskách představuje jednu z možností automatizace nebo poloautomatizace. Použití mikrotitračních desek s navázanými lyofilizovanými diagnostickými séry eliminují potřebu předkapat jamky tekutými antiséry a umožňuje tak jednoduchý pracovní postup (přikápává se pouze suspenze vyšetřovaných erytrocytů). Každá testovací protilátka je standardizována tak, aby poskytla jasné a reprodukovatelné výsledky. Mikrotitrační desky jsou připraveny k přímému použití. Pro identifikaci je každá deska značena čárovým kódem. Mikrotitrační deska je překryta aluminiovou fólií, která musí být před použitím odstraněna.

23

2.2. Techniky sloupcové aglutinace Techniky sloupcové aglutinace lze rozdělit na sloupcovou aglutinaci v gelu a sloupcovou aglutinaci na skleněných mikročásticích.

Obrázek č.2 Znázornění sloupcové aglutinace v gelu (zdroj: prezentace Capture-R technologie, Košťálková H., přednáška Poděbrady 2011) 2.2.1. Sloupcová aglutinace v gelu Základem systému jsou karty tvořené plastovým nosičem rozděleným do 6 - 8 mikrozkumavek. Každá zkumavka je naplněna pufrovaným gelem. Ke stabilizovanému gelu mohou být během výroby přidána jak séra pro stanovení antigenů základních krevních skupinových systémů, tak např. antiglobulinová diagnostika (AGH). Pro enzymové testy, testy v solném prostředí či pro jiné předem nespecifikované testy slouží karta pouze s neutrálním pufrovaným gelem bez přísady dalších reakčních činidel. Každá gelová karta je překryta aluminiovou fólií, která zabraňuje vysychání a kontaminaci gelu během skladování (skladování při laboratorní teplotě). 2.2.1.1. Složení diagnostických karet Vlastní mikrozkumavky gelových karet se skládají z reakční komory a gelového sloupce. V reakční komoře probíhají senzibilizační a aglutinační reakce u nepřímých imunohematologických testů (stanovení přirozených aglutininů v séru, screening a identifikace nepravidelných protilátek, zkouška kompatibility). Pro přímé imunohematologické testy (stanovení antigenů hlavních krevních skupinových systémů, přímý antiglobulinový test) je reakční komora pouze místem, kam se pipetují vyšetřované vzorky. K vlastním aglutinačním reakcím pak dochází až v gelovém sloupci během centrifugace karty. Velikost gelových mikročástic je volena tak, aby aglutinované erytrocyty byly během centrifugace karty zachycovány v gelovém sloupci a naopak, aby volné erytrocyty snadno sedimentovaly na dno mikrozkumavky. Podle konečného rozmístění krvinek v gelovém sloupci je možné provést vyhodnocení výsledků příslušného testu. 24

2.2.1.2. Interpretace výsledků Výsledek reakce může být pozitivní či negativní. Sílu pozitivní reakce hodnotíme křížky (1 - 4). Při pozitivní reakci zůstanou erytrocyty rozptýleny v gelu nebo usazeny na povrchu gelu, při negativní reakci erytrocyty procházejí gelem a usadí se na dně gelového sloupce. Hodnocení síly reakcí: 4+ kompletní aglutinace v horní části gelového sloupce 3+ 80% krvinek v horní třetině gelového sloupce 2+ 80% krvinek ve dvou horních třetinách gel. sloupce 1+ 80% krvinek ve dvou dolních třetinách gel. sloupce +/- 100% krvinek v dolní třetině gelového sloupce - 100% krvinek na dně gelového sloupce D.P.

dvojí populace

Hemol. hemolýza Obrázek č.3 (Přednáška:Popis DG Gel systému, firma Grifols )

2.2.1.3. Výhody sloupcové aglutinace Ve srovnání se zkumavkovými metodami mají metody sloupcové aglutinace (gelové nebo na mikročásticích) zanedbatelnou výhodu v tom, že eliminuje zdlouhavé propírání vzorků u těch imunohematologických testů, při kterých se používá AGH. K senzibilizaci krvinek dochází totiž již v reakční komoře, zatím co ke kontaktu senzibilizovaných krvinek s AGH až ve sloupci během centrifugace karty. Vzhledem k tomu, že erytrocyty jsou nejtěžšími krevními částicemi, vstupují během centrifugace do kontaktu AGH dříve, než by mohlo dojít k jeho neutralizaci volnými protilátkami krevního séra. Celková doba vyšetření se tak u tohoto systému pohybuje mezi 15 až 30 minutami (v závislosti na typu vyšetření). Při použití základního technického vybavení (např.centrifuga na gelové karty a termostat na gelové karty) jde o systém vhodný pro zpracování malých sérií vzorků a rychlé zpracování jednotlivých vyšetření (statimová vyšetření). Ve své automatizované podobě jde o systém vhodný ke zpracování velkých sérií rutinních imunohematologických vyšetření. Diagnostický sloupcový systém zaručuje standardizované zpracování vyšetřovaných vzorků a umožňuje snadné odečítání výsledků. Výsledky provedených vyšetření na kartách je možné uchovávat v ledničce po dobu několika dní v nezměněné podobě. Pro potřeby archivace je rovněž možné udělat fotokopii příslušných kartiček. 25

Tabulka č.5 Síla reaktivity - srovnání s jinými metodami (Capture x zkumavka x sloupcová aglutinace) (firma Immucor)

26

2.2.2. Sloupcová aglutinace na skleněných mikročásticích 2.2.2.1. Složení diagnostických karet Karty pro sloupcovou aglutinaci na skleněných mikročásticích jsou podobné kartám gelovým. Plastová karta je tvořena 6 mikrozkumavkami, opatřenými identifikačním štítkem, uzavřenými aluminiovou fólií. Mikrozkumavky jsou naplněny skleněnými kuličkami a podle typu karty dále obsahují různé diluenty nebo antiséra.

1

2

3

4

Obrázek č.4 Sloupcová aglutinace - jednotlivé kroky (firma Ortho Clinical Diagnostic) 1. mikrozkumavka s antisérem nebo diluentem + skleněné kuličky 2. suspenze erytrocytů, antisérum, diluent, PEG (polyetylenglykol)+skleněné kuličky 3. centrifugace 4. pozitivní x negativní reakce (erytrocyty na povrchu skleněných kuliček x erytrocyty na dně mikrozkumavky) 2.2.2.2. Interpretace výsledků Výsledek reakce může být pozitivní či negativní. Sílu pozitivní reakce hodnotíme křížky (1 - 4). Při pozitivní reakci zůstanou erytrocyty rozptýleny mezi skleněnými mikrokuličkami nebo usazeny na povrchu, při negativní reakci erytrocyty procházejí sloupcem a usadí se na dně.

27

2.3. Techniky pevné fáze – Capture Solid Phase systém je metoda pevné fáze, ve které jsou prostřednictvím modifikovaných mikrojamek imobilizovány lidské erytrocyty pro detekci erytrocytárních protilátek IgG, korespondujících s antigeny na erytrocytech. Používá se pro vyšetření screeningu protilátek, identifikaci protilátek, zkoušky kompatibility nebo fenotypizaci antigenů. Princip:Viz obrázek č. 5

Obrázek č.5 Princip techniky pevné fáze (firma Immucor)

2.3.1 Princip vyšetření Capture technologií Capture-R technologie: Solid Phase Red Cell Adherence je založena na postupech podle: a Plapp a spol Juji a spol. Erytrocyty jsou nejprve imobilizovány na povrchu polystyrénových mikrojamek. Antigeny imobilizovaných erytrocytů jsou využity k navázání specifických IgG erytrocytárních protilátek. Nenavázané imunoglobuliny jsou vyprány z jamek a je přidána suspense indikátorových erytrocytů s navázanou anti-IgG. Centrifugace vede ke kontaktu indikátorových erytrocytů s protilátkami, vázanými na imobilizované membrány diagnostických erytrocytů. V případě pozitivity jsou indikátorové erytrocyty zadrženy na dně jamek tím, že na povrchu imobilizované reagenční vrstvy tvoří pevné anti-IgG-IgG kompexy. Následkem tohoto přemostění adherují indikátorové erytrocyty ke screeningovým krvinkám jako druhá imobilizovaná vrstva. Naproti tomu v případě negativního testu, nejsou indikátorové erytrocyty zadrženy vazbou při jejich migraci a usadí se uprostřed mikrotitračních jamek jako pevný terčík. 28

2.3.2. Interpretace výsledků Negativní test: Na dně testovací jamky je dobře definovaný terčík indikátorových erytrocytů, žádná oblast adherence není pozorována. Pozitivní test: Pozorována adherence indikátorových erytrocytů na části nebo celé reakční ploše.

29

3. Rozdělení imunohematologických analyzátorů Imunohematologické analyzátory lze rozdělit podle různých hledisek. 3.1. Dělení podle stupně automatizace 3.1.1. Plně automatizované analyzátory (walk away) 3.1.2. Částečně automatizované analyzátory 3.1.3. Poloautomatizované analyzátory 3.2. Dělení podle použité technologie 3.2.1. Analyzátory využívající techniky sloupcové aglutinace 3.2.2. Analyzátory využívající techniku pevné fáze 3.2.3. Analyzátory využívající aglutinaci na mikrotitračních deskách 3.2.4. Analyzátory kombinující více technik

30

4. Analyzátory a produkty jednotlivých firem

4.1. Analyzátory, přístroje a produkty firmy Grifols Grifols s.r.o, dceřiná společnost Grifols SA působí v ČR od roku 1992. Společnost se zabývá prodejem a distribucí výrobků Grifols nejen na českém trhu, ale také v dalších zemích. Hlavními oblastmi činnosti Grifols je prodej a distribuce hemoderivátů, prodej krevních vaků, souprav a zařízení pro krevní banky, prodej zařízení pro aferézy, prodej činidel a vybavení pro imunohematologii krevních skupin, fenotypizac a hemostázu. 4.1.1. WADiana je plně automatizovaný imunohematologický ( tzv.walk-away) analyzátor navržený a vyráběný společností Grifols využívající techniku sloupcové aglutinace v gelu, určený ke zpracování gelových (DG Gel) karet při stanovení krevních skupin a předtransfuzních testech.

Obrázek č.6 Analyzátor Wadiana (firma Grifols) 4.1.1.1. Popis analyzátoru Prostor pro reagencie. Pozitivní identifikace karet a reagencií pomocí čárových kódů. Diagnostické erytrocyty (screeningové, panelové, A1/B) jsou průběžně automaticky promíchávány tak, aby byla stále zajištěna homogenita suspenze. Přístroj automaticky připravuje suspenzi vyšetřovaných vzorků krve o vhodné koncentraci dle zvoleného testu. Prostor pro vzorky. Pozitivní identifikace vzorků je uskutečněna pomocí čárových kódů. Analyzátor umožňuje kontinuální vkládání vzorků. V případě potřeby je možné do přístroje vkládat vzorky, karty a reagencie kontinuálně, tj. ještě v době, kdy probíhá inkubace předešlé série vzorků. Při tomto pracovním režimu nedochází k žádným časovým ztrátám a práce na přístroji se stává vysoce efektivní. Při práci s kompletně naplněným karuselovým nosičem mohou být vzorky, které již byly rozpipetován, vyjmuty a nahrazeny vzorky novými. Spuštěné testy lze kdykoliv přerušit a po ukončení právě prováděné operace vložit statimový vzorek. Takto vložený vzorek je automaticky zpracováván přednostně před dříve vloženými vzorky (pipetování momentálně probíhajícího testu však musí být nejdříve dokončeno). Inkubační blok je rozdělen do dvou částí, které mohou být nastaveny na rozdílnou teplotu (37°C/25°C). To umožňuje současné provedení testů s různou inkubační teplotou. 31

Pipetovací rameno. Přístroj podle zvoleného testu pipetuje vzorky a reagencie do příslušných karet v inkubačním bloku. Hliníková fólie pokrývající karty je prorážena pipetovací jehlou analyzátoru. Jehla je promývána po každé operaci, což zcela vylučuje zkříženou kontaminaci Centrifugace. Vestavěná centrifuga má kapacitu maximálně 12 karet. V případě lichého počtu karet je do centrifugy automaticky vložena vyvažovací karta. Reader - odečítání výsledků. Všechny zcentrifugované karty jsou automaticky odečteny pomocí systému analýzy obrazu. Citlivost odečítání je nastavena od výrobce přístroje, je však možné ji v odůvodněných případech korigovat. Přístroj nabízí i automatickou interpretaci získaných výsledků (např. určení krevní skupiny AB0 a Rh D, pozitivit či negativity screeningu protilátek, atd.). Ovládací PC. Přístroj WADiana je řízen a ovládán pomocí PC. Všechny získané výsledky jsou ukládány v elektronické podobě, což umožňuje jejich snadné archivování a dohledávání. Veškerá vygenerovaná data mohou být také ovládacím software exportována do příslušného informačního systému na základě obecně používaného protokolu (tzv. ATSM standard). Snadné kombinování testů umožňují tzv. pracovní listy. Prostřednictvím pracovních listů jsou k jednotlivým vzorkům přiřazovány příslušné testy Přehledy výsledků. Uživatel si může podle potřeby nadefinovat uspořádání přehledů výsledků tak, aby obsahovaly všechny požadované údaje 4.1.1.2. Kapacita analyzátoru Kapacita karuselového nosiče: 48 vzorků, 16 reagencií a 2 diluenty Inkubační blok pro 24 karet Stojánek pro odkládání 12 karet s nejednoznačnými nebo diskrepantními výsledky Centrifuga s kapacitou 12 karet 2 nádrže na promývací roztoky a 1 nádrž na biologický odpad 4.1.1.3. Výkonnost analyzátoru Zkoušky kompatibility: 35 testů za hodinu (při zadání 2 krevních vaků na příjemce, antiglobulinový test) Screening protilátek: 55 testů za hodinu (diagnostické krvinky I+II, antiglobulinový test) Vyšetření krevní skupiny AB0/Rh D: 30 testů za hodinu (včetně aglutininů anti-A1 a anti-B)

32

4.1.2. Poloautomatizovaná sestava (Diana, centrifuga, reader) Firma Grifols nabízí také poloautomatizovanou sestavu, kterou tvoří procesor Diana, centrifuga a reader. V současné době není tato sestava v ČR instalována.

Obrázek č. 7 Sestava Diana procesor + DG centrifuga + Diana reader (firma Grifols)

4.1.3. Erytra Plně automatizovaný vysoce výkonnostní přístroj zpracovávající DG gel karty. V současné době není v ČR instalován.

Obrázek č.8 Analyzátor Erytra (firma Grifols)

4.1.3. Produkty firmy Grifols Firma Grifols má širokou nabídku diagnostických karet pro stanovení antigenů krevních skupin, vyšetřování nepravidelných protilátek proti erytrocytům, identifikaci protilátek, zkoušku kompatibility. Gelové karty Grifols (DG Gel cards) s profilem 8 mikrozkumavek jsou založeny na principu sloupcové aglutinace. Tento formát umožňuje provedení více testů na kartě při současném získání širší informace.

33

4.1.3.1. DG Gel® ABO/Rh (2D)

Obrázek č.9 DG Gel karta: konfigurace A-B-AB-DVI- -DVI+ -ctl.-N/A1 – N/B (firma Grifols) Karta DG Gel AB0/Rh(2D) umožňuje kompletní vyšetření krevní skupiny AB0/Rh, tj. současné vyšetření aglutinogenů a aglutininů na jediné kartě. Karta umožňuje dvojí určení D antigenu (antiséra DVI- a DVI+). Obsažena je nezbytná kontrolní mikrozkumavka ctl. Kartu není potřeba pro získání výsledku inkubovat. 4.1.3.2. DG Gel® Coombs

Obrázek č. 10 DG Gel karta: konfigurace: 8 x AGH(firma Grifols) Karta se používá k vyšetření nepřímého a přímého antiglobulinového testu (NAT a PAT). Technika NAT zahrnuje detekci a identifikaci nepravidelných protilátek, testy kompatibility, autokontrolu a určování erytrocytárních antigenů. Složení gelu: pufrovaný roztok o nízké iontové síle (LISS) s přídavkem polyspecifické protilátky proti lidskému globulinu. Směs králičích polyklonálních anti-IgG protilátek a monoklonálních IgM anti-C3d protilátek myšího původu. ®

4.1.3.3. DG Gel Neutral

Obrázek č. 11 DG Gel karta: konfigurace: 8 x (N) (firma Grifols) 34

D Gel Neutral je karta pro vyšetření solných a enzymových testů. Solné a enzymové techniky zahrnují detekci a identifikaci nepravidelných protilátek, testy kompatibility, autokontrolu, typování erytrocytárních antigenů a stanovení aglutininů systému AB0. Složení gelu:pufrovaný roztok bez příměsi protilátek (neutrální mikrozkumavky) 4.1.3.4. DG Gel Rh fenotyp + Kell

Obrázek č.12 DG Gel karta: konfigurace DVI+, C, E, c, e, Cw, Kell, Ctl (firma Grifols) Karta pro stanovení antigenů Rh a Kell systému. 4.1.3.5. Diagnostické erytrocyty Výrobce nabízí celou škálu erytrocytárních reagencií k použití technikou sloupcové aglutinace, validované pro práci s gelovými kartami. Stanovení aglutininů: erytrocytární reagencie od známých dárců skupiny A1, B a 0 ke stanovení skupinových aglutininů (konzervační roztok neinhibuje aktivaci komplementu a umožňuje tak detekci hemolýzy). Detekce nepravidelných protilátek proti erytrocytům: soubor 3 diagnostických erytrocytů s pečlivě vybranou antigenní konfigurací k detekci většiny klinicky významných nepravidelných protilátek. Každá lahvička obsahuje erytrocyty od jediného dárce skupiny 0. Na diagnostických erytrocytech jsou přítomny antigeny s homozygotní expresí: D, C, c, E, e, M, N, S, s, Fy(a), Fy(b), Jk(a), Jk(b), Lu(b), Kp(b) a k. Je možné použití souboru papainizovaných diagnostických erytrocytů. 4.1.3.6. Doplňkové roztoky a reagencie Pro zajištění standardizovaného pracovního postupu je doporučeno použití firemních reagencií. DG Gel Sol: reagencie pro přípravu erytrocytárních suspenzí DG Papain: roztok tekutého papainu k provádění enzymových testů Diana Fluid A solný roztok a Diana Fluid B tenzidový roztok používané pro interní promývání fluidního systému a jehly

35

Obrázek č.13 Diagnostika firmy Grifols

36

4. 2. Analyzátory, přístroje a produkty firmy DiaMed Společnost DiaMed byla založena v roce 1977 malou skupinou odborníků v oblasti laboratorní diagnostiky, kteří vyvíjeli a vyráběli testovací systémy, umožňující snadné použití, bezpečnost a kvalitu. V roce 1988 společnost představila DiaMed-ID Micro Typing systém. Gelový test na principu sloupcové aglutinace byl revolucí v práci imunohematologických laboratoří. DiaMed GmbH se v roce 2007 stala dceřinou společností Bio-Rad Laboratories, Inc. Firma nabízí kompletní sortiment výrobků pro imunohematologickou diagnostiku - gelovou techniku sloupcové aglutinace, mikrotitrační techniku, zkumavkovou i sklíčkovou techniku. Dále nabízí diagnostika pro některá hematologická a parazitologická vyšetření. 4.2.1. Swing TwinSampler

Obrázek č.14 Přístroj Swing TwinSampler (firma DiaMed) Swing TwinSampler je pipetor sloužící k rychlému a bezpečnému testování v laboratoři, provádí rozkapávání do mikrotitračních destiček i ID-karet. 4.2.1.1. Popis přístroje Prostor pro reagencie je tvořen polokruhovým karuselem, který má prostor pro 2 diluenty a 12 reagencií. Prostor pro vzorky je součástí polokruhového karuselu pro reagencie. Pipetovací rameno umožňuje standardizované pipetování. Ovládací PC. Komunikačním softwarem je Maestro, kde je uložena databáze vzorků. Výsledky jsou archivovány včetně obrazového záznamu. Software umožňuje napojení a komunikace s LIS. Vestavěná čtečka čárových kódů umožňuje pozitivní identifikaci vzorků, mikrotitračních desek, ID-karet a reagencií 4.2.1.2. Výkonnost přístroje Možnost pipetování až 50 vzorků za hodinu 37

4.2.1.3. Kapacita přístroje 19 vzorků 24 ID-karet 1 mikrotitrační destička 12 ID-testovacích reagencií 2 diluenty

4.2.2. Lyra MP-Reader

Obrázek č.15 Přístroj Lyra MP-Reader (firma DiaMed) Lyra MP-Reader je kombinací centrifugy mikrotitračních destiček a čtecího zařízení. 4.2.2.1. Popis přístroje Integrované čtecí zařízení čárových kódů umožňuje identifikaci mikrotitračních desek Přístroj umožňuje objektivní a standardizovaný postup čtení a interpretace výsledků. Interpretuje výsledky a zasílá je do integrálního softwaru Maestro. 4.2.2.2. Výkonnost přístroje možnost poskytnutí výsledků všech 192 jamek za méně než 7 minut 4.2.2.3. Kapacita přístroje 2 mikrotitrační destičky

38

4.2.3. Saxo ID-Reader

Obrázek č.16 Přístroj Saxo ID-Reader (firma DiaMed) Saxo ID-Reader je plně automatizovaný systém centrifugy a čtecího zařízení pro ID-karty. Zabezpečuje objektivní a standardizovaný postup čtení a interpretace výsledků. 4.2.3.1. Popis přístroje Identifikace karet pomocí čtečky čárových kódů. Komunikuje s integrálním softwarem Maestro, kterému zasílá výsledky. Objektivní a standardizovaný postup čtení a interpretace výsledků. 4.2.3.2. Kapacita přístroje 24 ID-karet

4.2.4. Sestava Swing, Saxo a Lyra Sestava funguje jako poloautomatizovaný imunohematologický analyzátor umožňující stanovení antigenů krevních skupin, screening a identifikaci nepravidelných protilátek proti erytrocytům (NAT nebo enzymovým testem), zkoušku kompatibility a PAT. Sestava umožňuje zpracovávat gelové ID-karty systémem sloupcové aglutinace a mikrotitrační desky nevyžadující promývací roztok. Stanovení je založeno na tradiční hemaglutinační technologii. 4.2.4.1 Popis přístroje Čtečka čárových kódů zajišťuje pozitivní identifikací vzorků, mikrotitračních desek, ID-karet a reagencií. Je kontrolován objem vzorků a reagencií včetně diagnostických erytrocytů. Ovládací PC. Sestava je řízena integrálním softwarovým produktem Maestro. Databáze vzorků, testy a výsledky včetně obrazového záznamu jsou automaticky archivovány. 39

Nové výsledky vyšetření jsou porovnávány s předchozími a software upozorní na eventuální nesrovnalosti. Poloautomat umožňuje obousměrnou komunikaci s LIS.

4.2.5. Techno TwinStation s příslušenstvím Lyra-MP Reader

Obrázek č.17 Analyzátor Techno TwinStation (firma DiaMed) Techno TwinStation je imunohematologický plně automatický analyzátor, který kombinuje testování mikrotitračních destiček a ID-karet. Umožňuje stanovení antigenů krevních skupin, screening nepravidelných antierytrocytárních protilátek, identifikaci protilátek, zkoušku kompatibility a PAT na základě tradiční hemaglutinační technologie. Je to plně automatizovaný systém pro vyšetřování na ID-kartách. Pro mikrotitační desky slouží jako rozkapávač a inkubátor, tyto desky je možno odečíst na MP-Readeru Lyra. 4.2.5.1. Popis přístroj Dvě nezávisle pracující centrifugy Dvě nezávisle pracující čtečky čárových kódů zajišťují bezpečnost systému pomocí pozitivní identifikace vzorků, mikrotitračních desek, ID-karet i jednotlivých stripů pomocí čárového kódu. Ovládací PC. Sestava je řízena integrálním softwarovým produktem Maestro. Testy i výsledky včetně obrazového záznamu jsou archivovány. Nové výsledky jsou automaticky porovnávány s předchozími a jsou kontrolovány eventuální diskrepance. Automat umožňuje obousměrnou komunikaci s LIS.

4.2.5.2. Výkonnost přístroje Schopnost analyzovat až 60 ID-karet (360 vzorků) za hodinu 40

4.2.5.3 Kapacita analyzátoru 36 vzorků 48 ID-karet 3 mikrotitrační destičky 24 ID testovacích reagencií 2 diluenty

4.2.6. ID GelStation Classic

Obrázek č.18 Analyzátor ID GelStation Classic (firma DiaMed) ID GelStation Classic je plně automatický systém pro vyšetřování na ID-kartách. Analyzáror umí ID karty automaticky napipetovat, inkubovat a také centrifugovat. Následně, díky robotickému ramenu, tyto ID karty odečíst kamerou a vyhodnotit reakce. Ovládací PC.Sestava je řízena integrálním softwarovým produktem Maestro.Testy i výsledky včetně obrazového záznamu jsou archivovány. Nové výsledky jsou automaticky porovnávány s předchozími a jsou kontrolovány eventuální diskrepance. Automat umožňuje obousměrnou komunikaci s LIS.

41

4.2.7. IH-1000

Obrázek č. 18 Analyzátor IH-1000 (firma DiaMed) IH – 1000 je plně automatizovaný systém pro imunohematologickou diagnostiku prováděnou na ID-kartách. Součástí analyzátoru jsou 2 nezávislé pipetovací stanice, (3.rameno pouze pro transport karet), 3 centrifugy, zásobník pro 240 ID-karet. V současné době není v ČR instalován.

4.2.8. Gelové karty DiaMed Firma DiaMed nabízí širokou škálu diagnostických karet pro vyšetření krevní skupiny, screening protilátek proti erytrocytům, identifikaci protilátek, vyšetření fenotypu RhD, typování antigenů jednotlivých krevních skupinových systémů. Je možné použít různé kombinace pro různou úroveň doporučených vyšetření. 4.2.8.1. AB0/D + Reverse Grouping Konfigurace A, B, D, ctl/A1, B je určena pro vyšetření pacientů, umožňuje kombinované stanovení aglutinogenů na krvinkách a stanovení aglutininů v séru nebo plazmě a dále stanovení RhD.

Obrázek č.19 ID-karta: konfigurace AB0/D+Reverse Grouping (firma DiaMed) ID-Karta „AB0/D + Reverse Grouping“ obsahuje v gelové matrix anti-A, které je směsí polyklonálních protilátek a monoklonální protilátky (klon A5), dále obsahuje polyklonální 42

protilátky lidského původu anti-B a anti-D. Mikrozkumavka ctl je negativní kontrola. Dvě mikrozkumavky s neutrálním gelem slouží pro stanovení aglutininů v séru s diagnostickými erytrocyty A1 a B. ID-karta „AB0/D + reverse grouping“ neobsahuje anti-AB a umožňuje použití pouze erytrocytů A1 a B. Karta může být použita k testování krevní skupiny pouze v souladu s doporučenou laboratorní praxí. Kontroly: v souladu s platnými zásadami kontroly kvality by měly být do testování zahrnuty známé pozitivní a negativní vzorky. V tabulce č.6 je znázorněno hodnocení výsledků vyšetření aglutinogenů AB0 krevní skupiny:

Tabulka č.6 Hodnocení AB0 krevních skupin (firma DiaMed) Reakce slabší než +++ mohou indikovat přítomnost podskupiny. Pro bezchybnou interpretaci je nutno provézt kompletní stanovení aglutinogenů na erytrocytech (anti-A, anti-B, anti-AB). V případě výskytu slabé nebo velmi slabé exprese antigenů mohou být reakce negativní. V tabulce č.7 hodnocení reakcí při vyšetření aglutininů

Tabulka č.7 Hodnocení vyšetření aglutininů (firma DiaMed) V případě výskytu sporných reakcí, je vhodné opakovat stanovení aglutininů se 4 typy diagnostických erytrocytů (A1, A2, B, 0). Hodnocení reakcí RhD v tabulce č.8 :

Tabulka č.8 Hodnocení reakcí RhD(firma DiaMed) * stopové nebo slabé reakce by měly být podrobeny dalšímu vyšetření za účelem rozličení mezi slabým D a parciálními typy antigenu D přiměřeně tomu o jaký testovaný vzorek se jedná. 43

4.2.8.2. ID-Karta LISS/Coombs je určena pro vyšetření nepřímého a přímého antiglobulinového testu.

Obrázek č.20 ID- karta: konfigurace: anti-IgG + C3d (firma DiaMed) Polyspecifické antihumánní globulinové reagencie (AGH) se používají pro rutinní detekci nepravidelných protilátek proti erytrocytům identifikaci nepravidelných protilátek proti erytrocytům zkoušky kompatibility přímý antiglobulinový test (PAT) Nejdůležitější funkcí polyspecifického AGH je detekce přítomnosti IgG. Pozitivní PAT zpravidla indikuje senzibilizaci erytrocytů in vivo imunoglobuliny a/nebo komplementem. Mikrozkumavky ID-Karty „LISS/Coombs“ obsahují polyspecifické AGH. Při provedení nepřímého antiglobulinového testu (NAT) odpadají náročné promývací kroky vzhledem k tomu, že před přidáním séra/plazmy je do mikrozkumavek nejdříve pipetována suspenze erytrocytů, která nad gelovou suspenzí vytváří bariéru a brání neutralizaci AGH sérovými IgG proteiny. Antihumánní IgG globulin, použitý v ID-LISS/Coombs není specifický vůči lehkým řetězcům a proto může být také schopen reagovat s lehkými řetězci kappa a lambda molekul IgA a IgM. ID-Karta LISS/Coombs je vhodná pro PAT, zkoušku kompatibility, screening a identifikaci protilátek s diagnostickými erytrocyty „ID-DiaCell“ a „ID-DiaPanel. 4.2.8.3. ID-Karta NaCl, Enzyme Test and Cold Agglutinins je určena pro vyšetření solného testu, enzymového test a chladových protilátek Techniky v solném prostředí se používají k detekci protilátek, které reagují převážně při 4°C nebo při 18°C-25°C (laboratorní teplotě), například protilátky anti-M, -N, -P1, -Le(a), -Le(b), -I. Enzymové techniky jsou užitečné tam, kde je při detekci protilátek screeningovými testy vyžadována vyšší citlivost metod. Zesilují reakce určitých protilátek, zvláště v systémech Rh, Kell a Kidd. Protože proteolytické enzymy obvykle ničí některé antigeny (například M, N, S,s, Fy (a), Fy (b)), nesmí být nikdy enzymová technika pouze jedinou vyšetřovací metodou.

44

4.2.8.4. Rh-supergroups + Cw + K je ID karta pro stanovení Rh fenotypů včetně Cw a Kell

Obrázek č.21 ID-karta: konfigurace: C, Cw, c, E, e, K (firma DiaMed)

4.2.8.5. Diagnostické erytrocyty pro ID-Micro Typing System Diagnostické erytrocyty pro screening nepravidelných protilátek proti erytrocytům se používají v různých kombinacích podle požadavku na vyšetření. Firma DiaMed nabízí 4 kombinace dianostických erytrocytů: ID-DiaCell I-II ID-DiaCell I-II-III ID-DiaCell I-II-III P (papainizované) ID-DiaCell Pool

Obrázek č.22 Diagnostické erytrocyty 0, A1, A2, B (firma DiaMed)

Spolehlivost detekce protilátek je závislá na dostupnosti diagnostických erytrocytů s vhodnými antigeny a na citlivosti použitých testovacích postupů. Konfigurace antigenů musí umožnit bezpečné stanovení všech klinicky významných protilátek. Pro systémy Rh, MNSs, Duffy a Kidd musí být antigeny přítomny v homozygotní sestavě. Přítomny musí být také 45

antigeny Lewis a vzácný antigen Kp(a). Firma tyto požadavky splňuje a nabízí diagnostické erytrocyty, které na svém povrchu nesou klinicky významné antigeny. 4.2.8.6. Mikrotitrační desky DiaMed Firma DiaMed nabízí mikrotitrační desky v různých konfiguracích: DiaMed-MP Test slouží pro stanovení AB0/RhD krevní skupiny, na mikrotitračních deskách jsou navázány lyofilizované monoklonální protilátky.

Obrázek č.23 Mikrotitrační deska a reagencie (firma DiaMed) Pro stanovení 12 (respektive 24) krevních skupin včetně vyšetření aglutininů firma nabízí mikrotitrační desky v kombinacích: 1. anti -A, -B,-AB, -D(VI-), ctl./ erys A1, A2, B 2. anti -A, -B, -D(VI-), -D(VI+), ctl./ erys A1, A2, B 3. anti -A, -B,-AB, -D(VI-), -D(VI+) ctl./ erys A1, B 4. anti -A, -B, -D(VI+), ctl./ anti -A, -B, -D(VI+), ctl. 5. anti -A, -B,-AB, -D(VI-), ctl./ erys A1, B, 0 Pro stanovení 8 krevních skupin na mikrotitrační desce včetně vyšetřování aglutininů nabízí mikrotitrační desky v kombinacích: 1. anti -A, -B,-AB, -D(VI-), -D(VI+), ctl./ erys A1, A2, B, 0 2. anti -A, -B,-AB, -D(VI-), (VI+), ctl./ erys A1, A2, B, 0 DiaMed-MP Test slouží pro stanovení fenotypu Rh a Kell (mikrotitrační desky s lyofilizovanými monoklonálními protilátkami). Na jedné mikrotitrační desce je možno provézt typování antigenů u 16 vzorků.

46

V tabulce č.9 je znázorněna interpretace výsledků fenotypu systému Rh:

Tabulka č.9 Hodnocení reakcí fenotypů Rh (firma DiaMed) Iinterpretace výsledků Kell antigenu:

Tabulka č.10 Hodnocení reakcí Kell (firma DiaMed)

4.2.8.7. Další doplňkové roztoky a reagencie Pro zajištění standardizovaného pracovního postupu je doporučeno použití firemních reagencií. ID-Diluent 1 je modifikovaný bromelinový roztok speciálně připravený pro použití v IDSystém. ID-Diluent 1se používá k přípravě suspenzí krvinek pro stanovení krevních skupin a také jako aditivum do enzymových testů, ve kterých se používají enzymaticky neošetřené erytrocyty, například při detekci protilátek a testu kompatibility.

Obrázek č.24 Diluent 1 (firma DiaMed) ID-Diluent 2 je modifikovaný LISS pro přípravu suspenze erytrocytů. Roztok s nízkou iontovou silou (LISS-low ionic strenght solution) zvyšuje vazebnou schopnost protilátek a tím zesiluje reakci antigen x protilátka. ID-Diluent 2 je v ID-Systemu určený jak pro přípravu 5% suspenzí erytrocytů při stanovení krevních skupin, tak i pro přípravu 0,8% suspenzí erytrocytů pro zkoušky kompatibility, autokontroly, PAT, stanovení krevních skupin novorozenců. 47

Obrázek č.25 Diluent 2 (firma DiaMed)

48

4.3. Analyzátory, přístroje a produkty firmy Ortho Clinical Diagnostics Ortho Clinical Diagnostics (společnost Johnson & Johnson) je na světovém trhu několik desítek let, zabývá se diagnostikou v transfuzním lékařství a spolupracuje s laboratořemi, nemocnicemi a krevními centry po celém světě. Nabízí komplexní řešení pro screening, diagnostiku a sledování různých onemocnění. 4.3.1. AutoVue Innova AuteVue Innova je plně automatizovaný imunohematologický analyzátor využívající techniku sloupcové aglutinace na skleněných mikročásticích.

Obrázek č.26 Analyzátor AutoVue Innova (firma Ortho Clinical Diagnostic) 4.3.1.1. Popis analyzátoru Prostor pro reagencie. Pozitivní identifikace reagencií a diagnostických karet pomocí čárových kódů Prostor pro vzorky. Pozitivní identifikace vzorků pomocí čárových kódů. Plně automatizovaná příprava suspenze erytrocytů. Možnost provádění statimových vyšetření. Inkubační blok je integrovaný Pipetovací rameno zajišťuje standardizované rozkapávání Centrifuga je integrovaná Reader je integrovaný Ovládací PC. Instrumentační operace jsou řízené ORTHO AutoInnova software. Systém nabízí předdefinované programy obsluhy a dohledatelnost vykonaných činností. Příslušenstvím je dotyková obrazovka. Neočekávané události jsou hlášeny pomocí vizuálních a zvukových alarmů. Software nabízí možnost propojení s LIS.

49

4.3.1.2. Kapacita analyzátoru 42 vzorků 12 typů diagnostických karet 4 pozice pro karty určené k opakovanému odečtení (diskrepance)

Obrázek č.27 Pohled na obrazovku přístoje (firma Ortho Clinical Diagnostic)

4.3.2. Diagnostické karty pro sloupcovou aglutinaci Firma nabízí širokou škálu diagnostických karet pro vyšetření krevní skupiny, screeningu protilátek, vyšetření Rh a Kell fenotypu. Je možné použít různé kombinace pro různou úroveň doporučených vyšetření.

Jako příklad uvádím některé karty z nabídky firmy. Karty pro vyšetření krevní skupiny AB0/Rh D, fenotypu, PAT, NAT.

Obrázek č.28 Karta: konfigurace: anti-A, anti-B, anti-A,B, anti-D, anti-CDE, kontrol (firma Ortho Clinical Diagnostic) 50

Obrázek č.29 Karta: konfigurace: anti-A, anti-B, anti-D, anti-A, anti-B, anti-D (firma Ortho Clinical Diagnostic)

Obrázek č.30 Karta: konfigurace: anti-C, anti-E, anti-c, anti-e, anti-K, ctl (Rh fenotyp + K) (firma Ortho Clinical Diagnostic)

51

4.4. Analyzátory, přístroje a produkty firmy Immucor Firma APR na českém trhu zastupuje americkou společnost Immucor. K vyšetřování krevních skupin na analyzátorech používají přímou aglutinací na mikrotitračních deskách. K vyšetřování screeningu a identifikaci protilátek používají tzv.metodu pevné fáze, nebo-li metodu Capture.

Obrázek č. 31 Vývoj analyzátorů používající Capture technologii (firma Immucor) Aglutinaci na mikrotitračních destičkách a metody pevné fáze využívají plně automatizované imunohematologické analyzátory - Galileo ECHO, Galileo a Galileo NEO. 4.4.1. Analyzátor Galileo Galileo je plně automatizovaný analyzátor kombinující aglutinační metody v mikrotitračních jamkách a citlivé metody pevné fáze pro screening a identifikaci antierytrocytárních protilátek a antiglobulinové testy.

Obrázek č.32 Analyzátor Galileo (firma Immucor)

52

4.4.1.1. Popis analyzátoru Prostor pro reagencie. Integrovaná čtečka čárových kódů zabezpečuje pozitivní identifikace diagnostik a stripů včetně šarže, exspirace a individuálního kódu lahvičky v rámci šarže. Analyzátor provádí automatickou kontrolu množství diagnostik a materiálů pro zadané testy. Umožňuje doplňování diagnostik a spotřebního materiálu i během činnosti přístroje bez nutnosti jeho zastavení nebo čekání na dokončení probíhajících procesů. Prostor pro vzorky. Integrovaná čtečka čárových kódů umožňuje pozitivní identifikaci vzorků. Analyzátor umožňuje doplňování vzorků během činnosti přístroje bez nutnosti jeho zastavení nebo čekání na dokončení probíhajících procesů Inkubační blok je integrován Pipetovací rameno je integrováno Centrifuga je integrována Reader s CCD barevnou kamerou Ovládací PC. Součástí analyzátoru je monitor s dotykovou obrazovkou. Zadávání požadavků lze provádět manuálně nebo prostřednictvím LIS. Jsou víceúrovňová práva obsluhy s identifikací a ochranou individuálním heslem. 4.4.1.2. Výkon analyzátoru v závislosti na konfiguraci testů 100-150 KS a protilátek za hodinu

4.4.2. Galileo ECHO Analyzátor Galileo ECHO je plně automatizovaný kompatibilní stolní analyzátor, vhodný pro menší a střední laboratoře, který používá stripové technologie. Možnost přidávání vzorků za provozu, možnost vyšetření dle priorit. 4.4.2.1. Kapacita analyzátoru 20 vzorků 16 reagenčních lahviček 32 stripů

4.4.3. Galileo NEO Plně automatický imunohematologický analyzátor. Představuje čtvrtou generaci plně automatických přístrojů pro krevní banky. Je navržen pro vysokoobjemové laboratoře. 53

Obrázek č. 33 Analyzátor Galileo Neo (firma Immucor) (a) (b) (c) (d) (e) (f)

Uživatelské rozhranní založené na Windows, ovládané dotykovou obrazovkou Lineární prostor vkládání vzorků a reagentů umožňující vložení až 224 vzorků Duální pipetor pro současné paralelní zpracování vzorků a desek Vež vkládání desek, modul promývačky, modul inkubátoru, reader analyzující obrázky Modul centrifugy Samostatný modul kapalin

4.4.4. Capture-R Ready –Screen (Pooled Cells) Jsou diagnostické krvinky používané se k detekci nepravidelných IgG protilátek proti erytrocytům poloautomatizovanou nebo plně automatizovanou metodou, která využívá přilnavosti (adherence) erytrocytů k pevné fázi. Capture-R Ready-Screen (Pooled Cells) reagent není doporučen pro předtransfuzní testování k detekci nepravidelných protilátek v sérech pacientů. 4.4.4.1. Reagenty pro Capture-R Ready- Screen Capture-R Ready-Screen se skládají z jednotlivých stripů o osmi jamkách s navázanými a vysušenými erytrocytárními membránami směsi, tvořené erytrocyty 0 od dvou dárců. 12 stripů po 8 jamkách je uloženo v transportním rámečku a uzavřeno ve fóliovém sáčku s absorbentem a indikátorem vlhkosti. Každý strip je připraven k okamžitému použití. Stripy se mohou používat jednotlivě nebo hromadně. Stripy vytažené ze sáčku musí být použity během 8 hodin.Master List je dokument, který je součástí každé šarže Capture-R Ready-Screen, je v něm uveden kód a antigenní skladba každého dárce erytrocytů, které byly použity k přípravě sušené jednolité vrstvy reagentu. Indicator Red Cells (indikátorové erytrocyty) představují suspenze erytrocytů s navázanými molekulami myších monoklonálních anti-lidských IgG . Positive Control Serum (Weak) je pozitivní kontrolní sérum slabé reaktivity, obsahuje protilátky proti erytrocytům. 54

Negative Control Serum je negativní kontrolní sérum, neobsahuje žádné protilátky proti erytrocytům. 4.4.4.2. Odečítání výsledků – sleduje se přítomnost nebo nepřítomnost adherence indikátorových erytrocytů. Pokud nejsou pozorovány správné reakce s Capture-R kontrolními séry, mohou být výsledky testů chybné. 4.4.4.3. Interpretace výsledků Negativní test: Na dně testovací jamky je dobře definovaný terčík indikátorových erytrocytů, žádná oblast adherence není pozorována. Pozitivní test: Pozorována adherence indikátorových erytrocytů na části nebo celé reakční ploše. 4.4.5. Capture-R Ready Screen (3) Capture-R Ready-Screen se vyrábí jako tříkrvinkový set skupiny 0, vhodný pro automatické a poloautomatické metody detekce nepravidelných IgG protilátek proti erytrocytům na pevné fázi. Jednotlivé antigeny, vytypovaných dárců, jsou uvedeny na Master Listu. 4.4.5.1. Reagenty pro Capture-R Ready- Screen (3) Capture-R Ready-Screen (3) se skládají z jednotlivých stripů o osmi jamkách s navázanými a vysušenými erytrocytárními membránami skupiny 0 od 3 různých dárců, čtvrtá jamka je využita jako positivní kontrola. 4.4.6. Capture-R Select Reagent Capture-R Select slouží k in vitro testování séra nebo plazmy nebo k využití typových antisér k detekci interakce mezi antigenem a protilátkou. Vybrané erytrocyty, které se vážou na Capture-R Select mikrojamky stripů jsou pak inkubovány s testovaným sérem/plazmou nebo antisérem za podmínek, které usnadňují detekci interakce mezi antigenem a protilátkou. Capture-R Select se používá při detekci protilátek, vyšetření zkoušky kompatibility nebo vyřešení problému při identifikaci protilátek provedením fenotypizace erytrocytárních antigenů. Zvolené diagnostické erytrocyty jsou vázány k testovacím jamkám a inkubovány se sérem pacienta. Po dokončení testu je získán vzorec negativních a pozitivních reakcí, který pomůže vyřešit detekci nebo identifikaci protilátky nebo protilátek proti erytrocytům. Při vyšetření zkoušky kompatibility jsou erytrocyty dárce vázány ke Capture-R Select testovacím jamkám. Následně jsou krvinky inkubovány v přítomnosti séra nebo plazmy pacienta (příjemce). Pozitivní testy znamenají, že má příjemce vytvořené protilátky, namířené proti antigenům na erytrocytech dárce. Negativní test znamená, že nejsou přítomny detekovatelné IgG protilátky proti antigenům dárce. Při fenotypizaci antigenů jsou erytrocyty dárce nebo pacienta navázány na Capture-R Select testovací jamky. Navázané erytrocyty jsou inkubovány s vybraným antisérem a měly by být testovány paralelně v autologní kontrole. Pozitivní výsledek testu se zvoleným antisérem znamená přítomnost korespondujícího antigenu, pokud je autologní kontrola negativní. Pozitivita, zjištěná v autologní kontrole znamená neplatnost výsledku testování. Negativita, 55

zjištěná jak s použitým antisérem, tak v autokontrole znamená nepřítomnost korespondujícího antigenu na testovaných erytrocytech. 4.4.6.1. Reagenty pro Capture-R Select U Capture-R Select jsou mikrojamky stripů jsou potaženy imunologickým vazebným agens – vzájemně se přitahujícími protilátkami a to anti-myšími protilátkami kozího původu a anti-erytocytárními ( anti-RBC) protilátkami. Dvanáct stripů po 8 jamkách jsou uloženy v transportním rámečku a uzavřeny ve foliovém sáčku společně s absorbentem a indikátorem vlhkosti. Každá destička stripů je připravena k přímému použití. Stripy mohou být použity jednotlivě nebo hromadně. Erytrocytární reagent jsou komerčně vyráběné diagnostické erytrocyty k detekci a identifikaci protilátek. 4.4.6.2. Omezení použitelnosti Capture-R Select produkt je určen při vyšetření zkoušky kompatibility pouze pro detekci inkompatibilit, způsobených IgG protilátkami. Zkouška kompatibility vyšetřením vzorků pacientů s erytrocyty dárce ( IgG RBC crossmatch) není určena pro detekci inkompatibilit, vyvolaných IgM protilátkami, jako například AB0 inkompatibility. Pokud je detekce inkompatibilit IgM nezbytná, pak musí být provedena křížová zkouška tzv.okamžitou centrifugací. Screening protilátek, prováděný s poolovanými erytrocyty nebude tak citlivý, jako ta vyšetření, která zahrnují nepoolované, tedy jednotlivé erytrocyty. Poolované erytrocyty nesmí být používány při vyšetřování křížové zkoušky. Negativní reakce se mohou objevit, když testované sérum obsahuje příliš nízkou koncentraci přítomné protilátky. Neexistuje jediná metoda, která by byla schopna detekovat všechny protilátky. 4.4.7. Capture-R Ready Indicator Cells Anti-IgG-coated Indicator Cells jsou indikátorové erytrocyty s navázanými anti-IgG protilátkami se používají k detekci IgG protilátek proti erytrocytům soupravami Capture-R Ready-Screen, Capture-R Ready-ID nebo Capture-R Select, které používají systém pevné fáze. Capture-R Ready Indicator Red Cells jsou indikátorové erytrocyty. Na erytrocyty od jednoho dárce nebo na poolované erytrocyty je navázána myší monoklonální anti-lidská protilátka IgG. Reagent je připraven jako erytrocytární suspenze v pufrovaném a konzervačním roztoku, obsahujícím adenosin a adenin k omezení hemolýzy a ztráty antigenity během stanovené doby použitelnosti. Jako konzervační látky jsou přidány chloramfenikol, neomycin sulfát a gentamycin sulfát. Skladují se při 1°C - 10°C, pokud se právě nepoužívají. Reagent je dodáván v lahvičkách s kapátkem, připravený k okamžitému použití.

56

Závěr Ve své diplomové práci jsem se pokusila zmapovat současné možnosti automatizace v České republice. Snažila jsem se seznámit s nejčastěji uplatňovanými technologiemi, které jsou používány k vyšetřování vzorků v imunohematologických laboratořích. Absolvovala jsem stáž na úseku imunohematologie v Ústavu hematologie a krevní transfuze v Praze, kde jsem měla tu možnost seznámit se s technologiemi, které na našem oddělení nepoužíváme. Seznámila jsem se s přístrojovým vybavením: Transfuzního oddělení Fakultní nemocnice v Brně Transfuzní oddělení Fakultní nemocnice v Olomouci Transfuzního oddělení Fakultní nemocnice v Ostravě-Porubě Transfuzního úseku Centrální laboratoře nemocnice v Krnově Krevní banky Zlín Baťova nemocnice Pracuji na Hematologicko-transfuzním oddělení Slezské nemocnice v Opavě a pravidelně pracuji na poloautomatizované sestavě firmy DiaMed Swing-Saxo-Lyra. Navázala jsem kontakt se zástupci jednotlivých firem, které dodávají přístrojové vybavení do imunohematologických laboratoří a snažila jsem se získat co nejvíce informací o zařízeních, analyzátorech a reagenciích. V současné době jsou na našem trhu analyzátory, které umožňují plnou automatizaci, ale i poloautomatizované sestavy které je možno kombinovat podle potřeb příslušných laboratoří. Vybrala jsem si některé analyzátory a uvádím přehled jejich rozmístění v tabulkách č. 11, 12, 13 a 14. Nejširší zastoupení má na našem trhu firma DiaMed (přibližně 47% ze sledované skupiny), jejichž analyzátory využívají princip gelové aglutinace a aglutinace na mikrotitračních deskách. Firma distribuuje jak plné automaty, tak poloautomatizované sestavy. Dále je to firma Grifols, která zaujímá asi 14% (ze sledované skupiny) na českém trhu, využívá gelovou aglutinaci. Firma Ortho Clinical Diagnostic jako jediná umožňuje vyšetřování na skleněných mikročásticích a tuto technologii využívá 8 % laboratoří ze sledované skupiny. Analyzátory firmy Immucor jako jediné používají techniku pevné fáze a kombinují ji v analyzátorech s aglutinací na mikrotitračních deskách, kterými lze vyšetřovat na 3 analyzátorech. Zaujímají asi 30% na českém trhu (ze sledované skupiny).

57

Přehled rozmístění analyzátorů jednotlivých firem v rámci České republiky: Přístroje firmy DiaMed Brno Onkologický ústav

Centrální laboratoř

Swing Twin Sampler sestava

Frýdek Místek

Krevní centrum

Swing Twin Sampler sestava

Klatovy nemocnice

Transfuzní oddělení

Swing Twin Sampler sestava

Opava nemocnice

Transfuzní oddělení

Swing Twin Sampler sestava

Praha FN Motol

Krevní banka

Swing Twin Sampler sestava

Praha Prevedig

Soukromá laboratoř

Swing Twin Sampler sestava

Praha Thomayerova fakultní nemocnice

Transfuzní oddělení

Swing Twin Sampler sestava

Praha Thomayerova fakultní nemocnice

Transfuzní oddělení

Swing Twin Sampler sestava

Sokolov nemocnice

Transfuzní oddělení

Swing Twin Sampler sestava

Šumperk nemocnice

Centrální laboratoř

Swing Twin Sampler sestava

Uherské Hradiště nemocnice

Transfuzní oddělení

Swing Twin Sampler sestava

Zlín krajská nemocnice

Transfuzní oddělení

Swing Twin Sampler sestava

Znojmo nemocnice

Transfuzní oddělení

Swing Twin Sampler sestava

Brno FN Bohunice

Transfuzní oddělení

Techno Twin Station

České Budějovice Krajská nemocnice

Transfuzní oddělení

Techno Twin Station

Olomouc FN

Transfuzní oddělení

Techno Twin Station

Olomouc FN

Transfuzní oddělení

Techno Twin Station

Ostrava FN

Transfuzní oddělení

Techno Twin Station

Praha FN Bulovka

Krevní banka

Techno Twin Station

Praha VFN pracoviště Zbraslav

Transfuzní oddělení

Techno Twin Station

Šumperk Transfúzní služba

Transfuzní oddělení

Techno Twin Station

Ústí n/L Krajská zdravotní

Transfuzní oddělení

Techno Twin Station

Brno FN Bohunice

Transfuzní oddělení

ID-Gel Station

Pardubice krajská nemocnice

Transfuzní oddělení

ID-Gel Station

Pardubice krajská nemocnice

Transfuzní oddělení

ID-Gel Station

Tabulka č.11 Rozmístění přístrojů firmy DiaMed

58

Přístroje firmy Immucor Nemocnice Litomyšl

Transfuzní oddělení

Galileo ECHO

Orlickoústecká nemocnice

Transfuzní oddělení

Galileo ECHO

Svitavská nemocnice

Transfuzní oddělení

Galileo ECHO

Nemocnice Na Františku (Citylab)

OKBH

Galileo ECHO

ÚHKT

Speciální imunohemat. Lab.

Galileo ECHO

ÚHKT

Dárcovská laboratoř

Galileo

FN UVN

Dárcovská laboratoř

2x Galileo

FN UVN

Imunohematologická lab.

Galileo NEO

FN Hradec Králové

Dárcovská laboratoř

Galileo

FN Hradec Králové

Expedice

Galileo

FN Hradec Králové

Expedice

Galileo ECHO

Nem. Havlíčkův Brod

Transfuzní oddělení

Galileo

Nem. Benešov

Transfuzní oddělení

Galileo

Nem. Chomutov

Transfuzní oddělení

Galileo

Eurexmedic

OKBH

Galileo

Nem. Liberec

Transfuzní oddělení

Galileo NEO

Tabulka č.12 Rozmístění přístrojů firmy Immucor

Přístroje firmy Grifols TTO FN Brno-Bohunice

Transfuzní oddělení

WADiana

THO Oblastní nemocnice Kolín

Transfuzní oddělení

WADiana

TO KNL Liberec

Transfuzní oddělení

WADiana

P&R LAB a.s. (Agel)

Centrální laboratoř

WADiana

SPADIA LAB a.s.

Centrální laboratoř

WADiana

FTO VFN v Praze

Transfuzní oddělení

WADiana

OLM Středomoravská nemocniční a.s. (Agel)

Centrální laboratoř

WADiana

HTO Oblastní nem. Trutnov

Transfuzní oddělení

WADiana

Tabulka č.13 Rozmístění přístrojů firmy Grifols

Přístroje firmy Ortho Clinical Diagnostic Nemocnice na Homolce, Praha 4

Krevní banka

AutoVue Innova

Zlín Baťova nemocnice

Krevní banka

AutoVue Innova

Synlab Praha

Centrální laboratoř

AutoVue Innova

Synlab Brno

Centrální laboratoř

AutoVue Innova

Tabulka č.14 Rozmístění přístrojů firmy OrthoClinical Diagnostic 59

Graf č.1 Rozmístění imunoanalytických přístrojů firem DiaMed, Immucor, Grifols a Ortho v České republice

Znázornění použité technologie a stupeň automatizace u jednotlivých analyzátorů Přístroje

Firma

Swing Twin Sampler sestava

DiaMed

Použitá technologie

Stupeň automatizace

Sloupcová aglutinace-gel

Částečná

MP Techno Twin Station

DiaMed

Sloupcová aglutinace-gel

Plná

MP

Částečná

ID-Gel Station

DiaMed

Sloupcová aglutinace-gel

Plná

Galileo ECHO

Immucor

Technika Capture

Plná

Galileo

Immucor

Technika Capture

Plná

MP Galileo NEO

Immucor

Technika Capture

Plná

MP WaDiana

Grifols

AutoVue Innova

Ortho Clinic Diagnostic

Sloupcová aglutinace - gel

Plná

Sloupcová aglutinace skleněné mikročástice

Plná

Tabulka č 15. Použitá technologie a stupeň automatizace 60

-

Z mého přehledu v tabulce č. 15 vyplývá, že firmy Immucor, Grifols a Ortho Clinic Diagnostic dodávají na český trh jen plně automatizované analyzátory. Pouze firma DiaMed nabízí jak plně, tak částečně automatizované přístroje. Techniku sloupcové aglutinace využívají analyzátory a přístroje: Swing Twin Sampler sestava, Techno Twin Station, ID-Gel Station, WaDiana, AutoVue Innova. Techniku pevné fáze využívají analyzátory: Galileo ECHO, Galileo NEO, Galileo Techniku aglutinace na mikrotitračních deskách využívají analyzátory: Swing Twin Sampler sestava, Techno Twin Station, Galileo, Galileo NEO.

Na trhu jsou i některé další firmy, které nabízejí automatické nebo poloautomatické analyzátory, ale tyto jsem nezahrnula do své práce. Zmíním se o nic tedy jen okrajově: Na českém trhu jsou také analyzátory firmy Dynex, které využívají techniku sloupcové aglutinace a aglutinaci na mikrotitračních deskách. Spektrum vyšetření – krevní skupiny, screening protilátek, fenotypizace antigenů krevních skupin. Tuto firmu jsem nekontaktovala a neměla jsem možnost se seznámit s jejími produkty. Firma Hebios Diagast využívá techniku aglutinace na mikrotitračních deskách, ale v současné době není instalován v ČR žádný automatizovaný analyzátor této firmy. Firma Biorad také nabízí produkty linie ScanGel využíjící sloupcovou aglutinaci v gelu a v ČR je instalován jeden přístroj HemOS SP II TwinSampler.

61

Výhody automatizace Pozitivní identifikace vzorků a reagencií (snížení rizika záměny) Standardizace jednotlivých vyšetření Objektivní interpretace výsledků Ekonomičnost laboratorních vyšetření Úspora času Personální úspora Splnění požadavků na správnou laboratorní praxi Sledovatelnost a správa dat Možnost napojení na laboratorní informační systém a další systémy Zvýšení bezpečnosti práce zdravotnického personálu Nevýhody automatizace Vysoká pořizovací cena přístroje Nemožnost instalace metod od jiného výrobce – uzavřené systémy Zvýšené nároky na zdravotnický personál

Cíl své práce jsem splnila, zmapovala jsem současné možnosti automatizace a seznámila jsem se s nejčastěji používanými technologiemi v imunohematologických laboratořích. Porovnala jsem stupeň automatizace vybraných analyzátorů. Získané cenné informace uplatním ve své budoucí práci v oboru imunohematologie.

62

Chtěla bych na závěr poděkovat zástupcům jednotlivých firem a odborníkům v oblasti imunohematologii za cenné rady při přípravě této práce a za jejich velikou trpělivost. Jmenovitě: Janě Pozlerové Ing. Vítu Oramovi Mgr. Filipu Čápovi Mgr. Heleně Košťálkové Miroslavě Králové

63

Seznam použité literatury: Penka M., Tesařová E. Hematologie a transfuzní lékařství I. Praha: Grada, 2011. ISBN 97880-247-3459-0 Penka M., Tesařová E., Hematologie a transfuzní lékařství II. Praha: Grada, 2012. ISBN 97880-247-3460-6 Řeháček V., Masopust J. Transfuzní lékařství. Praha: Grada, 2013. IBSN 978-80-247-4535-3 Bartůňková J., Paulík M. Vyšetřovací metody v imunologii. Praha: Grada, 2005. ISBN 80247-0691-1 Penka M., Buliková A. Neonkologická hematologie, 2. vydání. Praha: Grada, 2009. IBSN 978-80-247-2299-3 Litzman J., Freiberger T., Král V., Thon V. Základy vyšetřování v klinické imunologii. Brno: Masarykova univerzita, 2011. ISBN 978-80-210-4227-8 Čermáková Z., Kořístka M., Malušková A. skripta Imunohematologie, Ostrava: Ostravská univerzita, 2008 Transfuze a hematologie dnes. Časopis Společnosti pro transfuzní lékařství a České hematologické společnosti. Ročník 17, říjen 2011 Přednášky a prezentace: Blood Banking and Immunohaematology Basics, Nadine Veltz, Product Support Coordinator, Ortho Clinical Diagnostics Blood Banking and Immunohaematology Basics 2, Nadine Veltz, Product Support Coordinator, Ortho Clinical Diagnostics ORTHO BioVue Systém, Nadine Veltz, Product Support Coordinator, Ortho Clinical Diagnostics OCD CAT System and Competition, Nadine Veltz, Product Support Coordinator, Ortho Clinical Diagnostics BioVue Products-Cassettes and Regents, Nadine Veltz, Product Support Coordinator, Ortho Clinical Diagnostics AutoVue Innova, , Nadine Veltz, Product Support Coordinator, Ortho Clinical Diagnostics Capture-R technologie, Košťálková H., přednáška Poděbrady 2011

64

Automatizace v imunohematologii-včera, dnes a zítra?, Zedníček O., LAB-MED Systems s.r.o. Pracovní návody Micro Typing Systém, Pozlerová J. EurexMedica s.r.o. Standardní operační postupy, Hematologicko-transfuzní oddělení SN v Opavě

Internetové odkazy http://www.cls.cz/dokumenty/ http://www.uvn.cz/ http://www.apr.cz/ http://www.eurexmedica.cz/ http://www.grifols.com/ http://www.orthoclinical.com/ http://www.cls.cz/cls-jep clanek/imunohematologie-historie-soucasny-stav-poznani-a-rolehttp://www.vnitrnilekarstvi.cz/vnitrni-lekarstvi-uhkt-38883 http//www.tribune.cz/clanek/2999 http://www.conferencepartners.cz/transfuze

65

Obsah Obecná část 1. Základní pojmy v imunohematologii ................................................................................. 7 1.1. Imunohematologie .............................................................................................. 7 1.2. Antigen ................................................................................................................ 8 1.3. Epitop .................................................................................................................. 8 1.4. Paratop ................................................................................................................ 8 1.5. Protilátky ............................................................................................................. 8 2. Základní reakce v imunohematologii ................................................................................ 9 2.1. Aglutinační reakce ........................................................................................... 9 2.1.1. Antiglobulinové testy ........................................................................... 9 2.1.2. Enzymové testy .................................................................................... 10 2.1.3. Hodnocení výsledků ............................................................................. 10 3. Vyšetření v imunohematologických laboratořích .............................................................. 10 3.1. ABO systém a H systém ................................................................................... 11 3.1.1. Antigeny AB0 ...................................................................................... 11 3.1.2. Protilátky v systému AB0 .................................................................... 12 3.1.3. Diagnostika v AB0 systému ................................................................. 13 3.2. Rh systém .......................................................................................................... 13 3.2.1. Antigeny Rh systému ........................................................................... 13 3.2.2. Protilátky v Rh systému ....................................................................... 14 3.2.3. Diagnostika v Rh systému .................................................................... 14 3.3. Kell systém ......................................................................................................... 14 3.3.1. Antigeny Kell systému ........................................................................ 14 3.3.2. Protilátky v Kell systému ..................................................................... 15 3.4. Další skupinové systémy ..................................................................................... 15 3.5. Screening nepravidelných erytrocytárních protilátek ......................................... 15 3.5.1. Vyšetření nepravidelných protilátek proti erytrocytům ....................... 15 66

3.6. Identifikace protilátek proti erytrocytům ............................................................ 16 3.7. Test kompatibility ............................................................................................... 16 3.7.1. Serologické testy kompatibility............................................................ 16 3.7.2. Elektronický test kompatibility ............................................................ 16 3.7.3. Hodnocení testu kompatibility ............................................................. 16 3.8. Screeningové imunohematologické vyšetření těhotných žen ............................ 17 3.9. Vyšetření novorozenců-prevence HON .............................................................. 17 3.9.1. Imunohematologické vyšetření novorozence ....................................... 18 3.9.2. Hemolytické onemocnění novorozence rozdělení ................................ 18 3.10. Imunohematologické vyšetření dárců krve ....................................................... 18 3.10.1. Vyšetření krevní skupiny v AB0 systému .......................................... 19 3.10.2. Vyšetření antigenu RhD ..................................................................... 19 3.10.3. Vyšetření dalších erytrocytárních antigenů ........................................ 19 3.10.4. Screening nepravidelných protilátek proti erytrocytům ..................... 19 3.11. Speciální imunohematologická vyšetření ........................................................ 19 3.12. Autoimunní hemolytické anemie (AIHA) ....................................................... 20 3.12.1. Dělení autoimunních hemolytických anemií...................................... 20 Speciální část ........................................................................................................................ 21 1. Význam a rozvoj automatizace .......................................................................................... 21 1.1. Mechanizace........................................................................................................ 21 1.2. Rozvoj automatizace v imunohematologii .......................................................... 21 1.3. Mé osobní zkušenosti s procesem automatizace ................................................. 21 2. Automatizované a poloautomatizované techniky .............................................................. 22 2.1. Aglutinace na mikrotitračních deskách ............................................................... 23 2.2. Techniky sloupcové aglutinace ........................................................................... 24 2.2.1. Sloupcová aglutinace v gelu................................................................. 24 2.2.2. Sloupcová aglutinace na skleněných mikročásticích ........................... 27 67

2.3. Techniky pevné fáze – Capture ........................................................................... 28 2.3.1 Princip vyšetření Capture technologií ................................................... 28 2.3.2. Interpretace výsledků ........................................................................ 29 3. Rozdělení imunohematologických analyzátorů ................................................................. 30 3.1. Dělení podle stupně automatizace....................................................................... 30 3.2. Dělení podle použité technologie ........................................................................ 30 4. Analyzátory a produkty jednotlivých firem ....................................................................... 31 4.1. Analyzátory, přístroje a produkty firmy Grifols ................................................. 31 4.1.1. WADiana.............................................................................................. 31 4.1.2. Poloautomatizovaná sestava (Diana, centrifuga, reader) ..................... 33 4.1.3. Erytra .................................................................................................. 33 4.1.3. Produkty firmy Grifols ......................................................................... 33 4. 2. Analyzátory, přístroje a produkty firmy DiaMed ............................................. 37 4.2.1. Swing TwinSampler ............................................................................. 37 4.2.2. Lyra MP-Reader ................................................................................... 38 4.2.3. Saxo ID-Reader .................................................................................... 39 4.2.4. Sestava Swing, Saxo a Lyra ................................................................ 39 4.2.5. Techno TwinStation ............................................................................. 40 4.2.6. ID GelStation Classic ........................................................................... 41 4.2.7. IH-1000 ............................................................................................... 42 4.2.8. Gelové karty DiaMed .......................................................................... 42 4.3. Analyzátory, přístroje a produkty firmy Ortho Clinical Diagnostics................. 49 4.3.1. AutoVue Innova .................................................................................. 49 4.4. Analyzátory, přístroje a produkty firmy Immucor .............................................. 52 4.4.1. Analyzátor Galileo .............................................................................. 52 4.4.2. Galileo ECHO ..................................................................................... 53 4.4.3. Galileo NEO ........................................................................................ 53 68

4.4.4. Capture-R Ready –Screen (Pooled Cells) ........................................... 54 4.4.5. Capture-R Ready Screen (3) ................................................................ 55 4.4.6. Capture-R Select ................................................................................. 55 4.4.7. Capture-R Ready Indicator Cells ......................................................... 56 Závěr ..................................................................................................................................... 57 Seznam použité literatury ................................................................................................... 64 Obsah .................................................................................................................................... 66

69