INFEKČNÍ SÉROLOGIE Parazitologie
IMUNOENZYMATICKÉ SOUPRAV Y K DIAGNOSTICE TOXOPLAZMÓZY Toxoplasma gondii ELISA a IMUNOBLOT soupravy jsou určeny ke stanovení specifických protilátek třídy IgA, IgE, IgG a IgM v lidském séru nebo plazmě
Úvod
Toxoplasmóza je parazitární onemocnění, jehož původcem je prvok Toxoplasma gondii. Jedná se o parazita se složitým vývojovým cyklem, který se vyskytuje v několika morfologicky odlišných stádiích. Primárním hostitelem jsou kočkovité šelmy. Člověk a ostatní teplokrevní obratlovci se mohou nakazit buď primárně infikovanou potravou (nedostatečně tepelně upravené maso) nebo pozřením oocyst (znečištěné prsty, předměty atd.). Získaná toxoplasmóza probíhá u imunokompetentních jedinců obvykle asymptomaticky nebo jen s mírnými příznaky (lymfadenopatie, subfebrilie, únava) a bez následků. Závažnější projevy onemocnění (encefalitida, hepatitida, myokarditida, generalizovaná forma) mohou nastat u imunokompromitovaných jedinců, kteří jsou navíc ohroženi i reaktivací latentní infekce. Vrozená toxoplasmóza je způsobena přenosem infekce z matky na plod. Primoinfekce matky krátce před otěhotněním nebo v graviditě může vést k abortu, porodu mrtvého dítěte nebo porodu dítěte s různým stupněm poškození (kalcifikace mozku, hydrocefalus, poruchy zraku, ovlivnění duševního vývoje).
Diagnostika onemocnění Diagnostika onemocnění je založena na klinickém obrazu, epidemiologické anamnéze a laboratorních testech. Přímá detekce parazita není dostupná pro rutinní diagnostiku. Významnou roli v diagnostice hraje sérologie. Screening - stanovení celkových protilátek metodou KFR Stanovení specifických protilátek třídy IgA, IgE, IgM a IgG metodou ELISA, případně konfirmační metodou IMUNOBLOT
Protilátková odpověď
Titr protilátek
IgG Avidita IgG
KFR IgM IgA
IgE 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Měsíce
ELISA IgM protilátky:
IgE protilátky:
Vysoce senzitivní marker akutní infekce
Vysoce specifický marker akutní infekce
Mohou přetrvávat déle než rok po prodělání akutní infekce
Přetrvávají méně než 6 měsíců po prodělání akutní infekce
IgA protilátky:
IgG protilátky:
Senzitivní a specifický marker akutní infekce
Přetrvávají dlouhodobě (mnoho let)
Přetrvávají 6-9 měsíců po prodělání akutní infekce
Zajišťují ochranu před novou infekcí Stanovení avidity umožňuje přesnější určení fáze onemocnění
Použití souprav Diagnostika toxoplazmózy: vhodná je kombinace stanovení celkových a specifických protilátek třídy IgA, IgE, IgM a IgG včetně testu avidity
Antigen Purifikovaný a inaktivovaný nativní antigen T. gondii (RH kmen)
Princip testu Souprava IgG je založena na sendvičovém typu ELISA metody
Pracovní postup Soupravy IgA, IgE a IgM jsou založeny na capture typu ELISA metody
Sandwich ELISA
Capture ELISA
HRP
HRP
Anti-Hu IgG
Tracer
Ag
IgG
Krok č.
Kroky testu
1
Ředění vzorků
2
Dávkování kontrol a ředěných vzorků 100 µl
3
Inkubace 60 min. při 37 °C
4
Odsátí a promytí jamek 5 krát
5
Dávkování Konjugátu nebo Traceru 100 μl
6
Inkubace 60 min. při 37 °C
7
Odsátí a promytí jamek 5 krát
8
Dávkování substrátu (TMB-Complete) 100 μl
9
Inkubace 20 min. při 37 °C
séra/plazmy (1+100)
blank = prázdná jamka
blank = prázdná jamka
IgM
Ag
Anti-Hu IgM
Mikrotitrační destička
Mikrotitrační destička
Tracer: antigen T. gondii + protilátka anti-p30 značená HRP
10
Dávkování Zastavovacího roztoku 100 μl
11
Fotometrické měření při 450 nm
Barevně odlišené reagencie Zaměnitelnost komponent Barevně značené stripy s odlamovacími jamkami CUT-OFF kontrola
včetně blanku
Charakteristiky souprav
Uživatelský komfort Komponenty v pracovním ředění
včetně blanku
ELISA
Diagnostická Diagnostická citlivost specifita
EIA Toxoplasma IgA
96,9 %
99,0 %
EIA Toxoplasma IgE
96,9 %
99,0 %
EIA Toxoplasma IgG
98,9 %
99,2 %
EIA Toxoplasma IgM
96,4 %
97,9 %
Semikvantitativní hodnocení výsledků (Index pozitivity-IP) Kalibrátory (EIA Toxoplasma IgG) Kvantitativní hodnocení výsledků IgG (IU/ml)
Výhody souprav
Interpretace výsledků
Vysoká diagnostická účinnost
IgE
IgA
IgM
IgG
–
–
+
–
+
+
+
slabě
+
Akutní infekce
+
+
+
+
Akutní infekce
–
+
+
+
Akutní infekce nebo postakutní stav
–
slabě
+
+
+
Postakutní stav
–
–
+
+
Postakutní stav nebo latentní infekce
–
–
–
+
Latentní infekce
–
–
–
–
Přítomnost protilátek neprokázána
Hodnocení
Dobrá reprodukovatelnost Vysoká dynamika testů
Akutní infekce (zřídka)
Identický pracovní postup Celková doba vyšetření 1,5 hodiny Aviditní test (EIA Toxoplasma IgG) Vhodné pro otevřené automatické systémy Možnost nezávislé verifikace (CKS) Komplexní zákaznický servis
IMUNOBLOT Princip testu
Použití souprav
Elektroforeticky separované antigeny Toxoplasma gondii jsou přeneseny na nitrocelulózovou membránu.
Diagnostika toxoplazmové infekce; konfirmační test ELISA vyšetření Podrobné stanovení přítomnosti protilátek proti specifickým antigenům T. gondii
P E
Po přidání substrátu vzniká reakcí s enzymem nerozpustný barevný produkt
Enzymem konjugovaná sekundární protilátka se váže na primární protilátku Specifická primární protilátka se váže na protein
Specifický protein antigenu Ag
Nespecifický protein antigenu
Stanovení kongenitální toxoplazmózy – porovnání imunitního profilu sér matky a dítěte
Uživatelský komfort Komponenty v pracovním ředění Barevně odlišené reagencie Zaměnitelnost komponent Negativní a pozitivní kontrola Kontrolní linie na stripu
Blokátor Strip
Ag
Možnost softwarového vyhodnocení
Pracovní postup
Antigeny Za specifický je považován antigen o Mr = 30 kDa (p30). Cut-off line Start
Krok č.
Kroky testu
1
Dávkování Univerzálního roztoku 2 ml
2
Smáčení stripů 10 min. při lab. teplotě
3
Odsátí
4
Ředění vzorků
5
Dávkování kontrol a ředěných vzorků 1,5 ml
6
Inkubace 60 min. při lab. teplotě
7
Odsátí a promytí v Univerzálním roztoku 3 krát 1,5 ml po 5 min.
8
Dávkování Konjugátu 1,5 ml
9
Inkubace 60 min. při lab. teplotě
třepačka
séra/plazmy (8 µl+1,5 ml)
35 kDa 30 kDa
Charakteristiky souprav
třepačka
třepačka
třepačka
10
Odsátí a promytí v Univerzálním roztoku 3 krát 1,5 ml po 5 min. třepačka
Immunoblot
Diagnostická citlivost
Diagnostická specifita
11
Dávkování substrátu (BCIP/NBT) 1,5 ml
BLOT Toxoplasma IgA
90,9 %
92,9 %
12
Inkubace 10 min. při lab. teplotě
BLOT Toxoplasma IgG
91,7 %
91,7 %
13
Odsátí a promytí v destilované vodě 2 krát 2 ml po 5 min.
BLOT Toxoplasma IgM
90,9 %
99,5 %
14
Nalepení a vyhodnocení stripů
třepačka
třepačka
Výhody souprav Jednoduchá interpretace a reprodukovatelnost výsledků
Vhodné pro automatické systémy
Vysoká diagnostická účinnost
Komplexní zákaznický servis
Klinická data
6 5
Séroprevalence a dynamika protilátek třídy IgG u dárců krve (ČR) Titr protilátek
4
Dárci krve (n = 483)
3 2
Pozitivní (n = 119) (séroprevalence)
Negativní (n = 364)
25%
75%
1
Hraniční
0
Vzorky
Avidita Stanovení avidity protilátek IgG Avidita protilátek vyjadřuje pevnost vazby mezi antigenem a protilátkou. Při primární infekci se tvoří nejprve protilátky s nízkou aviditou. V průběhu infekce imunitní odpověď organismu vyzrává a avidita protilátek narůstá. V latentní fázi onemocnění jsou protilátky vysoce avidní a při sekundární infekci nebo reaktivaci produkují paměťové B-buňky ihned IgG protilátky s vysokou aviditou. Stanovení avidity protilátek IgG umožňuje přesnější určení fáze nákazy.
100 8
80
IA (%)
70
11
60
10
6
6 3
0
2 0
30
0
5
5 4
40
10
3
6
3
50
20
6
9
90
0 0
0 0
0
A B Pacientské vzorky A-H
0
C
D E F G H Časový interval v měsících (2-11) od 1. testování (0)
1. vzorek 2. vzorek 3. vzorek 4. vzorek
INFEKČNÍ SÉROLOGIE Související produkty
Objednací údaje Ordering Information ELISA
KFR
Kód
Název soupravy
TgA096
EIA Toxoplasma IgA (capture)
TgE096
Počet testů
Kód
Název soupravy
96
TgKF02
Toxo – CF – Ag lyophil. (0,2 ml)
EIA Toxoplasma IgE (capture)
96
TgKF05
Toxo – CF – Ag lyophil. (0,5 ml)
TgG096
EIA Toxoplasma IgG
96
Tg-KF1
Toxo – CF – Ag lyophil. (1 ml)
TgM096
EIA Toxoplasma IgM (capture)
96
KFAs00
CF – AMBOCEPTORset (0,5 ml)
xxxTLN
CKS negativní (dle seznamu na www.testlinecd.cz)
3,5 ml
KFAs01
CF – AMBOCEPTORset (1 ml)
xxxTLP
CKS pozitivní (dle seznamu na www.testlinecd.cz)
3,5 ml
KFC001
CF – COMPLEMENT (1 ml)
TgKFN2
Toxo – CF – Negative Control lyophil.
TgKFP2
Toxo – CF – Positive Control lyophil.
IMUNOBLOT Kód
Název soupravy
Počet testů
TgAB16
BLOT Toxoplasma IgA
16
TgGB16
BLOT Toxoplasma IgG
16
TgMB16
BLOT Toxoplasma IgM
16
Kontakt
TestLine Clinical Diagnostics s.r.o. Křižíkova 68 612 00 Brno, Česká republika Tel.: +420 549 121 205 (237, 238) Fax: +420 541 243 390 E-mail:
[email protected]
www.testlinecd.cz
TestLine Clinical Diagnostics s.r.o. je držitelem certifikátů ISO 9001:2008 a ISO 13485:2003.
