Rapid-VIDITEST Calprotectin-Lactoferrin Blister (Jednokrokový blisterový test pro diagnostiku kalprotektinu a laktoferinu)
Návod k použití soupravy Výrobce: VIDIA spol. s r.o., Nad Safinou II č. 365, Vestec, 252 42 Jesenice u Prahy, ČR, tel: 261 090 565, web: www.vidia.cz
POUŽITÍ: Rapid-VIDITEST Calprotectin-Lactoferrin Blister je rychlý imunochromatografický (neinvazivní) test pro kvalitativní detekci kalprotektinu a laktoferinu ve vzorcích lidské stolice, který lze využít při diagnostice zánětlivých gastrointestinálních onemocnění. ÚVOD: Kalprotektin je protein vázající vápníkový ion a tvoří 5% z celkových a 60% z cytoplazmatických proteinů neutrofilů. Má bakteriostatické a fungicidní vlastnosti a jeho hladina ve stolici je šestkrát vyšší než v plazmě. Stanovení tohoto biomarkeru ve stolici je vhodným ukazatelem při diagnostice nespecifických střevních zánětů. Nespecifické střevní záněty (IBD, zkratka z angl. Inflammatory bowel disease) zahrnují Crohnovu chorobu a ulcerózní kolitidu a jsou spojeny se zvýšenou hladinou neutrofilů. Stanovení koncentrace kalprotektinu ve vzorku stolice je důležité pro odlišení funkčních poruch zažívacího ústrojí od zánětlivých postižení. Vyšetření tohoto biomarkeru je jednoduché a neinvazivní, což je zvláště vhodné u dětí, protože tam vyžaduje kolonoskopické vyšetření celkovou anestézii. Kromě toho test slouží k predikci relapsu onemocnění. Laktoferin je glykoprotein produkovaný neutrofily, mononukleárními fagocyty a epiteliálními buňkami a je obsažen v sekrečních tekutinách, jako jsou sliny a mateřské mléko. Laktoferin blokuje růst bakterií tím, že snižuje dostupnost železa pro bakterie, přičemž tento bakteriostatický efekt je zesilován přítomností specifických antibakteriálních sekrečních IgA protilátek. Laktoferin může ve spolupráci s lysozymem také přímo poškozovat buněčné stěny bakterií. Dojde-li k zánětu v gastrointestinálním traktu, migrují neutrofilní fagocyty k zánětlivému ložisku a uvolňují granula obsahující laktoferin. Laktoferin je ve stolici stabilní a snadno detekovatelný imunochemickými metodami. Hladina tohoto markeru je zvýšená u pacientů se zánětlivými střevními onemocněními. Nespecifické střevní záněty, tj. ulcerózní kolitida a Crohnova choroba, představují choroby charakteristické akutními i chronickými záněty gastrointestinálního traktu. Děti a dospělí s IBD mohou vykazovat řadu nespecifických klinických příznaků (bolesti břicha, průjem). PRINCIP TESTU: Rapid-VIDITEST Calprotectin-Lactoferrin Blister je kvalitalitativní imunochromatografický test pro stanovení kalprotektinu a laktoferinu ve vzorcích stolice. V testovacích zónách membrány blisteru jsou navázány myší polyklonální protilátky proti kalprotektinu a laktoferinu. V průběhu testování vzorek reaguje s barevnými částicemi, na kterých jsou navázány protilátky proti lidskému kalprotektinu a laktoferinu a které byly předem ponechány vyschnout na testovacím proužku. Směs pak kapilárním efektem vzlíná vzhůru po 1
membráně blisteru. V případě pozitivního výsledku je barevný konjugát zachycen specifickými protilátkami, což se ve „výsledkové zóně“ projeví jako barevná linka. Směs pak vzlíná dále po membráně k imobilizovaným protilátkám v „kontrolní zóně“, kde se vždy na konci testu objeví zelená linka. Přítomnost zelené linky ověřuje, že byl použit dostatečný objem vzorku, že došlo ke správnému vzlínání vzorku, a představuje interní kontrolu reagencií. OBSAH SOUPRAVY: -
Testovací blistery Rapid-VIDITEST Calprotectin-Lactoferrin Odběrové zkumavky obsahující ředicí roztok pro vzorky Návod k použití
POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU: -
Nádoba na sběr vzorků Jednorázové rukavice Stopky
SBĚR A PŘÍPRAVA VZORKŮ: Odeberte přiměřené množství stolice (1-2 g nebo ml tekutého vzorku). Vzorky odebírejte do čistých a suchých odběrových nádob (bez konzervantů nebo transportních médií). Vzorky mohou být skladovány v chladničce (2-4ºC) po dobu 7 dnů před testováním. V případě delšího skladování je nutno vzorky uchovávat zmrazené při -20°C. Před použitím nechte vzorky vytemperovat na laboratorní teplotu. PRACOVNÍ POSTUP: Příprava vzorků: Pro každý vzorek použijte zvláštní odběrovou zkumavku. 1) Odšroubujte víčko odběrové zkumavky a aplikační tyčinku třikrát ponořte do vzorku stolice, abyste nabrali vzorek (obr. 1). Zavřete zkumavku s ředicím roztokem a vzorkem stolice. Zkumavka se vzorkem může být skladována po dobu 5 dnů. 2) Za účelem dobré homogenizace vzorku zkumavku důkladně promíchejte (obr. 2). V případě, že je vzorek tekutý, odsajte vzorek stolice kapátkem a aplikujte do odběrové zkumavky s ředicím roztokem 10-20 μl vzorku.
vzorek stolice
odběrová zkumavka
Před testováním nechte testovací blister, vzorek stolice a roztok vytemperovat na laboratorní teplotu (15 - 30°C). Neotvírejte blister, dokud nejste připraveni provést test. 2
Pro provedení testu můžete zvolit postup označený A nebo B. A. Aplikace kapky vzorku z odběrové zkumavky na blister 1. Po vytemperování blisteru otevřete obalovou folii v označeném místě (blister nevyjímejte). 2. Znova protřepejte odběrovou zkumavku se vzorkem stolice za účelem dobré homogenizace vzorku. Uřízněte nebo ustřihněte konec špičky zkumavky (obr. 3). 3. Těsně před použitím položte blister na vodorovnou podložku. Nedotýkejte se membrány v místě testovací zóny a zóny pro aplikaci vzorku. Pro každý vzorek a kontrolu použijte samostatnou odběrovou zkumavku a blister. 4. Aplikujte 5 kapek naředěného vzorku z odběrové zkumavky na bílý konec blisteru (zóna pro aplikaci vzorku – sample region) (obr. 4). Zapněte stopky. 5. Po 10 minutách odečtěte výsledek bez další manipulace s blisterem. B. Ponořením blisteru do zkumavky 1. Po vytemperování blisteru otevřete obalovou folii v označeném místě. 2. Znova protřepejte odběrovou zkumavku se vzorkem stolice za účelem dobré homogenizace vzorku. Uřízněte nebo ustřihněte konec špičky zkumavky (obr. 3). 3. Přeneste 5 kapek vzorku homogenizovaného v ředicím roztoku z odběrové zkumavky do čisté označené zkumavky. Ponořte testovací blister bílým koncem do zkumavky (obr. 5). Neponořujte blister hlouběji než po rysku vyznačenou pod bílými šipkami (sample region). Zapněte stopky. 4. Po 10 minutách odečtěte výsledek bez další manipulace s blisterem. Postup B přidejte 5 kapek
Postup A přidejte 5 kapek Odečtěte za 10 minut
3
INTERPRETACE VÝSLEDKU: Obr. 6
Kontrolní zóna Výsledková zóna
ZELENÁ ČERVENÁ MODRÁ
ZELENÁ ČERVENÁ MODRÁ
MODRÁ
ČERVENÁ
Zóna pro nanesení vzorku kalprotektin
laktoferin kalprotektin-laktoferin
NEGATIVNÍ
NEPLATNÝ
POZITIVNÍ
Kalprotektin POZITIVNÍ: V okénku se objeví dvě linky: jedna červená ve výsledkové zóně (T) a druhá zelená v kontrolní zóně (C). Kalprotektin-pozitivní výsledek indikuje přítomnost zánětu v gastrointestinálním traktu. Laktoferin POZITIVNÍ: V okénku se objeví dvě linky: jedna modrá ve výsledkové zóně (T) a druhá zelená v kontrolní zóně (C). Interpretace: pravděpodobně nespecifický střevní zánět (IBD). Kalprotektin a laktoferin POZITIVNÍ: V okénku se objeví tři linky: červená a modrá ve výsledkové zóně (T) a zelená v kontrolní zóně (C). Interpretace: pravděpodobně aktivní střevní zánětlivé onemocnění. NEGATIVNÍ: V okénku se objeví pouze zelená kontrolní linka (C). Negativní výsledek svědčí o nepřítomnosti aktivního gastrointestinálního zánětu. NEPLATNÝ: Test je neplatný, pokud se v kontrolní zóně neobjeví zelená linka bez ohledu na přítomnost červené nebo modré ve výsledkové zóně. Nejčastější příčinou selhání testu je nedostatečný objem vzorku, nesprávný pracovní postup nebo poškození reagencií. Zkontrolujte pracovní postup a opakujte test s novou testovací sadou. Pokud potíže přetrvávají, kontaktujte prosím svého dodavatele. POZNÁMKA K INTERPRETACI VÝSLEDKU: Intenzita červené nebo modré barevné linky v místě označeném T může být různá v závislosti na koncentraci kalprotektinu a laktoferinu ve vzorku. PLATNOST TESTU: Součástí testu je interní kontrola průběhu testu. - Test je platný pouze v případě, když se v kontrolní zóně (C) objeví zelená linka, která potvrzuje dostatečný objem vzorku a správný průběh testu. - Interní negativní kontrolou je čisté pozadí. Pokud test funguje správně, pozadí ve výsledkovém okénku by mělo být čisté a nemělo by znesnadňovat odečtení výsledku testu. OMEZENÍ TESTU: 1. Nadbytečné množství vzorku stolice může vést k nesprávnému výsledku (objevují se hnědé linky). V tomto případě nařeďte vzorek ředicím roztokem a opakujte test. 4
2. Některé vzorky stolice mohou způsobit snížení intenzity kontrolní zelené linky. 3. Vzorky stolice pacientů s aktivním nespecifickým střevním zánětem (Crohnova choroba, ulcerózní kolitis) by měly být kalprotektin-pozitivní. Rapid-VIDITEST CalprotectinLactoferrin Blister může být použit i pro pacienty s chronickým průjmem. 4. Kalprotektin-pozitivní výsledek testu znamená přítomnost kalprotektinu ve stolici; nicméně příčina může být různá - IBD, kolorektální karcinom, některé enteropathie. Výsledek testu by měl být potvrzen dalšími diagnostickými metodami a správnou diagnózu by měl stanovit lékař. 5. U novorozenců byla publikována vyšší hladina kalprotektinu ve stolici než ve stolici starších dětí (prům. 167 µg/g stolice). 6. Laktoferin-pozitivní výsledek testu znamená přítomnost laktoferinu ve stolici; nicméně toto může mít i jinou příčinu než IBD. Výsledek testu by měl být potvrzen dalšími diagnostickými metodami - endoskopií a histologickým vyšetřením bioptického vzorku. 7. Použití testu se nedoporučuje u kojených dětí, protože laktoferin je součástí mateřského mléka, tudíž i u zdravých kojených dětí může být výsledek testu pozitivní. PŘEDPOKLÁDANÉ HODNOTY: Zvýšená hladina kalprotektinu ve stolici je u pacientů s IBD spojena se zvýšeným rizikem relapsu. Pro pacienty s gastrointestinálními zánětlivými problémy uvádějí některé studie jako hodnotu cut-off ≥50 µg kalprotektinu/g stolice. Rapid-VIDITEST Calprotectin-Lactoferrin Blister dává pozitivní výsledek u vzorků obsahujících laktoferin v koncentraci ≥10ug/g stolice. PARAMETRY TESTU: Citlivost Rapid-VIDITEST Calprotectin-Lactoferrin Blister test dává pozitivní výsledek u vzorků obsahujících kalprotektin v koncentraci ≥50µg/g stolice a laktoferin v koncentraci ≥10ug/g stolice. Pro stanovení detekčního limitu byly podle návodu k použití testovány vzorky s různým obsahem kalprotektinu a laktoferinu ředěnými v ředicím roztoku nebo v negativních vzorcích stolice. Detekce lidského kalprotektinu testem Rapid-VIDITEST Calprotectin-Lactoferrin Blister vykazovala >94% shodu v citlivosti v porovnání s jiným komerčním imunotestem (Calprest® Eurospital). Detekce lidského laktoferinu testem Rapid-VIDITEST Calprotectin-Lactoferrin Blister vykazovala >99% shodu v citlivosti v porovnání s jiným komerčním imunotestem. Specificita Detekce lidského kalprotektinu testem Rapid-VIDITEST Calprotectin-Lactoferrin Blister vykazovala 93% shodu ve specificitě v porovnání s jiným komerčním imunotestem (Calprest® Eurospital). Detekce lidského laktoferinu testem Rapid-VIDITEST CalprotectinLactoferrin Blister vykazovala 99% shodu ve specificitě v porovnání s jiným komerčním imunotestem (IBD EZ VUE®TechLab®). Rapid-VIDITEST Calprotectin-Lactoferrin Blister test je specifický pro lidský kalprotektin a lidský laktoferin a nevykazuje žádnou zkříženou reakci s ostatními kalprotektiny nebo hovězím laktoferinem. SKLADOVÁNÍ A STABILITA: Skladujte v originálním obalu při teplotě 2 - 30°C. Test je stabilní do data exspirace uvedeného na obalu. Nezmrazujte.
5
BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ: -
Pouze pro in vitro diagnostiku. Nepoužívejte po uplynutí expirační doby. Skladujte uzavřené v originálním obalu až do použití. Nepoužívejte test z poškozeného obalu. Dodržujte správnou laboratorní praxi, používejte ochranné rukavice, při práci nejezte, nepijte a nekuřte. Se vzorky manipulujte jako s potenciálně infekčním materiálem. Odpad likvidujte jako biologický infekční odpad v souladu s příslušnými předpisy. Test musí být proveden do 2 hodin po otevření obalu.
REFERENCE: 1. VIEIRA, A. et al., “Inflammatory bowel disease activity assessed by fecal calprotectin and lactoferrin: correlation with laboratory parameters, clinical, endoscopic and histological indexes”, BMC Research Notes 2009, 2:221. 2. HANAI, H. et al. «“Relationship Between Fecal Calprotectin, Intestinal Inflammation, and Peripheral Blood Neutrophils in Patients with Active Ulcerative Colitis” Digestive Diseases and Sciences, Sept. 2004, Vol 49, No 9, pp 1438-1443. 3. BONNIN TOMAS, A, et al. “Calprotectina fecal como marcador diferencia entre patología gastrointestinal orgánica y funcional”. Rev. Esp. de Enf. Dig. 2007, Vol 99, No 12, pp. 689-693. 4. Amemoto K. et al. Clinical evaluation of fecal lactoferrin and α-1-antitrypsin in pediatric gastrointestinal infections, Pathophysiology. Vol 3; 1996, p. 87-90. 5. Walker, T.R. et al. Fecal Lactoferrin is a Sensitive and Specific Marker of Disease Activity in Children and Young Adults with Inflammatory Bowel Disease. J. Pediatr Gastroenterol. Nutr. April 2007; Vol 44, No 4, p. 414-422. POUŽITÉ SYMBOLY: Určeno pro diagnostiku in vitro
Číslo šarže (LOT)
Datum exspirace
Výrobce
Poslední revize tohoto návodu: 06/2012
6
