EduChemia (Jurnal Kimia dan Pendidikan)
Vol.2, No.2, Juli 2017 e-ISSN 2502-4787
IMOBILISASI LIPASE PADA KITOSAN SERBUK DENGAN METODE PENGIKATAN SILANG DAN UJI AKTIVITAS TRANSESTERIFIKASINYA Wikan Mahargyani1, Tri Joko Raharjo2, Winarto Haryadi2 1
Stikes Jenderal Achmad Yani Cimahi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Gadjah Mada
2
email :
[email protected] Diterima: 13 April 2017. Disetujui: 19 Juli 2017. Dipublikasikan: 30 Juli 2017
Abstract : Immobilization lipase on chitosan powder by cross linking technique has been carried out. The research was purposed to determine the optimum condition of immobilization process and catalytic activities of immobilized lipase. Glutaraldehyde was used as cross linking agent in immobilization lipase on chitosan powder. Immobilization was performed under the optimum conditions such as solubility pH of lipase, degree of deacetylation, mole ratio of chitosan and glutaraldehyde, and concentration of enzyme. Immobilized and free lipases were assayed their activity, thermal stability, reused ability, and kinetic parameters for transesterification reaction of palm oil with methanol. Result of the study showed that the optimum conditions of immobilization were occurred when lipase was dissolved in buffer phosphate at pH 6, mole ratio of chitosan and glutaraldehyde 4:1, and 5% for concentration of enzyme. The immobilized lipase has lower thermal stability but has better affinity and reused stability than the free lipase. Key words: lipase, chitosan, immobilization, cross linking, transesterification Abstrak : Telah dilakukan imobilisasi lipase pada kitosan serbuk dengan metode pengikatan silang. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kondisi optimum proses imobilisasi dan aktivitas katalitik lipase terimobilisasi. Enzim lipase diimobilisasikan pada kitosan serbuk menggunakan glutaraldehid sebagai senyawa penaut silang. Parameter yang dipelajari untuk menentukan kondisi optimum imobilisasi meliputi pH pelarutan enzim, nilai derajat deasetilasi, perbandingan mol kitosan dengan glutaraldehid, dan konsentrasi enzim. Enzim lipase terimobilisasi dan enzim lipase bebas diuji aktivitas, stabilitas termal, dan kemampuan penggunaan ulangnya melalui reaksi transesterifikasi minyak kelapa sawit menggunakan metanol. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kondisi optimum imobilisasi diperoleh saat enzim dilarutkan pada buffer fosfat pH 6, perbandingan mol kitosan dengan glutaraldehid 4:1, dan konsentrasi enzim 5%. Enzim lipase terimobilisasi mempunyai stabilitas termal yang lebih rendah tetapi mempunyai kemampuan penggunaan ulang yang lebih baik daripada enzim lipase bebas. Kata kunci: lipase, kitosan, imobilisasi, pengikatan silang, transesterifikasi
196
197 EduChemia,Vol.2, No.2, Juli 2017
Mahargyani, Raharjo, dan Haryadi
dalam air. Enzim terimobilisasi mampu
PENDAHULUAN Lipase merupakan enzim pencernaan
mempertahankan aktivitas dan dapat
yang mempunyai aktivitas katalitik pada
digunakan
reaksi
alkoholisis,
proses kontinyu (Jegannathan et al.,
transesterifikasi, dan esterifikasi. Salah
2008). Pemilihan padatan pendukung dan
satu aktivitas yang menarik untuk dikaji
metode imobilisasi yang sesuai menjadi
adalah aktivitas transesterase. Reaksi
hal yang penting dan menarik untuk
tersebut merupakan reaksi dasar yang
dikaji lebih lanjut.
digunakan dalam konversi triasilgliserol
Imobilisasi
hidrolisis,
secara
berulang
enzim
maupun
lipase
dapat
menggunakan
dilakukan dengan teknik pengikatan pada
katalis enzim menguntungkan karena
matriks pendukung (carrier binding),
kondisi reaksinya yang lunak, pemisahan
penjebakan (entrapping), dan taut silang
gliserol dapat dilakukan dengan mudah,
(cross
dan tidak menghasilkan limbah yang
memilki kelebihan dibanding yang lain
berbahaya.
reaksi
yaitu ikatan antara enzim dan padatan
enzimatis berpotensi untuk diaplikasikan
pendukung stabil, sehingga enzim tidak
pada proses pembuatan biodiesel (Yücel
mudah
et al., 2013).
berinteraksi maksimal (Brena et al.,
menjadi
ester.
Reaksi
Oleh
karena
itu,
linking).
lepas
Metode
dan
taut
silang
substrat
dapat
Secara umum enzim hanya larut pada
2006). Glutaraldehid merupakan senyawa
pelarut tertentu dan cenderung sulit
penaut silang yang banyak digunakan
dipisahkan di akhir reaksi sehingga
karena
kemampuan
ulangnya
harganya yang terjangkau. Senyawa ini
terbatas (Krajewska, 2004). Selain itu
memiliki dua gugus aldehid yang dapat
struktur enzim tidak stabil terhadap
membentuk taut silang antara enzim
perubahan pH dan suhu, sehingga mudah
dengan matriks pendukung imobilisasi.
penggunaan
preparasi
yang
mudah
dan
mengalami denaturasi. Tingginya harga
Padatan pendukung yang digunakan
enzim juga menjadikan proses enzimatis
dapat berupa material anorganik maupun
tidak ekonomis ketika diaplikasikan pada
polimer organik (Tan et al., 2010).
skala yang besar (Tan et al., 2010).
Pemilihan padatan pendukung harus
Langkah yang dapat dilakukan untuk
memperhatikan gugus fungsional yang
mengatasi beberapa kelemahan tersebut
berperan dalam ikatan (Cahyaningrum,
adalah dengan mengimobilisasi enzim
2009). Salah satu polimer alam yang
pada matriks pendukung yang tidak larut
sering
digunakan
adalah
kitosan
e-ISSN 2502-4787
Imobilisasi Lipase pada Kitosan Serbuk 198
(Amorim et al., 2003; Chiou et al., 2004;
stabilitas
termal,
kemampuan
Deng et al., 2009; Orrego et al., 2010;
penggunaan ulang, dan parameter kinetik
Romdhane et al., 2011;
Silva et al.,
dipelajari untuk mengetahui kualitas
2012; Xie et al., 2012, Kuo et al., 2012).
enzim terimobilisasi pada kitosan serbuk.
Menurut Nasratun (2009) kitosan banyak digunakan sebagai matriks pendukung imobilisasi
karena
bentuknya
METODE
dapat
Bahan
yang
digunakan
dalam
dimodifikasi sesuai kebutuhan (serpihan,
penelitian ini adalah kitin (Biotech
serbuk, gel, fiber, membran, beads),
Surindo), enzim lipase pankreas babi
dapat
dan
(Merck), minyak kelapa sawit (Bimoli
itu
Spesial), kertas saring Whatman 1, bahan
material kitosan bersifat non toksik dan
dari Merck dengan kualitas p.a, yaitu :
yang terpenting mempunyai afinitas yang
natrium hidroksida (NaOH), asam klorida
baik terhadap protein (Pereira et al.,
(HCl),
2003).
natrium
terbiodegradasi
penanganannya
mudah.
Selain
Pemanfaatan kitosan sebagai matriks imobilisasi
enzim
lipase
banyak
metanol
(CH3OH),
n-heksan,
dihidrogen
(NaH2PO4.2H2O),
fosfat
natrium
hidrogen
fosfat (Na2HPO4.2H2O), asam oksalat
memanfaatkan gugus amina, dimana
(H2C2O4),
interaksi terjadi melalui reaksi taut silang
(CuSO4.5H2O), kalium natrium tatrat
antara
kitosan
(KNaC4H4O6.4H2O), glutaraldehid, BSA
seperti
(Bovin Serum Albumin) dan indikator
lipase
dengan
menggunakan
penaut
silang
glutaraldehid
(Foresti dan Ferreira,
2007). Efisiensi optimum imobilisasi
tembaga
(II)
sulfat
pp. Alat-alat
yang
digunakan
dalam
dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti
penelitian ini adalah seperangkat alat
pH, komposisi kitosan, glutaraldehid, dan
gelas laboratorium, botol Falcon 50 mL,
enzim.
mikropipet (10, 200, 1000 μL), hot plate
Penelitian
ini
untuk
(Ishtar Hitzstir), magnetic stirrer, shaker
mengetahui kondisi optimum imobilisasi
incubator (Seiwa Rico Co, LTD, EFM-
enzim
serbuk.
60), oven (WTB Binder), muffle furnace,
enzim
pH meter, spektrometer inframerah (FT-
dibuktikan melalui uji aktivitas katalitik
IR Prestige-21), kromatografi gas (GC,
enzim
transesterifikasi.
Shimadzu GC-14B, Shimadzu QP 2010),
Selain itu beberapa parameter seperti
kromatografi Gas-Spektrometer Massa
lipase
pada
Keberhasilan
pada
dilakukan
kitosan
imobilisasi
reaksi
e-ISSN 2502-4787
199 EduChemia,Vol.2, No.2, Juli 2017
(GC-MS,
Shimadzu
QP
Mahargyani, Raharjo, dan Haryadi
2010S),
microplate, Elisa Reader.
Uji aktivitas enzim transesterifikasi
pada
reaksi
Sebanyak 2,43 mL minyak kelapa Pembuatan kitosan
sawit dimasukkan ke dalam labu takar 10
Sebanyak 50 g kitin direaksikan
mL lalu ditambahkan 606 μL metanol, 10
dengan 500 mL NaOH 50% (b/v) pada
μL air dan n-heksan sampai tanda batas.
suhu 100 °C dengan variasi waktu reaksi
Kemudian campuran dipindahkan ke
1, 2, dan 3 jam. Setelah dingin, hasil
botol falcon 50 mL lalu ditambahkan 1 g
reaksi disaring dan dicuci hingga pH
kitosan serbuk terimobilisasi. Dengan
pencucian
hasil
prosedur yang sama, kontrol reaksi dibuat
penyaringan dioven hingga kering dan
dengan penambahan enzim lipase bebas
diperoleh
kemudian
yang setara dengan enzim terimobilisasi.
menggunakan
Kedua larutan direaksikan selama 24 jam
spektrometer FT-IR serta diukur kadar
pada suhu 37 °C dalam shaker incubator.
air, kadar abu, dan kadar nitrogennya.
Setelah
netral.
kitosan
Residu
yang
dikarakterisasi
reaksi
selesai,
dilakukan
penyaringan untuk memisahkan enzim Imobilisasi enzim lipase pada kitosan serbuk Larutan enzim bebas 1% dibuat
dengan filtrat yang mengandung Fatty Acid Methyl Ester (FAME) dan dianalisis menggunakan GC.
dengan melarutkan 50 mg enzim lipase dalam 5 mL buffer fosfat 0,05 M.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Campuran
Pembuatan Karakterisasinya
dihomogenkan
dengan
pengadukan selama 30 menit. Pada saat
Kitosan
dan
yang sama kitosan serbuk diaktivasi
Kitosan diperoleh melalui reaksi
dengan glutaraldehid. Selanjutnya kitosan
deasetilasi kitin menggunakan basa kuat.
teraktivasi diinteraksikan dengan enzim
Reaksi deasetilasi dilakukan selama 1, 2,
terlarut. Setelah perendaman 60 menit
dan 3 jam menghasilkan produk yang
dilakukan penyaringan. Jumlah enzim
selanjutnya disebut sebagai kitosan DD-
awal
terimobilisasi
1, kitosan DD-2, dan kitosan DD-3. Hasil
dianalisis kadar proteinnya menggunakan
karakterisasi kitosan disajikan pada Tabel
elisa reader.
1. Kitosan yang diperoleh pada penelitian
dan
sisa
enzim
ini memiliki kadar abu dan kadar nitrogen yang sesuai dengan parameter
e-ISSN 2502-4787
Imobilisasi Lipase pada Kitosan Serbuk 200
standar kitosan. Namun untuk kadar
lama
terbukti
dapat
meningkatkan
airnya sedikit lebih tinggi dari parameter
penghilangan gugus asetil.
standar yang ditentukan. Tabel 1. Hasil karakterisasi kitosan Hasil pengukuran (%)
Pengukuran
Studi Pengaruh pH dan Derajat Deasetilasi Pada Imobilisasi Enzim Enzim
lipase
yang
akan
DD-1
DD-2
DD-3
diimobilisasikan pada kitosan serbuk
Kadar Air
10,85
10,65
11,65
dilarutkan terlebih dahulu dalam larutan
Kadar Abu
0,40
0,29
0,34
buffer fosfat dengan pH yang bervariasi.
Kadar Nitrogen
2,92
3,94
4,34
Larutan
enzim
digunakan
untuk
merendam kitosan yang sebelumnya telah Berdasarkan standar kualitas kitosan,
diaktivasi menggunakan agen penaut
jika derajat deasetilasi < 70% maka
silang glutaraldehid. Semakin banyak
disebut sebagai kitin dan apabila > 70%
enzim lipase yang terlarut dalam buffer
disebut sebagai kitosan. Nilai derajat
fosfat diharapkan dapat meningkatkan
deasetilasi kitin dan kitosan ditentukan
jumlah enzim yang terimobilisasi dalam
dari spektra FTIR yang diperoleh dengan
kitosan serbuk. Hasil kelarutan enzim
membandingkan serapan gugus amida
lipase pada buffer fosfat dengan variasi
(1655
-1
hidroksi
pH disajikan pada Gambar 1. Grafik
deasetilasi
tersebut menunjukkan bahwa jumlah
menunjukkan
enzim terlarut paling banyak terdapat
persentase gugus asetil yang hilang
pada buffer fosfat pH 6 dan mengalami
selama proses deasetilasi kitin.
penurunan seiring dengan naiknya pH
(3450
cm )
dan
cm-1).
merupakan
nilai
Perhitungan
gugus
Derajat yang
derajat
deasetilasi
buffer fosfat.
seperti yang dikemukakan oleh Domzy dan Robets (1985) dan base-line B seperti yang dikemukakan Baxter dalam Hung et al. (2002). Kitosan yang diperoleh pada penelitian ini memiliki nilai derajat deasetilasi sebesar 82,37; 87,30; dan 92,72%. Adanya perlakuan deasetilasi pada waktu yang yang lebih
e-ISSN 2502-4787
Kelarutan enzim (%)
didasarkan pada metode base-line A 50
039
40 027
30 031
20
027
028
10 0 4
5
6
7
8
9
10
pH
Gambar 1. Hubungan pH dengan Jumlah Enzim Terlarut
201 EduChemia,Vol.2, No.2, Juli 2017
Enzim
terlarut
Mahargyani, Raharjo, dan Haryadi
selanjutnya
mudah
terprotonasi
menjadi
–NH3+,
diimobilisasikan pada kitosan serbuk
sehingga ikatan silang antara kitosan-
yang memiliki nilai derajat deasetilasi
glutaraldehid-enzim sulit terjadi. Pada pH
bervariasi. Hal ini dilakukan untuk
yang lebih tinggi dari titik isoelektrik
mengetahui pengaruh pH pelarutan enzim
akan menyebabkan enzim dan kitosan
dan nilai derajat deasetilasi kitosan
kaya elektron. Sedangkan pada pH yang
terhadap efisiensi imobilisasi enzim.
terlampau tinggi efisiensi imobilisasi
Kitosan dengan nilai derajat deasetilasi
akan semakin menurun karena enzim
yang tinggi mengandung lebih banyak
mengalami denaturasi.
gugus –NH2 yang dapat berikatan silang glutaraldehid
dan
Semakin tinggi nilai derajat deasetilasi diharapkan dapat meningkatkan jumlah enzim yang terimobilisasi pada kitosan serbuk. Grafik
yang
disajikan
80
enzim. Efisiensi imobilisasi (%)
dengan
optimum
pelarutannya,
paling besar pada masing-masing jenis
20
0
2
4
6
8
10
pH
Gambar 2. Hubungan pH dan derajat deasetialasi kitosan terhadap efisiensi imobilisasi enzim
Efisiensi imobilisasi enzim pada kitosan DD-1, kitosan DD-2, dan kitosan
optimumnya, sehingga ikatan silang yang
DD-3 berturut-turut sebesar 71,24; 50,36;
terbentuk
yang
dan 45,99%. Berdasarkan hasil ini dapat
terimobilisasi semakin banyak (Nakajima
diketahui bahwa kenaikan nilai derajat
et al., 2000). Enzim lipase dan kitosan
deasetilasi tidak berpengaruh terhadap
memiliki titik isoelektrik (pI) yang sangat
jumlah enzim yang terimobilisasi pada
peka terhadap perubahan pH. Enzim
kitosan serbuk. Jumlah gugus –NH2 yang
lipase memiliki titik isoelektrik 5,7-5,8
semakin banyak dimungkinkan dapat
sedangkan
titik
menimbulkan halangan sterik pada proses
isoelektrik sebesar 5,4. Pada pH di bawah
imobilisasi, sehingga sisi aktif kitosan
titik isoelektriknya gugus –NH2 yang
sulit berikatan dengan sisi aktif enzim
terdapat pada molekul enzim dan kitosan
dan
jumlah
kitosan
pada
30
pH
dan
terbuka
40
0
kitosan. Penutup sisi aktif enzim (lid) mudah
50
enzim
memiliki nilai efisiensi imobilisasi yang
lebih
60
10
pada
Gambar 2 memperlihatkan bahwa pada pH
Kitosan DD1 Kitosan DD2
70
enzim
mempunyai
mengakibatkan
jumlah
enzim
e-ISSN 2502-4787
Imobilisasi Lipase pada Kitosan Serbuk 202
terimobilisasi
semakin
sedikit.
Pada
kitosan-glutaraldehid-enzim melalui dua
tahap selanjutnya kitosan DD-1 (82,37%)
kemungkinan. Selama proses pengikatan
digunakan sebagai padatan pendukung
silang gugus –NH2 dari kitosan dapat
untuk mempelajari kondisi optimum
berikatan dengan gugus –CHO dari
imobilisasi enzim pada kitosan serbuk.
glutaraldehid pada dua perbandingan molekul yaitu 1:1 dan 2:1. Pengikatan
Studi Pengaruh Rasio Mol Kitosan dengan Glutaraldehid terhadap Efisiensi Imobilisasi Efisiensi imobilisasi dan aktivitas katalitik enzim terimobilisasi ditentukan oleh proses cross-linking yang tepat. Reaksi pengikatan yang tepat dapat terjadi antara gugus –NH2 kitosan secara dominan terhadap gugus –CHO pada glutaraldehid.
Dengan
demikian,
perbandingan kitosan dan glutaraldehid yang digunakan menjadi salah satu hal yang penting untuk diperhatikan. Kitosan yang
teraktivasi
dengan
baik
akan
meningkatkan peluang enzim menempel pada permukaannya. Pada tahap ini imobilisasi
dilakukan
menggunakan
kondisi optimum yang telah diperoleh pada tahap sebelumnya yaitu pH 6 untuk pelarutan enzim dengan kitosan DD-1
Migneault et al. (2004) menyatakan bahwa belum ada mekanisme pasti yang dapat menggambarkan interaksi yang terjadi antara glutaraldehid dan protein (enzim). Juang et al. (2002) mengusulkan yang
e-ISSN 2502-4787
terjadi
–NH2 pada kitosan akan berikatan dengan satu molekul –CHO pada glutaraldehid, sehingga memungkinkan gugus –NH2 dari enzim berikatan dengan gugus – CHO glutaraldehid pada sisi yang lain. Sedangkan pada rasio 2:1 enzim akan terjebak terbentuk
pada
antara
ikatan
antara
silang
kitosan
yang dengan
glutaraldehid. Interaksi pada pola ini kurang menguntungkan karena dapat menghambat aktivitas katalitik enzim karena berpotensi mengganggu sisi aktif enzim. Perbandingan
kitosan
dan
glutaraldehid yang optimum diamati melalui efisiensi imobilisasi dan aktivitas katalitik dari enzim lipase terimobilisasi. Hasil yang disajikan pada Gambar 3 memperlihatkan
sebagai padatan pendukung.
interaksi
silang pada rasio 1:1 berarti satu molekul
bahwa
efisiensi
imobilisasi meningkat seiring dengan semakin
banyaknya
kitosan
yang
digunakan. Hal ini dapat terjadi karena jumlah
amina
yang
tersedia
untuk
berikatan silang dengan glutaraldehid dan enzim menjadi semakin banyak.
203 EduChemia,Vol.2, No.2, Juli 2017
Efisiensi imobilisasi (%)
80
Mahargyani, Raharjo, dan Haryadi
3, 4, dan 5% (%, b/v) yang masing-
71,429
70
61,714
60
masing dilarutkan dalam buffer fosfat pH 52,571
50
047
6. Konsentrasi yang digunakan hanya
044
40
sampai 5% karena pada konsentrasi
30 20
tersebut larutan enzim sangat pekat dan
10 0 0
1
2
3
4
5
6
mulai jenuh sehingga pelarutan tidak optimal.
Gambar 3. Hubungan Perbandingan Mol (Kitosan: Glutaraldehid) terhadap Efisiensi Imobilisasi
Perbandingan
kitosan
dan
glutaraldehid yang digunakan pada tahap ini mengacu pada kondisi optimum imobilisasi yang diperoleh pada tahap
Keberadaan semakin
glutaraldehid
banyak
akan
yang
sebelumnya.
menginisiasi
terbentuknya ikatan antara gugus –CHO
yaitu ion alkoksida pada serin. Terjadinya interaksi ini akan menyebabkan aktivitas katalitik
enzim
terganggu.
Pada
penelitian ini mekanisme cross-linking yang
terjadi
diperkirakan
melalui
Jumlah enzim terlarut (mg)
dari glutaraldehid dengan sisi aktif enzim
50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
041 044 026 023 011 0
4
6
Konsentrasi enzim (%, b/v)
mekanisme dimana satu gugus –CHO pada glutaraldehid mengikat gugus –NH2
2
Gambar 4. Hubungan konsentrasi enzim terhadap banyaknya jumlah enzim terimobilisasi
pada kitosan dan pada sisi yang lain gugus –CHO berikatan dengan gugus –NH2 dari enzim.
Berdasarkan Gambar 4 dapat dilihat bahwa konsentrasi enzim yang semakin besar dapat meningkatkan jumlah enzim
Studi Pengaruh Konsentrasi Enzim terhadap Jumlah Enzim Terimobilisasi Imobilisasi
enzim
pada
variasi
yang terimobilisasi pada kitosan serbuk. Kenaikan konsentrasi enzim sebanding dengan bertambahnya
jumlah enzim
konsentrasi dilakukan untuk mengetahui
terimobilisasi,
batas
pengaruh konsentrasi enzim terhadap
dimana kenaikan enzim tidak dapat
banyaknya enzim yang terimobilisasi
menaikkan jumlah enzim terimobilisasi.
pada
yang
Pada setiap kenaikan konsentrasi jumlah
digunakan pada penelitian ini adalah 1, 2,
enzim terimobilisasi mengalami kenaikan
kitosan.
Variasi
enzim
hingga
tertentu
e-ISSN 2502-4787
Imobilisasi Lipase pada Kitosan Serbuk 204
hampir 2 kali dibanding konsentrasi
semakin
sebelumnya. Namun demikian, terjadi
terimobilisasi
penyimpangan
3%
katalitik yang semakin baik pula, ditandai
terimobilisasi
dengan semakin meningkatnya luas area
justru mengalami penurunan. Hal ini
metil palmitat yang terbentuk (Gambar
dapat disebabkan proses pelarutan yang
5).
dimana
pada
jumlah
konsentrasi
enzim
banyak
jumlah
memberikan
enzim aktivitas
belum sempurna, sehingga jumlah enzim terimobilisasi menjadi lebih sedikit. Pada konsentrasi enzim 5% jumlah
Aktivitas Katalitik Terimobilisasi Keberhasilan
enzim terimobilisasi hanya mengalami
Enzim enzim
Lipase lipase
kenaikan sedikit. Hal ini dimungkinkan
terimobilisasi dalam mengkatalisis reaksi
terjadi karena sistem imobilisasi telah
transesterifikasi
jenuh, dimana kitosan serbuk yang telah
terbentuknya FAME (Fatty Acid Methyl
diaktivasi dengan glutaraldehid tidak
Ester). Hasil uji aktivitas transesterase
dapat
enzim lipase terimobilisasi pada kitosan
lagi
mengikat
enzim
pada
ditandai
dengan
serbuk dengan derajat deasetilasi berbeda
konsentrasi yang lebih tinggi.
disajikan pada Gambar 6. 700000 200.000 Kelimpahan relatif
Kelimpahan relatif
600000 500000 400000 300000 200000
150.000 100.000 50.000
100000
Metil palmitat
DD-1
Enzim bebas Jenis katalis yang digunakan
0 0
2
4
6
Konsentrasi enzim 5% (b/v)
Gambar 5. Hubungan Konsentrasi Enzim terhadap Kelimpahan Relatif Metil Palmitat
DD-2
DD-3
Gambar 6. Perbandingan aktivitas katalitik enzim lipase bebas dan enzim lipase terimobilisasi pada kitosan dengan derajat deasetilasi yang berbeda
Banyaknya enzim yang terimobilisasi pada kitosan serbuk sebanding dengan aktivitas katalitik enzim pada reaksi transesterifikasi minyak kelapa sawit dengan metanol. Hal ini dibuktikan dengan konversi metil ester dimana
e-ISSN 2502-4787
Data yang diperoleh menunjukkan bahwa enzim lipase terimobilisasi pada kitosan
serbuk
memiliki
aktivitas
katalitik pada reaksi transesterifikasi. Enzim lipase yang terimobilisasi pada
205 EduChemia,Vol.2, No.2, Juli 2017
Mahargyani, Raharjo, dan Haryadi
kitosan DD-1 memberikan hasil korversi
permukaan enzim. Luas permukaan yang
yang lebih baik dibanding kitosan DD-2
semakin
dan kitosan DD-3. Sebagai pembanding
peluang terjadinya interaksi antara enzim
digunakan enzim lipase bebas dengan
dan substrat, sehingga pada rentang
jumlah
enzim
waktu yang sama enzim terimobilisasi
terimobilisasi. Secara keseluruhan enzim
dapat mengkonversi produk lebih banyak
lipase terimobilisasi pada kitosan serbuk
dibandingkan dengan enzim bebasnya.
memiliki aktivitas katalitik yang lebih
Selain itu enzim berbentuk serbuk dapat
baik dibanding enzim lipase bebas.
membentuk agregat pada medium reaksi
yang
setara
dengan
besar
dapat
memperbesar
Pada beberapa kajian yang diacu
yang minim air, sehingga menghambat
pada penelitian ini melaporkan bahwa
interaksinya dengan substrat Shah and
enzim terimobilisasi memiliki aktivitas
Gupta
yang lebih rendah dibandingkan dengan
pendukung imobilisasi yang tepat juga
enzim bebas. Penurunan aktivitas ini
menjadi penentu keberhasilan imobilisasi
dapat disebabkan oleh hambatan sterik
enzim.
yang
ditimbulkan
oleh
juga karena faktor perubahan struktur yang
terjadi
Ketepatan
matriks
matriks
pendukung imobilisasi. Selain itu dapat
enzim
(2007).
selama
proses
Stabilitas Termal Terimobilisasi Aktivitas
Enzim
Lipase
enzimatik
sangat
menghambat
dipengaruhi oleh lingkungan yang salah
mengingat
satunya adalah suhu. Enzim memiliki
struktur enzim sangat sensitif terhadap
aktivitas optimum pada suhu tertentu dan
perubahan kondisi lingkungan. Namun
akan kehilangan aktivitas ketika berada
demikian, memungkinkan bagi enzim
di atas suhu optimumnya. Hal ini terjadi
terimobilisasi memiliki aktivitas katalitik
karena
yang lebih baik dibanding dengan enzim
mengalami
bebasnya.
stabilitas
imobilisasi aktivitas
sehingga katalitik
enzim
Aktivitas enzim terimobilisasi yang
struktur
enzim
rusak
denaturasi. termal
dilakukan
atau
Pengujian terhadap
enzim lipase bebas dan enzim lipase
lebih baik dibanding enzim bebasnya
terimobilisasi
dapat terjadi jika ikatan yang terbentuk
kemampuan
selama proses imobilisasi berada pada
mempertahankan aktivitas katalitiknya
sisi yang tepat, sehingga ikatan yang
setelah pemanasan pada suhu tertentu.
terbentuk
dapat
memperbesar
untuk
membandingkan
keduanya
dalam
luas
e-ISSN 2502-4787
Imobilisasi Lipase pada Kitosan Serbuk 206
Enzim lipase bebas dan enzim lipase
yaitu 16,25-32,92%, sedangkan enzim
terimobilisasi dipanaskan pada variasi
lipase
terimobilisasi
suhu 35, 40, 45, dan 50 °C sebelum
penurunan sebesar 36,01-47,86%. Namun
digunakan untuk mengkatalisis reaksi
demikian stabilitas termal enzim lipase
transesterifikasi minyak kelapa sawit
terimobilisasi pada suhu 50 °C lebih baik
dengan metanol. Pengaruh pemanasan
dibandingkan dengan enzim lipase bebas.
terhadap aktivitas katalitik enzim lipase
Besarnya penurunan
terimobilisasi dan enzim lipase bebas
lipase
disajikan pada Gambar 7.
terimobilisasi
bebas
dan
mengalami
aktivitas
enzim
enzim
lipase
berturut-turut
sebesar
64,86% dan 61,94%. Kelimpahan relatif
1.200.000
(a)
Berdasarkan
hasil
pengujian
ini
1.000.000 800.000
diketahui
bahwa
enzim
lipase
600.000
terimobilisasi memiliki stabililitas termal
400.000
yang hampir sama dengan enzim lipase
200.000
bebasnya.
0 30
35
40
45
50
Hal
ini
ditandai
dengan
perbedaan yang tidak signifikan dari
Suhu pemanasan (°C)
persentase
Kelimpahan relatif
40.000
setiap
(b)
penurunan
kenaikan
rata-rata
suhu.
pada
Persentase
30.000
penurunan rata-rata untuk reaksi yang
20.000
dikatalisis enzim lipase bebas dan enzim
10.000
lipase
terimobilisasi
berturut-turut
sebesar 38% dan 48%. Enzim lipase
0 30
35
40
45
50
Suhu pemanasan (°C)
bebas
masih
dapat
mempertahankan
aktivitasnya di setiap kenaikan 5 °C Gambar 7. Pengaruh pemanasan terhadap aktivitas katalitik (a.) enzim lipase terimobilisasi, (b) enzim lipase bebas
dengan penurunan yang cenderung lebih rendah
dibandingkan
terimobilisasi Pada Gambar 7 menunjukkan bahwa aktivitas enzim lipase bebas dan enzim lipase
terimobilisasi
kecuali
enzim
lipase
pada
suhu
pemanasan 50 °C. Struktur tiga dimensi enzim sangat
mengalami
rentan terhadap perubahan suhu, dimana
penurunan pada setiap suhu pemanasan.
perubahan struktur atau konformasi dapat
Pada suhu 35-45 °C penurunan aktivitas
mempengaruhi aktivitas katalitik enzim.
rata-rata enzim lipase bebas lebih kecil
Bahkan dapat menyebabkan inaktivasi
e-ISSN 2502-4787
207 EduChemia,Vol.2, No.2, Juli 2017
Mahargyani, Raharjo, dan Haryadi
jika enzim berada pada lingkungan yang
pada padatan pendukung yang tidak larut
ekstrim
tinggi
sehingga proses pemisahan setelah reaksi
dibanding suhu optimumnya. Enzim
lebih mudah dan enzim terimobilisasi
terimobilisasi
pada
masih dapat digunakan ulang. Pengujian
penelitian ini memiliki stabilitas termal
kemampuan penggunaan ulang enzim
yang tidak terlalu baik. Hal ini mungkin
lipase terimobilisasi menghasilkan grafik
terjadi
yang disajikan pada Gambar 8.
rendah
karena
atau
yang
ekstrim
dihasilkan
ikatan
silang
kitosan-glutaraldehid-enzim
antara
mengalami
Hasil
yang
disajikan
pada
pemutusan selama pemanasan, sehingga
Gambar 8 memperlihatkan bahwa enzim
sebagian enzim terlepas dari sistem
lipase
imobilisasi.
terimobilisasi
bebas
dan
enzim
mengalami
lipase
penurunan
aktivitas pada setiap siklus reaksi. Pada siklus kedua penurunan aktivitas cukup
Secara umum enzim bebas memiliki
rata-rata untuk enzim lipase bebas dan
stabilitas penggunaan ulang yang rendah
enzim lipase terimobilisasi berturut-turut
karena mudah terlarut dalam sistem
sebesar 98,06% dan 72,35%. Hal ini
reaksi, sehingga kurang menguntungkan
berarti perbandingan konversi minyak
jika diaplikasikan pada reaksi berulang.
kelapa sawit menjadi estermya pada awal
Imobilisasi enzim dilakukan sebagai
dan akhir reaksi untuk enzim lipase bebas
upaya untuk mengatasi kelemahan ini.
dan enzim lipase terimobilisasi berturut-
Pada proses imobilisasi, enzim diikatkan
turut
Kelimpahan relatif
Kemampuan Penggunaan Ulang Enzim Lipase Terimobilisasi
signifikan dimana penurunan aktivitas
sebesar
1,94%
dan
27,65%.
500.000 Metil palmitat enzim bebas
400.000 300.000
Metil oleat enzim bebas
200.000 Metil palmitat enzim imobil
100.000 0 1
2
Metil oleat enzim imobil 3
Suklus reaksi
Gambar 8. Perbandingan Luas Area Metil Palmitat Dan Metil Oleat Pada Uji Stabilitas Penggunaan Ulang
e-ISSN 2502-4787
Imobilisasi Lipase pada Kitosan Serbuk 208
Pada
siklus
ketiga
terimobilisasi
enzim
masih
lipase
imobilisasi ditandai dengan semakin
dapat
banyaknya
jumlah
enzim
mempertahankan aktivitas katalitiknya
terimobilisasi
dengan penurunan aktivitas rata-rata
Semakin besar nilai derajat deasetilasi
sebesar 2,19%. Hal ini berarti enzim
kitosan tidak berpengaruh signifikan
lipase
terhadap jumlah enzim terimobilisasi.
terimobilisasi
masih
dapat
pada
kitosan
yang
mengkonversi reaktan sebesar 97,81%
Imobilisasi
dibandingkan dengan metil ester yang
kondisi pH 6 untuk pelarutan enzim, nilai
dihasilkan pada siklus reaksi kedua.
derajat deasetilasi 82,27%, perbandingan
Hasil pengujian ini menunjukkan bahwa
enzim
kitosan
diperoleh
dengan
pada
glutaraldehid
terimobilisasi
sebesar 4:1, dan konsentrasi enzim 5%.
memiliki stabilitas penggunaan ulang
Banyaknya enzim yang terimobilisasikan
yang lebih baik dibanding dengan enzim
pada kitosan serbuk, sebanding dengan
lipase bebas. Enzim lipase terimobilisasi
aktivitas
masih
transesterifikasi
dapat
lipase
mol
optimum
serbuk.
mempertahankan
katalitiknya
pada
minyak.
reaksi
Imobilisasi
aktivitasnya hingga tiga siklus reaksi
enzim mampu meningkatkan stabilitas
meskipun mengalami penurunan konversi
penggunaan ulang dari enzim.
hasil yang signifikan pada siklus reaksi
Berdasarkan hasil yang diperoleh
kedua. Sedangkan enzim lipase bebas
pada penelitian ini, lipase terimobilisasi
hanya dapat digunakan hingga dua siklus
dapat digunakan sebagai katalis pada
reaksi. Hasil ini mengindikasikan bahwa
reaksi transesterifikasi yang merupakan
ikatan silang yang terjadi dalam sistem
reaksi dasar untuk produksi biodisel.
enzim terimobilisasi tidak mengganggu
Lipase terimobilisasi memiliki stabilitas
sisi aktif enzim, sehingga enzim masih
penggunaan
dapat
dibanding lipase bebas, sehingga dapat
mempertahankan
aktivitas
katalitiknya.
ulang
mengefisienkan
yang lebih
penggunaan
baik
katalis.
Selain itu, penggunaan kitosan sebagai KESIMPULAN Enzim lipase dapat diimobilisasikan pada kitosan serbuk dengan metode pengikatan silang. Kondisi optimum
e-ISSN 2502-4787
matriks imobilisasi dapat meningkatkan nilai guna dan ekonomi dari limbah cangkang kepiting.
209 EduChemia,Vol.2, No.2, Juli 2017
Mahargyani, Raharjo, dan Haryadi
DAFTAR RUJUKAN Amorim, R. V. S., Melo E. S., Carneiro-
Foresti, M.L., and Ferreira, M.L., 2007,
daChunha, M. G., Ledingham, W.
Chitosan-immobilized Lipases for
M., and Campos-Takaki, G. M.,
The
2003,
Esterifications, J. Enzyme Microb.
Chitosan
from
Syncephalastrum resemosum Used as a
Film
Support
for
Lipase
Catalysis
of
Fatty
Acid
Tech., 40, 769–777. Hung, S., Peh, K.K., and Khan, T.A.,
Immobilization, Bioresour. Technol.,
2002,
Reporting
Degree
of
89, 35-39.
Deacetyllation Value of Chitosan :
Brena, B.M., and Batista-Viera, F., 2006,
The Influence of Analytical Methods,
Imobilization of Enzymes, Humana
J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 5(3),
Press, Spanyol.
202-212.
Cahyaningrum,
S.E.,
2009,
Jembatan
Kation
Logam
Imobilisai
Papain
pada
Peranan
Jegannathan, K.R., Abang, S., Poncelet,
dalam
D., Chan, E.S., and Ravindra, P.,
Kitosan,
2008, Production of Biodiesel using
Disertasi, Jurusan Kimia FMIPA
Immobilized
UGM, Yogyakarta.
Review, Crit. Rev. Biotechnol., 28,
Chiou, S.H., and Wu, W.T., 2004,
Lipase-a
Critical
253–64.
Immobilization of Candida Rugosa
Krajewska, B., 2004, Application of
Lipase on Chitosan with Activation
Chitin and Chitosan-Based Materials
of
for
The
Hyroxyl
Groups,
Biomaterials, 25, 197-204.
and
35, 126-139. Kuo, C.H., Liu, Y.C., Chang, C.M.J.,
Hydrophobic Surface Modification of
Chen J.H., Chang C., and Shieh, C.J.,
Chitosan
2012,
Gels the
by
F.,
:
2009,
Improving
Zheng,
Immobilizations
A Review. Enz. Microb. Technol.,
Deng, H.T., Wang, J.J., Ma, M., Liu, Z.Y.,
Enzyme
Stearyl Activity
for
Optimum
Conditions
for
of
Lipase Immobilization on Chitosan-
Immobilized Lipase, Chinese Chem.
Coated Fe3O4 Nanoparticles, J. Carb.
Lett., 20, 995–999.
Pol., 87, 2538-2545.
Domzy, J.G., and Roberts, G.A.F., 1985,
Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand,
Evaluation of Infrared Spectroscopic
M.J., and Waldron, K.C., 2004,
Technique for Analyzing Chitosan,
Glutaradehyde
Makromol. Chem., 186, 1671-1677.
Aqueous Solution, Reaction with
:
Behavior
in
e-ISSN 2502-4787
Imobilisasi Lipase pada Kitosan Serbuk 210
Protein and Aplication to Enzym
Immobilized onto Chitosan, J. Mol.
Crosslinking, BioTechnique, 37, 790-
Cat. B: Enzym., 68, 230–239.
802.
Shah, S., and Gupta, M.N., 2007 Lipase
Nakajima, M., Ichikawa, S., Nabetani,
Catalyzed Preparation of Biodiesel
H., Maruyama, T.M., Furusaki, S.,
from Jatropha Oil in a Solvent Free
and Seki, M., 2000, Oil-Water
Sistem, Process Biochem., 42, 409–
Interfacial Activation of Lipase for
14.
Interesterification of Triglyseride and
Silva, J. A., Macedo, G.P., Rodrigues,
Fatty Acid, J. Am. Oil Chem. Soc.,
D.S.,
77, 1121-1126.
Goncalves,
Nasratun, M., Said, H. A., Noraziah, A., and
Adl
Alla,
Immobilization
A. of
Giordano,
R.L.C.,
L.R.B.,
and 2012,
Immobilization of Candida antartica
N.,
2009,
lipase B by Covalent Attachment on
Lipase
from
Chitosan-Based
Hyrogels
Support
Using
Candida rugosa on Chitosan Beads
Different
Activation
for Transesterification, Am. J. Appl.
Strategies, J. Biochem. Eng., 60, 16-
Sci., 6 (9), 1653-167.
24.
Orrego, C.E., Salgado, N., Valencia, J.S.,
Tan, T., Lu, J., Nie, K., Deng, L., and
Giraldo, O.H., and Cardona, C.A.,
Wang, F., 2010, Biodiesel Production
2010, Novel Chitosan Membranes as
with Immobilized Lipase : A Review,
Support for Lipases Immobilization :
J. Biotech. Adv., 28, 628-634.
Characterization Aspects, J. Carb. Pol., 79, 9-16.
Lipase
Pereira, E.B., Zanin, G.M., and Castro, H.F.,
2003,
Immobilization
and
Chatalytic Properties of Lipase on Chitosan
for
Esterification
Hydrolysis Reaction,
Braz.
Magnetic
Chitosan
Microspheres for Transesterification of Soybean Oil, J. Biom. Bioe.., 36, 373-380. Yücel, S., Terzioğlu, P., and Özçimen,
J.
D., 2013, Lipase Application in
Romdhane, Z.B.,
Gargouri, A., and Belghith, H., 2011, Esterification Activity and Stability of Talaromyces thermophilus Lipase
e-ISSN 2502-4787
on
and
Chem. Eng., Vol.20 (4), 343-355. Romdhane, I.B.B.,
Xie W., and Wang J., 2012, Immobilized
Biodiesel
Production,
InTech, 210-250.
Lecensee
