Immunológiai Gyakorlatok II. 2016. április 20-26. T- és B-limfociták szeparálása (dúsítása) egér lépsejt-szuszpenzióból; neutrofil extracelluláris csapda (NET) vizsgálata Anyagok: • steril fülke, olló, csipesz, fecskendő, petri csésze, Falcon cső, szűrő (mind steril), centrifuga, pipetta, Bürker kamra • GKN (fiziológiás NaCl, glukóz és fenolvörös tartalmú foszfát puffer, pH 7.2) • RPMI 1640 komplett médium (2-merkapto-etanollal, piruváttal és antibiotikumokkal kiegészített, 10 % FCS-t tartalmazó tápoldat) • ACK (KCl és EDTA tartalmú 0,83 %-os ammóniumklorid oldat) • Anti-Thy-1.2 (HO-13.4 egér monoklonális IgM) tartalmú sejttenyészet felülúszó • Friss (legfeljebb egyszer lefagyasztott és felolvasztott) nyúlsavó • Tripánkék (festék sejtszámoláshoz, élő/pusztult arány megállapításához) A lép feldolgozása: 1. A lép és a combcsontok steril körülmények között történő kivétele az egerekből GKN oldatot tartalmazó petricsészékbe. A csontvelő izolálása a D. pontban! 2. Sejtszuszpenzió készítése és 50 ml-es Falcon csövekbe töltése majd a sejtek lecentrifugálása (7 perc, 1200 rpm, 4°C) 3. A felülúszó leöntése után a sejtüledék fellazítása (vortex), majd 10-10 ml ACK oldat hozzáadásával a vörösvérsejtek lízise. 1,5 perc inkubálás után a csövek feltöltése GKN-nel (50 ml), majd a sejtek lecentrifugálása (7 perc, 1200 rpm, 4°C). 4. A sejtek felvétele 10 ml RPMI-ben, átszűrése (70µm-es sejtszűrő), majd a sejtszám megállapítása Bürker-kamrával. 5. A sejtszuszpenzió kettéosztása: 7 ml szuszpenzió a T-sejt deplécióhoz, 3 ml a sejtszortírozáshoz. A. B-limfociták dúsítása T-sejt deplécióval A/6. A 7 ml lépsejtszuszpenzió kiegészítése 1 ml anti-Thy-1 tartalmú sejttenyészet felülúszóval és 2 ml tápoldattal, majd 20 perc inkubálás szobahőmérsékleten. A/7. A sejteket lecentrifugálása (7 perc, 1200 rpm, 20°C) után a felülúszó elöntése és a sejtüledék fellazítása, majd a sejtek felvétele 9 ml GKN oldatban. 1 ml friss nyúlsavó (komplement forrás) hozzáadása, majd inkubálás 45-60 percig 37°C-os vízfürdőben. A/8. A sejtek lecentrifugálása (7 perc, 1200 rpm, 20°C), mosása 50ml GKN oldatban (centrifugálás: 7 perc, 1200 rpm, 20°C) majd a sejtek felvétele 5 ml tápoldatban, sejtszámolás.
1
B. T-sejt dúsítás szorterrel és a T-sejt depléció ellenőrzése áramlási citometriával Hozzávalók: - teljes lépsejt szuszpenzió és T-sejt depletált lépsejt szuszpenzió - FACS puffer (PBS, 1% FCS, 0,1% Na-azid) - FACS csövek - előre kihígított FcγR blokkoló ellenanyag 50 ul / cső - előre kihígított konjugált ellenanyagok (ea): anti-CD3-FITC 50 μl / cső anti-CD19-APC 50 μl / cső A módszer leírása: • A T-sejt-depletált szuszpenzió egy részét (~106 sejtet) és a teljes szuszpenziót is lecentrifugáljuk (7 perc,1200 rpm, 4°C), majd leöntjük róluk a médiumot. • Enyhe vortexelés után 50-50 µl FcγR blokkoló ellenanyagot pipettázunk a sejtpelletekre (5 perc inkubáció jégen). • Ezek után felvesszük a sejteket 1-1 ml FACS pufferben, és szétosztjuk őket FACS csövekbe 250µl-enként. • Minden csőhöz a táblázat alapján hozzáadjuk a megfelelő antitesteket (50 µl / cső). 20 perc inkubáció, fénytől elzárva, 4°C. cső
minta
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
teljes lép teljes lép teljes lép teljes lép T-sejt depletált T-sejt depletált T-sejt depletált T-sejt depletált
Antitestek (20 perc jégen) anti-CD19-APC anti-CD3-FITC anti-CD19-APC + anti-CD3-FITC anti-CD19-APC anti-CD3-FITC anti-CD19-APC + anti-CD3-FITC
• Mosás 3ml FACS pufferrel, a mosási lépést követően a fellazított sejtpellethez 500 μl FACS puffert adunk. • A sejtek lemérése FACS ARIA III. sejtszortírozó berendezéssel. Feladat: Határozzuk meg a B-sejt dúsítás hatékonyságát az egyes mintákban a B- és T-sejtek %-os arányának megállapításával! C. Proliferációs teszt CFSE jelöléssel Hozzávalók: T-sejt depletált lépsejtek CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester) 10 mM-os oldata PBS-5 %FCS stimuláló ellenanyag: kecskében termelt anti-egér IgM (0,5 mg/ml) A sejtek feltöltése CFSE-vel: A T-sejt deplécióval tisztított B-sejtek koncentrációját 2-5x107/ml-re állítsuk be 1 ml végtérfogatban, PBS/5%FCS oldatban, 15 ml-es Falcon csőben. Adjunk a sejtekhez 5 µM 2
végkoncentrációban CFSE-t, majd inkubáljuk sötétben, szobahőmérsékleten 10 percig. Mossuk a sejteket 2x PBS-5%FCS oldattal (10 ml, 7 perc,1200 rpm, 20°C) majd vegyük fel a sejteket tápfolyadékban és állítsuk be a sejtszámot 2x106 /ml-re. A sejtek stimulálása: Tegyük ki a sejteket 96 lyukú platre (100-100 µl sejtszuszpenzió/lyuk, mintánként 3 párhuzamos), adjuk hozzá a stimuláló ellenanyagot (anti-IgM) 100 ul-ben, 10 és 1 µg/ml végkoncentrációban, majd 5 napra, 37°C-ra, CO2 termosztátba helyezzük a sejteket. A sejtproliferációt FACS segítségével, 5 nap elteltével mérjük. 1
2
3
4
5
6
B
tápoldat
tápoldat
tápoldat
C
a-IgM 1
a-IgM 1
a-IgM 1
D
a-IgM 10
a-IgM 10
a-IgM 10
7
8
9
10
11
12
A
E F G H
D. Neutrofil granulociták kinyerése és stimulálása A combcsontokat kiszedjük az egerekből, majd Petri-csészében GKN-oldattal injekciós tű segítségével kimossuk a csontvelőt a combcsontokból. A szuszpenziót lecentrifugáljuk (7 perc,1200 rpm, 4°C), a vörösvértesteket a lépnél leírtak szerint ACK oldattal lizáljuk, majd mosás után a sejteket 1ml tápoldatban felvesszük. 8-lyukú kamrás lemezen két lyukba 5x105 sejtet mérünk, és 20 percig hagyjuk őket kitapadni (37°C, CO2 inkubátor). A tápoldatot óvatosan leszívjuk, majd a kontrollhoz 150 µl tápoldatot, a stimulált mintához 150 µl 100 nM phorpbol-miristoyl-acetátot (PMA; protein kináz C aktivátor) tartalmazó tápoldatot pipettázunk. A kamrát 3 órára 37°C-os CO2 inkubátorba rakjuk. Festés: A lyukakból kiszívjuk a folyadékot, majd PBS-sel óvatosan 2x mossuk. Lyukanként 120 µl Sytox orange festéket tartalmazó oldatot pipettázunk, 20 percig állni hagyjuk a mintákat, majd CLSM-mel értékeljük.
3
A B-sejtek antigénreceptor-közvetített aktivációja: Intracelluláris fehérjék foszforilációjának kimutatása Western blot módszerrel Anyagok, pufferek, reagensek, eszközök: BL41 sejtvonal (humán, érett B sejtek) aktiváló ellenanyag (anti-humán IgG+M F(ab’)2 ), előzetesen titrálva szérummentes RPMI 1640 médium lízis puffer (a sejtek szolubilizálására alkalmas, detergens tartalmú oldat): Tris 50mM, NaCl 150mM, EDTA 5mM, 0,1% NP40, pH 7,6 A pufferhez mindig frissen adjuk a proteáz- és foszfatázgátlókat: Proteázinhibitor koktél – hígítás: 1:20 Foszfatázinhibitor koktél – hígítás: 1:50 folyékony nitrogén Gélöntéshez: akrilamid-biszakrilamid 33 %-os oldata. 0,5 M-os Tris/HCl puffer pH 6.8 1,5 M-os Tris/HCl puffer pH 8.8 10%-os SDS oldat 10%-os ammónium perszulfát oldat (APS) N,N,N',N'-tetrametil-etiléndiamin (TEMED) 2-szeres redukáló minta-puffer a poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE)-hez: (0.5 M Tris/HCl pH 6.8, SDS, glicerin, 2-merkapto-etanol, brómfenolkék) Elektroforézis futtató puffer: (14.4 g/l glicin, 3 g/l Tris/HCl, 0.1 % SDS pH: 8,3) Blottoló puffer: (14.4 g/l glicin, 3 g/l Tris/HCl pH: 8,3) Membrán-mosó puffer (TWB): 1 literre (pH: 7.6): 2.42 g/l Tris (20 mM) 8.00 g/l NaCl (137 mM) 3.8 ml 1 M HCl 0.05 % TWEEN - Blokkoló puffer: 5% BSA oldat TWB-ben - szűrőpapír, nitrocellulóz membrán (0.45 µm pórusméret) a blottoláshoz - Eppendorf-csövek, pipetták, centrifugacsövek, automata pipetták - molekula-tömeg standard - anti-foszfotirozin monoklonális ellenanyag - anti-egér IgG-tormaperoxidázzal konjugálva - kemiluminescens szubsztrát (ECL-reagens) - röntgen film - előhívó és fixáló oldatok - elektroforézis és blottoló készülék
4
A sejtek aktiválása: - Mossuk a B-sejteket szérum-mentes médiumban, és állítsuk a sejtek számát 1x107/ml-re. - Tartsuk a mintákat (200 µl/ Eppendorf-cső) szérum-mentes médiumban 37°C-on 15-30 percig, majd aktiváljuk a sejteket 2, 5, 20 és 60 percig 5 µg anti-humán IgG+M-el + készítsünk egy 60 perces aktivált mintát, amit foszfatázinhibitor mentes lízis pufferben fogunk lizálni. (A reakció pontos leállítása érdekében az egyes mintákat az idő „visszaszámlálásával” stimuláljuk, vagyis a 2-perces aktivációt az 58. percben kezdjük el.) - Centrifugáljuk a mintákat rögtön az inkubációs idő elteltével (14000 g, 30 mp), szívjuk le a felülúszót és tegyük a sejtüledéket tartalmazó Eppendorf-csövet lezárva folyékony nitrogénbe. Így az adott időpontban a sejtekre jellemző aktivitást „befagyasztjuk”. Minták: - Kontroll (nem aktivált) - 2’ - 5’ - 20’ - 60’ - 60’ foszfatáz-gátló mentes lízis pufferrel A sejtek szolubilizálása - Vegyük ki a csöveket a nitrogénből csipesszel és minden mintához azonnal mérjünk 100 µl szolubilizáló puffert. Vortex segítségével azonnal keverjük össze, amíg nem marad üledék a cső alján. - Hagyjuk állni a mintákat jég között 30 percig. - A detergensben oldhatatlan frakciót (törmelék membrán, mag, stb.) ülepítsük 15000 g-vel 15 percig centrifugálva 4 oC-on. - Vigyünk át 90 µl felülúszót újabb Eppendorf-csövekbe és mérjünk hozzá 90 µl 2X redukáló mintapuffert. SDS-PAGE és Western blot - Futtassunk meg SDS-PAGE-sel minden mintából 20 µl-t, redukáló közegben. - Blottoljuk a szétválasztott fehérje-elegyet nitrocellulóz membránra. - Blokkoljuk a sejtlizátum fehérjéit tartalmazó nitrocellulóz membrán szabadon maradt kötőhelyeit szobahőmérsékleten 5 % BSA-t tartalmazó TWB-vel 1 órán át billegőasztalon. - Adjunk egy újabb adag 5% BSA-t tartalmazó TWB-hez monoklonális anti-foszfotirozin ellenanyagot (1:8000 hígításban) és inkubáljuk 4°C-on éjszaka, állandó mozgatással, billegő asztalon. Fontos, hogy a teljes membránt fedje az ellenanyag tartalmú oldat. (ált. 8-10 ml térfogat szükséges.) - Másnap mossuk a nitrocellulóz membránt 3 x 10 percig TWB –Tween pufferrel. - Adjuk a nitrocellulóz membránhoz az anti-egér IgG F(ab’)2-HRPO konjugátumot 3% BSA tartalmú pufferben, 8000-szeres hígításban és inkubáljuk 1 órán át szobahőmérsékleten, állandó mozgatás közben. - Mossuk a nitrocellulóz membránt 5-6x 5 percig TWB-Tween pufferrel, majd kemilumineszcencia (ECL) reagens alkalmazásával detektáljuk a tirozinon foszforilált fehérjéket. Az ECL mindkét komponenséből 1-1 ml-t keverünk össze, majd a blottot kissé leitatva, 1 percig állandóan mozgatva tartjuk a reagensben.
5
- 1 perc elteltével a reagens leöntése és leitatása utána a membránt helyezzük röntgenkazettába, fóliák közé, sötétkamrában tegyünk rá filmet, és 30 sec -5 perc közötti időtartamig való expozíció után hívjuk elő a filmet. Feladat: Értékeljük az előhívott Western-blotot a tirozin foszforiláció intenzitása (denzitás) szempontjából az aktiváció körülményei és az idő függvényében!
6
A B limfocita aktiváció jellemzői II.: a B sejt receptor internalizációja A B sejtek B sejt receptoron (BCR) keresztüli aktivációjakor – hasonlóan a T sejtek TCR-en keresztüli aktivációjához - két fontos folyamat indul be. Az egyik a gyakorlaton is vizsgált foszforilációs kaszkád, a másik pedig a receptor-antigén komplex internalizálódása (más néven receptor-közvetített endocitózis), vagyis a citoplazmába kerülése. Ez utóbbi folyamat eredményeképpen megy végbe az antigén processzálása, majd az antigénből származó peptidek MHCII-molekulákon keresztüli újraprezentálása a T-sejtek felé. Az endocitózis kezdeti szakaszának vizsgálatát a gyakorlaton áramlási citofluoriméterrel végezzük. A kísérletben a BCR-aktivációt követően a sejtfelszíni BCR-molekulák mennyiségét detektáljuk, és a kapott adatokból következtetünk az idő folyamán „eltűnő”, azaz internalizálódott BCR-molekulák mennyiségére. A gyakorlat menete: Mintánként 5x105 RAMOS sejtet 500 μl szérummentes médiumban veszünk fel, FACScsövekbe rakjuk, 15-30 percig inkubátorban tartjuk 37°C-on, majd 2-3 percig jégre helyezzük. Ezután anti-humán IgG+M F(ab’)2 ellenanyagot 5 µg/ml végkoncentrációban adunk a megfelelő mintákhoz, a csöveket pedig 45 percig jégen hagyjuk. Ez a szinkronizációs lépés biztosítja, hogy az ellenanyag minden mintában egyformán telítse a BCR-eket. Az aktivációhoz a mintákat adott időközönként 37°C-ra (CO2-termosztát) tesszük. Az aktiválást a leghosszabb idejű mintával kezdjük, és a legrövidebbel fejezzük be, hogy az aktivációs időknek egyszerre legyen végük. Ezután a sejteket hideg FACS pufferben 2x mossuk (1ml 5’ 1200 rpm 4°C), majd anti-humán IgM-FITC ellenanyagot adunk hozzájuk (2 µl/cső), és 20 percig fénytől védve, jégen hagyjuk. A sejteket ezután 1x mossuk, majd 300 µl ml FACS pufferben felvesszük, és elvégezzük az áramlási citofluoriméteres mérést. A minták:
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
anti-humán F(ab’)2 Ø Ø + + + + + +
IgG+M Aktiváció (37°C) Ø Ø Ø 15’ 30’ 60’ 90’ 120’
α-humán IgM-FITC Ø + + + + + + +
Feladat: Ábrázoljuk a sejtfelszínen expresszált BCR mennyiségét – melyet áramlási citometriával határoztunk meg – az aktiválást követően az idő függvényében és értelmezzük a görbét.
7
Fas-független apoptózis indukciója T sejtekben „membrán stressz” révén: az apoptózis néhány szelektív markerének áramlási citometriás és konfokális mikroszkópiás vizsgálata Az apoptózis az immunrendszerben különösen gyakran fellépő programozott sejthalál folyamat, melynek révén a funkcionálisan nem megfelelő, a szervezet sejtjeire veszélyes (autoreaktív) ill. a feladatukat már ellátott, vagy arra egyáltalán nem képes sejtek eliminálódnak az immunrendszer sejtkészletéből. Ez naponta akár több száz millió sejt (nagyrészt limfociták) folyamatos elhalását jelenti. Az apoptózis során a sejtek citotoxikus anyagokat nem ürítenek a környezetükbe, szemben a nekrotikus sejthalállal (ami a sejtek lízisével jár). Az apoptotikus sejteket a makrofágok felismerik sejtfelszíni lipid (ill. fehérje) mintázataik alapján és fagocitózis útján eltávolítják őket az immunrendszerből. Az apoptózis folyamán bekövetkező DNS fragmentálódás eredményeként megjelenő csökkent mértékű propidium-jodid festődést mutató, ún. szubdiploid (apoptotikus) populáció %-os arányát áramlási citométer segítségével vizsgálhatjuk. A folyamat beindulásának több jellegzetes markere is megfigyelhető mikroszkópiásan, többek között a sejtek plazma membránjának ’hólyagosodása’ (blebbing), majd késői fázisban a DNS fragmentálódása, apoptotikus testek képződése és leválása a sejtekről, valamint a plazma membrán permeabilizálódása („szekunder nekrózis”). Ezeket a folyamatokat a membrán lipidek (pl. GM1 gangliozid) fluoreszcens jelzésével (Alexa-488 cholera toxin B alegység), ill. a spontán módon csak a permeabilizálódott sejtek által felvett ’viabilitás marker’ festék, a propidium jodid (DNS-be interkalálódik) fluoreszcenciája alapján vizsgálhatjuk. Sejtek, anyagok, eszközök:
IP12-7 egér TH-hibridoma sejtek (2.5x105/ml, RPMI komplett médiumban) RPMI komplett médium propidium-jodid törzsoldat (1 mg/ml) VIGYÁZAT, MUTAGÉN HATÁSÚ!!! PBS pufferoldat hipotóniás DNS-extraháló/festő oldat: 0.1 % Na-citrát, 0.1 % Triton X-100, 50 µg/ml propidium-jodid steril csövek; 24-lyukú sejttenyésztő lemez; 5 ml-es FACS csövek 5 μl (40 μg/ml törzsoldatból) Alexa488-cholera toxin B oldattal Metodika A: Az IP12-7 T sejteket RPMI médiumban inkubálunk (5x105 sejt/ml) apoptózis indukció céljából (37°C-on, CO2 termosztátban) 24 lyukú mikroplateben, kb. 24 órán át, 0, 12.5, 25 és 50 µM C2 ceramiddal, ami a sejthalál receptor (Fas) független apoptózis jelátvitel egyik mediátora. Az apoptotikusan indukált sejteket centrifugáljuk és mossuk hideg PBS-ben. A sejteket 5 ml-es FACS csövekbe pipettázzuk, PBS-sel egyszer mossuk (1200 rpm, 8 min), majd a fellazított sejtpelletre 500 µl propidium-jodid tartalmú DNS-extraháló/festő oldatot mérünk (KESZTYŰ AJÁNLATOS!!!), majd a mintákat +4 oC-on 3-4 óráig inkubáljuk, óránként felszuszpendálva (vortex). Áramlási citométeren mérjük a propidium-jodid fluoreszcencia intenzitását (gerjesztés 488 nm-en Ar+-lézerrel, detektálás a vörös (FL3) csatornában). Meghatározzuk az apoptotikus (DNS fragmentáción átesett, szubdiploid) sejtek százalékát, marker jel alkalmazásával
8
Metodika B: Az IP12-7 T sejteket RPMI médiumban inkubálunk (5x105 sejt/ml) apoptózis indukció céljából (37°C-on, CO2 termosztátban) 24 lyukú mikroplateben, kb. 24 órán át, 0, 12.5, 25 és 50 µM C2 ceramiddal, ami a sejthalál receptor (Fas) független apoptózis jelátvitel egyik mediátora. Az apoptotikusan indukált sejteket centrifugáljuk és mossuk hideg PBS-ben, majd festjük a sejt pelletet 5 μl (40 μg/ml törzsoldatból) Alexa-488 cholera toxin B oldattal, 5 percig 37°C-os vízfürdőben vagy 20 percig jégen, mindkét esetben letakarva, hogy fény ne érje. A sejteket mossuk 2 x hideg PBS-ben, majd hideg médiumban felszuszpendáljuk (kb. 500 μl) és közvetlenül mérés előtt 1 μl propidium jodid törzsoldatot (1 mg/ml) adunk hozzá a DNS festése céljából. Feladat: A membrán és DNS festett apoptotikus T sejtmintáról felvett CLSM képek elemzése. A mintában várhatóan találhatók ép sejtek (folytonos, gyűrűszerű membránfestés), ill. olyan sejtek melyekben már beindult az apoptózis, ill. a kb. 20 órás inkubáció alatt már el is jutott a DNS fragmentáció fázisába. Így a vörös színű magfestés alapján ezen sejtek egymás mellett jól értékelhetőek. A membrán festés alapján a membrán permeabilizálódása/propidium jodid pozitivitás, folytonossági hiányok, valamint a gyengébb vagy nem észlelhető festődés alapján a késői apoptózis/szekunder nekrózis azonosítható. A fragmentáció a DNS-t festő propidium jodid foltos intracelluláris festődése alapján deteketálható, szemben a még nem fragmentálódott sejtmagok homogén vörös festődésével.) A ’bleb’-ek (hólyagok) képződése a morfológiai (DIC) kép alapján detektálható és jelzi a korai apoptotikus sejteket.
9
B-limfociták aktiválása a B-sejt receptoron keresztül anti-humán IgG+M F(ab’)2 ellenanyaggal: az intracelluláris Ca2+ válasz áramlási citometria segítségével. Sejtek, anyagok, eszközök: RAMOS humán IgM+ B-sejtvonal RPMI 1640 komplett médium GKN-oldat (NaCl, glükóz és fenolvörös tartalmú fiziológiás foszfátpuffer) tripánkék festék Anti-humán IgG+M F(ab’)2 kecskében termelt poliklonális ellenanyag Fluo-4 AM törzsoldata (1 mg/ml), Pluronic F-127 tartalmú DMSO-ban oldva propidium-jodid törzsoldat (1 mg/ml) VIGYÁZAT, MUTAGÉN HATÁSÚ!!! Ionomycin (1 mg/ml) steril csövek; 5 ml-es FACS csövek Feladat: Aktiváljuk a B sejteket BCR-en keresztül anti-humán IgG+M ellenanyaggal. Alkalmazzunk egyre növekvő dózist a stimulálásra: 0, 1, 2,5 5, 10 µg/ml végkoncentrációk(!). Mérjük meg a kontroll (kezeletlen) és a kezelt sejtek intracelluláris Ca2+-szintjét (mérés: az FL1 csatornában, idő függvényében, 6 percig; halott sejtek negatívan kikapuzva PI DNS-festék segítségével (PI-pozitív sejtek az FL3 csatornában). Ábrázoljuk a görbék maximumát az antiIgG+M dózis függvényében. Metodika: 1. A sejtek feltöltése Fluo-4 AM Ca2+-szenzitív fluoreszcens festékkel: 5x106 sejtet 0,5 ml médiumban felveszünk és 5 µl Fluo-4 AM festék hozzáadását követően 30 percig 37 oC-os vízfürdőben enyhe rázatás mellett inkubálunk. Ezután médiummal 10 ml-re egészítjük ki a sejtszuszpenzió térfogatát, és további 30 percig inkubáljuk 37°C-os vízfürdőben. Egyszeri hideg GKN-nel történő mosás után a sejteket 4 ml hideg médiumban vesszük fel, majd 0,5 ml-enként FACS méréshez használatos csövekbe mérjük és jégre helyezzük. 2. Az 5 perces 37°C-on való előmelegítés után a 0,5 ml sejtszuszpenzióhoz 1 µl propidiumjodid törzsoldatot adunk a halott sejtek mérés során való elkülöníthetősége érdekében. 3. A 0,5 ml térfogatú előmelegített sejtszuszpenziókhoz – az alapjel (kb. 30 sec) regisztrálása után pipettázzunk anti-IgG+M-t, hogy annak a végkoncentrációja rendre 0, 1, 2,5, 5 és 10 µg/ml legyen, majd folytassuk a Ca2+ jel regisztrálását. 4. 30 sec-os alapjel felvétele után 2 µl ionomycin (ionofór vegyület) hozzáadásával mérjük meg B-sejtek maximális Ca2+-jelét.
10
Molekuláris kolokalizáció (pl. MHCII glikoprotein és GM1 gangliozid raft lipid között) kimutatása A20 egér B limfóma (APC) sejtek membránjában konfokális lézerpásztázó mikroszkópiával (CLSM). Bevezetés, elméleti háttér: Receptorok, membránfehérjék kolokalizációjának analízise konfokális fluoreszcens mikroszkópiával A receptorok és egyéb membránfehérjék sejtfelszíni eloszlása gyakran informatív az aktivációs folyamatokhoz kötött un. aktivációs fehérje clusterek (több tíz-száz fehérje molekula csoportosulása) ill. funkcionális membrán mikrodomének kialakulása szempontjából. Ezeket a molekulacsoportosulásokat, ill. tetszőleges membránfehérjék előfordulását bennük, a konfokális fluoreszcens mikroszkópia segítségével is vizsgálhatjuk, természetesen az optikai mikroszkópia térbeli feloldási korlátai (min. 250 nm) mellett. Ez azt jelenti, hogy csak ilyen vagy az ennél nagyobb méretű clusterek/mikrodomének feloldására van lehetőség, a clustereken belüli molekuláris kapcsolatokat ezeken képeken közvetlenül nem tudjuk feloldani. A konfokális mikroszkóp tulajdonképpen a tárgylemezen elhelyezett, immuncitokémiai úton fluoreszcensen jelzett sejteken egy függőleges z irányú optikai szeletelést végez (az immunrendszer különféle sejtjeinél a vastagság, azaz a z irányú kiterjedés kb.1030 mikrométer, egy szelet tipikus vastagsága 200 nm, de ez tetszés szerint változtatható), azaz több fókuszsíkból gyűjt be információt a szelet x,y irányú, pontszerű lézersugárral történő pásztázásával, miközben az éppen pásztázott síkon kívüli térrészből érkező fluoreszcens fényt (háttérzaj) optikai úton (pontszerű rés, ‘pinhole” a detektor előtt) kiszűri. Az így előállt optikai szelet képek számítógép segítségével 3 dimenziós kép formájában rekonstruálhatók. Ez a vizsgálati módszer előnyösen alkalmazható teszőleges sejtfelszíni (vagy akár intracelluláris) fehérje lokalizálására, kolokalizására más fehérjékkel (vagy intracelluláris organellumokkal), ill. membrán mikrodoménekkel (pl. caveola, lipid raft). A módszer alkalmazását itt az MHCII molekula lipid raftokkal (marker: GM1 gangliozid, fluoreszcens cholera toxin B-vel jelölve) való kolokalizációjának demonstrálásán keresztül mutatjuk be, de bármely két tetszőleges fehérje között is hasonló módon végezhető el a vizsgálat. Anyagok, Reagensek, Eszközök: a vizsgálni kívánt sejt/sejtvonal szuszpenzióban izotóniás, foszfátpufferelt sóoldat (PBS, pH: 7.4) fluoreszcens festékkel konjugált monoklonális ellenanyag (FmAb) a vizsgálni kívánt fehérje ellen fluoreszcens festékkel konjugált cholera toxin B (40 μg/ml, frissen hígitva 1 mg/ml törzsoldatból, mely utóbbi aliquotjai – 200Con 6 hónapig tárolhatók) Fc receptort expresszáló sejtek esetén Fc receptor blokkolására alkalmas ellenanyag vagy Fc preparátum 50 ml-es Falcon cső, 1.5 ml-es Eppendorf csövek hűthető centrifuga 4 vagy 8 osztatú microplate, amely alkalmas a mikroszkópra felszerelt hőmérséklet és CO2 szabályozó egység használatára 10µg/ml fibronectin a microplate-ek felszínének bevonására inverz fluoreszcens mikroszkóp konfokális pásztázó egységgel és megfelelő hullámhosszakra érzékeny fotomultiplier detektorokkal ellátva
11
lézer fényforrások (488 nm Argon, 543 nm HeNe-Green és 632nm HeNe-Red lézer) és megfelelő szűrőkockák (dichroikus tükör/ emissziós szűrő kombináció) a kétféle fluoreszcencia detektálására A digitális képek felvételére és kiértékelésére alkalmas szoftver Zeiss LSM5/Axiovert 200, Olympus Fluoview 300/500/IX81.
A módszer leírása: A sejteket megszámoljuk, és mintánként 5x105sejt/ml koncentrációt állítunk be, 1.5 ml-es Eppendorf csövekben, majd lecentrifugáljuk (1300g, 7 perc, 4°C). A sejtpellethez megfelelő (telítési) mennyiségű fluoreszcens ellenanyagot (pl. FITC anti MHCII) és egyidejűleg 5 μl Alexa-647 cholera toxin B-t adunk, majd összekeverést követően, jégen 20 percig inkubáljuk. A jelölést követően a sejteket saját médiumban 2x mossuk. A kettősen jelölt sejtmintát 4% formaldehiddel fixáljuk (szobahőmérsékleten, kb. 20 perc), majd a fibronectinnel előkezelt (ON, szobahőn) microplate lyukaiba pipettázzuk. A microplate-et a hőmérséklet és CO2 szabályozó készülékbe majd a konfokális mikroszkóp tárgyasztalára helyezzük. A konfokális mikroszkópban a minta fluoreszcens képe alapján megkeressük a lemezzel érintkező ún. fenék síkot (csökkenés után éppen eltűnő fluoreszcencia), majd felfelé lépegetve a tetősíkot, és meghatározzuk, hogy milyen szeletvastagságot kívánunk beállítani. Erre a kb. 200 nm érték javasolt. Ezután a mikroszkóp automatikusan pásztázza a kijelölt síkokat, ill. összeállítja a síkokból a 3D rekonstrukciót. A kettősen jelzett sejtek fluoreszcens képét regisztráljuk a mikroszkóp optikai csatornáiban, digitális formában, az előző pontban említett módon. (A festékek esetleges spektrális “áthallásának” ellenőrzésére a felvételeket szekvenciális üzemmódban készítsük.) Célszerű ezen mérésekhez nagy numerikus appertúrájú, immerziós olajos objektívet (60 x nagyítás) alkalmazni. Vizsgáljuk a kolokalizáció mértékét a két optikai csatornában felvett képek pixelhelyes fedésbe hozásával /overlay/ vizuálisan (pl. zöld és vörös szín esetén az adott pixelben történő együttes előfordulás esetén narancssárga szín észlelhető). A kolokalizáció mértéke kvantitatívan is értékelhető, a két képen kijelölt, adott koordinátájú pixelben megjelenő, a detektálási küszöböt meghaladó zöld ill. vörös fluoreszcencia intenzitásának keresztkorreláció analízisével (pl. Image J (NIH, USA) szoftver, vagy az adott mikroszkóp kolokalizációs index értékelő programja). A módszer kritikus pontjai ► Célszerű a vizsgált fehérjékre nézve specifikus, keresztreakciót nem mutató, monoklonális antitestek használata. Fontos az ellenanyaggal való jelöléseket hidegen végezni, ill. a sejtek azonnali fixálása, az antitest internalizáció minimalizálása céljából. ► Fontos olyan festékek választása, melyek emissziós spektrumai jól elkülönülnek egymástól (nincs “áthallás” egymás optikai csatornáiba). ► A kiértékelést (ld. alább) szokásos ekvatoriális optikai szeleten (a sejt középmagasságában) is elvégezni, de célszerűbb a kétféle szín (szomszédos, szeleten belüli síkokból történő) véletlenszerű egymásravetülését kiküszöbölendő egy a sejt felszínéhez közeleső szeleten (is) elvégezni azt. Az eredmények értékelése ► A két, spektrálisan izolált, csatornában (pl. zöld:x,vörös:y) a kettősen jelölt sejtmintáról digitálisan rögzített képek esetén a kolokalizációt a keresztkorrelációs koefficiens (C) értéke alapján kvantitatívan is megítélhetjük. A koefficiens definíciója C = Σi Σj (xi,j - <x>) (yi,j -
) / √ Σi Σj (xi,j - <x>)2 Σi Σj (yi,j - )2, ahol xi,j ill. yi,j az i és j koordinátákkal jellemzett pixel fluoreszcencia értékei az x (zöld) ill. y (vörös) képen. A kiértékeléskor csak a detektálási küszöb fölötti értékekkel rendelkező pixeleket vesszük figyelembe a summázás során. A C elméleti
12
felső értéke 1, ami két teljesen azonos kép esetén adódik, míg a 0 ill. ahhoz közeli érték a kétféle festék (jelölt molekula) szeparált lokalizációjára utal. A módszer alkalmazási lehetőségei ►A módszer alkalmas az immunrendszer legtöbb sejtje (pl. T, B limfociták, hízósejtek, makrofágok) esetén két tetszőleges sejtmembránban expresszált fehérje (vagy lipid) kolokalizációjának vizsgálatára pixelenként. A módszer 104 fehérje/sejt expresszió alatt korlátozottan alkalmazható az esetleges alacsony fluoreszcencia jelszint miatt.
Kísérlet: A20 egér B sejteket anti-MHCII (IA) ellenanyaggal jelöljük a fentiekben leírt módon, egyidejűleg a fluoreszcens cholera toxin B-vel, mely utóbbi a plazma membrán GM1 gangliozidok (raft marker lipid) jelölésére szolgál. A sejteket a jelölés után fixáljuk, majd a sejtkamra lyukaiba cseppentjük. Konfokális mikroszkóp két szeparált optikai csatornájában (zöld és vörös fluoreszcencia) vizsgáljuk a sejtek fluoreszcencia képét („ekvatoriális”, „tető„ és „fenék„ szelet fókuszsíkok), majd a leírt módon pixelenként értékeljük a kétféle fluoreszcencia együttes előfordulását. Megjegyzés: A kolokalizáció magas foka nem jelent bizonyítékot a kétféle molekula fizikai asszociáciációjára/kölcsönhatására (ez csak a fluoreszcencia rezonancia energia transzfer /FRET/ technikával vizsgálható megbízhatóan), pusztán azt jelzi, hogy a két molekula milyen mértékben fordul együttesen elő egy pixel méretnyi térelemben (min. 0.1 x 0.1 mikrométernyi terület, amely a membrán raft mikrodomének mérettartományával összemérhető).
13
