Immunhisztokémia: Előhívó rendszerek, problémák és megoldások

Immunhisztokémia: Előhívó rendszerek, problémák és megoldások

Dr. Krenács Tibor Semmelweis Egyetem I.sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet Budapest

Patológus Klinikai adatok Klasszikus patomorfológia

Molekuláris információ

Patológus Klinikai adatok Klasszikus patomorfológia

Molekuláris információ

Immunhisztokémia Biomarker molekulák in situ Kimutatása

Patológus Klinikai adatok Klasszikus patomorfológia

Molekuláris információ

Immunhisztokémia Biomarker molekulák in situ Előfordulása

Kimutatása

Diagnosztikus interpretálás

Megbízható-e a pozitív ill. a negatív eredmény ?

Immunhisztokémia • Szöveti molekulák “in situ” kimutatása nagy specificitású antigén-antitest kötés segítségével

Immunhisztokémia • Szöveti molekulák “in situ” kimutatása nagy specificitású antigén-antitest kötés segítségével Specifikus térszerkezetbe koncentrált „Kulcs a zárba” illeszkedés

NEM-KOVALENS Kötőerők Ionos -CH2 -CH2-NH3+ - O C-CH2-CH2van der Waals

-CH2-CH-CH3

O Hidofób

CH3 -CH2-CH2H(+)………(-)O -CH2-OH O=C-CH2H - híd

Immunglobulinok IgG (7S) NH3+

papain pepsin

VL Fab

VH emésztés

IgG1, G2 és G4

CH1 Fc receptor kötés O

diszulfid híd zsanér „hinge” régió

2x Fab+Fc

CH2

szénhidrát

CH3

IgG3

• Ig-ok/antitestek: IgG, IgM, (IgA, IgD, IgE) • Antigenitás:

Fc

COO

http://pathmicro.med.sc.edu/mayer (Gene Mayer)

fehérjék > szénhidrátok > lipoidok, nukleinsavak

Immunglobulinok mint reagensek Antigén-determináns: Az antigén molekula azon szakaszai melyekhez az (epitóp)

antitest közvetlenül kapcsolódik Fab-fragmensének hipervariábilis régiójával. Általában 8-15 aminósav (fehérje antigén), ill. oligoszacharidok (szénhidrát antigén) határoz meg egy epitópot.

Stabilitás(tárolás): - Tömény antitestek, 1% BSA+0,1% Na-azid-TBS-ben 4oC-on.

hónapokig, akár évekig igen stabil. - Munkahígítások hasonló módon tartva néhány hétig, de van amelyik antitestet csak frissen hígítva használhatunk.

- Érzékeny antitestek, -20oC-on aliquot-okban (csak egyszer) Destabilizál:

1) alacsony/magas pH; 2) hő; 3) magas sókoncentráció; 4) fény

Immunhiszto-/Cytokémia

Dako, 1994

Shi és mtsai, 1991 Holgate és mtsai, 1983

Polimer konjugátum módszer

Hsu és mtsai, 1981

Antigénfeltárás HIER

Köhler és Milstein, 1975

IGSS módszer

Taylor és Burns, 1974 Sternberger, mtsai, 1970 Nakane és Pierce, 1966 Coons, 1942

FITC-antiPneumocuccus

ABC módszer Monoklonális antitestek

Formol-paraffin immunhisztokémia PAP módszer

Indirekt immunperoxidáz

• Standardizált kit-ek • Atomatizálás

Specifikus/Primer antitestek: •

Egyre több antigénre

•

Szintetizált oligopeptidekre

•

1-1 antigén számtalan epitópjára (pl. intra-, extracelluláris)

•

Foszforilált (aktivált) enzimekre

•

Egyre több formol-paraffinos

IMMUNHISZTOKÉMIA

Egymásra épülő, egymást befolyásoló faktorok

Analitika

Összetett Szövet kimetszés

Diagnosztikus riport

Pre-analitika Antigénfeltárás • hatékonysága Reagens Rögzítés • eszköze •módja minőség/ •időtartama • módja affinitás •szövettípus Jelző-/előhívó•méret rendszer

Immunhisztokémia Automatizálás Reagenseredményessége (Standard kit-ek) hígítás Kontrollok A reakció értékelése értelmezése

Poszt-analitika

Inkubációs idő hőmérséklet

Szöveti pre-analitikai eljárások hibalehetőségei • Szövetrögzítés:

4%-os Formaldehid

denaturál

- szöveti keresztkötések - konformáció torzulás - háromdimenziós rács - gátolt antigén hozzáférés Igaz más kémiai rögzítésre is – de a mértéke változó

Szöveti pre-analitikai eljárások hibalehetőségei • Szövetrögzítés:

4%-os Formaldehid

denaturál

- szöveti keresztkötések - konformáció torzulás - háromdimenziós rács - gátolt antigén hozzáférés Igaz más kémiai rögzítésre is – de a mértéke változó

• Késleltetett/alulrögzítés: antigénkárosodás, diffúzió Sebész/Klinikus szerepe! • Túlrögzítés:

gátolt antigénkimutatás Antigénfeltáró módszerek

Szöveti pre-analitikai eljárások hibalehetőségei • Szövetrögzítés:

4%-os Formaldehid

denaturál

- szöveti keresztkötések - konformáció torzulás - háromdimenziós rács - gátolt antigén hozzáférés Igaz más kémiai rögzítésre is – de a mértéke változó

• Késleltetett/alulrögzítés: antigénkárosodás, diffúzió Sebész/Klinikus szerepe! • Túlrögzítés:

• Víztelenítés: • Beágyazás: • Metszés:

gátolt antigénkimutatás Antigénfeltáró módszerek utolsó absz. alkohol vizes – gyakoribb csere/forgás orientációs hiba – blokk öntés gyűrött vagy szakadozott metszet (terítési hő - idő)

Pre-analitika: Egymásra épülő, egymást befolyásoló faktorok

Immunhisztokémia Rögzítés

BLOKKMÉRET

IDŐ

Szövetrögzítés Ca2+ ionok/kelátok stabilizálják Időben:

1 h = ~1 mm Penetráció

Rögzítés = 16-24 h

Méret:

<10 percen belül < 3 mm

Időtartam: 16-24h

4% formaldehid = ~ 10%-os formalin

Nagyméretű blokk szakszerű indítás nélkül 4oC-on

Immunhisztokémia Rögzítés

Ca2+ ionok/kelátok stabilizálják

IDŐ

BLOKKMÉRET

1 h = ~1 mm Penetráció

Szövetrögzítés

Időben:

10 percen belül

Méret:

< 3 mm

Rögzítés = 16-24 h

Időtartam: 16-24h

4% formaldehid = ~ 10%-os formalin

Nagyméretű blokk szakszerű indítás nélkül 4oC-on

Egymás ellen ható követelmények

Rögzítés

Struktúra

Antigenitás

Kompromisszum!

Antigénfeltárás

Metszés

Metszetadhézió

3-5 m paraffin metszet ADHÉZIÓS TÁRGYLEMEZ pl. SuperFrost (Ultra) Plus

Metszés

Metszetadhézió

3-5 m paraffin metszet ADHÉZIÓS TÁRGYLEMEZ pl. SuperFrost (Ultra) Plus Terítési hőmérséket - idő! - gyűrődéstől, - szakadozástól mentes

Vízfürdő ~48-50 oC

- Simítás nedves szűrőpapíron át - MULTIPONT ADHÉZIÓ! - HŐAKTIVÁLÁS! 60 oC-on ~2h

Metszés

Metszetadhézió

3-5 m paraffin metszet ADHÉZIÓS TÁRGYLEMEZ pl. SuperFrost (Ultra) Plus Terítési hőmérséket - idő! - gyűrődéstől, - szakadozástól mentes

Vízfürdő ~48-50 oC

Terítés vízcseppen

1-2 m, műgyanta

- Simítás nedves szűrőpapíron át - MULTIPONT ADHÉZIÓ! - HŐAKTIVÁLÁS! 60 oC-on ~2h

Antigén/epitóp feltárás CD21 (1F8) Trypsin 8’

17’

Proteáz? vagy Nedves hőhatás (főzés) ? 15’

Proteáz emésztés: • Rögzítés-függő • Fehérje emésztés az epitópot is pl. trypsin: lizin-arginin

20’

Antigén/epitóp feltárás CD21 (1F8) Trypsin 8’

17’

Proteáz? vagy Nedves hőhatás (főzés) ? 15’

Proteáz emésztés: • Rögzítés-függő

20’

HIER

• Fehérje emésztés az epitópot is pl. trypsin: lizin-arginin

Nedves hővel (HIER =„heat-induced epitope retrieval”)

Antigénfetárás főzéssel (HIER) Széleskörű hatás: - a formaldehid keresztkötések lazítása – Ca2+ eltávolítás

Pan-cytokeratin: AE1/AE3

CK5, 14 (CK1, 6, 10, 16, 17?)

Nincs

Proteáz

HIER

Antigénfetárás főzéssel (HIER) Széleskörű hatás: - a formaldehid keresztkötések lazítása – Ca2+ eltávolítás

Pan-cytokeratin: AE1/AE3

CK5, 14 (CK1, 6, 10, 16, 17?)

Proteáz

Nincs

Puffer: Hatékonyság ~ szövetkárosítás

HIER

Tris-EDTA pH9 > Citrát pH6

Kálcium kelátok eltávolítása Ca++ Ca++

Citrát pH 6 EDTA pH 6 EDTA pH 8 Tris/EDTA pH 9*

++ (+) +++ ++++

Javasolt!

Ca++ - Morgan et al. J. Pathol. 182 233-237 1997 - *Vyberg M és Nielsen S. NORDIQC

Vimentin

Tonzilla

Flex – nincs feltárás

Flex – feltárás után

Immunhisztokémia

Antigénfetárás beállítása

Sorozatmetszetek napi reprezentatív/túlrögzített anyagból

Vimentin (V9):

- HIER sorozat eltérő időkkel - Standard immunhisztokémia

Elvárás: Minden lymphocyta pozitív! 40’ citrát pH6,0

30’ citrát pH6,0

elégtelen

optimális

HIER hatékonyság = hőmennyiség (idő+hőmérséklet) + puffer/pH

Antigénfeltárás Normál citrát, pH 6.0

(Hígítás!) Erős citrát, pH 6,0

HER2 2+ emlőrák

Jelentősége Normál Tris-EDTA, pH9,0

HÍGÍTÁS - primer antitest (detektáló rendszer) Optimális hígítás: Maximális jel/háttér arány Jó FP

FN

Primer Antitest

Specificitás - Érzékenység

Melanoma markerek

HMB-45

S-100

Érzékenység: Az adott entitás hány %-ában pozitív Specificitás/Szelektivitás: Az adott entitáson kívül nem vagy csak kismértékben fordul elő Tyrosinase

Melan-A

Epitóp specificitás - érzékenység

EGFR: intra-, extracleluláris

Immunhisztokémia Optimalizás

Primer antitest

Inkubáció

Antigénfeltárás

Detektáló rendszer

Immunhisztokémia Detektáló rendszer

• Típusa (biotin v. polimer) • Érzékenysége • Stabilitása • Gazdaságossága • Kiegészítők (Kit) - reprodukálhatóság - érzékenység - háttércsökkentés - takarékosság

ABC módszer - Hsu és mtsai, 1981 (Strept)Avidin-Biotin peroxidáz (ABC) komplex

Biotin (H vitamin) Biotinnal jelölt kapcsoló antitest Primer antitest

(Strept)avidin PO, AP enzim FITC, TRITC Au kolloid

Jelző/Detektáló rendszer

ABC módszer

pCD3 1:200

Citrát pH6

Tris-EDTA pH9

Jelző/Detektáló rendszer

ABC módszer

pCD3 1:200

Citrát pH6

Tris-EDTA pH9

Hatékony HIER (Tris-EDTA; EDTA stb…) • Metabolikusan erősen aktív sejtekben: FALS POZITIVITÁS !

Endogén biotin ! máj, vese, mellékvese, emlő gasztointesztinális hám

Polimer konjugátum TM EnVision + módszer (Dako)

BIOTIN-MENTES!

EnVision Flex 3. generációs

2 lépcsős polimer: • Primer egér antitest •Anti-nyúl+ anti-egér Polimer-PO

-DAB/H2O2

~10 perc

Detektáló rendszer

Polimer-enzim-antitest BIOTIN-MENTES!

Standardizált kit-ek

Anti-nyúl+ anti-egér Polimer-PO

EnVision Flex Mini High pH K8023 EnVision™ FLEX Endogén peroxidáz blokkoló Foszfát pufferelt H2O2+NaN3+detergens EnVision™ FLEX /HRP Dextrán-PO és kecske anti-nyúl, -egér IgG; BSA, azid EnVision™ FLEX DAB+ Kromogén 3,3’-diaminobenzidin HCl4 szerves oldószerben EnVision™ FLEX Subsztrát puffer Pufferelt hidrogén peroxid oldat tartósítva. EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) Tris/EDTA buffer, pH 9-es puffer.

„3-in-1” módszer

- előmelegítés 65 oC-ra, - paraffin metszet 20’ 97oC - lehülés 65 oC-ra

EnVision™ FLEX Mosó puffer (20x) TBS + detergens, Tween 20, pH 7.6

Polimer konjugátum módszer

BIOTIN-MENTES!

Jelerősítés!

3-lépéses módszer 1. Primer antitest (pl. - egér IgG) 2. Nyúl anti-egér IgG (vagy egér anti-nyúl IgG) Egér IgG

3. Anti-egér/anti nyúl IgG Peroxidáz polimer konjugátum

Polimer konjugátum módszer

BIOTIN-MENTES!

Jelerősítés!

3-lépéses módszer 1. Primer antitest (pl. - egér IgG) Nyúl anti-egér IgG Egér IgG

2. Nyúl anti-egér IgG (vagy egér anti-nyúl IgG) 3. Anti-egér/anti nyúl IgG Peroxidáz polimer konjugátum

Polimer konjugátum módszer

BIOTIN-MENTES!

Jelerősítés! Anti-egér

3-lépéses módszer 1. Primer antitest (pl. - egér IgG) Nyúl anti-egér IgG

Anti-nyúl

Egér IgG

2. Nyúl anti-egér IgG (vagy egér anti-nyúl IgG) 3. Anti-egér/anti nyúl IgG Peroxidáz polimer konjugátum

3-5 x érzékenyebb! Mint a 2 lépéses

Antigénfeltárás

Jelzőrendszer mérete ABC komplex

Anti-IgG-PO

Penetráció

Antigénfeltárás Polimer-konjugátum

Jelzőrendszer mérete ABC komplex

Anti-IgG-PO

Penetráció

Nagyobb méret – hosszabb antigénfeltárás!

CD3

Ig szupercsalád

Legkorábban megjelenő T-sejt marker (ALL)

Dako-Flex

1:200

ABC

1:200

Dako Flex+

1:400

EGFR

Óriássejtes csonttumor (GCTB) ABC- endogén biotin

Dako-Flex

HER2

3+ emlőrák

Dako Flex +

ABC

Dako-Flex

Polimer

HER2

1+ emlőrák Polimer 1

ABC

Dako-Flex

Polimer 2

Flex feltáró-deparaffinálás után

HER2 3+ emlőrák

Kollagén XVII

Melanoma

Flex feltáró-dep. után

Polimer

Immunhisztokémia Szobahő – 120’

Inkubációs idő Szobahő – 30’

EGFR Oesophagus SSC

Immunhisztokémia

Mosó puffer pH-ja CK 20 vastagbélrák

TBS – pH 7,4

Immunhisztokémia

Mosó puffer pH-ja CK 20 vastagbélrák

TBS – pH 8,0

TBS – pH 7,4

Immunhisztokémia

Jellemző hibák

-Technológiai

CD79a Széli intenzitás különbség

HIER Kiszáradási gyűrű

CD3 Drasztikus antigénfeltárás alulrögzültség

Immunhisztokémia

Jellemző hibák

-Technológiai

Széli intenzitás különbség

Sejtbiológiai megfeleltetés

TdT

CD3

HIER

CD79a

CD20

Kiszáradási gyűrű

Drasztikus antigénfeltárás alulrögzültség

Szubcelluláris lokalizáció

CD30

ALK-1

Immunhisztokémia • Antigén kimerítés (negatív) • Alacsony antigénszint (pozitív) • Endogén – beépített pozitív kontroll

ER

Kontrollok

Immunhisztokémia

Kontrollok

• Antigén kimerítés (negatív) • Alacsony antigénszint (pozitív) • Endogén – beépített pozitív kontroll Univerzális multikontroll

ER

Tonsilla, pancreas, máj, appendix

Túlrögzült > 48-72 h

Automatizálás STANDARDIZÁLÁS • Pre-analitika (?) - rögzítést nem! • Analitika - teljes • Poszt-analitika (-/+) - támogathat (képanalízis)

Automatizált immunfestés előnyei • Az inkubáció/mosás/előhívás kontrollja - standard körülményei: - NINCS: kávé/ebéd szünet, szabadság, csúszás - az eredmények reprodukálhatósága jelentősen javul • Immunigények és a munkaerő ritkán van szinkronban - a vizsgálat átfutási ideje csökken és egyenletesebbé válik • Érzékeny és standardizált jelző és előhívó rendszer - rövid inkubációk, az automata naponta többször indítható • Az asszisztensek tapasztalatbeli különbségei kevésbé dominálnak - javulhat a hatékonyság, a minőség és a megbízhatóság is

• Automatizálással a munkaerő ~30-40 %-a felszabadítható - javul a munkaerő kihasználtsága – egyéb fontos teendők

Az immunhisztokémiai asszisztensek fontos kiegészítő tevékenységei • Új antitestek tesztelése • Pozitív kontrollok regisztrálása, metszése

• Új módszerek, antigénfeltáró pufferek tesztelése • A reakciók eredményének technikai monitorozása (belső minőségbiztosítás) • Részvétel külső minőségbiztosításban • A reagensek és módszerek gondozása (standard protokollok) • Kutatási célú reakciók • Tanácsadás, asszisztens oktatás • Adminisztráció: ISO, immunkérések, TB elszámolás stb.

Automatizált kettős jelölés

1.

EnVision Doublestain System K5361

2. AP/F-Red

PO/DAB

Ig könnyűlánc

Ig könnyűlánc

Polimer-enzim detektálók

Kettős jelölés

CD1a - CD68

Reaktív nyirokcsomó

Az immunhisztokémia minőségbiztosítása KÜLSŐ TECHNOLÓGIAI BELSŐ • Standard protokoll követése • Szövetfeldolgozási és festési lépések monitorozása • Festett metszetek ellenőrzése • Kontroll festések ellenőrzése • Hibás minták kigyűjtése • Hiba meghatározása • Hiba javítása • A folyamat rögzítése

ORVOSSZAKMAI/ DIAGNOSZTIKUS

Az immunhisztokémia minőségbiztosítása KÜLSŐ TECHNOLÓGIAI BELSŐ • Standard protokoll követése • Szövetfeldolgozási és festési lépések monitorozása • Festett metszetek ellenőrzése • Kontroll festések ellenőrzése • Hibás minták kigyűjtése • Hiba meghatározása • Hiba javítása • A folyamat rögzítése

ORVOSSZAKMAI/ DIAGNOSZTIKUS

• Technikai kontrollok ellenőrzése • Sejt-/patobiológiai korreláció • Endogén pozitív kontrollok • Panel részeként a kizáró reakciók megfelelősége • Egyezés, eltérés okainak elemzése, javítása

Immunhisztokémia

Alapszabályok

• ELŐHÍVÁS – standard DAB kit (esetenként AEC vagy VIP)

• KONTROLLOK (endogén +kontroll; multiszövet kontroll) • Gazdaságosság (érzékeny módszer >Ab hígítás) • Automatizálás (a standardizálás preferált módja)

• Finomhangolás (minden új primer Ab – titrálás; tárolás!) • Biotin-mentes DETEKTÁLÓ (Jelerősített, 3 lépéses) • ELŐHÍVÁS – standard DAB kit (esetenként AEC vagy VIP) • KONTROLLOK (endogén +kontroll; multiszövet kontroll) • Gazdaságosság (érzékeny módszer >Ab hígítás) • Automatizálás (a standardizálás preferált módja) • Finomhangolás (minden új primer Ab – titrálás; tárolás!)

Köszönet Parsch Edit Dr. Zsákovics Ivett Tamási Anna Kiss Renáta