III. METODOLOGI PENELITIAN
A. BAHAN DAN ALAT 1. Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah susu kambing peranakan
etawah
yang
diperoleh
dari
peternakan
kambing
di
Cangkurawok, Bogor. Bahan kimia yang digunakan untuk analisis antara lain berupa H2SO4, K2SO4, ZnSO4, HgO, HCl, aquades, NaOH 60%, Na2S2O3 5%, H3BO3, BaOH 4,5 %, metilen merah, metilen biru, amil alkohol, HCl 0,02 N, etanol 95%, etanol 70%, indikator PP 1%, NaOH, KHP, H2O2 0,5%, plate count agar (PCA), buffer fosfat, Butterfield’s fosfat steril, brilliant green lactose bile broth (BGLBB), lauryl sulfate tryptose broth (LSTB), eter asam format 1N, amonium dalam asam format, standar laktosa. 2.
Alat Peralatan yang digunakan untuk penelitian ini adalah panci, timbangan, termometer, pengaduk, evaporator vakum OSK 6513 Universal Reduced Pressure Concentration Still Apparatus Ogawa Seiki Co. Ltd., homogenizer heavy duty laboratory mixer emulsifier model L4R Armfield, pengering semprot Buchi 190 mini spray dryer, neraca analitik, gelas ukur, cawan porselin, gelas piala, tabung reaksi, cawan aluminium, plastik high density polyethylene (HDPE), kertas saring Whatman No. 42, cawan petri, pH meter, autoklaf, oven, tanur listrik, desikator, statis, pemanas listrik atau pembakar, pengaduk magnetik, aluminium foil, ose, pembakar
Bunsen,
labu
Kjedahl
100
ml,
pipet,
inkubator,
spektrofotometer, kapas, labu Erlenmeyer, labu Biuret, laktodensimeter, butirometer, chromameter.
15
B. METODE PENELITIAN 1. Penelitian Pendahuluan Penelitian pendahuluan diawali dengan karakterisasi susu kambing. Tahapan karakterisasi tersebut meliputi analisis fisik, kimia dan mikrobiologi susu kambing segar yang digunakan sebagai bahan baku, serta penentuan waktu evaporasi. Analisis fisik terdiri dari analisis berat jenis susu segar, pH, bahan kering, bahan kering tanpa lemak. Analisis kimia yang dilakukan meliputi analisis kadar lemak, kadar protein, kadar laktosa, serta kadar abu dan total asam tertitrasi pada susu segar. Analisis mikrobiologi yang dilakukan meliputi analisis angka lempeng total dan total koliform. Penentuan waktu evaporasi bertujuan untuk menentukan waktu yang dibutuhkan untuk mendapatkan total padatan susu yang diharapkan sebelum dikeringkan. Alat yang digunakan adalah evaporator vakum Ogawa Seiki Co. Ltd. Total padatan yang harus didapatkan adalah 30 – 50 % (Juliawati, 1999). Menurut Walstra et al. (1999) suhu yang baik untuk mengevaporasi susu rendah panas adalah di bawah 60 0C sedangkan penelitian Pratiwi (2005) menyebutkan bahwa telah dilakukan optimasi sampai suhu 50 0C selama 20 menit, namun tidak dicantumkan keterangan volume sampel yang dievaporasi. Oleh karena itu perlu diuji ulang sesuai volume sampel yang digunakan pada penelitian ini. Uji dilakukan dengan metode trial and error dengan pengaturan suhu tetap 50 0C dan waktu proses tahap pertama 20 menit sampai didapatkan waktu evaporasi yang memenuhi total padatan antara 30 – 50 %.
2. Penelitian Utama a. Tahap I Penelitian utama yang dilakukan pada tahap I yaitu pembuatan susu kambing bubuk. Sampel dibeli dalam kondisi beku dan disimpan dalam freezer sampai waktu persiapan pasteurisasi dan evaporasi selesai. Persiapan pasteurisasi dan evaporasi meliputi penyiapan alat, bahan, dan proses sanitasi alat. Pasteurisasi dilakukan pada suhu 63-
16
650 C selama 30 menit (Widodo, 2003), pada wadah yang sama dengan proses evaporasi yaitu di panci evaporator vakum seperti terlihat pada Gambar 2.
Gambar 2. Panci yang digunakan untuk pasteurisasi Proses evaporasi dilanjutkan dengan suhu 500C selama waktu yang didapatkan pada penelitian pendahuluan. Setelah itu susu yang telah dievaporasi dikemas kembali dalam plastik HDPE dua rangkap, kemudian disimpan dalam freezer sampai proses pengeringan siap dilakukan. Persiapan proses pengeringan meliputi penyiapan alat pengering semprot yang telah disanitasi dan diatur suhunya sesuai dengan rancangan percobaan. Setelah proses penyiapan selesai, dilakukan proses thawing dengan suhu kurang dari 45 0C tidak lebih dari 15 menit (Andrews dan Hammack, 2003). Kemudian sampel dihomogenisasi dan dilakukan pengeringan dengan pengering semprot. Produk susu kambing bubuk hasil pengeringan dikemas secara aseptis dengan plastik HDPE steril dua rangkap dilengkapi dengan silica gel. Adapun peralatan yang digunakan pada penelitian terlihat pada Gambar 2. Penelitian utama tahap I dilakukan untuk melihat efek pengaturan suhu outlet pada pengering semprot terhadap sifat fisik dan kimia susu bubuk yang dihasilkan. Sifat fisik yang dianalisis adalah kelarutan, pH dan warna, sedangkan sifat kimia dianalisis total asam tertitrasi (TAT).
17
Pengaturan suhu outlet yang digunakan dalam penelitian utama tahap I adalah 80, 90, dan 100 0C. Penggunaan suhu outlet 100 0C didasarkan pada Malik et al. (1994) dan rancangan pengatuan ke suhu yang lebih rendah didasarkan pada pernyataan Robinson (1999) yang menyatakan bahwa pada suhu 100 0C dan diatasnya maka kelarutan susu bubuk akan sangat rendah. Sedangkan suhu inlet yang digunakan adalah 180±2 0C (Malik et al., 1994).
1
2
3
Gambar 3. Peralatan untuk pembuatan susu bubuk : 1) evaporator; 2) homogenizer; 3) pengering semprot. b. Tahap II Analisis yang dilakukan pada penelitian utama tahap II antara lain : karakterisasi sifat kimia, fisik, dan mikrobiologi susu kambing bubuk yang terpilih. Karakterisasi sifat kimia yang dilakukan meliputi analisis kadar laktosa, kadar lemak, kadar protein, kadar abu dan kadar air. Sedangkan sifat fisik meliputi total padatan. Analisis sifat mikrobiologi meliputi analisis angka lempeng total dan total koliform. Diagram alir penelitian pembuatan susu kambing bubuk dan analisisnya terlihat pada Gambar 4.
18
Gambar 4. Diagram alir penelitian pembuatan susu kambing bubuk dan analisisnya 3. Rancangan Percobaan Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian ini adalah rancangan acak lengkap dengan dua ulangan. Perlakuan yang diamati pada penelitian utama adalah pengaturan suhu outlet 80, 90, dan 100 0C. Model matematis untuk rancangan acak lengkap adalah sebagai berikut : Yij = µ + τi + εij Dimana : i
= perlakuan 1,2…,t dan j = ulangan 1,2,…,r
Yij = pengamatan pada perlakuan suhu ke-i dan ulangan ke-j µ = rataan umum τi = pengaruh perlakuan suhu ke-i εij = pengaruh acak pada perlakuan suhu ke-i ulangan ke-j Bentuk hipotesis yang akan diuji adalah sebagai berikut : H0 = τ1= τ2 = τ3 H1 = paling sedikit ada satu i dimana τi ≠ 0
19
4. Metode Analisis a. Berat jenis (BSN, 1998a) Susu dihomogenkan dengan sempurna (dituangkan dari gelas piala satu ke gelas piala lainnya), kemudian dengan hati-hati dituangkan ke dalam tabung tanpa menimbulkan buih. Laktodensimeter dicelupkan ke dalam susu dalam tabung tadi dengan hati-hati, dibiarkan timbul dan ditunggu sampai diam. Skala yang ditunjukkan kemudian dibaca dan angka yang terbaca menunjukkan angka ke-2 dan ke-3 di belakang koma, sedangkan desimal ke-4 dikira-kira. b. Bahan kering dan bahan kering tanpa lemak (BSN, 1998a) Setelah angka kadar lemak dan BJ didapatkan, maka angka-angka tersebut dimasukkan ke dalam rumus : BK = 1,311 x L + 2,738
-
Keterangan : BK = Kadar bahan kering L = Kadar lemak susu BJ = Berat jenis susu Penetapan kadar bahan kering tanpa lemak berdasarkan rumus : BKTL = BK – L Keterangan : BKTL = Bahan Kering Tanpa Lemak BK = Kadar Bahan Kering L = Kadar Lemak Susu Hasil uji Kadar Bahan Kering Tanpa Lemak susu dinyatakan dalam (%) c. Penentuan pH (Apriyantono et al., 1989)
Sampel yang berbentuk larutan homogennya yang tidak terlalu pekat maka penetapan pH-nya dapat langsung, jika terlalu pekat maka harus diencerkan dulu (perhatikan faktor pengencer, untuk setiap sampel harus sama). Sedangkan untuk sampel kering dilakukan dengan metode
ekstraksi.
Sampel
sebanyak
1
gram
ditimbang dan
20
ditambahkan air 20 ml kemudian dikocok dengan stirer sampai basah semua, kemudian ditambahkan 50 ml air dan dihomogenkan. Sampel dibiarkan selama 1 jam. Tidak perlu disaring dan dibiarkan sampai terbentuk endapan, selanjutnya diukur pH supernatan sampel.
d. Kadar laktosa susu segar (Teles, 1978) Susu 2 ml dipindahkan ke labu takar 100 ml dan diencerkan sampai tepat 100 ml. dicampurkan dengan baik. Sampel 2,5 ml yang telah diencerkan dalam tabung sentrifus, ditambahkan 2 ml ZnSO4, 0,2 ml BaOH 4,5 %. Sentrifus tabung dengan kecepatan 2500 rpm selama 15 – 30 detik atau 1000 rpm selama 1 menit. Supernatan sebanyak 1 ml dipindahkan ke tabung folin sugar blood dan ditambahkan reagen Teles serta ditutup kencang dengan penutup karet yang kering. Bagian tabung sebesar 4-6 cm dibenamkan dalam air mendidih selama 6 menit kemudian didinginkan secara cepat. Sampel dipindahkan ke 12,5 atau 25 ml air distilasi (tergantung kandungan laktosa dari sampel). Sampel dibolak-balik 6 kali agar tercampur. Absorbansinya dibaca pada 520 nm, untuk blankonya sampel diganti air 2,5 ml. e. Kadar lemak (BSN, 1998a) Sebanyak 10 ml asam sulfat pekat dimasukkan ke dalam butirometer. Sebanyak 10,75 ml contoh susu dan 1 ml amil alkohol ditambahkan pula ke dalam butirometer. Urutan dari pemasukan bahan ke dalam butirometer harus runtut seperti cara di atas. Butirometer disumbat sampai rapat, kemudian dikocok sehingga bagian-bagian di dalamnya tercampur rata. Setelah terbentuk warna ungu tua sampai kecoklatan (terbentuk karamel), butirometer dimasukkan ke dalam sentrifus dan disentrifusi pada 1200 rpm selama 5 menit. Kemudian butirometer dimasukkan ke dalam penangas air dengan suhu 650 C selama 5 menit. Setelah itu, skala yang tertera pada butirometer dibaca. Skala tersebut menunjukkan kadar lemak.
21
f. Kadar protein (Castillo et al, 1962) Sebanyak 10 ml sampel susu dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 100 ml. Indikator PP 2 – 3 tetes dan 0,4 ml kalium oksalat ditambahkan pula ke dalam Erlenmeyer. Campuran dalam Erlenmeyer kemudian dititrasi dengan NaOH sampai warna merah muda. Formaldehid ditambahkan 2 ml. Warna larutan akan berubah dari merah jambu menjadi bening. Campuran dititrasi kembali dengan NaOH sampai warna berubah menjadi merah muda. Hasil akhir titrasi yang didapat kemudian dicatat (P). Blanko juga dititrasi dengan prosedur yang sama seperti titrasi sampel tetapi susu diganti dengan aquades. Hasil akhir titrasi yang didapat kemudian dicatat (Q). Perhitungan = (P – Q) x faktor formol Keterangan : faktor formol : susu sapi susu kerbau
= 1.70 = 1.91
susu kambing = 1.95 g. Kadar abu (DSN, 1992) Sebanyak 2-3 g sampel ditimbang dengan seksama ke dalam sebuah cawan porselen yang diketahui bobotnya, untuk sampel cairan diuapkan di atas penangas air sampai kering. Sampel diarangkan di atas nyala pembakar, lalu abukan dalam tanur listrik pada suhu maksimum 550 0C sampai pengabuan sempurna. Sampel didinginkan dalam eksikator, lalu ditimbang sampai bobot tetap. Perhitungan : Kadar abu (%b/b) =W1- W2 x 100% W Keterangan : W = bobot contoh sebelum diabukan dalam gram W1 = bobot contoh+cawan sesudah diabukan dalam gram W2 = bobot cawan kosong dalam gram
22
h. Total asam tertitrasi susu segar (AOAC, 1995) Pengukuran total asam tertitrasi merupakan penentuan konsentrasi total asam. Pada susu segar total asam tertitrasi dihitung sebagai persen asam laktat. Pengukuran asam tertitrasi menggunakan prinsip asam basa. Sebanyak 10 ml sampel dimasukkan ke dalam Erlenmeyer, kemudian ditambahkan 3 tetes indikator phenolphtalein 1%. Sampel dititrasi dengan larutan NaOH 0.1 N yang telah distandardisasi sampai terbentuk warna merah muda yang merupakan titik akhir titrasi. Jumlah (volume) titran yang digunakan, normalitas basa standar, volume atau berat contoh digunakan untuk menghitung total asam tertitrasi. Total asam laktat (%) = [(VNaOH x NNaOH x 90) : (Vsampel x 1000)] x 100
i. Angka lempeng total (Maturin dan Peller, 2001) Pengenceran desimal disiapkan dengan pipet steril terpisah sampai sejumlah keperluan. Pengenceran dilakukan terhadap sampel sampai pengenceran yang telah dibuat. Pengenceran 1 ml hasil dipipet dan diduplikat serta cawan petri ditandai. Sebanyak 12 – 15 ml PCA ditambahkan pada tiap cawan 15 menit dari pengenceran aslinya. Agar dibiarkan memadat. Kemudian diinkubasi terbalik 48±2 jam pada 35°C. Setelah itu dihitung koloni yang tumbuh.
j. Total koliform metode solid (Feng et al., 2002) Violet red bile agar (VRBA) disiapkan sesuai dengan instruksi pabrik kemudian didinginkan sampai suhu 48 0C sebelum digunakan. Sampel disiapkan, dihomogenisasi dan diencerkan sehingga koloni yang diisolasi dapat diperoleh di cawan nantinya. Sebanyak 1 ml dari setiap pengenceran dipindahkan ke cawan petri. VRBA 10 ml dituangkan ke dalam cawan, kemudian digoyang agar tercampur dan dibiarkan memadat. Untuk mencegah koloni permukaan dan sebar, agar padat dilapisi kembali dengan 5 ml VRBA dan dibiarkan memadat. Cawan kemudian diinkubasi terbalik selama 18-24 jam pada 23
suhu 35 0C. Koloni yang dihitung adalah yang berwarna merah-ungu berukuran 0,5 mm atau lebih besar. Cawan harus memiliki 25-250 koloni. Koliform dikonfimasi dengan mengambil sedikitnya 10 perwakilan koloni dan dipindahkan dalam BGLBB. Kemudian diinkubasi pada 35 0C dan diperiksa terdapat gas atau tidak setelah 2448 jam.
k. Total koliform metode MPN (Feng et al., 2002) Sampel ditimbang untuk diencerkan dalam pengenceran 1:10 secara aseptis. Pengenceran desimal kemudian disiapkan dengan pengencer Butterfield’s fosfat steril. Jumlah pengenceran yang disiapkan tergantung dari densitas koliform yang diantisipasi. Suspensi divortex dan dipindahkan sebanyak 1 ml bagian ke 3 tabung LSTB untuk setiap pengenceran sedikitnya 3 pengenceran berurutan. Penyiapan sampai inokulasi ke media yang dituju tidak lebih dari 15 menit. Inkubasi tabung LSTB pada suhu 350C. Tabung diperiksa dan reaksi dicatat pada 24±2 jam untuk gas. Tabung yang negatif diinkubasi kembali untuk tambahan 24 jam dan reaksi diperiksa serta dicatat kembali sampai 48±2 jam. Uji konfirmasi dilakukan terhadap tabung LSTB yang positif. Uji konfirmasi untuk koliform : Untuk setiap tabung LSTB bergas, seose suspensi dipindahkan ke dalam tabung BGLBB. Tabung BGLBB dinkubasi pada 35 0C dan diperiksa untuk produksi gas pada 48±2 jam. MPN dari koliform dihitung berdasarkan proporsi dari tabung LSTB yang positif untuk 3 pengenceran berurutan.
l. Kelarutan (Nuraini, 2001) Sampel susu bubuk (a gram) dilarutkan dalam air bersuhu 40oC dengan konsentrasi 5%. Larutan kemudian diaduk secara kontinyu selama 20 menit. Larutan disaring dengan kertas saring yang telah diketahui bobot tetapnya. Kertas saring dan bagian sampel yang tidak lolos saringan dioven selama satu jam pada suhu 105 oC. Bobot sampel 24
yang tidak tersaring (b gram) diperoleh dari selisih bobot kertas saring akhir dan bobot kertas saring awal. x 100 % m. Total asam tertitrasi susu bubuk (Apriyantono et al., 1989) Sebanyak 10 gram larutan dari persiapan sampel dilarutkan menjadi 250 ml dalam labu takar. Kemudian dititrasi dengan NaOH 0,1 M dan indikator Phenolphtalein (0,3 ml PP untuk 100 ml larutan yang dititrasi). Hasilnya dinyatakan sebagai ml NaOH 0,1 M/100 g atau 100 ml bahan. Nilai persen asam laktat diperoleh dengan acuan dasar 1 ml NaOH 0,11 N = 0,01 g asam laktat dalam 100 ml susu (Robinson, 1999). n. Pengukuran warna metode Hunter Lab (Sopian, 2005) Pengukuran warna dilakukan dengan alat chromameter. Sampel diletakkan pada cawan petri dengan alas putih. Sampel diratakan sampai seluruh permukaan tertutup sampel. Pengukuran dilakukan pada dua posisi yang berbeda dan dua kali untuk tiap sampel. Pengukuran menghasilkan nilai Y, x, y, L, a, b, Hue, dan C. Dalam pengukuran ini dipakai parameter sistem Hunter L, a, b. L menyatakan kecerahan sampel (warna akromatis dari hitam mutlak dengan nilai 0 sampai putih mutlak dengan nilai 100). Parameter a menunjukkan campuran merah hijau ( a+ = 0 – 100 untuk warna merah, a- = 0 – (80) untuk warna hijau). Parameter b menunjukkan campuran biru kuning (b+ = 0 - 70 untuk warna kuning, b- = 0 – ( -70) untuk warna biru). o. Nilai Hue (Kristie, 2008) Nilai Hue didapatkan dari rumus Hue = arctan (b/a). Intepretasi dari bola imajiner Munsell : merah (150 – 470 kuadran I), kuning-merah (470 – 800 kuadran I), kuning (800 kuadran I – 170 kuadran II), hijau-kuning (170 – 560 kuadran II), hijau (560 – 850
25
kuadran II), biru-hijau (850 kuadran II- 300 kuadran III), biru (300 – 760 kuadran III), ungu biru (760 kuadran III – 310 kuadran IV), ungu (310 – 660 kuadran IV), merah-ungu (660 kuadran IV – 140 kuadran I). p. Kadar laktosa susu bubuk (Mistry dan Pulgar, 1996) Laktosa dihitung dengan by difference : % Laktosa = % Total Padatan - (% Protein + % Lemak+ % Abu) q. Kadar Protein Metode Kjeldahl-mikro (Apriyantono et al., 1989) Sejumlah kecil sampel ditimbang (kira-kira akan membutuhkan 310 ml HCl 0,01 N atau 0,02 N). Sampel dipindahkan ke dalam labu Kjedhl 30 ml dan ditambahkan 1,9±0,1 g K2SO4, 40±10 mg HgO, dan 2,0±0,1 ml H2SO4. Jika sampel lebih dari 15 mg ditambahkan 0,1 ml H2SO4 untuk setiap 10 mg bahan organik di atas 15 mg. Beberapa butir batu didih ditambahkan ke dalam labu Kjedahl. Sampel didihkan selama 1-1,5 jam
sampai
cairan menjadi
jernih.
Campuran
didinginkan dan ditambahkan sejumlah kecil air secara perlahan-lahan, kemudian didinginkan kembali. Isi labu dipindahkan ke dalam alat destilasi. Labu dicuci dan dibilas 5-6 kali dengan 1-2 ml air. Air cucian ini dipindahkan ke dalam alat distilasi. Erlenmeyer 125 ml yang berisi 5 ml larutan H3BO3 dan 2-4 tetes indikator (Campuran 2 bagian metil merah 0,2% dalam alkohol dan 1 bagian metil biru 0,2 % dalam alkohol) diletakkan di bawah kondensor. Sebanyak 9-10 ml larutan NaOH-Na2S2O3 ditambahkan kemudian distilasi dilakukan sampai tertampung kira–kira 15 ml destilat dalam Erlenmeyer. Tabung kondenser dibilas dengan air dan bilasannya ditampung dalam Erlenmeyer yang sama. Isi Erlenmeyer diencerkan sampai kira-kira 50 ml kemudian dititrasi dengan HCl 0,02 sampai terjadi perubahan warna menjadi abu-abu. Penetapan blanko juga dilakukan. Kadar nitrogen dihitung berdasarkan rumus : % Nitrogen = (HCl – Blanko) ml x N HCl x 14,007 x 100 mg sampel Kadar protein (%) = % Nitrogen x 6.38 (susu) 26
q. Kadar air (DSN, 1992) Sebanyak 1-2 g cuplikan ditimbang dengan seksama pada sebuah botol timbang bertutup yang sudah diketahui bobotnya. Untuk contoh berupa cairan, botol timbang dilengkapi dengan pengaduk dan pasir kwarsa/ kertas saring berlipat. Sampel dikeringkan pada oven suhu 105 0
C selama 3 jam kemudian didinginkan dalam eksikator. Hasilnya
ditimbang dan pekerjaan ini diulangi hingga diperoleh bobot tetap. Perhitungan : Kadar air (%) = W/W1 x 100 W= bobot cuplikan sebelum dikeringkan dalam gram W1= kehilangan bobot setelah dikeringkan dalam gram
r. Total padatan (AOAC, 1995) Total padatan ditentukan dengan menimbang sampel susu, mengeringkan susu, dan menimbang residu susu kering. Sampel dikeringkan semalam di dalam oven suhu 100±10C. Kandungan total padatan adalah berat dari residu susu yang dikeringkan dan diekspresikan dalam bentuk % dari berat susu bubuk aslinya. Pelaksanaan metodenya disesuaikan dengan kondisi yang ada. Perhitungan : Total Padatan (%) = (W2-W)/(W1-W) x 100 Keterangan : W = berat cawan W1 = Berat cawan + sampel susu W2 = Berat cawan + susu kering
27
