III. METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini selesai dikerjakan dalam waktu 7 bulan (Mei-Desember 2011). Lokasi penelitian dilakukan di 3 desa di wilayah Kecamatan Dramaga Kabupaten Bogor. Analisis darah dilaksanakan di Laboratorium Biokimia Pangan Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan IPB serta Laboratorium Mikrobiologi Medik Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan IPB.
3.2 Alat dan Bahan Istilah CPO (crude palm oil) dalam program ini diterjemahkan sebagai “minyak sawit mentah” (MSMn), sedangkan MSMn yang telah mengalami pengolahan tetapi masih mengandung karotenoid tinggi dan berwarna merah disebut “minyak sawit merah” (MSM), yang merupakan penjabaran dari red palm oil (RPO). Penggunaan istilah ini untuk menghindari kesalahpahaman masyarakat umum jika memakai kata crude pada CPO dan diterjemahkan menjadi “minyak sawit asli”, dikhawatirkan akan memberikan kesan yang tidak menguntungkan bagi minyak sawit. Bahan utama yang digunakan adalah Minyak Sawit Mentah (MSMn) yang dikemas dalam botol plastik 140 mL sebagai minyak tumis. MSMn diperoleh dari PT SMART TBK Jakarta. Pembotolan produk MSMn dilaksanakan di TECHNOPARK IPB dan telah didaftarkan untuk mendapatkan nomor registrasi produk industri rumah tangga (P-IRT) dari Dinas Kesehatan Kabupaten Bogor. Nomor pendaftaran produk ini adalah P-IRT No 207320101871. Peralatan yang digunakan adalah vacutainer 5 mL dengan EDTA, venojek dan pompanya, syringe 10 mL, laminar, pipet pasteur, valcon 15 mL, freezer, lemari pendingin, sentrifuse, timbangan analitik, mikropipet 100 μL hingga 1000 μL, vortex, spektrofotometer UV-Vis, mikroplat, ELISA reader dan peralatan gelas lainnya.
32
Bahan untuk analisis plasma adalah: kit analisis kolesterol (AMS Chol4/092711), kit analisis trigliserida (AMS Trigs2/092598), HDL precipitan (FS 60053819), Monoclonal mouse anti-human C-reactive protein (Sigma C16880,2 mL), HRP (Horseradish Peroksidase) conjugated Goat anti-mouse IgG (ICL GGFC-90P), substrat ABTS (2,2’-azino-bis-(3-ethyl-benzothiazoline-6-sulphonic acid)) (KPL 50-66-18), akuades, tween-20, tween-80, PBS (phosphate buffer saline), akuabides, casein, dan beberapa bahan kimia lain. 3.3 Tahapan Penelitian 3.3.1 Pemilihan Responden dan Pengambilan Darah Sebelum Intervensi Responden yang digunakan adalah dari keluarga prasejahtera yang secara ekonomi tidak mampu membeli alternatif sumber vitamin A dari sayur-sayuran dan buah-buahan. Dari data yang diperoleh dari kantor desa terpilih, dilakukan kunjungan ke rumah-rumah penduduk yang termasuk ke dalam keluarga prasejahtera untuk meminta kesediaan menjadi responden dalam penelitian ini dan diberikan pengetahuan mengenai manfaat minyak sawit mentah. Responden diundang untuk mengikuti pertemuan kelompok untuk memberikan penjelasan lebih lanjut seperti cara penggunaan minyak sawit merah melalui demo masak, pembagian leaflet dan komik. Pada penelitian ini diambil 508 responden (dari 9 cluster) yang terbagi dalam 151 kepala keluarga dari RT/RW: 01,03/2; 02/6 Desa Babakan, 01,03/1; 02,03/2; 01/3 Desa Dramaga, 01,02,03/02 Desa Sukadamai. Dari 508 responden, dipilih 33 orang diambil darahnya untuk analisis profil lipid dan kadar C-reactive protein sebelum dan sesudah konsumsi minyak sawit merah. Syarat responden yang dipilih untuk analisis darahnya: •
Sehat berdasarkan pemeriksaan klinik
•
Ibu rumah tangga usia produktif
•
Sedang tidak hamil dan menyusui
•
Berstatus gizi normal (tidak overweight)
•
Tidak merokok
33
Responden yang terpilih diambil darahnya di Puskesmas desa Dramaga oleh seorang perawat setelah menandatangani informed consent, darah diambil secara aseptis dengan venojek sekali pakai. Sampel darah ditempatkan dalam vacutainer steril yang berisi antikoagulan EDTA. Darah kemudian disentrifuse dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit. Setelah disentrifuse akan diperoleh tiga lapisan, bagian atas adalah plasma darah, bagian tengah adalah buffy coat yang mengandung sel darah putih, dan bagian bawah adalah sel darah merah. Plasma dan sel darah merah kemudian disimpan dalam freezer dengan suhu 200C. 3.3.2 Intervensi Responden dengan Minyak Sawit Mentah (MSMn) Setiap keluarga responden akan diberikan produk MSMn 1 botol (140 mL) setiap minggu selama 2 bulan. Dengan asumsi tiap keluarga beranggotakan 4-8 orang, sehingga di perhitungkan setiap orang/hari akan mengkonsumsi minyak sawit mentah sebanyak 2,5 – 5 mL per orang/hari setara dengan 1500-3000 µg ekiuvalen vitamin A. Kalaupun anggota keluarga mencapai 10-12 orang akan tetap mendapat 1,7 – 2 mL per orang/hari setara dengan 1020-1200 µg equivalen vitamin A. Untuk sosialisasi penggunaan minyak sawit mentah, dilakukan pertemuan masal sebelum intervensi, sebulan setelah intervensi, dan 2 bulan setelah intervensi yang bertempat di balai desa atau majelis taklim desa setempat. Dalam pertemuan masal dilakukan penyuluhan singkat mengenai minyak sawit mentah (edukasi manfaat dan cara penggunaan), demo masak, dan pembagian komik yang berisi cara penggunaan minyak sawit mentah. Untuk memastikan responden mengonsumsi minyak sawit mentah, dilakukan monitoring dan evaluasi konsumsi dengan kunjungan minimal 1 minggu satu kali ke rumah-rumah responden selama masa intervensi berlangsung, dan juga diberikan kuesioner setelah 2 hari konsumsi, 1 minggu konsumsi, 2 minggu konsumsi, 1 bulan konsumsi, dan 2 bulan konsumsi untuk mengetahui penerimaan responden terhadap minyak sawit mentah.
34
Anjuran dan takaran penggunaan minyak sawit mentah dapat dilihat pada Tabel 11 berikut, dengan asumsi kebutuhan: 2,5 mL per/hari untuk orang dewasa dan 1 mL per hari untuk anak-anak. Tabel 11 Anjuran dan takaran penggunaan MSMn Ukuran MSMn 1 Sendok Makan ( ± 6 mL) = 2-3 kecrot
2 Sendok Makan (± 12 mL) = 4-6 kecrot
1 Kecrot = 2-3 mL
Cara penggunaan
Digunakan sebagai minyak tumis, untuk porsi makan seluruh keluarga dalam sehari. ( 2 dewasa 1 anak-anak) Digunakan sebagai minyak tumis, untuk porsi makan seluruh keluarga dalam sehari. (4 dewasa 2 anak-anak) Digunakan untuk makanan siap santap 1 porsi untuk 1 orang per satu kali makan
3.3.3. Pengambilan Darah Responden Setelah Intervensi Pengambilan darah dilakukan di Puskesmas desa Dramaga oleh seorang perawat. Darah diambil dari 33 responden yang sama dengan yang diambil darahnya sebelum intervensi MSMn. Darah diambil secara aseptis dengan venojek sekali pakai. Sampel darah selanjutnya diperlakukan sama dengan yang dilakukan terhadap sampel darah sebelum intervensi MSMn sebagaimana telah disebutkan di atas. 3.3.4 Analisis Plasma darah 3.3.4.1 Analisis Profil Lipid Lipid darah meliputi kadar trigliserida (TG), kadar total kolesterol (TK), kadar HDL dan kadar LDL. Kadar TG, TK dan HDL pada plasma/serum dapat diukur dengan menggunakan kit reagen komersial. Kit komersial berisi sejumLah enzim-enzim spesifik yang mengubah substrat menjadi kromofor, sehingga kadarnya dapat diukur dengan spektrofotometri. a. Analisis Kadar Total Kolesterol (TK) Kadar kolesterol total diukur dengan metode Cholesterol Oxidase Phenol Aminoantipyrin (CHOD-PAP) dan menggunakan pereaksi kit (AMS). Kolesterol diukur setelah dihidrolisis dan dioksidasi secara enzimatis.
35
kolesterol esterase
Kolesterol ester + H2O Kolesterol + O2
kolesterol oksidase
2 H2O2 + fenol+ 4-aminoantipyrine
kolesterol + asam lemak
kolesten-3-one + H2O2 peroksidase
quinoneimine + 4 H2O
Prosedur analisis yaitu sampel atau standar diambil sebanyak 100 µL dan dicampurkan dengan 1000 µL pereaksi kit (mengandung kolesterol esterase, kolesterol oksidase, fenol, 4-aminoantipyrine, peroksidase dan bufer) kemudian dimasukkan ke dalam tabung lalu dicampurkan sampai homogen. Campuran diinkubasi pada suhu 370C selama 5 menit, dan kemudian dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 500 nm. Perhitungan kadar kolesterol total dilakukan dengan menggunakan rumus : /
/
b. Analisis Kadar HDL Pengukuran HDL dilakukan dengan terlebih dahulu melakukan presipitasi terhadap lipoprotein densitas rendah (LDL dan VLDL) dan kilomikron. Presipitasi dilakukan dengan penambahan asam fosfotungstat dan kehadiran ion magnesium (MgCl2). Setelah disentrifugasi, HDL dalam supernatan diukur menggunakan pereaksi kit yang sama dengan pengukuran total kolesterol (CHOD-PAP). Prosedur presipitasi adalah: sebanyak 200 µL plasma darah dicampurkan dengan 500 µL pereaksi presipitasi yang telah diencerkan dengan akuabides (rasio 4+1), kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar. Setelah sentrifugasi pada 1074g (4000 rpm) selama 10 menit, dihasilkan supernatan yang siap untuk dianalisis sama seperti analisis total kolesterol di atas.
/
/
c. Analisis Kadar Trigliserida (TG) Sampel atau standar diambil sebanyak 10 µL dan dicampurkan dengan 1000 µL pereaksi kit, kemudian dimasukkan ke dalam tabung lalu dicampurkan
36
sampai homogen. Campuran diinkubasi pada suhu 370C selama 5 menit, dan kemudian dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 500 nm. Trigliserida ditentukan setelah hidrolisis enzimatis dengan lipase. lipase
Trigliserida + H2O Gliserol + ATP
gliserol + asam lemak
gliserol kinase
Gliserol-3-fosfat + O2
gliserol-3-fosfat + ADP
gliserol-3-fosfat oksidase
2 H2O2 + 4-aminofenazon + 4 klorofenol
dihidroksiaseton fosfat + H2O2 peroksidase
quinoneimine + HCl + 4 H2O
Perhitungan kadar trigliserida dilakukan dengan menggunakan rumus : /
/
d. Perhitungan Kadar LDL Teknik yang paling banyak digunakan oleh lab klinik untuk mengukur kadar LDL pasien yaitu dengan menggunakan formula Friedewald sebagai berikut: Kadar LDL = Total kolesterol – HDL – TG/5 3.3.4.2 Analisa C-Reactive Protein (CRP) Pengukuran kadar C-RP (C-Reactive Protein) secara kuantitatif diukur dengan menggunakan metode ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) indirect, dimana pengujian setiap sampel diulang sebanyak 3 kali. Prinsip kerja dari metode ini adalah antigen (C-RP plasma) dilekatkan pada lubang mikroplat ELISA dan dapat berikatan secara spesifik dengan antibodi primer (monoclonal mouse anti-human C-reactive protein), komplek antigen antibodi ini dapat dideteksi dengan menambahkan antibodi sekunder berlabel enzim HRP (HRP Conjugated Goat anti-maouse IgG). JumLah komplek antigen antibodi terlihat dari intensitas warna yang timbul setelah ditambahkan substrat ABTS (2,2’-azino-bis-(3-ethyl-benzo-thiazoline-6-sulphonic
acid)).
Reaksi
substrat
ABTS dengan enzim HRP menghasikan produk yang berwarna hijau (gambar 3). Intensitas warna yang terbentuk dibaca menggunakan alat ELISA reader pada panjang gelombang 450 nm.
37
Gambar 3 Prinsip kerja Elisa Indirect Warna yang terbentuk merupakan hasil reaksi antara substrat ABTS (0,3 g/L mengandung peroksida, H2O2, 0,01%) dengan enzim HRP yang terkonjugasi
dengan antibodi sekunder. Hidrogen peroksida digunakan oleh enzim HRP untuk mengoksidasi ABTS menjadi ABTS teroksidasi (ABTS+) yang berwarna hijau dan bersifat larut (Gambar 4).
Gambar 4 Reaksi antara substrat ABTS dengan Antibodi yang terkonjugasi dengan enzim HRP Prosedur analisa (Zakaria 2006): 100 µL plasma dimasukkan ke dalam mikroplat ELISA, inkubasi pada suhu 370C selama 1 jam, dibuang isinya kemudian dicuci 2 kali dengan PBST (PBS yang mengandung 0,05% tween-20) sebanyak 200 μL/sumur, didiamkan 1 menit, dibuang kembali isi mikroplat
38
ELISA. Selanjutnya ditambahkan 100 µL kasein 3%, diinkubasi pada suhu 370C selama 2 jam setelah dilakukan pencucian mikroplat sebanyak 2 kali dengan Tween 80 0.5%, kemudian ditambahkan 100 µL antibodi primer yang telah diencerkan (konsentrasi 10 µl/mL). Mikroplat diinkubasi pada suhu 370C selama 1 jam, lalu dicuci dengan PBST. Mikroplat selanjutnya ditambahkankan 100 µL antibodi sekunder yang telah diencerkan (1:1000), diinkubasi pada suhu 370C selama 1 jam, kemudian dicuci dengan PBST. Terakhir, mikroplat ditambahkan 50 µL ABTS, inkubasi 15 menit pada suhu ruang. Optical density (OD) diukur dengan mikroplat reader pada panjang gelombang 450 nm. 3.3.5 Analisis Penerimaan Produk MSMn Analisis penerimaan responden direkapitulasi dari hasil wawancara melalui kuesioner. Pengujian penerimaan produk diuji pada produk pangan yang diolah menggunakan MSMn, bukan uji organoleptik pada produk MSMn. 3.3.6. Analisis Data Untuk menguji signifikan perbaikan profil lipid dan penurunan kadar C-RP sebelum dan sesudah intervensi dengan MSMn selama 2 bulan diuji dengan Uji t berpasangan pada α=0,05.
