III. METODOLOGI PENELITIAN
A. BAHAN DAN ALAT Bahan baku yang digunakan adalah rimpang kunyit, asam jawa tanpa biji cap Cabe, dan rimpang jahe yang dibeli di Pasar Induk Tangerang, air minum dalam kemasan (AMDK) “Aqua”, dan gula pasir “Gulaku” (sukrosa). Bahan-bahan yang digunakan dalam analisis antara lain aluminium foil, air destilata, buffer pH 4 dan pH 7, metanol proanalysis, DPPH (1,1diphenyl-2-picrylhydrazyl), dan asam askorbat. Alat-alat yang digunakan dalam pembuatan ekstrak bahan adalah neraca, sendok makan, blender, kain saring, baskom, sarung tangan plastik, dan botol. Alat-alat yang digunakan dalam analisis adalah refraktometer, neraca analitik, tabung reaksi, pipet volumetrik, pipet tetes, kuvet, botol semprot, labu takar, gelas piala, gelas ukur, spektrofotometer UV-Vis, pH-meter, dan Chromameter Minolta CR-310.
B. METODE PENELITIAN Penelitian ini dibagi menjadi tiga tahap, yaitu: (1) persiapan bahan baku, (2) pembuatan rancangan formulasi dan respon dengan program Design Expert 7.0®, (3) pembuatan formula minuman, (4) analisis kimia, fisik, dan organoleptik, (5) analisis respon, (6) optimasi formula, dan (7) verifikasi formula optimum. Garis besar penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 9.
1. Persiapan Bahan Baku a. Ekstraksi Kunyit Rimpang kunyit yang akan digunakan dibersihkan dari kotoran, dikupas, dicuci bersih, dan ditiriskan. Rimpang kunyit kemudian dipotong kecil-kecil dan dihancurkan dengan blender sambil ditambahkan AMDK dengan perbandingan kunyit dan air sebesar 1:1 (b/b). Ekstraksi dengan menggunakan blender menghasilkan bubur encer yang selanjutnya disaring menggunakan kain saring hingga diperoleh ampas dan filtrat. Filtrat yang didapatkan kemudian didekantasi di dalam botol yang diletakkan di dalam refrigerator selama semalam. Proses dekantasi dimaksudkan untuk memisahkan pati yang masih tertinggal di dalam filtrat. Ekstrak kunyit kemudian dikeluarkan dari dalam botol dengan menggunakan selang dan pati yang mengendap dibuang. Ekstrak yang didapatkan kemudian disimpan di dalam botol air mineral yang telah dilapisi aluminium foil dan ditutup rapat. Ekstrak kunyit kemudian disimpan di dalam refrigerator sampai akan digunakan.
b. Ekstraksi Asam Jawa Asam jawa dipisahkan dari bijinya yang masih tertinggal. Asam jawa yang sudah bersih dari biji dihancurkan dengan blender sambil ditambahkan AMDK dengan perbandingan asam jawa dan air sebesar 4:1 (b/b). Ekstraksi dengan menggunakan blender menghasilkan bubur encer yang selanjutnya disaring menggunakan kain saring hingga diperoleh ampas dan filtrat. Ekstrak kemudian disimpan di dalam botol yang tertutup rapat dan disimpan di dalam refrigerator. Filtrat yang didapatkan kemudian didekantasi di dalam botol yang diletakkan di dalam refrigerator selama semalam. Proses dekantasi dimaksudkan untuk memisahkan
17
pati yang masih tertinggal di dalam filtrat. Ekstrak asam jawa kemudian dikeluarkan dari dalam botol dengan menggunakan selang dan pati yang mengendap dibuang. Ekstrak yang didapatkan kemudian disimpan di dalam botol air mineral yang telah dilapisi aluminium foil dan ditutup rapat. Ekstrak asam jawa kemudian disimpan di dalam refrigerator sampai akan digunakan.
c. Ekstraksi Jahe Jahe yang akan digunakan dibersihkan dari kotoran yang menempel dengan cara disikat dan dicuci dengan air mengalir. Kemudian jahe ditiriskan dan dikupas. Jahe yang sudah dikupas kemudian dipotong kecil-kecil dan dihancurkan dengan blender sambil ditambahkan AMDK dengan perbandingan jahe dan air sebesar 1:1 (b/b). Ekstraksi dengan menggunakan blender menghasilkan bubur encer yang selanjutnya disaring menggunakan kain saring hingga diperoleh ampas dan filtrat. Filtrat yang didapatkan kemudian didekantasi di dalam botol yang diletakkan di dalam refrigerator selama semalam. Proses dekantasi dimaksudkan untuk memisahkan pati yang masih tertinggal di dalam filtrat. Ekstrak jahe kemudian dikeluarkan dari dalam botol dengan menggunakan selang dan pati yang mengendap dibuang. Ekstrak yang didapatkan kemudian disimpan di dalam botol air mineral yang telah dilapisi aluminium foil dan ditutup rapat. Ekstrak jahe kemudian disimpan di dalam refrigerator sampai akan digunakan.
d. Pembuatan Larutan Stok Gula Larutan stok gula dibuat dengan cara melarutkan gula pasir (sukrosa) di dalam AMDK dengan perbandingan gula dan air sebesar 1:1 (b/b). Total padatan terlarut (TPT) larutan stok gula dibuat sebesar 39 – 40˚Brix
2. Pembuatan Rancangan Formula dan Respon dengan Program Design Expert 7.0® Setelah didapatkan ekstrak rempah (ekstrak kunyit, ekstrak asam jawa, dan ekstrak jahe) serta larutan stok gula yang akan digunakan dalam pembuatan formula minuman, penelitian dilanjutkan dengan tahapan pembuatan rancangan formula dan respon dengan menggunakan peranti lunak Design Expert 7.0® tahun 2005. Rancangan metode yang digunakan pada program ini adalah mixture design dengan rancangan D-optimal design. Rancangan ini digunakan oleh formulator untuk mendapatkan formula optimum dari berbagai kombinasi bahan. Tahap ini diawali dengan penetapan komponen bahan baku yang digunakan sebagai variabel tetap dan variabel berubah. Variabel tetap tidak dimasukkan ke dalam pengaturan rancangan pada program. Hal ini dikarenakan variabel tetap nilainya tidak berubah pada setiap formula. Variabel tetap adalah komponen bahan baku yang diasumsikan tidak akan mempengaruhi respon yang akan didapatkan dari setiap formula. Dalam penelitian ini, komponen bahan baku yang termasuk ke dalam variabel tetap adalah air sebesar 30%(v/v) dan larutan stok gula sebesar 40%(v/v). Sedangkan variabel berubah akan dimasukkan ke dalam pengaturan rancangan formula karena nilainya yang berubah-ubah pada setiap formula.
18
Variabel berubah adalah komponen bahan baku yang diasumsikan akan memberikan pengaruh terhadap respon yang dihasilkan pada masing-masing formula minuman. Oleh karena itu, nilai variabel berubah akan berbeda-beda pada setiap formula untuk melihat pengaruh perubahan komposisinya terhadap respon yang dihasilkan. Dalam penelitian ini, komponen bahan baku yang termasuk ke dalam variabel berubah adalah ekstrak kunyit, ekstrak asam jawa, dan ekstrak jahe. Penentuan variabel berubah kemudian diikuti dengan penentuan kisaran minimum dan maksimum dari penggunaan ekstrak kunyit, asam jawa, dan jahe, yaitu 0-30%(v/v) dengan total maksimum ketiganya adalah 30%(v/v). Batas-batas ini akan menjadi input dalam pengaturan rancangan formula oleh program Design Expert 7.0® dengan rancangan Doptimal design untuk mencari rancangan formula dari komponen-komponen yang dicampurkan sehingga dihasilkan output berupa rancangan formula minuman. Setelah dilakukan penentuan komponen formula, dilakukan penentuan variabel respon yang diinginkan. Menurut Wulandhari (2007), penentuan respon dilakukan berdasarkan karakteristik yang akan berubah akibat perubahan proporsi relatif dari komponenkomponennya. Respon yang digunakan dalam penelitian ini adalah respon obyektif berupa kapasitas antioksidan, pH, TPT, dan warna (L, a, b, dan ˚Hue) serta respon subyektif hasil uji rating hedonik berupa warna, bau, rasa, dan keseluruhan/overall. Respon-respon yang dipilih menggambarkan mutu formula minuman yang dihasilkan. Dengan mengoptimalkan responrespon yang dipilih, diharapkan formula minuman yang dihasilkan akan memiliki mutu yang optimum.
3. Pembuatan Formula Minuman Formula minuman dibuat dengan mencampurkan ekstrak kunyit, ekstrak asam jawa, ekstrak jahe, AMDK, dan larutan stok gula dengan formula yang telah didapatkan dari program Design Expert 7.0®. Kemudian seluruh formula minuman yang dibuat diukur responnya dengan melakukan analisis kimia, fisik, dan organoleptik yang telah ditentukan.
19
Kunyit
Asam Jawa
Jahe
Ekstraksi
Ekstraksi
Ekstraksi
Ekstrak Kunyit
Ekstrak Asam Jawa
Ekstrak Jahe
Pembuatan Rancangan Formula dan Penentuan Respon
Pembuatan Formula Minuman
Uji Kapasitas Antioksidan
Pengukuran pH
Pengukuran TPT
Analisis Warna
Uji Rating Hedonik
Analisis Respon
Optimasi Formula
Solusi Formula Optimum
Verifikasi
Formula Minuman Terpilih
Gambar 9. Rancangan diagram alir penelitian
20
4. Analisis Kimia, Fisik, dan Organoleptik Seluruh formula minuman yang telah dibuat kemudian diukur responnya dengan melakukan analisis kimia, fisik, dan organoleptik yang terdiri dari (1) analisis kapasitas antioksidan, (2) pengukuran nilai pH, (3) pengukuran nilai TPT, (4) analisis warna, dan (5) uji rating hedonik. Hasil pengukuran dan perhitungan dari keseluruhan respon kemudian akan dimasukkan ke dalam program Design Expert 7.0® untuk selanjutnya dianalisis.
a. Kapasitas Antioksidan (Leong, Shui 2002) Analisis kapasitas antioksidan yang dilakukan dalam penelitian ini menggunakan metode spektrofotometri, yaitu metode reduksi DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil). Larutan-larutan yang dibutuhkan adalah larutan DPPH 1 mM dalam metanol proanalysis, metanol, larutan standar asam askorbat, dan sampel. Analisis kapasitas antioksidan terdiri atas dua tahap, yaitu 1) pembuatan kurva standar asam askorbat dan 2) penentuan kapasitas antioksidan sampel.
1) Pembuatan Kurva Standar Asam Askorbat Seri larutan standar asam askorbat dibuat dengan konsentrasi 0 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm, dan 500 ppm. Larutan blanko dibuat dengan mencampurkan 8 ml metanol dengan 2 ml larutan DPPH. Larutan standar dibuat dengan mencampurkan 7 ml metanol dan 2 ml larutan DPPH dengan 1 ml standar asam askorbat pada masingmasing konsentrasi. Larutan didiamkan pada suhu ruang selama 30 menit untuk selanjutnya diukur absorbansinya (A) menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 520 nm. Pengukuran dilakukan secara duplo dengan dua kali ulangan. Selanjutnya dibuat kurva standar asam askorbat dengan memplotkan hubungan antara konsentrasi asam askorbat dan (A blanko – A sampel).
2) Penentuan Kapasitas Antioksidan Sampel Larutan blanko dibuat dengan mencampurkan 8 ml metanol dengan 2 ml larutan DPPH. Larutan sampel dibuat dengan mencampurkan 7 ml metanol dan 2 ml larutan DPPH dengan 1 ml sampel. Larutan didiamkan pada suhu ruang selama 30 menit untuk selanjutnya diukur absorbansinya (A) menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 520 nm. Pengukuran dilakukan secara duplo dengan dua kali ulangan. Selanjutnya diperoleh nilai (A blanko – A sampel) yang akan disubstitusikan pada persamaan kurva standar asam askorbat untuk menentukan AEAC (Ascorbic Acid Equivalent Antioxidant Capacity). Nilai yang diperoleh menunjukkan jumlah mg asam askorbat yang ekivalen dengan 1 ml sampel.
b. Nilai pH (Faridah et al. 2009) Sebelum dilakukan pengukuran, pH-meter dinyalakan dan distabilkan terlebih dahulu selama 10 menit. Selanjutnya pH-meter dikalibrasi dengan menggunakan larutan buffer pH 4 dan pH 7. Elektroda dibilas dengan air destilata dan dikeringkan dengan kertas tissue. Sebanyak 20 ml sampel dimasukkan ke dalam gelas piala 100 ml. Elektroda pH-meter dibilas dengan air destilata, dikeringkan, dan dicelupkan ke dalam sampel. Angka yang tertera pada layar menunjukkan nilai pH formula minuman. Sealanjutnya, elektroda kembali dibilas dengan air destilata, dikeringkan, dan dapat digunakan kembali
21
untuk pengukuran pH sampel. Pengukuran sampel dilakukan dengan dua kali ulangan untuk setiap sampelnya.
c. Nilai TPT (AOAC 1995) Total padatan terlarut diukur dengan menggunakan alat refraktometer. Filtrat sampel diteteskan di atas prisma refraktometer yang sudah distabilkan lalu dilakukan pembacaan. Sebelum dan setelah digunakan, prisma refraktometer dibersihkan dengan alkohol. Total padatan terlarut dinyatakan dalam ˚Brix.
d. Analisis Warna (Hutching 1999) Analisis warna dilakukan dengan menggunakan alat Chromameter Minolta CR310. Sebelum dilakukan pengukuran nilai L, a, dan b perlu dilakukan kalibrasi terlebih dahulu terhadap alat dengan menggunakan pelat standar warna putih (L=97.51; a=5.35; b=-3.37). setelah proses kalibrasi selesai, dilanjutkan dengan pengukuran warna sampel. Pengukuran dilakukan dengan tiga kali ulangan untuk masing-masing sampel. Sistem warna yang digunakan adalah sistem Lab. Sampel diletakkan pada tempat yang tersedia, kemudian tombol start ditekan dan akan diperoleh nilai L, a, dan b dari sampel. Hasil pengukuran dikonversi ke dalam sistem Hunter dengan L menyatakan parameter kecerahan dari hitam (0) sampai putih (100). Notasi a menyatakan warna kromatik campuran merah-hijau dengan nilai + a (positif) dari 0 sampai +100 untuk warna merah dan nilai – a (negatif) dari 0 sampai -80 untuk warna hijau. Notasi b menyatakan warna kromatik campuran biru-kuning dengan nilai + (positif) dari 0 sampai +70 untuk warna kuning dan nilai –b (negatif) dari 0 sampai -80 untuk warna biru. Sedangkan L menyatakan kecerahan warna. Semakin tinggi kecerahan warna, semakin tinggi nilai L. Selanjutnya dari nilai a dan b dapat dihitung ˚Hue yang menunjukkan kisaran warna sampel. Hubungan antara ˚Hue dan warna sampel dapat dilihat pada Tabel 6. Nilai ˚Hue dapat dihitung dengan persamaan : 𝑏
˚Hue = tan-1 𝑎
(3)
Tabel 6. Hubungan ˚Hue dengan warna sampel ˚Hue
Warna Sampel
18˚ - 54˚ 54˚ - 90˚ 90˚ - 126˚ 126˚ - 162˚ 162˚ - 198˚ 198˚ - 234˚ 234˚ - 270˚ 270˚ - 306˚ 306˚ - 342˚ 342˚ - 18˚
red (R) yellow red (YR) yellow (Y) yellow green (YG) green (G) blue green (BG) blue (B) blue purple (BP) purple (P) red purple (RP)
22
e. Uji Rating Hedonik Uji rating digunakan bila uji sensori bertujuan menentukan dalam cara bagaimana suatu atribut sensori tertentu bervariasi di antara sejumlah contoh. Pada uji rating hedonik, panelis diminta untuk menilai atribut sensori tertentu produk (rasa, warna, dan aroma) dan keseluruhan sifat sensori produk berdasarkan tingkat kesukaannya (Adawiyah, Waysima 2009). Skala pengukuran yang digunakan dapat berupa skala kategori atau skala garis. Persyaratan jumlah minimum panelis untuk uji rating hedonik menurut American Srandard Testing Material (ASTM) adalah 70 panelis tidak terlatih, sedangkan menurut Meilgaard et al. (1999), persyaratan jumlah minimum panelis untuk uji rating hedonik adalah 30 panelis tidak terlatih. Dalam penelitian ini, sampel yang digunakan adalah seluruh formula yang dihasilkan dari tahapan perancangan formula dengan program Design Expert 7.0®. Panelis tidak terlatih yang digunakan adalah sebanyak 70 orang. Taraf signifikansi yang digunakan adalah 5%. Uji dilakukan terhadap 4 atribut sensori sampel, yaitu warna, rasa, bau, dan overall. Dalam penelitian ini, uji rating hedonik yang dilakukan menggunakan skala kategori 7 poin dengan deskripsi sebagai berikut: 1 = sangat tidak suka 2 = tidak suka 3 = agak tidak suka 4 = netral 5 = agak suka 6 = suka 7 = sangat suka
5. Analisis Respon Setelah dilakukan pengukuran respon dari setiap formula, dilakukan input data hasil pengukuran tersebut dalam program Design Expert 7.0®. Hasil intput data dari masingmasing respon dari seluruh formula selanjutnya akan dianalisa oleh program Design Expert 7.0®. Pada tahapan analisis respon ini, program Design Expert 7.0® memberikan model polinomial yang sesuai dengan hasil pengukuran setiap respon. Respon-respon yang dianalisis antara lain kapasitas antioksidan, nilai pH, nilai TPT, hasil analisis warna (nilai L, a, b, dan ˚Hue), serta skor hasil uji rating hedonik (warna, bau, rasa, dan keseluruhan/overall). Program Design Expert 7.0® memberikan empat pilihan model polinomial untuk setiap respon, yaitu mean, linear, quadratic, dan cubic. Model polinomial merupakan output dari proses analisis respon formula minuman dengan rancangan D-optimal design. Terdapat tiga tahap untuk mendapatkan persamaan polinomial, yaitu berdasarkan sequential model sum of squares [Tipe I], lack of fit tests, dan model summary statistics. Kemudian partial sum of squares [Tipe III] akan memilih ordo tertinggi persamaan polinomial dari satu variabel respon yang analisis ragamnya masih memberikan hasil yang berbeda nyata. Lack of fit tests akan memilih ordo persamaan polinomial tertinggi yang memberikan hasil tidak berbeda nyata dilihat dari segi penyimpangan responnya. Model summary statistics akan memilih ordo persamaan polinomial yang memberikan nilai “Adjusted R-squared” dan “Predicted Rsquared” maksimum.
23
Berdasarkan tahap tersebut, peranti lunak Design Expert 7.0® menentukan ordo persamaan polinomial tertinggi untuk setiap variabel responnya. Suatu variabel respon dapat dikatakan berbeda nyata atau signifikan pada taraf signifikansi 5% apabila nilai p “prob>f” hasil analisis ragam lebih kecil dari 0.05. Variabel respon yang hasil analisis ragamnya berbeda nyata dapat digunakan sebagai model prediksi karena variabel uji memberikan pengaruh yang signifikan terhadap respon formula minuman tersebut. Selanjutnya, model yang dianggap paling sesuai tersebut akan ditampilkan di dalam sebuah contour-plot berupa grafik dua dimensi (2-D) atau tiga dimensi (3-D). Selain itu, program Design Expert 7.0® juga memberikan grafik plot kenormalan residual (normal plot residual) yang mengindikasikan apakah residual (selisih atau perbedaan antara respon aktual dengan yang diprediksikan untuk setiap respon) mengikuti garis kenormalan (garis lurus).
6. Optimasi Formula Hasil analisis dari setiap respon kemudian digunakan untuk melakukan optimasi formula dengan program Design Expert 7.0®. Proses optimasi dilakukan untuk mendapatkan suatu formula yang menghasilkan respon yang optimal sesuai target optimasi yang diinginkan. Nilai target optimasi yang dapat dicapai dikenal dengan istilah nilai desirability yang ditunjukkan dengan nilai 0 – 1. Semakin tinggi nilai desirability menunjukkan semakin tingginya kesesuaian formula minuman yang didapatkan untuk mencapai formula optimal dengan variabel respon yang dikehendaki. Pada tahap optimasi, komponen dioptimasi sesuai dengan target yang diinginkan. Untuk ekstrak kunyit, ekstrak asam jawa, dan ekstrak jahe ditargetkan untuk berada di dalam range (in range), yaitu antara 0-30%(v/v) dari volume total formula minuman. Nilai pH, nilai TPT, dan hasil analisis warna (nilai L, a, b, dan dan ˚Hue) juga ditargetkan untuk berada dalam range semula agar hasil yang didapatkan tidak menyimpang. Sedangkan variabel kapasitas antioksidan dan hasil uji rating hedonik (warna, bau, rasa, dan keseluruhan/overall) ditargetkan untuk menjadi setinggi mungkin. Dalam menentukan target optimasi seperti pada variabel kapasitas antioksidan dan hasil uji rating hedonik dilakukan pembobotan kepentingan untuk tujuan yang diinginkan. Pembobotan ini dinamakan importance yang dapat dipilih mulai dari 1 (+) hingga 5 (+++++) tergantung kepentingan variabel respon yang bersangkutan. Semakin tanda positif yang diberikan menunjukkan tingkat kepentingan variabel respon yang semakin tinggi. Berdasarkan target optimasi yang telah ditentukan, program Design Expert 7.0® akan memberikan solusi formula minuman optimum yang kemudian akan dilanjutkan ke tahapan verifikasi untuk memastikan kebenaran formula dan persamaan yang didapatkan. Solusi formula optimum yang diberikan juga dilengkapi dengan prediksi nilai setiap respon sehingga dapat dilihat kesesuaiannya pada tahapan verifikasi.
7. Verifikasi Setelah program Design Expert 7.0® memberikan solusi formula optimum, selanjutnya dilakukan pembuatan formula yang direkomendasikan tersebut. Hal ini dilakukan untuk memperoleh nilai aktual setiap respon dari formula yang direkomendasikan. Pengujian yang dilakukan untuk melihat kesesuaian respon aktual dan prediksi nilai respon yang didapatkan disebut dengan verifikasi. Uji yang dilakukan dalam tahapan verifikasi adalah uji kapasitas antioksidan, pengukuran nilai pH dan TPT, analisis warna (nilai L, a, b, dan ˚Hue), serta uji
24
rating hedonik terhadap empat atribut sampel (warna, bau, rasa, dan keseluruhan/overall). Prosedur uji yang dilakukan pada tahap verifikasi sama dengan prosedur yang dilakukan pada tahap analisis kimia, fisik, dan organoleptik. Tetapi pada tahap verifikasi, jumlah panelis tidak terlatih yang digunakan adalah 30 orang.
25
