III. METODOLOGI PENELITIAN A. BAHAN DAN ALAT Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah daun dan batang nilam varietas sidikalang, lhoksumawe, dan tapaktuan yang diambil di Desa Sukamulya, Kecamatan Garawangi, Kuningan, Jawa Barat. Ketiga varietas ini ditanam dengan teknik budidaya yang sama, ketinggian yang sama, serta waktu pemanenan yang sama (3-4 bulan). Penentuan varietas tanaman nilam mengacu pada karakteristik varietas nilam oleh Nuryani (2006) dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3. Karakteristik Tiga Varietas Unggul Tanaman Nilam Varietas Tapaktuan Panjang cabang primer 46-66 (Cm) Panjang cabang sekunder 20-45 (Cm) Pertulangan daun Delta, Bulat Telur Bentuk daun Menyirip Warna daun Hijau Panjang daun 6,46-7,52 Lebar daun 5,22-6,39 Panjang tangkai 2,67-4,13 Pangkal daun Rata, membulat Kadar Minyak (%) 2,83 Kadar patchouli alcohol 33,31 (%) Sumber: Nuryani (2006), Pustikasari (2011)
Lhokseumawe 38-63
Sidikalang 43-62
20-35
26-34
Delta, Bulat Telur Menyirip Hijau 6,23-6,75 5,16-6,36 2,66-4,28 Datar, membulat 3,21 32,63
Delta, Bulat Telur Menyirip Hijau keunguan 6,30-6,45 4,88-6,26 2,71-3,34 Rata, Membulat 2,89 32,95
Yang menjadi patokan dalam penentuan tiga varietas unggul nilam yang dilakukan pada penelitian ini adalah warna batang dan daun nilam. Varietas Tapaktuan dan Lhoksumawe memiliki warna batang dan daun yang sama, yaitu berwarna hijau, sedangkan Sidikalang berwarna hijau keunguan. Selain itu dilihat juga pangkal daun, dimana Varietas Tapaktuan dan Sidikalang memiliki bentuk rata dan membulat, sedangkan Lhoksumawe memiliki bentuk datar dan membulat. Setelah penentuan sampel, dilakukan preaparasi sampel untuk ketiga varietas tanaman nilam yang meliputi pemanenan, pengeringan, perajangan. Pemanenan dilakukan pada tanaman nilam yang berumur 2-3 bulan. Setelah dipanen, dilakukan pengeringan di bawah sinar matahari langsung selama 3 hari dan dilanjutkan dengan pengeringanginan selama 4 hari di dalam ruangan bersuhu 27-30oC. Daun dan ranting (terna) nilam yang sudah kering kemudian dirajang hingga ukuran 3-5 cm. Setelah preparasi sampel selesai, terna nilam siap untuk disuling. Bahan lain yang digunakan untuk seleksi dan pelatihan panelis adalah standar aroma yang diperoleh dari PT Ogawa Indonesia dan Sensient. Bahan kimia yang digunakan untuk ekstraksi komponen volatil yaitu toluene dan natrium sulfat anhidrat (grade pro analysis buatan Merck), kertas saring Whatman, propilen glikol, n-alkana standar, heksana pro analysis, etil asetat pro analysis, silica gel 60 H 7736, aquades, dan kapas. Bahan kimia diperoleh dari Stockroom Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan.
12
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah botol gelas amber kecil, mikropipet, alat-alat gelas, pisau, neraca analitik, seprangkat alat suling, pemanas,oven, freezer, tusuk sate, jarum, pipet tetes, termometel bola basah dan bola kering, statif, vial, alat GC Merk Agilent 7890 A detektor FID, dan alat GC Merk Agilent 7890 A detektor MS Merk Agilent 5975 C.
B. METODE PENELITIAN 1.
Penyulingan Minyak Nilam Penelitian Tahap I yang dilakukan penyulingan terna nilam menjadi minyak dengan metode destilasi uap. Penyulingan dilakukan di Laboratorium Balai Tanaman Obat dan Tanaman Aromatik (Balittro), Cimanggu, Bogor. Proses yang dilakukan dapat dilihat pada Gambar 8. Terna Nilam
Persiapan alat-alat penyulingan
Penyulingan uap (120140oC, 1-2 atm, 8 jam) Analisis kadar air Penambahan Natrium anhidrat dan Penyaringan minyak menggunakan kertas whatman Perhitungan rendemen Minyak Nilam Gambar 8. Diagram Alir Penyulingan Minyak Nilam (Modifikasi Metode Emmyzar & Yulius 2004)
Alat yang digunakan untuk penyulingan terna nilam terdiri dari ketel suling, kondensor, clavenger appartus, dan mercher burner. Gambar alat penyulingan dapat dilihat pada Gambar 9.
13
Gambar 9. Alat Penyulingan Minyak Nilam
2.
Analisis Sensori QDA (Meilgaard et.al. 1999, Setyaningsih, et.al. 2010 ) Penelitian Tahap II merupakan tahapan analisis sensori dengan menggunakan panelis terlatih. Tahapan analisis sensori yang dilakukan meliputi seleksi panelis, pelatihan panelis, dan pengujian.
14
a.
Seleksi Panelis Pemilihan panelis dilakukan dengan menyeleksi sejumlah orang sehingga didapatkan 8-12 orang yang selanjutnya akan dilatih hingga menjadi panelis terlatih. Tahap-tahap pemilihan panelis meliputi pertanyaan prescreening, uji ketepatan (uji duotrio atau uji segitiga) dan uji rangking (Meilgaard et al. 1999). Adapun pada tahap-tahap pemilihan yang dilakukan pada penelitian ini meliputi pendaftaran calon panelis, identifikasi bau dasar dan uji ketepatan (uji segitiga). Formulir pendaftaran panelis dapat dilihat pada Lampiran 1 Uji pertama adalah identifikasi aroma dasar seperti yang tertera pada Tabel 4. Scoresheet identifikasi aroma dasar dapat dilihat pada Lampiran 2. Uji ketepatan yang dilakukan menggunakan uji segitiga dimana bahan aroma standar dibagi dalam tiga kelompok. Setiap kelompok terdiri dari tiga aroma yang disajikan antara dua aroma yang sama dan satu aroma yang berbeda. Calon panelis diinstruksikan untuk menulis kode sampel yang berbeda. Scoresheet uji segitiga dapat dilihat pada Lampiran 3. Uji rangking dilakukan dengan mengurutkan intensitas aroma dari tiga konsentrasi aroma yang berbeda dari satu standar aroma yang sama. Scoresheet uji ranking dapat dilihat pada Lampiran 4. Tabel 4. Aroma dasar Bahan Patchouli Oil Benzaldehyde Cinnamic Aldehyde Winter green Sandalwood Oil (Burdock 2010)
Karakteristik bau Woody Bitter Almond, nutty, bitter Cinnamon Balsamic, herbal, green earthy Sandalwood, woody, insects
b. Pelatihan Panelis Panelis yang telah lolos seleksi diberi pelatihan untuk melatih kepekaan sensori terhadap atribut aroma yang akan sangat membantu pengujian selanjutnya. Setelah diperoleh panelis terlatih, diadakan Focus Group Discussion (FGD) dengan seorang panel leader yang memimpin diskusi tersebut. Aroma standar yang menjadi aroma penyusun aroma minyak nilam yang diteliti diperkenalkan pada sesi FGD ini. Selanjutnya, dilakukan penyamaan persepsi antarpanelis dengan pengenalan terminologi istilah aroma yang telah diperoleh sebelumnya. Panelis dilatih untuk dapat menilai intensitas suatu sampel pada skala garis. Scoresheet untuk latihan menskala terdapat pada Lampiran 6. Setelah panelis mengetahui jenis-jenis aroma yang terdapat dalam minyak nilam, panelis diminta untuk mendeskripsikan aroma tersebut menggunakan skala garis sehingga dapat diketahui seberapa dalam persepsi sensori aroma yang diterima oleh panelis. Selanjutnya, panelis akan dilatih untuk menilai intensitas tiap aroma dengan melakukan uji rating pada skala garis untuk tiap aroma dengan 3 tingkat konsentrasi yang berbeda. Jenis aroma dan konsentrasi yang diperkenalkan untuk melatih kemampuan menilai panelis pada skala garis dapat dilihat pada Lampiran 7. Pelatihan yang dilakukan didasarkan pada kompleksitas produk yang akan dianalisis. Dalam penelitian ini, pelatihan diadakan kontinyu selama 3-4 minggu setiap hari kerja. Materi pelatihan terdiri atas penetapan terminologi, pengenalan skala deskriptif, pengenalan perbedaan yang kecil dari produk, dan latihan. Pelatihan
15
bertujuan untuk melatih kepekaan sensori para panelis terhadap atribut sensori yang akan sangat membantu pada pengujian selanjutnya. Penetapan terminologi atribut sensori dilakukan untuk menyamakan konsep atribut sensori sehingga dapat dikomunikasikan antar panelis satu dengan yang lainnya (Stone & Sidel 2004). Panelis dilatih menggunakan uji rating skala garis pada atribut aroma. Pelatihan panelis dilakukan menggunakan larutan standar. Konsentrasi larutan standar untuk atribut aroma ditentukan secara subyektif oleh para panelis. Penentuan standar dan pelatihan dilakukan menggunakan skala garis tidak terstruktur sepanjang 15 cm dengan garis vertikal sebagai pengarah di awal dan di ujung garis. Pada tanda awal dan akhir diberi label berupa ekspresi kata-kata yang menunjukkan intensitas dari atribut yang diuji. Satu garis digunakan untuk satu atribut dan panelis memberi tanda berupa garis vertikal atau menyilang pada kisaran respon yang dideteksi. Pengenceran tiap jenis aroma tunggal dilakukan dengan propylene glycol. Uji rating tersebut dilakukan berulang kali hingga panelis dapat membuat urutan yang tepat untuk setiap sampel. Uji rating pada skala garis tersebut akan menghasilkan nilai-nilai intensitas aroma menurut subjektivitas panelis yang terukur melalui garis yang ditandai. Nilai konsentrasi dan intensitas masing-masing atribut akan diperoleh pada saat melakukan pelatihan QDA, selanjutnya akan dibuat hubungan logaritmik dan diplot menjadi persamaan Stephen (Meilgaard et al. 1999). Persamaannya adalah sebagai berikut: R = k Cn dimana R merupakan perkiraan intensitas, C merupakan konsentrasi, k merupakan konstanta yang tergantung pada unit yang dipilih untuk mengukur R dan C, dan n merupakan eksponensial yang digunakan untuk mengukur laju perkembangan intensitas yang diperoleh sebagai suatu fungsi stimulus intensitas. Nilai intensitas konsentrasi standar aroma yang diperoleh saat melakukan pelatihan diolah menggunakan persamaan Stephen (Meilgaard et al. 1999), lalu persamaan tersebut diturunkan hingga menjadi persamaan logaritmik dengan turunan rumus: Log R = Log k + n Log C Keterangan : R = perkiraan intensitas yang terdeteksi (magnitude C = ukuran konsentrasi (molar, molal, %) Log k = konstanta n = kemiringan
estimation)
Hal ini dilakukan untuk mendapatkan nilai konsentrasi standar yang digunakan pada analisis kuantitatif. Contoh scoresheet penentuan standar aroma dapat dilihat pada Lampiran 8. Dari hasil uji rating tersebut, dapat diperoleh kurva linier antara nilai logaritmik rataan konsentrasi aroma terhadap nilai logaritmik konsentrasi aroma sehingga dapat diketahui konsentrasi tertentu yang harus dibuat untuk menghasilkan intensitas tertentu suatu jenis aroma. Konsentrasi yang telah disesuaikan dengan persepsi panelis tersebut digunakan sebagai reference dalam memberikan penilaian tiap jenis aroma yang terdapat di dalam sampel minyak nilam.
16
Ketika panelis telah dapat mengukur dan mengurutkan dengan benar urutan konsentrasi tiap jenis aroma, panelis akan dilatih kembali untuk menentukan intensitas tiap jenis aroma yang dibuat berdasarkan nilai pada pengukuran yang diberikan panelis sebelumnya. Konsentrasi larutan standar aroma untuk pelatihan dapat dilihat pada Lampiran 9. Nilai konsentrasi untuk intensitas tertentu, digunakan sebagai reference untuk memudahkan penilaian panelis saat menguji sampel. Scoresheet pelatihan aroma cherry, camphor, dry, earthy, eugenol, floral, musky, sweet, turpentine, dan woody dapat dilihat pada Lampiran 10. c.
3.
Pengujian Pengujian sampel minyak nilam dilakukan menggunakan metode QDA. Pada saat pengujian, sampel minyak nilam hasil penyulingan ditempatkan pada wadah khusus yang telah diberi kode 3 digit angka acak. Panelis diminta untuk melakukan penilaian dari 10 aroma yang telah ditentukan pada minyak nilam. Sampel yang digunakan pada uji QDA merupakan sampel yang dipilih berdasarkan tiga varietas minyak nilam yang berbeda, yaitu minyak nilam Varietas Lhoksumawe, Sidikalang, dan Tapaktuan. Pemilihan sampel ini dimaksudkan untuk melihat perbedaan deskripsi aroma pada ketiga varietas minyak nilam. Penilaian dilakukan pada skala garis sepanjang 15 cm (diasumsikan skala 0-100) sesuai dengan intensitas atribut aroma yang terdapat di dalamnya dengan bantuan reference. Adanya standar dengan berbagai intensitas pada setiap atribut membantu panelis untuk mengingat dan menyamakan persepsi dengan panelis lainnya. Atribut aroma yang diujikan sebanyak 10 jenis, yaitu woody, camphor, cherry, dry, earthy, eugenil, floral, musky, sweet, dan turpentine. Jumlah set per sesi analisis tergantung derajat kelelahan panelis dalam menilai dan mengisi lembar uji. Umumnya 4-6 sampel per hari dan jika produk yang dinilai rumit atau atribut sensori yang dianalisis banyak, maka cukup tiga sampel per hari. Apabila sampel terlalu sedikit, akan mengakibatkan variasi yang terlalu besar dan apabila sampel terlalu banyak, akan mengakibatkan antarcontoh kelihatannya berbeda tetapi sebenarnya tidak (Setyaningsih et.al, 2010). Analisis atribut aroma dilakukan dalam tiga periode, yaitu empat atribut pada periode pertama, tiga atribut pada periode kedua, dan tiga atribut lainnya pada periode ketiga. Pengujian dilakukan sebanyak tiga kali ulangan pada setiap sampel. Ulangan dapat membantu mengkondisikan panelis terlatih agar dapat melakukan penilaian secara konsisten (Piggot et al. 1998). Scoresheet uji QDA dapat dilihat pada Lampiran 11.
Analisis GC-MS Peneelitian Tahap III adalah analisis minyak nilam dengan menggunakan GC-MS. Analisis ini dilakukan di Laboratorium Flavor Balai Besar Penelitian Padi Sukamandi, Subang, Jawa Barat. GC-MS yang digunakan mendeteksi senyawa dengan bobot molekul antara 35-550. Spesifikasi metode GC-MS yang digunakan dapat dilihat pada Tabel 5.
17
Tabel 5. Spesifikasi dan Metode GC-MS Spesifikasi
Keterangan
Gas Chromatography Merk Kolom
Agilent 7890A Kolom Kapiler DB-5 (60 m x 250 µm x 0.25 µm) Helium MS 2500C 0,2µL 1:200 50 ml/menit 500C ditahan 2 menit 100C/menit sampai suhu 990C, 20C/menit sampai 2250C ditahan 20 menit 50C/menit sampai 2500C 2500C
Gas Pembawa Detektor Suhu Injector Volume injeksi Split Ratio Kecepatan split Suhu awal Laju kenaikan suhu
Suhu akhir Mass Spectrometry Merk Kisaran Massa (Purwati 2010)
Agilent 5975 C 35-550
Pada analisis GC-MS, sampel minyak nilam dimasukkan ke dalam vial 2ml sebanyak dua kali ulangan dan diletakkan secara berurutan pada wadah sampel alat GC-MS. Heksana juga dimasukkan ke dalam vial 2ml dan diletakkan pada wadah paling akhir. Sampel minyak nilam akan disuntikkan ke dalam alat GC-MS sebanyak 0.2 µL dengan menggunakan syringe secara otomatis. Setelah menyuntikkan satu sampel minyak nilam, Syringe akan secara otomatis tercuci dan melakukan pembersihan kolom. Pada tahap pembersihan kolom, GC-MS dijalankan tanpa ada sampel yang dimasukkan. Proses ini dilakukan berulang hingga sampel terakhir. Setelah semua sampel tersuntikkan, tahap selanjutnya adalah identifikasi komponen minyak nilam. Pada tahap identifikasi, dilakukan analisis terhadap spektra massa dan perhitungan nilai Linear Retention Index (LRI). Interpretasi spektra massa dilakukan dengan bantuan komputer untuk membandingkan spektra massa suatu senyawa dengan spektra massa pada library dari NIST05, Wiley Library dan dibandingkan dengan referensi. Perhitungan Nilai LRI setiap komponen yang diperoleh dihitung berdasarkan waktu retensi standar alkana C8-C20. Berdasarkan Van Den Dool & Kratz (1963) perhitungan LRI dapat dihitung dengan persamaan:
LRIi
100
t t
t t
100x
18
Keterangan : LRIi = indeks retensi linier komponen i ti = waktu retansi komponen i (menit) tx = waktu retensi alkana standar, dengan n buah atom karbon, yang muncul sesuah komponen i (menit) tx+1 = waktu retensi alkana standar, dengan n+1 buah atom karbon, yang muncul sesuah komponen i (menit) x = jumlah atom karbon alkana standar yang muncul sebelum komponen i Hasil interpretasi spektra massa kemudian dikoreksi dengan membandingkan nilai LRI komponen tersebut dengan nilai LRI literatur yang menggunakan kolom yang sama. Jika senyawa tersebut memiliki pola spektra massa yang sama dan nilai LRI yang sama atau mendekati nilai LRI referensi, maka komponen tersebut dapat diidentifikasi. 4.
Fraksinasi Menggunakan Kromatografi Kolom Penelitian tahap akhir yang dilakukan merupakan fraksinasi salah satu sampel minyak nilam, yaitu varietas Sidikalang dengan menggunakan teknik kromatografi kolom. Fraksinasi dilakukan dengan pengemasan kolom untuk pemisahan 1 mL minyak dengan diameter 0,6 cm dan tinggi kolom 9 cm. Saat pengemasan kolom, jumlah silica gel adalah 15-20 kali jumlah ekstrak dan perbandingan tinggi adsorban dan diameter kolom adalah 8:1. Minyak nilam kasar dilarutkan dalam eluen heksana dengan pengenceran 10x, kemudian komponennya dipisahkan dengan kromatografi kolom sistem elusi step gradient (peningkatan kepolaran) menggunakan eluen campuran n-heksana:etil asetat (wulandari, 2011). Eluat akan menetes sedikit demi sedikit dan ditampung setiap 2 mL dalam enam tabung reaksi yang telah diberi nomor kemudian diuji dengan Gas Chromatography Flame Ionization Detector (GC FID). Apabila terlihat pemisahan komponen-komponen minyak nilam dengan baik menggunakan GC-FID dan terpilih fraksi terbaik, maka dilakukan analisis selanjutnya dengan menggunakan GC-MS. Diagram alir fraksinasi minyak nilam Varietas Sidikalang menggunakan kromatografi kolom dapat dilihat pada Gambar 10.
19
Minyak Nilam
Kromatografi Kolom
Fraksi 1
Fraksi 2
Gas Chromatography (GC)
Fraksi n
Fraksi terbaik
GC-MS Gambar 10. Fraksinasi Minyak Nilam menggunakan Teknik Kromatografi Kolom
C. METODE ANALISIS DATA Analisis atribut aroma yang diperoleh dari uji kuantitatif QDA berupa data rata-rata intensitas. Selanjutnya, dibuat grafik spider web untuk membandingkan intensitas masingmasing atribut secara visual. Selain itu, data diolah secara statistik menggunakan two-way ANOVA dengan program SPSS 16 dengan uji lanjut Duncan jika terlihat ada pengaruh yang nyata pada masing-masing atribut. Penggunaan two-way ANOVA dipilih karena penilaian intensitas tidak hanya dipengaruhi oleh perbedaan sampel, tetapi juga oleh perbedaan panelis. Kemudian menggunakan multivariate analysis, yaitu Principal Component Analysis (PCA) yang dilanjutkan dengan biplot menggunakan software MINITAB 16. Analisis statistik ANOVA yang dilakukan menggunakan hipotesis awal sebagai berikut: H0 = tidak terdapat perbedaan yang nyata pada semua sampel H1 = paling tidak terdapat satu sampel yang berbeda nyata dengan sampel lainnya taraf kepercayaan sebesar 95% (α= 0.05) Data komponen volatil hasil GC-MS berupa persentase area relatif diolah menggunakan multivariate analysis, yaitu Principal Component Analysis (PCA) yang dilanjutkan dengan biplot menggunakan software MINITAB 16. Analisis PCA akan menghasilakan 4 buah grafik, yakni scree plot, score plot, loading plot, dan scatter plot (biplot). Analisiss korelasi sensori deskriptif dengan komponen volatil minyak nilam, menggunakan analisis statistik PLS (Partial Least Square Regression) dengan software XLSTAT 2011.
20
