III. METODE PENELITIAN A. Bagan Alir Penelitian Persiapan alat dan bahan yang akan digunakan
Pembuatan media PDA (Potato Dextrose Agar) Pengambilan sampel tanah dekat perakaran tanaman Cabai merah (C. annum)
Isolasi jamur Fusarium dari sampel tanah yang telah diambil
Identifikasi jamur Fusarium sp.
Uji sifat patogenik Fusarium spp. ke tanaman cabai merah (C. annum)
Penanaman tanaman Cabai merah (C. annum) dengan menggunakan tanah dan pupuk kandang
Pembuatan inokulum jamur Fusarium spp.
Inokulasi Fusarium spp. ke media tanam Cabai merah (C. annum) Pengamatan respon tanaman
bio.unsoed.ac.id
6
B. Lokasi dan Waktu Penelitian Pengambilan sampel dilakukan di wilayah pertanian Cabai merah Desa Kebanggan, Kecamatan Sumbang, Kabupaten Banyumas yang terdiri dari tiga lokasi pengambilan sampel. Pelaksanaan penelitian melalui dua tahap, yakni identifikasi Fusarium dan uji karakter patogenisitas Fusarium yang dilakukan di Laboratorium Mikologi dan Fitopatologi serta Green House Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman. Penelitian dilaksanakan pada bulan Juni-Desember 2014. C. Teknik Pengambilan Sampel Penelitian ini akan menggunakan metode survey. Teknik pengambilan sampel dilakukan secara simple random sampling (sampel acak sederhana). Dimana sampel yang diambil berasal dari tiga lahan terpisah di desa Kebanggan. D. Parameter Penelitian Parameter yang akan diukur dalam penelitian ini meliputi tipe pertumbuhan
koloni,
diameter
koloni,
warna
koloni,
mikrokonidia,
makrokonidia, konidiofor, dan sifat patogenik serta non-patogenik dari Fusarium spp. terhadap tanaman cabai merah (C. annum). E. Cara Kerja 1.
Isolasi dan Identifikasi Jamur Fusarium 1.1 Pembuatan media PDA (Potato Dextrose Agar) (Fardiaz, 1993) - Sebanyak 200 gr kentang dikupas, dicuci bersih kemudian dipotong dadu kecil-kecil. - Potongan kentang direbus dalam 500 ml aquades sampai lunak. - Agar-agar 15 gr dicampur dengan 250 ml akuades, didihkan kemudian dicampur dengan air rebusan kentang ditambah 20 gr dextrose. - Campuran media ditambah dengan akuades hingga mencapai 1000 ml.
bio.unsoed.ac.id
- Media dimasukkan kedalam Erlenmeyer 250 ml dan tutup dengan kapas. - Disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121o C dengan tekanan 2 atm selama 15 menit. - Media steril kemudian dituang kedalam cawan petri steril secara aseptis.
7
1.2 Pengambilan sampel tanah dari rhizosfer tanaman Cabai merah (C. annum) di Desa Kebanggan, Kecamatan Sumbang, Kabupaten Banyumas. Pengambilan sampel dilakukan secara simple random sampling. Sampel tanah diambil dari 3 lokasi. Setiap lokasi, sampel tanah diambil 5 titik secara diagonal. Setiap titik pengambilan sampel tanah dipilih dari tanaman cabai merah yang menunjukkan gejala sakit dan tanaman cabai merah sehat, sehingga didapat 10 sampel tanah yang diambil dalam satu lokasi. 1.3 Isolasi jamur Fusarium dari sampel rizosfer yang telah diambil (Kristiana, 2012) Isolasi jamur Fusarium dilakukan dengan metode pengenceran bertingkat didalam LAF, dengan tahapan sebagai berikut: - Tanah sebanyak 10 gr dari masing-masing titik dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi 90 ml aquades steril. - Suspensi tersebut dihomogenkan selama 15 menit. - Suspensi yang telah homogen diambil sebanyak 1 ml, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml aquades steril dan dibuat pengenceran bertingkat hingga 10-5. - Hasil pengenceran diinokulasi kedalam media PDA dengan wadah cawan petri berdiameter 10 cm dan volume 15 ml yang telah diberi antibiotik kloramfenikol dan menggunakan cara spread plate sebanyak 3-5 tetes. - Biakan selanjutnya diinkubasi selama tiga hari. 1.4 Peremajaan jamur Fusarium setelah diisolasi (Kristiana, 2012) - Biakan hasil isolasi diambil miseliumnya dengan menggunakan jarum ose yang dilakukan dalam LAF. - Isolat dipindahkan ke cawan petri yang berisi media PDA baru.
bio.unsoed.ac.id
- Diinkubasi selama 3 hari, perlakuan yang sama diulang hingga mendapatkan biakan murni.
8
1.5 Identifikasi jamur Fusarium hasil isolasi Identifikasi dilakukan secara mikroskopis dan makroskopis dengan berpedoman dari sumber pustaka menurut Barnett and Hunter (1998) dan Ganjdar et,al., (1999). a) Pengamatan makroskopis - Jamur yang sudah tumbuh pada media PDA didalam cawan petri diamati. Pengamatan meliputi tipe pertumbuhan koloni, diameter koloni dan warna koloni. - Hasil dicatat dan difoto. b) Pengamatan mikroskopis - Isolat jamur Fusarium spp. yang telah murni diambil menggunakan jarum ose dan diletakkan ke object glass dengan ditetesi aquades sebanyak 1 tetes kemudian tutup dengan cover glass. - Isolat yang berada diatas object glass diletakkan dibawah mikroskop. - Konidia (mikrokonidia dan makrokonidia) diamati bentuknya dan diukur panjangnya. - Bentuk konidiofor diamati dan dilihat perbedaannya. - Hasil dicatat dan difoto. 2.
Uji sifat patogenik
2.1 Pembuatan inokulum Fusarium spp (Sutrisni dan Widodo, 2012). 2.1.1 Peremajaan isolat Fusarium spp. -
Isolat Fusarium yang telah diidentifikasi dipindah pada media PDA baru dalam cawan petri.
-
Isolat diinkubasi pada suhu ruang.
2.1.2 Pembuatan medium tanam Fusarium spp. (Sinaga et. al., 2013 dengan modifikasi). -
bio.unsoed.ac.id
Jagung giling sebanyak 700 gr dituang kedalam baskom dan dicampur dengan 290 gr dedak.
-
Campuran jagung giling dan dedak ditambah 10 gr CaCO3 serta diberi akuades hingga mengepal teksturnya apabila diremas dengan tangan.
-
Formula media jagung giling diambil sebanyak 40 gr dan dimasukkan kedalam botol bening berukuran 100 ml kemudian ditutup dengan alumunium foil dan wrapper. 9
-
Media jagung giling pada botol disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 100ᵒ-121ᵒC, selama 15 menit dan dengan tekanan 2 atm.
2.1.3 Pembuatan inokulum Fusarium spp. (Sinaga et. al., 2013 dengan modifikasi). -
Masing-masing isolat Fusarium yang telah diremajakan diambil miseliumnya dengan menggunakan jarum ose di dalam LAF.
-
Miselium ditanam pada media jagung giling, kemudian ditutup menggunakan alumunium foil dan wrapper.
-
Inokulum Fusarium yang diinkubasi pada suhu ruang selama 7-14 hari.
2.2 Penanaman tanaman
Cabai merah (C. annum) (Baharuddin et. al.,
2005) 2.2.1 Sterilisasi tanah -
Tanah dan pupuk kandang yang akan digunakan sebagai media pesemaian dan media tanam masing-masing dimasukkan ke dalam polybag selanjutnya disterilisasi.
-
Sterilisasi dilakukan dengan metode panas lembab menggunakan drum selama 9 – 10 jam pada suhu 90 – 100oC.
-
Setelah disterilisasi, media tersebut dibiarkan selama kurang lebih 24 jam agar suhu menurun.
2.2.2 Penyemaian bibit tanaman Cabai Merah (C. annum) -
Campuran tanah dan pupuk kandang yang telah disterilkan dimasukkan ke dalam baki persemaian sebanyak 3 Kg berukuran 15 cm x 20 cm.
-
Benih cabai merah disemai secara merata.
-
Tanaman dipelihara hingga berumur 30 hari.
2.2.3 Pembuatan medium tanam dan inokulasi inokulum Fusarium spp., (Sutrisni dan Widodo, 2012) -
Polybag plastik berukuran 20 x 20 cm diisi tanah steril sebanyak 2,5 Kg.
-
5 gram inokulum Fusarium dimasukkan ke polybag yang berisi tanah
bio.unsoed.ac.id
steril kemudian diaduk rata. -
Campuran tanah dan inokulum Fusarium pada medium jagung yang ditempatkan dalam polybag kemudian diinkubasi selama 5 hari.
10
2.2.4 Perawatan dan pengamatan respon tanaman Cabai Merah (C. annuum) -
Tanaman cabai merah di siram 2 kali sehari pada pukul 07.00 dan 17.00 WIB.
-
Selama proses perawatan berlangsung, pengamatan respon tanaman juga dilakukan dengan melihat gejala kelayuan pada tanaman yang telah diinokulasi Fusarium sp.
-
Respon tanaman diamati selama 30 hari.
-
Hasil dicatat dan difoto.
F. Metode Analisis Data hasil pengamatan yang diperoleh dianalisis menggunakan metode analisis deskriptif yang bertujuan untuk mengetahui jenis-jenis Fusarium sp. yang ditemukan dan sifat patogenik serta non patogenik jamur Fusarum sp. dari sampel tanah perakaran tanaman cabai merah (C. anuum) di Desa Kebanggan, Kecamatan Sumbang, Kabupaten Banyumas.
bio.unsoed.ac.id
11
