III. BAHAN DAN METODE 3.1.
Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi, Balai Besar Penelitian
dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB. Biogen) Cimanggu, Bogor. Penelitian dilaksanakan dari bulan Maret sampai dengan bulan Desember 2009.
3.2.
Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain sampel tanah
dari Kebun Percobaan IPB Cikabayan (Bogor, Jawa Barat), Citeureup (Bogor, Jawa Barat), Nusa Tenggara Barat (NTB), dan Nusa Tenggara Timur (NTT), medium Pikovskaya (dengan 2 sumber P yang berbeda, yaitu Ca3(PO4)2 atau trikalsium fosfat dan Ca5(PO4)3OH atau hidroksi apatit), larutan fisiologis 0.85%, Modified Universal Buffer (MUB) 1x, 0.5 N NaOH, 0.115 M p-nitro phenyl phosphate (p-NPP), 1 mg/ml p-nitrophenol (p-NP), larutan standar indole acetic acid (IAA), pereaksi Salkowski (400 ml H2SO4 pekat; 20 ml FeCl3 0.1 M; 580 ml akuades), akuades, ungu kristal, safranin, iodium, alkohol 95%, medium LB (Luria Bertani), bufer STE (100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA pH 8), larutan SDS 10%, proteinase-K 10 mg/ml, larutan fenol, larutan kloroform, etanol absolut 95%, aquabidest steril, 10x bufer TAE, agarosa, larutan loading buffer, primer F-63 (5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC) dan primer R-1387 (5’GGGCGGCGTGTACAAGGC) (Marchesi et al., 1998), 10 mM dNTP (deoxynucleotide triphosphates), 10x bufer Polymerase Chain Reaction (PCR), 50 mM MgSO4, enzim Taq DNA polimerase, dan Etidium Bromida (EtBr). Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain berbagai macam peralatan gelas (cawan Petri, batang penyebar, erlenmeyer, tabung reaksi), neraca analitik, pH meter, shaker, autoklaf, ruang laminar, mikropipet, tip mikro, magnetik stirer, inkubator, tabung Eppendorf, vorteks, waterbath, sentrifuse, Hitachi Spectrophotometer tipe 150-20, mikroskop, kaca preparat, microvawe, refrigerator, perangkat elektroforesis (Mupid-2plus), perangkat PCR (SwiftTM Maxi Thermal Cycler Blocks-”ESCO”), dan Scope UV Transilluminator (Dekstop Gel Imager-SCOPE 21).
14
3.3.
Metode Penelitian 3.3.1. Isolasi Bakteri Pelarut Fosfat dari Tanah di sekitar Perakaran (Rizosfer) Sebanyak 10 gram tanah dari setiap sampel tanah dimasukkan ke dalam
tabung erlenmeyer yang berisi 90 ml medium Pikovskaya cair pH 6.8, dishaker (120 rpm) selama 7-10 hari pada suhu ruang, kemudian dibuat serial pengenceran sampai 10-4. Sebanyak 50 µl dari pengenceran 10-3 dan 10-4 dituang di atas permukaan medium Pikovskaya padat secara steril, kemudian disebar merata menggunakan batang penyebar, dan diinkubasi selama 2-3 hari pada suhu ruang. Adanya pertumbuhan bakteri pelarut fosfat ditandai dengan zona berwarna terang jernih atau zona bening di sekeliling koloni.
Koloni yang dikelilingi zona
berwarna terang jernih atau zona bening menunjukkan adanya pelarutan fosfat. Koloni-koloni bakteri pelarut fosfat yang diinginkan selanjutnya dimurnikan dengan metode cawan gores dan disimpan di dalam medium agar-miring Pikovskaya.
3.3.2. Karakterisasi dan Pengujian Kemampuan Bakteri Pelarut Fosfat dalam Melarutkan P Setelah terpilih bakteri pelarut fosfat (BPF) hasil isolasi dari beberapa sampel tanah, kemudian dilakukan karakterisasi secara morfologi dengan melakukan pengamatan terhadap koloni BPF meliputi bentuk, tepian, elevasi, dan warna sesuai prosedur Hadioetomo (1993). Selain itu, dilakukan pula pengujian kemampuan BPF dalam melarutkan P pada medium Pikovskaya padat dengan mengukur diameter zona bening dan indeks pelarutan (IP) fosfat. Pengujian karakterisasi dan kemampuan BPF dalam melarutkan P dilakukan dengan membuat larutan fisiologis 0.85%, kemudian dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf sebanyak 20 µl. Sebanyak 1 ose kultur isolat BPF yang telah ditumbuhkan pada medium Pikovskaya padat, dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf yang telah berisi larutan fisiologis dengan menggunakan tusuk gigi, kemudian dihomogenkan. Setelah itu, diambil sebanyak 10 µl menggunakan mikropipet kemudian diteteskan di atas medium Pikovskaya padat secara steril, dan diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang. Pengamatan dilakukan selama 7 hari inkubasi dengan mengamati bentuk, tepian, elevasi, dan warna serta
15
mengukur diameter zona bening dan indeks pelarutan (IP) fosfat koloni BPF yang menghasilkan zona bening di sekeliling koloni.
3.3.3. Pengujian Bakteri Pelarut Fosfat dalam Menghasilkan Enzim Fosfatase Bakteri pelarut fosfat (BPF) yang telah terpilih dari hasil isolasi beberapa sampel tanah dan pengujian karakterisasi dan kemampuan BPF dalam melarutkan P pada medium Pikovskaya padat dengan Ca3(PO4)2 atau trikalsium fosfat sebagai sumber fosfatnya, kemudian dilakukan pengujian
BPF tersebut
dalam
menghasilkan enzim fosfatase. Pengujian ini dilakukan dengan membuat kurva standar p-nitrophenol (p-NP) dan mengukur kandungan enzim fosfatase BPF. Pembuatan kurva standar p-nitrophenol (p-NP). Sebanyak 0.02 gram p-nitrophenol (p-NP) dilarutkan dengan akuades 20 ml (konsentrasi = 1000 ppm), kemudian dibuat beberapa tingkat pengenceran menjadi konsentrasi 800 ppm, 400 ppm, 200 ppm, 100 ppm, dan 50 ppm di dalam tabung reaksi. Ke dalam tabung reaksi uji dimasukkan 2 ml masing-masing konsentrasi larutan standar pnitrophenol (p-NP) dan diinkubasi selama 60 menit pada suhu ruang. Larutan standar p-nitrophenol berwarna kuning. Larutan standar p-nitrophenol diukur absorbansinya pada panjang gelombang (λ) = 410 nm menggunakan Hitachi Spectrophotometer tipe 150-20 dan dibuat kurva standar yang menunjukkan hubungan antara konsentrasi larutan standar p-nitrophenol (x) dan absorbansi (y). Pengukuran kandungan enzim fosfatase.
Pengukuran kandungan
enzim fosfatase dilakukan sesuai prosedur Tabatabai dan Bremner (1969). Sebanyak 10 ml kultur sel BPF yang ditumbuhkan selama 3 hari pada suhu ruang di dalam medium Pikovskaya cair (dengan 2 sumber P yang berbeda, yaitu Ca3(PO4)2 atau trikalsium fosfat dan Ca5(PO4)3OH atau hidroksi apatit) disentrifugasi (10000 rpm, 15 menit) untuk memisahkan koloni bakteri dari medium. Supernatan hasil sentrifugasi tersebut dipindahkan ke dalam tabung reaksi bersih dan steril sebanyak 1 ml, kemudian ditambahkan 4 ml Modified Universal Buffer (MUB) 1x, dan 1 ml 0.115 M p-nitro phenyl phosphate (p-NPP), kemudian diinkubasi selama 60 menit di dalam waterbath pada suhu 37ºC. Setelah diinkubasi selama 60 menit, ditambahkan 5 ml 0.5 N NaOH untuk menghentikan reaksi.
Larutan akan berubah menjadi warna kuning, hal ini
16
menandakan bahwa bakteri menghasilkan enzim fosfatase. Semakin pekat warna kuning yang terbentuk, maka semakin tinggi enzim fosfatase yang dihasilkan. Pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang (λ) = 410 nm menggunakan Hitachi Spectrophotometer tipe 150-20.
3.3.4. Pengujian Bakteri Pelarut Fosfat dalam Menghasilkan Zat Pemacu Tumbuh Indole Acetic Acid (IAA) Selain dilakukan pengujian bakteri pelarut fosfat (BPF) dalam menghasilkan
enzim
fosfatase,
dilakukan
pula
pengujian
BPF
dalam
menghasilkan zat pemacu tumbuh IAA dengan 2 sumber P yang berbeda, yaitu Ca3(PO4)2 atau trikalsium fosfat dan Ca5(PO4)3OH atau hidroksi apatit. Pengujian ini dilakukan dengan membuat kurva standar IAA dan mengukur kandungan IAA BPF. Pembuatan kurva standar IAA. Sebanyak 10 ml larutan standar IAA 100 ppm dibuat beberapa tingkat pengenceran menjadi konsentrasi 80 ppm, 40 ppm, 20 ppm, 10 ppm, dan 5 ppm di dalam tabung reaksi. Ke dalam tabung reaksi dimasukkan 2 ml masing-masing konsentrasi larutan standar IAA kemudian ditambahkan 2 ml pereaksi Salkowski (perbandingan 1 : 1) dan diinkubasi selama 60 menit pada suhu ruang.
Setelah penambahan pereaksi
Salkowski dan inkubasi selama 60 menit, larutan akan berubah menjadi warna merah muda. Larutan standar IAA diukur absorbansinya pada panjang gelombang (λ) = 530 nm menggunakan Hitachi Spectrophotometer tipe 150-20 dan dibuat kurva standar yang menunjukkan hubungan antara konsentrasi larutan standar IAA (x) dan absorbansi (y). Pengukuran kandungan IAA. Pengukuran kandungan IAA dilakukan sesuai prosedur Gordon dan Weber (1993). Sebanyak 10 ml kultur sel BPF yang ditumbuhkan selama 3 hari pada suhu ruang di dalam medium Pikovskaya cair (dengan 2 sumber P yang berbeda, yaitu Ca3(PO4)2 atau trikalsium fosfat dan Ca5(PO4)3OH atau hidroksi apatit) disentrifugasi (10000 rpm, 15 menit) untuk memisahkan koloni bakteri dari medium. Supernatan hasil sentrifugasi tersebut dipindahkan ke dalam tabung reaksi bersih dan steril sebanyak 2 ml, kemudian ditambahkan pereaksi Salkowski sebanyak 2 ml (perbandingan 1 : 1). Campuran supernatan dan pereaksi Salkowski diinkubasi selama 60 menit pada suhu ruang.
17
Larutan akan berubah menjadi warna merah muda, hal ini merupakan indikasi adanya kandungan IAA. Larutan diukur absorbansinya pada panjang gelombang (λ) = 530 nm menggunakan Hitachi Spectrophotometer tipe 150-20.
3.3.5. Pengujian Pewarnaan Gram Bakteri Pelarut Fosfat Setelah dilakukan pengujian bakteri pelarut fosfat (BPF) dalam menghasilkan zat pemacu tumbuh IAA, kemudian dilakukan pengujian pewarnaan Gram (Hadioetomo, 1993). Sebanyak 1 ose kultur isolat BPF, dioleskan di kaca preparat yang telah diberi setetes air dan difiksasi dengan panas (dilewatkan di atas api). Kemudian diteteskan ungu kristal selama 1 menit, kelebihan zat warna dibuang dan dibilas dengan akuades. Selanjutnya diteteskan iodium selama 2 menit, kelebihan zat warna dibuang dan dibilas dengan akuades.
Tahap
berikutnya pemucatan dengan meneteskan alkohol 95% selama 30 detik dan dibilas dengan akuades. Kemudian diteteskan safranin selama 30 detik, kelebihan zat warna dibuang dan dibilas dengan akuades. Sisa-sisa air diserap dengan kertas serap kemudian preparat diamati tanpa kaca penutup di bawah mikroskop. Bakteri Gram positif akan tampak berwarna ungu, sedangkan bakteri Gram negatif akan tampak berwarna merah muda.
3.3.6. Pengukuran Pertumbuhan Populasi, pH, dan Kandungan Enzim Fosfatase Bakteri Pelarut Fosfat Setelah dilakukan karakterisasi dan pengujian kemampuan bakteri pelarut fosfat (BPF) dalam melarutkan P secara kualitatif, pengujian BPF dalam menghasilkan enzim fosfatase dan zat pemacu tumbuh IAA, serta karakteristik pewarnaan Gram, kemudian dipilih tiga isolat BPF berdasarkan kandungan enzim fosfatase dan zat pengatur tumbuh IAA tertinggi pada masing-masing daerah asal sampel tanah (Bogor, NTB, dan NTT). Isolat terpilih tersebut selanjutnya akan dilakukan pengujian lebih lanjut, yaitu pengukuran pertumbuhan populasi, perubahan pH pada medium Pikovskaya cair, dan pengukuran kandungan enzim fosfatase.
Pengukuran kandungan enzim fosfatase tersebut dilakukan dengan
metode yang sama dengan metode pengukuran kandungan enzim fosfatase sebelumnya, yaitu sesuai dengan prosedur Tabatabai dan Bremner (1969), tetapi
18
pada pengukuran kali ini dilakukan selama 7 hari inkubasi (sebelumnya 3 hari inkubasi). Pengukuran perubahan pH pada medium Pikovskaya cair tiap isolat BPF dilakukan menggunakan pH meter.
Pengukuran pertumbuhan populasi BPF
dilakukan dengan membuat serial pengenceran 10-5, 10-6, dan 10-7. Sebanyak 25 µl dari setiap pengenceran tersebut dituang di atas permukaan medium Pikovskaya padat secara steril dan disebar merata menggunakan batang penyebar, kemudian diinkubasi pada suhu ruang sampai terbentuk zona bening di sekeliling koloni. Ketiga pengukuran tersebut dilakukan selama 7 hari inkubasi, dimulai dari hari ke-0 sampai hari ke-6.
3.3.7. Identifikasi Molekuler Selain dilakukan pengukuran pertumbuhan populasi, perubahan pH pada medium Pikovskaya cair, dan pengukuran kandungan enzim fosfatase, dilakukan pula identifikasi molekuler terhadap tiga isolat BPF terpilih dari masing-masing daerah asal sampel tanah (Bogor, NTB, dan NTT). Identifikasi molekuler ini dilakukan dalam beberapa tahapan sebagai berikut, yaitu isolasi DNA genom bakteri, elektroforesis DNA, Polymerase Chain Reaction (PCR), dan sekuensing DNA. Isolasi DNA Genom Bakteri. Isolasi total DNA genom yang digunakan merupakan modifikasi dari metode Lazo et al. (1987). Sebanyak 10 ml kultur sel BPF yang ditumbuhkan selama 3 hari pada suhu ruang di dalam medium LB (Luria Bertani) disentrifugasi (8000 rpm, 10 menit) untuk memisahkan koloni bakteri dari medium.
Supernatan hasil sentrifugasi dibuang dan pelet dicuci
dengan 1 ml bufer STE (100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA pH 8), kemudian pelet diresuspensi menggunakan mikropipet.
Hasil resuspensi
disentrifugasi (8000 rpm, 10 menit) kembali kemudian supernatan dibuang dan pelet diresuspensi dengan 200 µl bufer STE dan ditambahkan 40 µl larutan SDS 10%.
Selanjutnya suspensi diinkubasi dalam waterbath (65ºC, 90 menit).
Kemudian suspensi didinginkan pada suhu ruang dan ditambahkan 4 µl proteinase-K 10 mg/ml.
19
Suspensi DNA disimpan dalam inkubator 37ºC selama ± 4 jam. Hasil inkubasi ditambahkan larutan fenol dan kloroform masing-masing 120 µl sampai terbentuk emulsi, kemudian tabung Eppendorf yang berisi campuran DNA dibolak-balik secara halus. Suspensi yang telah teremulsi disentrifugasi (8000 rpm, 10 menit) dan supernatan yang mengandung DNA dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf steril dan dipresipitasi dengan etanol absolut 95% yang dingin (-20ºC) sebanyak 2 kali volume supernatan yang diperoleh, kemudian diinkubasi pada suhu -20ºC selama 30 menit. DNA dililit keluar menggunakan ujung tip mikro ukuran 200 µl yang steril kemudian dikeringudarakan. Hasil isolasi DNA tersebut dilarutkan ke dalam tabung Eppendorf steril yang berisi 40 µl aquabidest steril. DNA yang telah dicairkan tersebut siap digunakan untuk elektroforesis atau disimpan sebagai stock pada suhu -20ºC. Proses Elektroforesis DNA. Larutan 10x bufer TAE diencerkan menjadi 0.5x bufer TAE. Kemudian dibuat gel agarosa 0.8%, yaitu 0.8 gram agarosa dalam 100 ml 0.5x bufer TAE yang selanjutnya dituang ke dalam cetakan gel agarosa. Setelah gel membeku diletakkan ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi 0.5x bufer TAE sehingga gel terendam. Sebanyak 2 µl dari masing-masing DNA dicampur dengan 3 µl loading buffer sebagai pemberat.
Suspensi larutan DNA dengan loading buffer
diinjeksikan ke dalam sumur-sumur pada gel elektroforesis. Setelah semua sumur terisi, power supply perangkat elektroforesis dinyalakan dengan voltase sebesar 110 V selama ± 45 menit. Gel hasil elektroforesis diangkat dan selanjutnya direndam dalam larutan Etidium Bromida (EtBr) selama 10 menit untuk pewarnaan (staining) dan destaining dalam akuades selama 5 menit. Selanjutnya DNA dapat dilihat dan difoto menggunakan perangkat UV Transilluminator yang dilengkapi dengan kamera digital. Proses Polymerase Chain Reaction (PCR). Proses PCR diawali dengan pembuatan campuran komponen reaksi untuk PCR sebanyak 75 µl dengan komposisi sebagai berikut : 7.50 µl 10x bufer PCR, 2.25 µl 10 mM dNTP, 1.50 µl 50 mM MgSO4, 0.75 µl 10 µM primer F, 0.75 µl 10 µM primer R, 1.00 µl template DNA, 1.00 µl Taq DNA polymerase, dan 60.25 µl aquabidest steril.
20
Running PCR dilakukan sebanyak 30 siklus dengan kondisi sebagai berikut, denaturasi siklus awal atau pra-denaturasi 94ºC selama 5 menit, diikuti denaturasi untuk siklus selanjutnya pada suhu 94ºC selama 30 detik. Penempelan primer (annealing) dilakukan selama 30 detik pada suhu 50ºC.
Polimerisasi
dilakukan selama 2 menit pada suhu 72ºC dan pada siklus terakhir, yaitu siklus ke-30 dilakukan perpanjangan waktu polimerisasi selama 7 menit.
Terakhir
dilakukan penurunan suhu ke 4ºC untuk menghentikan reaksi PCR. Produk hasil PCR divisualisasi dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa 1.0% dalam 0.5x bufer TAE dengan voltase 110 volt selama ± 45 menit. Sekuensing DNA.
Produk hasil PCR disekuen menggunakan piranti
Automated DNA Sequencer ABI PRISM 377 (Perkin Elmer Biosystem, USA). Cycle sequencing DNA template dilakukan menggunakan kit BigDye® Ready Reaction Mix (Perkin Elmer Biosystem, USA). Proses sekuensing dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler, Fakultas Teknobiologi, Universitas Atmajaya, Jakarta. Sekuen DNA yang diperoleh dibandingkan dengan sekuen pada database European Bioinformatics Institute (EBI) menggunakan piranti WU-BLASTN 2.0 pada situs http://www.ebi.ac.uk.
