15
III. BAHAN DAN METODE 3.1. Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan dari bulan April hingga bulan September 2010 di Laboratorium Bioteknologi Tanah serta Laboratorium Kimia dan Kesuburan Tanah, Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan, Fakultas Pertanian IPB.
3.2. Alat dan Bahan Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain laminar flow, autoclave, spectrophotometer Spectronic 20-D Bausch and Lomb, oven, timbangan, pipet, tabung reaksi, erlenmeyer, gelas piala, dan alat-alat gelas lainnya. Bahan utama penelitian ini berupa sampel tanah yang berada di sekitar kandang ternak (sapi, kerbau, kambing, dan ayam). Penggunaan sampel tanah tersebut dilakukan di sekitar kandang ternak dengan alasan bahwa tanah di sekitar kandang ternak tersebut mengandung nitrat yang merupakan komponen yang terkandung dalam kotoran ternak. Kandungan nitrat yang tinggi pada sampel tanah tersebut diduga merupakan habitat yang sangat baik bagi populasi bakteri penitrifikasi. Media yang digunakan untuk isolasi adalah media spesifik untuk Nitrosomonas sp. (Tabel 1) dan media spesifik untuk Nitrobacter sp. (Tabel 2). Tahap seleksi dilakukan dengan dilakukan pengukuran konsentrasi amonium dengan bahan yang digunakan
berupa larutan Buffer sitrat, Na-Fenolat, dan
NaOCl 5%. Bahan yang digunakan untuk mengukur konsentrasi nitrat berupa H2SO4 pekat dan Brusin. Tabel 1. Media Spesifik untuk Isolasi Nitrosomonas sp. (Verstraete, 1981 dalam Iswandi, 1989) Komposisi Jumlah (per liter media) (NH4)2SO4 0.5 g KH2PO4 0.2 g CaCl2.2H2O 0.04 g MgSO4.7H2O 0.04 g Fe-sitrat 0.5 mg Fenol-red (pH 6.2-8.4) 0.5 mg
16
Tabel 2. Media Spesifik untuk Isolasi Nitrobacter sp. (Verstraete, 1981 dalam Iswandi, 1989) Komposisi Jumlah (per liter media) KNO2 0.006 g K2HPO4 1.0 g NaCl 0.3 g MgSO4.7H2O 0.1 g FeSO4.7H2O 0.03 g CaCO3 1.0 g CaCl2 0.3 g 3.3. Metode dan Pelaksanaan Penelitian 3.3.1. Isolasi Bakteri Penitrifikasi Proses isolasi bakteri penitrifikasi dilakukan dengan menggunakan metode Enrichment Culture. Pertama-tama, dilakukan pengambilan sampel tanah pada 14 titik di sekitar kandang sapi, kerbau, kambing, ataupun ayam di beberapa lokasi di sekitar Kabupaten Bogor (Tabel 3). Pengambilan sampel tanah dilakukan secara komposit dengan ukuran ± 100 x 100 cm dan kedalaman 0-20 cm. Sebanyak 14 sampel tanah ini dikeringudarakan untuk selanjutnya dilakukan isolasi, sehingga diperoleh masing-masing 14 isolat bakteri penitrifikasi, yaitu bakteri pengoksidasi amonium (“Nitrosomonas”) dengan kode isolat diawali huruf NS dan bakteri penghasil nitrat (“Nitrobacter”) dengan kode isolat diawali huruf NB dari tiap sampel tanah yang diperoleh tersebut (Tabel 3). Dengan demikian, akan diperoleh masing-masing 14 isolat “Nitrosomonas” dan “Nitrobacter”. Tabel 3. Ternak, Kode Isolat, dan Lokasi Pengambilan Tanah Sebagai Sumber Isolat Ternak Sapi Kambing Kambing Kerbau Kambing Ayam Kerbau Sapi Sapi Sapi Sapi Kerbau Sapi Kambing
Kode Isolat “Nitrosomonas” NSsp1 NSkm1 NSkm2 NSkb1 NSkm3 NSam NSkb2 NSsp2 NSsp3 NSsp4 NSsp5 NSkb2 NSsp6 NSkm4
Kode Isolat “Nitrobacter” NBsp1 NBkm1 NBkm2 NBkb1 NBkm3 NBam NBkb2 NBsp2 NBsp3 NBsp4 NBsp5 NBkb2 NBsp6 NBkm4
Lokasi Pengambilan Tanah Sebagai Sumber Isolat Ds. Pabuaran, Cilendek Ds. Pabuaran, Cilendek Ds. Bantar Sari, Bantar Kambing Ds. Bantar Sari, Bantar Kambing Ds. Carang Pulang, Cikarawang Ds. Pabuaran, Cilendek Ds. Carang Pulang, Cikarawang Peternakan Fapet IPB Ds.Ciherang, Darmaga Ds. Ciherang, Darmaga Ds. Babakan Resmi, Bantar Kambing Ds. Bantar Sari, Bantar Kambing Ds. Babakan Resmi, Bantar Kambing Ds. Babakan Resmi, Bantar Kambing
17
Isolasi dengan metode enrichment culture ini dilakukan dengan cara sebanyak 1 g sampel tanah yang telah diperoleh diinokulasikan ke dalam masingmasing 50 ml media spesifik untuk Nitrosomonas sp. (Tabel 1) dan media spesifik untuk Nitrobacter sp. (Tabel 2). Media spesifik tersebut berupa media cair. Kultur cair berisi isolat tersebut dikocok dengan menggunakan shaker dan diinkubasi selama 7-10 hari. Adanya bakteri pengoksidasi amonium diindikasikan dengan terjadinya perubahan warna media dari merah menjadi kuning yang disebabkan perubahan pH media akibat oksidasi amonium menjadi nitrit, sedangkan adanya bakteri penghasil nitrat diindikasikan dengan perubahan warna media dari bening menjadi keruh. Setelah diperoleh masing-masing 14 isolat bakteri penitrifikasi secara spesifik, kemudian masing-masing isolat tersebut dipindahkan ke dalam 50 ml kultur yang baru dengan cara sebanyak 1 ml kultur berisi isolat dimasukkan ke dalam media baru tersebut. Kemudian diinkubasi kembali selama 5-7 hari sambil dikocok dengan menggunakan shaker. Proses pemindahan kultur ke dalam media yang baru ini dilakukan sebanyak 4 kali. Setelah dilakukan pemindahan sebanyak 4 kali ke dalam media yang baru, sebanyak masing-masing 14 isolat bakteri penitrifikasi tersebut disimpan dalam bentuk kultur cair dengan pengocokan secara terus-menerus untuk selanjutnya dilakukan penetapan konsentrasi amonium dan nitrat. Selain dalam bentuk cair, isolat yang diperoleh juga disimpan dalam media spesifik berupa agar miring untuk masing-masing bakteri penitrifikasi. Penyimpanan dengan agar miring ini untuk dijadikan sebagai kultur stok atau kultur persediaan. 3.3.2. Seleksi Bakteri Penitrifikasi Berdasarkan Kemampuan Mengoksidasi Amonium dan Menghasilkan Nitrat Seleksi kemampuan 14 isolat bakteri penitrifikasi yang telah diperoleh dalam mengoksidasi amonium (NH4+) dan menghasilkan nitrat (NO3-) ini dilakukan terhadap beberapa konsentrasi (NH4)2SO4 yang berbeda di dalam media baru, yaitu 250 ppm, 500 ppm, dan 1000 ppm (NH4)2SO4. Tujuan dilakukannya seleksi dengan variasi konsentrasi (NH4)2SO4 yang berbeda ini agar diketahui konsentrasi yang tepat sehingga dapat meminimalisir penggunaan (NH4)2SO4
18
tersebut. Proses seleksi ini dilakukan hanya dengan mengukur konsentrasi amonium dan nitrat, sedangkan konsentrasi nitrit tidak diukur. Hal ini dikarenakan proses oksidasi nitrit berjalan dengan cepat, sehingga yang diukur adalah nitrat. Seleksi dilakukan dengan sebanyak masing-masing 3 ml kultur bakteri penitrifikasi dipindahkan ke dalam 30 ml media baru dengan konsentrasi (NH4)2SO4 yang berbeda-beda tersebut, lalu dikocok. Pengukuran kadar amonium dan nitrat ini dilakukan pada interval waktu tertentu, yaitu pada hari ke-0, ke-4, ke-8, ke-12, dan ke-16. Setiap pengukuran juga dilakukan terhadap blanko. Blanko ini merupakan kultur tanpa isolat, yaitu berisi media spesifik untuk Nitrosomonas dan Nitrobacter dengan variasi (NH4)2SO4 tersebut. Blanko ini dijadikan sebagai faktor koreksi untuk tiap pengukuran dan dapat dijadikan indikator ada tidaknya kontaminasi. Pengukuran kadar amonium dilakukan dengan metode Penetapan Amonium Biru Indofenol. Metode ini dilakukan dengan cara sebanyak 1 ml kultur ditambahkan dengan larutan Buffer Sitrat dan Na-Fenolat masing-masing sebanyak 2 ml, dikocok dan didiamkan selama 10 menit. Setelah itu, ditambahkan dengan larutan NaOCl 5% hingga warna media berubah menjadi biru, lalu dikocok dan didiamkan selama 30 menit. Setelah 30 menit, kadar amonium diukur dengan menggunakan Spectrophotometer pada panjang gelombang 636 nm (Sulaeman et al., 2005). Berbeda dengan amonium, penetapan kadar nitrat (NO3+) dilakukan dengan Metode Brusin. Metode ini dilakukan dengan cara sebanyak 2,5 ml kultur baru ditambahkan dengan 0,25 ml Brusin dan 2,5 ml H2SO4 pekat sehingga warna media berubah menjadi kuning, dikocok dan didiamkan selama 60 menit. Setelah 60 menit, kadar nitrat diukur dengan menggunakan Spectrophotometer pada panjang gelombang 432 nm (Sulaeman et al., 2005). Pengukuran nitrat ini juga dilakukan pada selang waktu seperti halnya pengukuran amonium. Kultur yang mengalami penurunan kadar amonium tercepat dan menghasilkan kadar nitrat tertinggi merupakan kultur yang paling baik. Selanjutnya, dari hasil pengukuran tersebut akan diseleksi isolat bakteri penitrifikasi (“Nitrosomonas”) yang mampu mengoksidasi amonium dengan cepat dan isolat bakteri penitrifikasi (“Nitrobacter”) yang mampu menghasilkan nitrat
19
paling tinggi. Berdasarkan hasil seleksi, dipilih 5 isolat terbaik untuk masingmasing bakteri penitrifikasi, baik yang terdapat pada kultur dengan konsentrasi 250 ppm (NH4)2SO4, 500 ppm (NH4)2SO4, maupun 1000 ppm (NH4)2SO4. Selain melakukan seleksi terhadap masing-masing isolat bakteri penitrifikasi dari tiap konsentrasi (NH4)2SO4, dilihat pula konsentrasi (NH4)2SO4 yang mampu dioksidasi secara optimal. Isolat bakteri penitrifikasi terbaik yang berasal dari konsentrasi (NH4)2SO4 yang mampu dioksidasi secara optimal itu selanjutnya akan digabungkan dan dikombinasikan satu dengan lainnya ke dalam satu media baru untuk diukur kemampuannya dalam melakukan nitrifikasi. Penggabungan dan pengkombinasian ini dilakukan dengan cara sebanyak masingmasing 2.5 ml isolat “Nitrosomonas” dan “Nitrobacter” yang memiliki kemampuan paling baik dimasukan ke dalam 50 ml media spesifik baru. Hasil dari kombinasi antara 5 isolat dari masing-masing bakteri penitrifikasi tersebut diperoleh 25 pasangan isolat bakteri penitrifikasi. Kemudian, dari tiap pasangan isolat tersebut, dipilih pasangan bakteri penitrifikasi yang mampu menurunkan konsentrasi amonium dengan cepat sekaligus meningkatkan konsentrasi nitrat. Pasangan isolat yang demikian merupakan pasangan isolat bakteri penitrifikasi yang dapat melakukan proses nitrifikasi secara efektif.
