III. BAHAN DAN METODE
3.7 Kerangka Pemikiran Ekstrak kasar tanaman jarak pagar memiliki sifat antimikroba dan antioksidan. Kendala pemanfaatan ekstrak kasar seperti kandungan padatan yang tinggi, aktivitas yang rendah serta sifat toksik perlu diwaspadai. Oleh karena itu perlu dilakukan proses fraksinasi/pemisahan dengan tujuan mendapatkan fraksi ekstrak yang lebih murni dengan aktivitas yang lebih tinggi. Salah satu metode pemisahan yang dapat digunakan adalah partisi pelarut. Uji coba pemanfaatan fraksi aktif ekstrak terpilih sebagai zat antimikroba atau zat antioksidan dalam formula produk kosmetik (hand and body cream) dilakukan untuk mengevaluasi karakteristik produk kosmetik yang dihasilkan dan mengevaluasi efektivitas fraksi aktif sebagai zat antimikroba dan zat antioksidan dalam produk krim. Evaluasi dilakukan dengan melihat karakterisitik produk krim yang disimpan pada suhu 37oC selama waktu tertentu. Tujuan penambahan zat antioksidan dalam produk hand and body cream ada dua yaitu sebagai pengawet yang melindungi produk dari oksidasi, dan sebagai bahan aktif yang memberikan fungsi khusus (seperti perlindungan kulit, pelembab, anti-aging). Adapun penambahan zat antimikroba lebih ditujukan untuk pengawetan produk dengan melawan pertumbuhan mikroba pada produk karena adanya peraturan BPOM (HK.03.1.23.12.10.12459) bahwa produk kosmetika tidak dipergunakan untuk pengobatan atau mencegah penyakit. Evaluasi keamanaan dari penggunaan ekstrak jarak pagar dalam produk kosmetik dilakukan dengan melakukan uji toksisitas dan sifat alergenitas. Beberapa uji untuk mengevaluasi tingkat keamanan suatu bahan antara lain uji toksisitas akut oral, uji toksisitas akut kulit, uji iritasi kulit primer, uji iritasi kulit kumulatif, uji fototoksik, uji iritasi mata, uji sensitisasi, dan uji fotosensitisasi. 3.8 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian pemanfaatan fraksi aktif ekstrak tanaman jarak pagar (Jatropha curcas Linn.) sebagai zat antimikroba dan zat antioksidan dalam sediaan kosmetik dilaksanakan dari bulan Januari 2010-Mei 2011, bertempat di Laboratorium Pusat Penelitian Surfaktan dan Bioenergi (SBRC LPPM-IPB) dan Laboratorium Teknik
30
Kimia Teknologi Industri Pertanian, IPB. Beberapa laboratorium penunjang antara lain Laboratorium Biokimia Pangan, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan IPB, Laboratorium Instrumentasi SBRC LPPM IPB dan Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Ternak, Fakultas Peternakan IPB.
3.9 Bahan dan Alat Bahan utama dalam penelitian adalah sampel tanaman jarak pagar yang diperoleh dari Kebun Jarak Pagar PT. Indocement Tunggal Prakarsa, Citeureup Bogor yang berupa batang dan daun serta bungkil jarak pagar. Bahan lain untuk proses ekstraksi dan fraksinasi meliputi: metanol, kertas saring, n-heksan dan etil asetat. Bahan untuk uji aktivitas dan analisa meliputi: DPPH, metanol p.a., bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus, media agar NA dan NB, pelarut Folin Ciocalteu, natrium karbonat, asam tanat, aseton, asetonitril dan standar phorbol ester. Bahan untuk uji toksisitas kulit dan sifat alergenitas menggunakan PBS, antibodi sekunder (IgG kelinci anti IgE manusia, Anti IgG kelinci terkonjugasi HRP), substrat DAB (Diaminobenzidine), Sodium Dodecyl Sulfate, dan kelinci jantan sebagai hewan coba. Bahan untuk formulasi produk kosmetik (krim) meliputi: asam stearat, setil alkohol, olive oil, Nipagin (MP), Nipasol (PP), Dimetikon, Allantoin, BHT, propilen glikol, sorbitol dan aquades. Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah pisau dan wadah untuk pengambilan sampel, perangkat alat ekstraksi, penguap putar (rotary evaporator), freeze dryer, HPLC (Shimadzu, ELSD detector), spektrofotometer (Genesys, Vis), inkubator, GC-MS (Agilent 19091S-433), lempeng ELISA (Costar® 3590), ELISA reader (BIORAD Microplate Reader Benchmark), serta kandang kelinci percobaan. 3.10
Metode Penelitian Kegiatan penelitian ini terdiri dari 6 kegiatan yaitu 1) persiapan dan
karakterisasi bahan baku, 2) proses ekstraksi dan fraksinasi, 3) analisis ekstrak dan fraksi ekstrak, 4) uji coba formulasi fraksi ekstrak dalam produk krim, 5) uji toksisitas kulit dan 6) uji sifat alergenitas ekstrak jarak pagar. Diagram alir penelitian disajikan pada Gambar 5.
31
Batang
Daun dan ranting
Bungkil
Pemisahan kulit batang
Perajangan Pengeringan
Penggilingan
Metanol
Ekstraksi (maserasi, 3x 24 jam)
Ekstrak kasar Heksan Etil asetat Metanol dan air
Fraksinasi (partisi pelarut)
Fraksi ekstrak Uji aktivitas antioksidan, aktivitas antimikroba, total fenol, phorbol ester Fraksi ekstrak terpilih
Uji coba formulasi dalam produk krim
Uji alergenitas
Uji toksisitas kulit
Identifikasi senyawa kimia dengan GC-MS
Produk krim
Gambar 5 Diagram alir kegiatan penelitian
3.10.1 Persiapan dan Karakterisasi Bahan Baku Sampel daun dan batang tanaman jarak pagar diambil pada saat dilakukan pemangkasan tanaman jarak. Selanjutnya sampel basah dipisahkan bagian daun dan batangnya. Bagian daun dihilangkan kotoran dan bagian yang mengandung penyakit (kutu dan jamur tanaman) dan dirajang. Adapun bagian batang jarak dikuliti untuk mendapatkan kulit batang yang selanjutnya dipotong-potong. Potongan daun dan kulit batang segar selanjutnya dikeringanginkan selama ± 1 minggu hingga kering dan digiling menggunakan blender hingga diperoleh sampel serbuk kering. Adapun bungkil jarak sisa
32
pengepresan biji jarak langsung digiling karena sudah dalam keadaan kering. Sampel serbuk kering dikemas dalam kantong plastik dan disimpan dalam freezer sebelum proses ekstraksi. Karakterisasi yang dilakukan terhadap sampel serbuk kering sebelum digunakan dalam penelitian meliputi analisa kadar air, kadar abu dan kadar lemak. Prosedur analisa proksimat sampel jarak pagar disajikan pada Lampiran 1.
3.10.2 Proses Ekstraksi dan Fraksinasi Proses ekstraksi dilakukan menggunakan cara maserasi dengan pelarut metanol. Prosedur ekstraksi yang dilakukan adalah sebagai berikut : sebanyak 200 g serbuk sampel kering diekstraksi menggunakan metanol (3 x 800 ml) dengan cara direndam selama 24 jam pada suhu kamar (cara maserasi). Ekstrak yang diperoleh dipisahkan dari pelarut dengan penguap putar (rotary evaporator) hingga diperoleh ekstrak kental. Ekstrak yang dihasilkan dikeringkan dengan pengering beku (freeze dryer) hingga diperoleh ekstrak kasar kering. Proses fraksinasi kasar yang dilakukan mengacu pada metode Can-Ake et al. (2004) yaitu proses partisi menggunakan pelarut metanol-air (2:3), heksan dan etil asetat. Sebanyak 5 g ekstrak kasar dilarutkan dalam 50 ml pelarut campuran metanol air. Larutan selanjutnya dipartisi dengan menambahkan 150 ml pelarut n-heksan, diaduk/dikocok dalam labu pemisah, didiamkan selama 30-60 menit dan dipisahkan lapisan yang terbentuk (lapisan metanol air bagian bawah, lapisan heksan lapisan atas). Proses penambahan heksan pada lapisan metanol air diulang tiga kali, dan lapisan heksan yang diperoleh digabungkan menadi satu sebagai fraksi heksan. Lapisan metanol air sisa dari proses partisi heksan dipartisi lanjut dengan etil asetat. Sebanyak 150 ml pelarut etil asetat ditambahkan dalam lapisan metanol air, dikocok dalam labu pemisah, didiamkan selama 30-60 menit dan dipisahkan lapisan yang terbentuk (lapisan metanol air bagian bawah, lapisan etil asetat lapisan atas). Proses penambahan etil asetat pada lapisan metanol air diulang tiga kali, dan lapisan etil asetat yang diperoleh digabungkan menjadi satu sebagai fraksi etil asetat. Lapisan metanol air sisa
33
setelah proses partisi pelarut etil asetat dipisahkan sebagai fraksi metanol air. Masing-masing fraksi yang diperoleh dipisahkan pelarutnya menggunakan rotary evaporator pada suhu 50oC hingga diperoleh ekstrak kental dan dikeringkan dengan pengeringan beku selama 24 jam hingga diperoleh fraksi ekstrak. Perhitungan rendemen proses ekstraksi dan persentase fraksi pelarut adalah sebagai berikut:
3.10.3 Analisis Ekstrak dan Fraksi Ekstrak Ekstrak kasar dan fraksi ekstrak yang dihasilkan selanjutnya dianalisa aktivitas antioksidan dengan metode peredaman DPPH, aktivitas antimikroba dengan metode difusi sumur, total fenol dengan metode Folin Ciocalteu serta dilakukan kandungan senyawa toksik ester forbol menggunakan HPLC. Fraksi yang memiliki aktivitas antimikroba dan aktivitas antioksidan tinggi dipilih sebagai fraksi aktif terpilih dan diidentifikasi komposisi senyawa kimianya dengan GC-MS serta digunakan dalam formulasi produk yaitu produk krim. Prosedur uji ekstrak dan fraksi ekstrak jarak pagar disajikan pada Lampiran 2.
3.10.4 Pemanfaatan Fraksi Aktif dalam Formulasi Produk Kosmetik Fraksi aktif terpilih diformulasikan dalam sediaan kosmetik yaitu produk krim. Formula dan proses pembuatan produk krim mengacu pada formula PT. ANI dengan dua kelompok utama bahan yaitu fase air dan fase lemak. Pembuatan krim dilakukan dengan mencampurkan/menghomogenkan masing-masing bahan fase air dan fase lemak secara terpisah pada suhu 60oC dan 50oC, kemudian dilakukan pencampuran dan homogenisasi fase air dan fase minyak hingga diperoleh sediaan krim. Diagram alir pembuatan produk disajikan pada Gambar 6. Fraksi aktif jarak pagar terpilih ditambahkan dalam formula krim sebagai pensubstitusi zat antioksidan dan zat antimikroba komersial (MP, PP dan BHT). Untuk melihat efektivitas aktivitas antimikroba dan antioksidan
34
dalam produk kosmetik dilakukan analisa penampakan, nilai pH, cemaran mikroba dan aktivitas antioksidan produk krim awal dan setelah dilakukan penyimpanan pada suhu 37oC. Prosedur analisa karakteristik produk krim disajikan pada Lampiran 3. Sorbitol dan air Asam stearat, minyak zaitun, dimetikon, em delta, alantoin, TiO2
Pemanasan 60oC dan pengadukan
Pengadukan
Propilen glikol
Pemanasan 50oC dan pengadukan
Adonan A
Pengadukan dan pencampuran
Pengadukan dan pemanasan 55-60oC , 15 menit
Adonan B
Pengadukan suhu 40oC
Cetil alkohol Pemanasan 45oC
Zat antimikroba, zat antioksidan
Homogenisasi Hand and body cream
Gambar 6 Diagram alir pembuatan produk hand and body cream
3.10.5 Uji Toksisitas Kulit Uji toksisitas kulit yang dilakukan adalah Primary Skin Irritation Testing dengan menentukan tingkat iritasi primer dengan metode Draize test dengan sedikit modifikasi. Uji tingkat iritasi dilakukan terhadap fraksi ekstrak jarak pagar terpilih baik dalam konsentrasi rendah maupun dalam bentuk aslinya serta produk krim yang mengandung ekstrak jarak pagar. Sebanyak 4-6 ekor kelinci jantan jenis New Zealand dengan bobot 1,5-2 kg diaklimatisasi selama 7 hari sebelum pengujian. Sebelum aplikasi sampel, punggung kelinci dicukur. Sebanyak 0,1 g / 0,1 ml masing-masing sampel diaplikasikan pada kulit tercukur (2*2 cm), selanjutnya daerah aplikasi ditutup dengan 2 lapis
35
perban dan dilekatkan menggunakan perekat. Sekitar 24, 48 dan 72 jam setelah aplikasi, kulit kelinci diamati tanda-tanda iritasi dan dilakukan pemberian skor dari eritema dan edema yang terbentuk berdasarkan Metode Draize (Tabel 5) (Draize et al. 1944). Sebagai kontrol positif digunakan surfaktan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) dengan konsentrasi 20%. Tabel 5 Evaluasi reaksi kulit Metode Draize No 1
Reaksi Kulit Skor Eritema dan Pembentukan Kerak Tanpa eritema 0 Eritema sangat sedikit (hampir tidak nampak) 1 Eritema berbatas jelas 2 Eritema moderat sampai berat 3 Eritema berat (merat bit) sampai sedikit membentuk 4 kerak (luka dalam) Total Skor Eritema yang mungkin 4 2 Pembentuka edema Tanpa edema 0 Edema sangat sedikit (hampir tidak nampak) 1 Edema sedikit (tepi daerah berbatas jelas) 2 Edema moderat (tepi naik kira-kira 1 mm) 3 Edema berat (naik lebih dari 1 mmdan meluas keluar 4 daerah pajanan) Total skor edema yang mungkin 4 Respon reaksi kulit = Jumlah maksimal skor eritema dan pembentukan kerak + jumlah maksimal skor edema/Jumlah kelinci
3.10.6 Uji Alergenitas Ekstrak Jarak Pagar Uji sifat alergi ekstrak jarak pagar dilakukan dengan metode ELISA (Enzym linked immnunosorbent assay) dengan tipe sandwich, yaitu antigen diikat oleh 2 molekul antibodi IgE dari serum subjek penderita alergi sehingga membentuk lapisan seperti ”sandwich”. Banyaknya IgE yang mengikat antigen dideteksi menggunakan antibodi sekunder yang berkonjugasi dengan enzim HRP. Substrat DAB (Diaminobenzidine) ditambahkan untuk mengukur komplek Ab-Ag-Ab-Ab* yang terbentuk dimana substrat DAB akan teroksidasi oleh enzim peroksidase membentuk warna coklat yang mudah diamati dan diukur absorbansinya menggunakan ELISA reader. Uji sifat alergi dilakukan terhadap tiga jenis ekstrak kasar jarak pagar (daun, bungkil, kulit batang)
36
dengan menggunakan 6 serum subjek yang memiliki riwayat alergi berdasarkan wawancara antara lain alergi jarak pagar, alergi getah, makanan, udara dingin/ekstrim. Pengambilan sampel darah dilakukan oleh dokter di Klinik IPB Darmaga. Sebanyak 10 ml sampel darah yang diambil dari pasien yang teridentifikasi memiliki alergi diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37oC hingga keluar cairan bening (serum). Selanjutnya dilakukan sentrifugasi selama 15 menit, kecepatan 1.500 rpm. Serum yang dihasilkan kemudian di simpan di freezer suhu -20oC dan siap digunakan untuk analisa. Pengujian sifat alergi ekstrak jarak pagar dengan metode ELISA adalah sebagai berikut. Sebanyak 50 μl serum subyek tanpa pengenceran dilapiskan ke dalam lempeng mikrotiter kemudian diinkubasi selama 15 jam pada suhu 4oC. Lempeng selanjutnya diblok dengan PBS Skim 3% sebanyak 100 μl, diinkubasi lagi selama 1 jam pada suhu 37oC, lalu ditambahkan ekstrak jarak pagar (200 μg/ml) sebanyak 50 μl dan diinkubasi selama 3 jam pada suhu 37oC. Serum subyek sebanyak 50 μl kembali ditambahkan ke dalam lempeng mikrotiter dan diinkubasi selama 15 jam pada suhu 4oC. Untuk melihat reaksi antara IgE serum dengan ekstrak jarak dilakukan penambahan antibodi IgG kelinci anti IgE manusia sebanyak 50μl (pengenceran 1:100 dan 1:300) dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37oC. Untuk mendeteksi IgG kelinci maka ditambahkan anti IgG kelinci yang telah diberi label horseradish peroxidase sebanyak 50 μl (pengenceran 1:1000) dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37oC. Pada setiap langkah setelah inkubasi dilakukan pencucian dengan PBSTween
sebanyak
5
kali.
Kemudian
ditambahkan
substrat
DAB
(Diamiobenzidine) yang telah diencerkan dengan buffernya (1:10) sebanyak 50 μl dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37oC. Pengukuran OD dilakukan dengan ELISA reader pada panjang gelombang 450 nm. Kontrol dibuat dengan melapiskan PBS Skim 3% pada lempeng mikrotiter secara langsung.
3.11
Teknik Analisis Data Untuk menentukan fraksi terpilih sebagai zat antimikroba dan atau zat
antioksidan yang akan diformulasikan dalam produk krim dilakukan analisis
37
statistik terhadap data aktivitas antimikroba, aktivitas antioksidan, total fenol serta rendemen ekstrak. Analisis statistik menggunakan Rancangan Petak Terbagi dengan petak utama disusun secara acak lengkap (Steel dan Torrie 1995). Faktor utama adalah bagian tanaman yang terdiri dari 3 perlakuan (daun, bungkil, kulit batang), sedangkan anak petak adalah jenis ekstrak (ekstrak kasar, fraksi metanol, fraksi heksan dan fraksi etil asetat). Model rancangan yang digunakan adalah sebagai berikut: Yijk = µ + Ai + єik + Bj + ABij + єijk Keterangan: Yijk
: Nilai pengamatan pada faktor utama (A) taraf ke-i, faktor tambahan taraf ke-j dan ulangan ke-k
µ
: Rataan umum
Ai
: Pengaruh utama pada taraf ke-i
єik
: Pengaruh acak dari petak utama
Bj
: Pengaruh faktor tambahan pada taraf ke-j
Abij
: Interaksi antara faktor utama dengan faktor tambahan
єijk
: Pengaruh acak dari faktor tambahan
Apabila perlakuan berpengaruh nyata, maka dilanjutkan dengan Uji Rentangan Berganda Duncan.
3.12
Hipotesis Penelitian Ekstrak kasar jarak pagar mengandung beberapa senyawa yang
diantaranya memiliki aktivitas antimikroba dan antioksidan. Aktivitas antioksidan dan antibakteri dari fraksi aktif jarak pagar tersebut kemungkinan dapat dimanfaatkan dalam produk kosmetik seperti krim karena umumnya pada formula lotion atau krim sering ditambahkan zat aditif tersebut sebagai pengawet maupun sebagai bahan aktif. Proses fraksinasi ekstrak kasar dapat mengurangi hambatan penggunaan ekstrak tanaman jarak pagar dalam produk kosmetik yaitu dengan meningkatkan kemurnian ekstrak, meningkatkan aktivitas antimikroba dan antioksidan dan mengurangi sifat toksiknya.
