III. BAHAN DAN METODE 3.1. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan dari bulan November 2006 sampai dengan Januari 2008. Penelitian bertempat di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas MIPA dan Laboratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis, PPSHB, Institut Pertanian Bogor.
3.2. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu spektrofotometer (Metertek), inkubator bergoyang (Certomat WR), sentrifus (Beckman GPR), stirer magnetik (RCH-3 Eyela), timbangan analitik (Ohaus AS200), vortex (VWR K550-G), pipet mikro (Finnpipette), penangas air (TZ4ST Autonics), pH meter (HANNA), laminar air flow (Gelaire BSB4A), autoklaf (TOMY SS-245), pengaduk bermagnet, dan alat-alat gelas. Bahan-bahan
yang
digunakan
dalam
penelitian
ini
yaitu
isolat
Streptomyces sp. 45I-3 asal Kalimantan (koleksi Dr. Ir. Yulin Lestari, Departemen Biologi, FMIPA IPB), Substrat Xilan Birchwood (Sigma), Sukrosa, Ekstrak Khamir, Agar-agar, DNS (3,5–Asam Dinitrosalisilat), K-Na-Tartrat, NaOH, Na2SO3, Coomassie Brilliant Blue G-250, Etanol 95 %, Asam Fosfor 85 %, Na2HPO4, NaH2PO4, Asam Sitrat, NaCl, Xilosa, BSA (Bovine Serum Albumine), Matriks Amobilisasi EudragitTM S100 (Rohm Pharma) dan Akuades. Bahan kimia tersebut dari MerckTM (kecuali yang disebutkan) dan berkualitas pro analisa.
3.3. Metode Penelitian 3.3.1. Preparasi Ekstrak Kasar Xilanase Isolat Streptomyces sp. 45I-3 diremajakan pada cawan petri berisi media agar-agar xilan (Tabel 2), diinkubasi pada suhu ruang selama 5 hari sampai terbentuk
spora.
Produksi
enzim
xilanase
dilakukan
dengan
cara
menginokulasikan sebanyak 2 loop (diameter 1 cm) kultur agar cawan hasil peremajaan ke dalam Erlenmeyer yang berisi 100 ml media cair xilan (Tabel 2, tanpa agar). Kultur tersebut diinkubasi pada suhu ruang di dalam inkubator bergoyang kecepatan 150 rpm selama 8 hari. Enzim ekstrak kasar dipanen dengan cara sentrifugasi kultur pada 4500 x g selama 15 menit pada suhu 4 oC.
16
Supernatan merupakan ekstrak kasar xilanase yang digunakan dalam tahap amobilisasi. Tabel 2. Komposisi Media Agar-Agar Xilan Bahan
Jumlah (%)
Agar-Agar
1.5
Xilan Birchwood
0.75
Sukrosa
10.3
Ekstrak Khamir
1.0
Sumber: Prihandono (2007) 3.3.2. Amobilisasi Enzim Xilanase Ekstrak kasar xilanase diamobilisasi dengan EudragitTM S100 berdasarkan modifikasi metode Sardar et al. (2000), yang terdiri atas: 1. Pembuatan Larutan EudragitTM S100 2 % (b/v) Larutan EudragitTM S100 untuk amobilisasi xilanase ekstraseluler dibuat dengan melarutkan 1 g EudragitTM S100 ke dalam 40 ml akuades. Dengan pengadukan konstan, diteteskan larutan 3 M NaOH hingga mencapai pH 11.0. Setelah matriks terlarut sempurna, pH larutan diturunkan menjadi 7.0 dengan penambahan larutan 3 M HCl. Volume larutan ditera sampai 100 ml dengan akuades. Larutan disimpan pada 4 oC sampai akan digunakan. 2. Penentuan Konsentrasi Larutan EudragitTM S100 Tahapan ini dilakukan untuk mengetahui konsentrasi larutan EudragitTM S100 yang optimum untuk mengikat xilanase, dengan menggunakan enam taraf konsentrasi larutan, yaitu 0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 dan 3.0 % (b/v). Larutan EudragitTM S100 masing-masing konsentrasi sebanyak 4 ml ditambahkan dengan 1 ml ekstrak kasar xilanase secara terpisah. Setelah inkubasi selama 1 jam pada suhu 30
o
C, matriks diendapkan dengan
mengatur pH menjadi 4.5 menggunakan larutan 0.1 M asam asetat. Setelah 30 menit, suspensi disentrifugasi pada 12000 x g selama 20 menit dan supernatan dipisahkan. Endapan dicuci dengan 4 ml 0.01 M bufer asetat pH 4.0 (Lampiran 1), kemudian suspensi disentrifugasi kembali. Endapan yang
17
terbentuk (xilanase yang teramobilkan) dilarutkan dalam 0.02 M bufer sitrat fosfat pH 5.0 sehingga volume akhir menjadi 5 ml. Aktivitas xilanase dihitung dengan menentukan gula pereduksi yang terbentuk menggunakan metode Miller (1959) yang tersaji pada Lampiran 2 dan kadar protein dihitung menggunakan metode Bradford (1976) pada Lampiran 3. Aktivitas xilanase pada supernatan dan hasil pencucian dihitung untuk menentukan aktivitas yang tidak terikat, sedangkan aktivitas xilanase pada suspensi xilanase amobil dihitung sebagai aktivitas xilanase amobil. Konsentrasi
larutan
EudragitTM
S100
yang
menghasilkan
efektivitas
amobilisasi yang optimum dipilih untuk digunakan pada tahap selanjutnya. Aktivitas xilanase amobil (nkat/ml) Efektivitas Amobilisasi (%) =
x 100 % Aktivitas tidak terikat (nkat/ml)
Dimana: Aktivitas tidak terikat =
Aktivitas Enzim Bebas – (Aktivitas pada supernatan + Aktivitas pada hasil pencucian)
3. Penentuan Rasio Konsentrasi Xilanase dengan EudragitTM S100 Langkah selanjutnya yaitu dengan menentukan rasio konsentrasi xilanase dengan larutan EudragitTM S100 dari penelitian tahap sebelumnya, dengan menggunakan sebelas kombinasi rasio konsentrasi xilanase dan larutan EudragitTM S100, yaitu 6 : 1, 5 : 1, 4 : 1, 3 : 2, 3 : 1, 2 : 1, 1 : 1, 1 : 2, 1 : 3, 2 : 3 dan 1 : 4. Xilanase ekstrak kasar ditambahkan ke dalam larutan EudragitTM S100 dengan rasio tertentu dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 30 oC. Matriks diendapkan dengan mengatur pH menjadi 4.5 menggunakan 0.1 M asam asetat. Setelah 30 menit, suspensi disentrifugasi pada 12000 x g selama 20 menit. Endapan dicuci dengan 0.01 M bufer asetat pH 4.0 (Lampiran 1), kemudian suspensi disentrifugasi kembali. Endapan yang terbentuk (xilanase yang teramobilkan) dilarutkan dalam 0,02 M bufer sitrat fosfat pH 5.0. Aktivitas xilanase dan kadar protein dihitung seperti yang tersaji pada Lampiran 2 dan 3. Aktivitas xilanase pada supernatan dan hasil pencucian dihitung untuk menentukan aktivitas yang tidak terikat, sedangkan aktivitas xilanase pada suspensi xilanase amobil dihitung sebagai aktivitas xilanase amobil. Rasio konsentrasi xilanase dengan larutan EudragitTM S100 yang
18
menghasilkan efektivitas amobilisasi yang optimum dipilih untuk digunakan pada tahap karakterisasi. 3.3.3. Karakterisasi Enzim Xilanase Amobil 1. Pengujian pH optimum Pengujian pH optimum xilanase amobil dilakukan dengan mereaksikan xilanase amobil dengan substrat xilan birchwood 0.5 % (b/v) pada suhu 50 oC selama 30 menit pada berbagai kondisi pH larutan bufer dengan selang pH 0.5 unit, yaitu menggunakan bufer sitrat fosfat 0.02 M untuk pH 3.0 – 6.0 dan bufer fosfat 0.02 M untuk pH 6.0 – 7.0. Aktivitas xilanase dihitung berdasarkan gula pereduksi yang terbentuk menggunakan metode Miller (1959) seperti tersaji pada Lampiran 2. 2. Pengujian suhu optimum Pengujian
suhu
optimum
xilanase
amobil
dilakukan
dengan
mereaksikan xilanase amobil dengan substrat xilan birchwood 0.5 % (b/v) selama 30 menit pada suhu 30 – 70 oC, dengan selang suhu 10 oC. Aktivitas xilanase dihitung berdasarkan gula pereduksi yang terbentuk menggunakan metode Miller (1959) seperti tersaji pada Lampiran 2. 3. Pengujian Stabilitas Suhu Pengujian stabilitas xilanase amobil terhadap suhu dilakukan dengan menginkubasikan enzim amobil pada berbagai suhu (30 – 70 oC) selama 1 jam. Setelah inkubasi selesai larutan enzim dengan cepat didinginkan di dalam penangas es bersuhu 4 oC. Aktivitas enzim yang tersisa diuji pada kondisi standar reaksi enzimatis xilanase. Aktivitas xilanase dihitung berdasarkan gula pereduksi yang terbentuk menggunakan metode Miller (1959) seperti tersaji pada Lampiran 2. Nilai aktivitas enzim tersisa dinyatakan dalam persentase dibandingkan dengan kontrol (enzim tanpa perlakuan). 4. Stabilitas Xilanase Amobil dalam Substrat Xilan Birchwood dan Xilan Tongkol Jagung Pengujian stabilitas xilanase amobil dalam substrat dilakukan dengan menginkubasikan xilanase amobil dengan xilan birchwood dan xilan tongkol
19
jagung 1 % (b/v) dalam 0.02 M bufer sitrat fosfat pada kondisi optimum xilanase amobil (suhu 40 oC dan pH 6.0) selama 7 jam. Pengambilan sampel xilanase amobil dilakukan setiap 2 jam. Aktivitas xilanase dihitung berdasarkan gula pereduksi yang terbentuk menggunakan metode Miller (1959) seperti tersaji pada Lampiran 2. 5. Stabilitas Xilanase Amobil pada suhu 40 oC dan pH 5.0 Pengujian
stabilitas
xilanase
amobil
ini
dilakukan
dengan
menginkubasikan xilanase amobil dalam 0.02 M bufer sitrat fosfat pH 5.0 pada suhu 40 oC selama 10 jam. Pengambilan sampel xilanase amobil dilakukan setiap 1 jam. Aktivitas xilanase dihitung berdasarkan gula pereduksi yang terbentuk menggunakan metode Miller (1959) seperti tersaji pada Lampiran 2.
3.3.4. Spesifitas Xilanase Amobil terhadap Substrat Xilan Birchwood dan Xilan Tongkol Jagung Pengujian spesifitas xilanase amobil terhadap xilan birchwood dan xilan tongkol jagung dilakukan untuk mengetahui kemampuan xilanase amobil untuk mendegradasi substrat xilan menjadi xilan rantai pendek, xilooligosakarida dan xilosa. Pengujian dilakukan dengan mencampurkan 1 ml xilanase amobil (0.32 nkat/ml), 10 ml larutan bufer substrat xilan birchwood atau xilan tongkol jagung 1 % (b/v) dan 9 ml larutan bufer sitrat fosfat 0.02 M. Hasil pencampuran tersebut ditempatkan pada Erlenmeyer dan diinkubasikan pada suhu optimumnya. Hasil inkubasi diambil sebanyak 1 ml setiap jamnya selama 5 jam inkubasi dan dididihkan untuk inaktivasi enzim. Hasil pengujian dihitung dengan menentukan Kadar Gula Pereduksi dengan metode DNS (Miller 1959) pada Lampiran 2 dan Total Gula dengan metode fenol sulfat (Dubois 1956) seperti tersaji pada Lampiran 4, untuk mendapatkan perhitungan Derajat Polimerisasi (DP). 3.3.5. Penggunaan Berulang Xilanase Amobil Pengujian penggunaan berulang terhadap enzim amobil dilakukan berdasarkan modifikasi metode Roy et al. (2003) untuk mengetahui kemampuan xilanase
amobil
untuk
dipakai
berulang
tanpa
kehilangan
aktivitasnya.
Penggunaan berulang ini dilakukan dengan melakukan hidrolisis 18 ml substrat
20
xilan birchwood 1 % (b/v) dalam bufer sitrat fosfat 0.02 M pH 5.0 dengan 2 ml xilanase amobil (16.88 nkat/ml) pada suhu 40 oC selama 1 jam. Setelah setiap siklus hidrolisis, xilan yang tidak terdegradasi dipisahkan dengan sentrifugasi pada 2000 x g selama 10 menit. pH supernatan diturunkan menjadi 4.5 dengan penambahan 0.1 M asam asetat sehingga enzim amobil terendapkan dan dipisahkan dengan sentrifugasi pada 12000 x g selama 20 menit. pH supernatan diatur kembali menjadi pH 5.0. Untuk melakukan percobaan siklus kedua, enzim amobil dilarutkan kembali dalam bufer baru dan ditambahkan dengan xilan yang tidak terdegradasi, selanjutnya diproses dengan cara yang sama. Jumlah gula pereduksi pada supernatan diuji menggunakan metode Miller (1959) seperti tersaji pada Lampiran 2. 3.3.6. Prosedur Analisis 1. Pengujian Aktivitas Enzim Xilanase Pengujian aktivitas enzim xilanase dilakukan dengan menghitung gula pereduksi yang terbentuk sebagai hasil aktivitas xilanase terhadap substratnya dengan metode Miller (1959). Satu unit aktivitas xilanase dinyatakan sebagai banyaknya enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1 µmol gula xilosa dari substrat birchwood per menit pada kondisi optimal reaksi enzimatis. Prosedur pengujian aktivitas xilanase dan kurva standar xilosa disajikan pada Lampiran 2. 2. Pengujian Kadar Protein Pengujian kadar protein enzim dilakukan dengan metode Bradford (1976). Prosedur pengujian kadar protein dan kurva standar Bovine Serum Albumine (BSA) disajikan pada Lampiran 3. 3. Pengujian Total Gula Total gula hasil hidrolisis xilanase ditetapkan berdasarkan metode fenol asam sulfat (Dubois 1956) dengan prinsip bahwa gula sederhana, oligosakarida, polisakarida dan turunannya dapat bereaksi dengan fenol dalam asam sulfat menghasilkan warna jingga yang stabil. Penetapan total gula dan kurva standar total gula disajikan pada Lampiran 4.
21
4. Derajat Polimerisasi Derajat Polimerisasi menyatakan perbandingan antara total gula dengan gula pereduksi dengan rumus hitung sebagai berikut: Total Gula (mg/ml) Derajat Polimerisasi (DP) = Gula Pereduksi (mg/ml)
