21
III. BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Pelaksanaan Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Vapor Heat Treatment Balai Besar Peramalan Organisme Pengganggu Tumbuhan (BBPOPT) Karawang, Jawa Barat. Waktu pelaksanaan penelitian adalah bulan Mei 2011 sampai Nopember 2011.
Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah buah mangga varietas gedong gincu, lalat buah B. papayae dan B. carambolae, dan pakan buatan. Buah mangga pada tingkat kematangan awal diperoleh dari petani mangga di Cirebon, Jawa Barat. Lalat buah stadia larva dan telur didapatkan dari pembiakan massal yang dilakukan di Laboratorium Vapor Heat Treatment Balai Besar Peramalan Organisme Pengganggu Tumbuhan (BBPOPT) Karawang, Jawa Barat. Pakan buatan dengan komposisi bahan seperti pada Tabel 4 digunakan dalam pemeliharaan larva lalat buah. Tabel 4 Komposisi pakan buatan lalat buah stadia larva untuk 1000 gram* Bahan-bahan Dedak gandum Gula HCl 3.5% Sodium benzoat Crude dry yeast Tisu Air *Sumber: JFTA (1996).
Jumlah 175 g 50 g 20 ml 0.75 g 35 g 25 g 650 ml
Peralatan yang digunakan terdiri atas: water bath Advantec, biotron chamber Sanshu model STH-19P, mesin perlakuan uap panas merek Sanshu model EHK-1000D, inkubator Sanyo MIR-254, kipas angin, timbangan analitik, dan berbagai alat bantu lain.
22
Metode Penelitian Pengujian Pendahuluan Identifikasi spesies lalat buah. Identifikasi dilakukan secara morfologis terhadap spesimen pada stadia imago. Lalat buah yang diamati terdiri dari beberapa spesies yang menjadi perhatian Jepang untuk dicegah introduksinya ke negara tujuan.
Identifikasi dilakukan dengan menggunakan alat bantu
mikroskop stereo untuk mengamati karakteristik sayap, toraks, dan abdomen. Identifikasi lalat buah yang termasuk dalam B. dorsalis complex, yaitu B. papayae dan B. carambolae, dilakukan dengan pengukuran panjang aedeagus lalat buah jantan dan panjang aculeus lalat buah betina. Pengukuran dilakukan di bawah mikroskop kompon yang terintegrasi dengan program komputer. Pembedaan antara B. papayae dan B. carambolae dilakukan dengan pengamatan femur depan dan spot pada abdomen (Tabel 5). Tabel 5 Perbedaan morfologi B. papayae dan B. carambolae* Bagian tubuh yang diamati Abdomen
Femur depan
B. papayae
B. carambolae
Ujung bercak pada terga III – IV berbentuk runcing
Ujung bercak pada terga III – IV berbentuk tumpul
Tidak ada spot hitam
Ada spot hitam
1.77 – 2.12 mm
1.4 – 1.6 mm
3.4 mm – 3.6 mm
2.4 – 3.4 mm
Panjang aculeus (betina) Panjang aedeagus (jantan)
*Sumber: Drew dan Hancock (1994). Pemeliharaan dan perbanyakan lalat buah. Pemeliharaan secara berkesinambungan diperlukan untuk menyediakan lalat buah dalam jumlah yang memadai untuk pengujian perlakuan uap panas.
Dua spesies lalat buah uji
0
dipelihara dalam biotron dengan temperatur 28 C dan kelembaban relatif 65 70%. Tempat peletakan telur dibuat dari gelas plastik yang telah dilubangi dan diisi jus mangga. Pakan buatan untuk pemeliharaan stadia larva dilakukan dari bahan-bahan sebagaimana tercantum dalam tabel 1. Semua bahan dicampur dan dihaluskan dengan blender. Selanjutnya pakan buatan ditempatkan di kontainer plastik dengan menempatkan satu lapis kertas tisu di bagian atas
23
pakan. Telur lalat buah diinokulasikan ke permukaan pakan secara merata. Telur diinkubasi selama 1 – 2 hari di biotron sampai proses penetasan. Lima hari setelah inokulasi telur, kontainer berisi pakan buatan dan larva dipindahkan ke sangkar khusus untuk pupasi. Sangkar khusus tersebut diberi pasir yang sudah diayak. Stadia larva berumur 5 -7 hari pada kondisi pakan buatan. Larva instar ketiga siap melenting ke pasir pada umur 5 sampai 7 hari setelah penetasan. Pupa akan berumur sekitar 10 hari dan selanjutnya dipindahkan ke wadah tersendiri. Pemindahan pupa diawali dengan pengayakan pasir yang telah tercampur stadia pupa lalat buah. Pupa ditempatkan di sangkar untuk stadia imago. Setelah bermetamorfosis menjadi lalat buah imago, nutrisi lalat buah dipenuhi
dengan
pemberian
pakan
buatan
gula
dan
autoliese
yeast
(perbandingan 1:4). Stadia lalat buah yang berpotensi terbawa oleh buah segar adalah telur dan larva. Oleh karena itu periode hidup lalat buah di dalam buah mangga dan pakan buatan mutlak diketahui untuk persiapan pengujian. Uji perkembangan lalat buah pada pakan buatan dan mangga. Pengujian pendahuluan dibutuhkan untuk mengetahui periode hidup telur dan larva lalat buah pada buah mangga dan pakan buatan. Informasi tersebut berguna untuk keakuratan stadia uji yang dibutuhkan dalam perlakuan uap panas. Peneluran dilakukan ± 1 jam, kemudian diinokulasikan ke pakan buatan/mangga sebanyak 1 ml per 1 liter pakan. Pengamatan dilakukan setiap hari sampai hari ke-9 setelah inokulasi telur ke pakan buatan. Sebanyak 300 larva diambil dari pakan dan dibunuh dengan air panas. Selanjutnya diidentifikasi instar perkembangan setiap larva. Prosedur yang sama dilakukan terhadap lalat buah di buah mangga, namun setiap mangga hanya diinokulasi 100 telur secara artifisial. Selanjutnya diidentifikasi instar perkembangan setiap larva pada buah mangga. Uji Perendaman Air Panas Penelitian dilaksanakan dalam tiga tahap pengujian. Tahap pertama adalah pengujian perendaman air panas yang bertujuan untuk mengetahui tingkat toleransi spesies dan stadia hidup lalat buah terhadap panas serta memberikan gambaran temperatur tinggi yang mampu membunuh lalat buah. Pengujian perbandingan antar stadia menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) Faktorial dengan 3 ulangan. Stadia lalat buah yang diuji adalah telur dan larva (tiga instar berbeda) masing-masing spesies. Temperatur yang digunakan dalam penelitian adalah 44ºC, sedangkan waktu perlakuan meliputi 0 menit
24
(kontrol), 5, 10, 15, dan 20 menit. Pengujian perbandingan antar spesies menggunakan RAL Faktorial dengan 2 ulangan. Temperatur yang digunakan adalah 46oC terhadap telur dan larva B. carambolae dan B. papayae. Waktu perendaman hingga 20 menit dengan interval per 2 menit. Perbandingan temperatur
bertingkat
menggunakan
RAL
Faktorial dengan
3
ulangan.
o
Perendaman dilakukan pada air dengan temperatur 44 – 48 C terhadap stadia larva B. carambolae. Waktu perendaman yang digunakan adalah 0 menit (kontrol), 5, 10, 15, dan 20 menit. Tempat peletakan telur ditempatkan pada sangkar lalat buah selama ± 1 jam untuk mendapatkan sejumlah telur yang dibutuhkan. Selanjutnya telur diinokulasikan ke pakan buatan. Inokulasi telur untuk mendapatkan larva sesuai instar yang diinginkan dilakukan bedasarkan hasil uji perkembangan lalat buah di pakan buatan. Peneluran untuk mendapatkan larva instar pertama dilakukan 2 hari sebelum perlakuan, larva instar kedua dilakukan 4 hari sebelumnya, dan larva instar ketiga dilakukan 5 hari sebelumnya. Sedangkan stadia telur disiapkan sehari sebelumnya. Dua puluh individu larva/telur ditempatkan di tabung gelas beralas kain kasa. Tabung gelas direndam dalam air pada water bath dengan temperatur konstan 44ºC. Selanjutnya tabung gelas dipindahkan dari water bath sesuai dengan lama perlakuan yang diinginkan dan didinginkan dengan air pada temperatur ± 27ºC. Serangga uji kemudian diberi pakan dan ditempatkan di biotron dengan temperatur 28oC dan RH 65 – 70%. Pengamatan dilakukan dua hari setelah perlakuan perendaman untuk memastikan bahwa serangga telah benar-benar mati dan bukan hanya pingsan. Mortalitas terkoreksi digunakan untuk mengeliminasi faktor di luar perlakuan yang mungkin mengakibatkan kematian serangga uji. Mortalitas terkoreksi diperoleh melalui rumus Abbott: mortalitas (perlakuan) – mortalitas (kontrol) Mortalitas terkoreksi (%) =
x 100% 100 – mortalitas (kontrol)
Pada Gambar 3 disajikan skema prosedur perlakuan perendaman air panas. Prosedur yang sama juga digunakan untuk perbandingan antar spesies dan perbandingan temperatur bertingkat. Larva yang digunakan adalah instar tiga karena mempunyai periode hidup paling panjang di buah mangga dibandingkan instar lain.
25
Peneluran lalat buah
Pemindahan telur ke pakan buatan*) dan simpan di temperatur 27ºC - 2-5 hari untuk larva - 1 hari untuk telur
Pemindahan telur/larva ke tabung
Perendaman di air panas 44ºC selama 5, 10, 15, dan 20 menit
Pendinginan di air temperatur ruang
Pemindahan telur/larva ke pakan buatan dan simpan di temperatur 27ºC
- 2 hari
Pengamatan
Catatan: *) = tidak dilakukan untuk uji telur
Gambar 3 Skema prosedur perlakuan perendaman air panas terhadap telur dan larva lalat buah
26
Gambar 4 Pelaksanaan perlakuan perendaman air panas terhadap telur dan larva lalat buah Uji Toleransi Jaringan Buah Mangga Pengujian toleransi buah mangga gedong gincu terhadap temperatur tinggi dilakukan dengan teknik perendaman air panas. Aveno et al. (2006) menyatakan bahwa perendaman air panas pada temperatur di atas 55ºC terhadap buah mangga akan mengakibatkan gejala scalding dan diskolorasi buah. Pada temperatur 42-49ºC, mangga varietas tertentu yang direndam dalam air panas akan menunjukkan luka atau kerusakan di dalam maupun permukaan buah (Jacobi et al 2001). Temperatur yang digunakan dalam pengujian adalah 45ºC, 47ºC, dan 49ºC. Temperatur yang digunakan adalah temperatur pusat buah mangga yang diukur dengan sensor. Perendaman air panas dilakukan pada water bath yang dilengkapi dengan termometer merkuri bersertifikasi untuk validitas temperatur. Buah mangga dibawa dari kebun dengan karton plastik yang dilapisi dengan kertas koran. Hal ini perlu dilakukan untuk mencegah terjadinya kerusakan mekanis selama penanganan dan pengangkutan. Setelah di laboratorium, mangga dicuci dengan air bersih untuk membebaskan buah dari partikel tanah atau kotoran lain yang mungkin menempel di permukaan buah. Setelah dikeringkan dengan kertas tisu, buah disortasi berdasarkan bobot buah. Masing-masing buah ditimbang dengan timbangan analitik untuk mendapatkan
27
bobot buah yang relatif seragam untuk pengujian. Hasil penimbangan ditulis pada buah mangga dengan spidol hitam Buah mangga direndam dalam air di water bath pada temperatur 49ºC. Buah mangga kontrol direndam di air temperatur ruang (±27ºC). Buah dipindahkan
setelah
mencapai
temperatur
perlakuan.
Kemudian
didinginkan dengan penganginan untuk mengembalikan temperatur
buah buah
seperti semula. Selanjutnya buah dilapisi kertas koran dan dimasukkan ke dalam karton. Setelah itu, buah disimpan pada temperatur 13ºC di ruang pendingin. Pengamatan dilakukan 1 hari setelah perlakuan untuk parameter bobot buah dan warna kulit buah. Sedangkan pengamatan 5 hari setelah perlakuan meliputi kondisi kekerasan, bobot, perubahan warna kulit, kandungan gula, dan rasa. Warna kulit buah. Buah diamati untuk memastikan apakah terjadi perubahan penampilan fisik yang mengarah ke penurunan kualitas buah dan nilai jual pemasaran. Penurunan kualitas dapat berupa pembusukan dan diskolorasi kulit buah. Perubahan warna pada buah mangga, sebelum dan sesudah perlakuan diukur dengan alat color reader (Konica Minolta CR-13). Pengukuran dilakukan pada bagian pangkal dan ujung buah. Nilai pengukuran menggunakan sistem L*a*b dimana nilai L menunjukkan tingkat kecerahan. Nilai a menunjukkan warna kromatik campuran merah hijau yang nilainya bergerak dari positif untuk warna merah sampai negatif untuk warna hijau. Nilai b menunjukkan warna kromatik campuran biru kuning yang nilainya bergerak dari positif untuk warna kuning sampai negatif untuk warna biru. Pengukuran warna kulit buah setelah perlakuan dilakukan 1 hari dan 5 hari setelah perlakuan. Bobot. Bobot sebelum dan sesudah perlakuan perlu diketahui untuk mengetahui kemungkinan adanya penurunan bobot buah. Setelah perlakuan, setiap buah ditimbang dengan timbangan analitik dan dibandingkan dengan hasil penimbangan sebelumnya. Penimbangan bobot buah setelah perlakuan dilakukan 1 hari dan 5 hari setelah perlakuan. Kandungan gula. Pada beberapa buah, perlakuan panas dapat mempengaruhi kandungan gula, seperti apel dan muskmelon (Lurie 1998). Jus diambil dari bagian yang sama untuk setiap buah. Kandungan gula pada buah diukur dengan digital refractometer (Atago PAL-1) dengan meneteskan jus pada prisma refraktometer. Nilai kandungan gula ditentukan dengan melihat angka yang tertera pada alat dengan satuan persen. Pengamatan kandungan gula
28
dilakukan 5 hari setelah perlakuan. Hasil perhitungan kemudian dibandingkan dengan kandungan gula buah mangga kontrol.
Buah mangga var. gedong gincu
Pencucian, sortasi
Penyimpanan
Pengamatan: bobot, warna
Perendaman air panas 45ºC, 47ºC, 49ºC, dan kontrol (27ºC)
Penyimpanan - 1 hari
Pengamatan: bobot, warna
- 5 hari
Penyimpanan
Pengamatan: bobot, warna, kekerasan, kandungan gula, dan rasa
Gambar 5 Diagram alir proses pengujian toleransi buah mangga dengan perendaman air panas Tingkat kekerasan. Pengukuran tingkat kekerasan buah dilakukan dengan hardness meter. Pengukuran dilakukan pada sisi yang sama dari setiap buah. Terlebih dahulu buah mangga dibelah dan data diambil dari sisi dalam buah mangga. Nilai pengukuran tingkat kekerasan dilakukan 5
hari setelah
29
perlakuan. Hasil perhitungan kemudian dibandingkan dengan tingkat kekerasan buah mangga kontrol. Nilai yang ditunjukkan alat merupakan nilai kekerasan buah dengan satuan kg/mm. Uji rasa. Pengujian rasa dilakukan dengan metode triangle differential testing (JFTA 1996). Penilaian rasa buah dilakukan oleh 10 orang panelis terlatih 5 hari setelah perlakuan. Buah dengan dan tanpa perlakuan disajikan secara acak di meja. Terdapat 3 kombinasi uji yang disiapkan dimana salah satunya merupakan buah mangga tanpa atau dengan perlakuan. Panelis mengidentifikasi potongan buah mangga dengan rasa berbeda dibandingkan potongan lain dalam satu kombinasi uji. Hasil penilaian panelis selanjutnya diuji khi-kuadrat dengan tingkat kepercayaan 95%.
Gambar 6 Pelaksanaan uji toleransi jaringan buah mangga dengan perendaman air panas Uji Perlakuan Uap Panas terhadap Lalat Buah pada Mangga Gedong Gincu Tujuan pengujian adalah untuk mengetahui kondisi temperatur dan waktu optimum untuk mendisinfestasi lalat buah pada mangga gedong gincu dengan teknik perlakuan uap panas. Pengujian menggunakan Rancangan Acak Lengkap dengan 5 ulangan. Perlakuan disinfestasi dilakukan 2 kali, yaitu 1) pada
30
temperatur 46.5ºC dengan waktu tunggu 0 – 10 menit dan 2) pada temperatur 45.5oC sampai 46.5oC tanpa waktu tunggu. Pengujian dilakukan dengan menggunakan buah gedong gincu yang telah diinokulasi telur dan larva B. carambolae. Inokulasi 50 ekor larva atau telur B. carambolae per buah dilakukan secara artifisial. Inokulasi larva harus dilakukan secara hati-hati untuk menghindari terlepasnya larva uji dari jaringan buah. Oleh karena itu, buah mangga uji ditutup rapat dengan selotip hingga menyerupai mumi (Gambar 7). Dalam satu rak perlakuan terdiri atas 5 buah mangga yang telah diinokulasi lalat buah. Buah kontrol adalah buah mangga yang tidak diberi perlakuan uap panas. Pengujian disinfestasi lalat buah dilakukan pada temperatur suhu chamber VHT 47.5oC dan RH > 95. Temperatur perlakuan yang dimaksud adalah temperatur pusat atau bagian tengah buah mangga. Kondisi temperatur tengah buah diukur dengan sensor temperatur yang ditempatkan di dalam tiga buah mangga selama pengujian. Selama perlakuan, temperatur pusat buah dapat diketahui melalui monitor mesin perlakuan uap panas. Temperatur perlakuan tercapai apabila minimal dua dari tiga sensor telah mencapai temperatur target.
Gambar 7
Pelaksanaan perlakuan uap panas terhadap telur dan larva B. carambolae pada mangga gedong gincu
31
Setelah perlakuan, dilakukan pendinginan dengan penganginan selama kurang lebih 30 menit. Selanjutnya buah mangga uji disimpan di inkubator pada temperatur 27ºC. Pengamatan dilakukan 48 jam setelah perlakuan. Tingkat mortalitas larva tiap perlakuan diperoleh dengan menghitung jumlah larva yang masih hidup setelah perlakuan. Mortalitas telur ditentukan dengan menghitung jumlah telur yang tidak menetas hingga 2 hari setelah perlakuan.
Buah mangga var. gedong gincu
Pencucian dan sortasi
Inokulasi telur/larva instar ketiga secara artifisial
Perlakuan uap panas 46.5ºC Waktu tunggu: 0, 5, 10 menit dan kontrol
Perlakuan uap panas 45.5oC, 46oC, 46.5ºC, dan kontrol
Pendinginan
Penyimpanan pada 27ºC - 2 hari Pengamatan
Gambar 8 Diagram alir proses perlakuan uap panas terhadap telur dan larva B. carambolae pada mangga gedong gincu
