III. Bahan dan Metode A.
Bahan Sampel yang digunakan adalah bakteri penghasil
biopigmen hasil isolasi dari Acropora nasuta yang diambil dari Taka Cemara Karimunjawa, Jepara, Jawa Tengah. Bahan kimia yang digunakan diantaranya yeast extract, peptone, agar bacteriological, untuk isolasi dan kultur bakteri, etanol, n-heksana, aseton, metanol, asetonitril, ammonium asetat, gas N2, akuades, dan akuabides untuk ekstraksi dan identifikasi pigmen dengan UV-Tampak dan KCKT. TE buffer, lysozym, SDS 10%, NaCl 5 M, CTAB, Chloroform, Isopropanol, Etanol 70% digunakan untuk ekstraksi DNA. Akuabides steril, primer 27oF, primer 1492R, DNA template pengenceran 100x, Mega Mix Royal untuk identifikasi bakteri. B.
Metode
Sampling Organisme Laut Sampel karang lunak Acropora nasuta diambil dari perairan Taka Cemara Karimunjawa di kedalaman kurang lebih 2 meter dengan peralatan scuba diving. Setelah pengambilan, sampel karang lunak segera dimasukkan ke dalam cool box yang sebelumnya telah diisi dengan es.
11
Sampel
dicuci
3×
dengan
akuades
steril
untuk
menghindari kontaminasi air laut. Pembuatan Media dan Isolasi Bakteri Media yang digunakan adalah ZoBell 2216E marine agar medium. Sebanyak 1 L media Zobell 2216E Agar dibuat
dengan
mencampurkan
7.5
gram
agar
bacteriological, 2.5 gram peptone, 0.5 gram yeast extract ditambahkan air laut hingga mencapai volume 1000 mL dan
dihomogenisasi
Campuran
tersebut
dengan
pengaduk
selanjutnya
magnetik.
disterilisasi
dalam
autoclave pada suhu 121°C selama 15 menit. Isolasi
bakteri
dilakukan
dengan
pemotongan
bagian tubuh organisme laut, kemudian diencerkan dan ditanam pada media Zobell 2216E Agar dalam cawan petri. Inkubasi dilakukan pada suhu kamar (±30oC) selama
48
jam
(Radjasa
dkk,
2007).
Berdasarkan
morfologi warna dari koloni-koloni bakteri yang tumbuh, dilakukan pemurnian dengan teknik goresan (streak method) pada cawan petri (Madigan dkk, 2000).
12
Reaksi berantai polimerase (PCR) 16S rDNA 1. Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA dilakukan menurut Ausubel dkk (1995). Kultur bakteri cair sebanyak 3 mL dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1,5 mL, kemudian disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 10 menit. Supernatan (cairan) dibuang sehingga akan didapat sel-sel bakteri dalam bentuk pelet. Pelet bakteri ditambahkan 500 μL TE buffer lalu divortex selama 5 menit, ditambahkan 40 μl Lysozym dan diinkubasi dalam waterbath pada suhu 37°C selama 1 jam. Selanjutnya larutan ditambahkan 200 μL SDS 10% dan diinkubasi kembali, selanjutnya larutan ditambahkan 100 μL NaCl 5 M dan 80 μL CTAB dan diinkubasi pada suhu 68°C selama 10 menit sampai larutan jernih. Larutan ditambahkan kloroform sampai volume tabung 1,5 mL lalu tabung dibolak-balik dan disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 10 menit. Supernatan di bagian atas cincin
dipindahkan
ke
tabung
eppendorf
baru,
ditambahkan Isopropanol (dengan volume 0,6x volume supernatan) kemudian dibolakbalik dan disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang, lalu ditambahkan 100 μL Etanol 70% dan disentrifugasi kembali pada 13.000 rpm selama 1 menit. Etanol dibuang (usahakan agar pelet tidak ikut terambil) kemudian pelet 13
dikering anginkan. Setelah kering, pelet ditambahkan 15 μL TE Buffer. Ekstrak DNA disimpan dalam lemari pendingin pada suhu -20oC. 2. Amplifikasi PCR 16S rDNA Campuran bahan-bahan yang digunakan yaitu akuabides steril (9,5 µl), primer 27oF (1 µL), primer 1492 R (1 µL), DNA template pengenceran 100x (1 µL), Mega Mix Royal (12,5 µL) sehingga total volume 25 µL. Primer yang digunakan untuk PCR 16S rDNA adalah primer universal 27oF (5'-AGAGTTTGATCMTG GC TCAG-3') dan primer spesifik
eubacteria
GYTACCTTGTTACGACTT-3')
1492R (Isnansetyo
(5'-TACG dan
Kamei,
2003). Bahan-bahan tersebut dicampur dalam tabung PCR
0,2 mL, dengan perlakuan suhu yang digunakan
pada PCR adalah: denaturasi pada 94oC selama 3 menit, kemudian sebanyak 30 siklus (annealing pada 55oC selama 60 detik, extension pada 72oC selama 90 detik dan terakhir ~4oC (Sabdono, 2001). Visualisasi produk PCR 16S rDNA ini dilakukan melalui elektroforesis dengan memasukkan 5 μL produk PCR ke dalam sumur gel agarosa 1%. Pembuatan gel agarosa 1% dilakukan dengan melarutkan 1 g agarosa dalam 100 mL larutan TAE buffer 1x, lalu dipanaskan sampai homogen (jernih). Larutan gel dituang dalam 14
cetakan dengan sisir cetakan yang dipasang dengan posisi tegak hingga melewati sisir sesuai dengan ketebalan yang diinginkan.
Gel
dibiarkan
beberapa
saat
sampai
mengeras. Selanjutnya gel direndam dalam larutan buffer TAE 1×, kemudian dielektroforesis dengan voltase sebesar 100 V selama ± 30 menit. Setelah elektroforesis, gel direndam dalam etidium bromida selama 10 menit untuk mewarnai pita DNA yang terperangkap pada gel. Terakhir, pita
hasil
PCR
dapat
dilihat
dengan
alat
UV
transluminator. 3.
Purifikasi Produk PCR 16S rDNA Purifikasi
dilakukan
untuk
mendapatkan
DNA
murni hasil amplifikasi PCR 16S rDNA. Bahan yang digunakan yaitu High Pure PCR Product Purification Kit (Roche, Germany) yang terdiri dari tiga larutan yaitu, larutan 1 (binding buffer), larutan 2 (washing buffer) dan larutan 3 (elution buffer). Langkah
awal
dalam
proses
purifikasi
adalah
fragmen DNA target pada gel agarosa dipotong secara utuh menggunakan cutter tajam dan steril yang kemudian fragmen DNA tersebut ditampung dalam tabung ependorf 1,5 mL (berat tabung sudah ditera sebelumnya). Tabung ependorf ditimbang kembali untuk mendapatkan berat gel agarosa. Larutan 1 ditambahkan ke dalam tabung (setiap 15
100 mg gel agarosa ditambahkan 300 µL larutan 1) kemudian divortex selama 15-30 detik. Selanjutnya DNA diinkubasi dalam waterbath pada suhu 56oC selama 10 menit, namun setiap 3 menit sekali divortex. Setelah gel mencair, larutan ditambahkan isopropanol 150 µL pada setiap
100
mg
gel
agarosa.
Selanjutnya
larutan
dimasukkan dalam tabung filter yang telah dimasukkan dalam tabung receiver sebelumnya dan disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 30 detik. Penyaringan dilakukan sampai larutan hasil pengenceran gel agarosa habis. Tabung filter mempunyai matriks pengikat DNA yang akan menahan DNA target. Pelet yang tersaring dalam tabung filter diambil, ditambahkan 500 µL larutan 2, lalu disentrifugasi
pada
13.000
rpm
selama
1
menit.
Supernatan dibuang dan ditambahkan kembali dengan larutan 2 sebanyak 200 µL lalu divortex selama 1 menit. Supernatan dibuang, tabung filter dipindahkan ke dalam tabung ependorf steril yang baru. Sebanyak 50 µL larutan 3 dimasukkan ke dalam tabung filter dan disentrifugasi kembali pada 13.000 rpm selama 1 menit. Hasil purifikasi DNA (larutan yang tertampung dalam tabung) kemudian dielektroforesis menggunakan gel agarosa 1% untuk mengetahui hasil purifikasi.
16
Sekuensing Sekuensing
dilakukan
sekuensing menggunakan
menurut
Big
siklus
PCR
Dye Terminator v.3.1.
Formula untuk reaksi PCR sekuensing yaitu: 2 μL big dye, 2 μL buffer 10x, 4 μL templet DNA, 1 μL primer dengan konsentrasi 3,2 pmol, ddH2O hingga volume akhir 10 μL. Amplifikasi DNA dilakukan dengan pengkodisian alat (96°C selama 2 menit), selanjutnya sebanyak 25 siklus dengan
ketentuan denaturasi (96°C selama 10
detik); annealing (50°C selama 5 detik); dan extension (60°C selama 4 menit). Hasil PCR dipurifikasi dan disekuen
menggunakan
primer
5'TACGGYTACCTTGTTACGACTT3' 5'TACGGYTACCTTGTTACGACTT3'.
27F
dan
1492R
Sekuen
dianalisis
secara otomatis (ABI 3130XL, Applied Biosystem). Analisa Data BLAST Homologi Analisis
sekuen
DNA
isolat
bakteri
terbaik
dibandingkan dengan sekuen DNA pada basis data (data base) DNA. Penelusuran dilakukan menggunakan internet melalui
program
pelacakan
data
base
Basic
Local
Alignment Search Tool (BLAST) pada National Center for
17
Biotechnology Information, National Institute for Health, USA (www.ncbi.nlm.nih.gov) (Altschul dkk, 1997). Analisa Filogenetik Analisis
filogenetik
bakteri
dilakukan
dengan
membandingkan sekuen bakteri terdekat dengan sekuen 16S rDNA bakteri target pada data base Gen Bank. Analisis
BLAST
dilakukan
menggunakan
bakteri
pembanding sebagai out group. Sekuen diolah dengan program
ClustalX.
Program
ClustalX
diaktifkan
dan
ditentukan model Multiple Alignment Mode, kemudian ditekan File dan Load Sequences lalu dipilih data sekuen yang ada. Langkah selanjutnya ditekan Alignment dan dipilih Do Complete Alignment, kemudian ditekan tombol Align sehingga keluar ALN dan DND file. Tekan Trees dan ceck list exsclude Positions with Gaps kemudian dipilih Bootstrap N-J Tree dan tekan OK, sehingga keluar PHB file. Terakhir, dibuka program njplot dan pilih Full Tree pada bagian Operation dan Bootstrap values pada bagian Display. Buka file lalu Open dan pilih PHB file yang telah dibuat tadi. Setelah itu akan keluar pohon filogenik, langkah terakhir edit dan copy, lalu paste di program Microsoft Word (Isnansetyo dan Kamei, 2003).
18
Seleksi
β-karoten
dengan
Ekstraksi
dan
Spektroskopi UV-Tampak Sampel dalam kultur agar dikerok secara hati-hati kemudian dilarutkan kedalam aquades steril dan di presipitasi menggunakan refrigerated sentrifuge (4°C, 10.000 rpm, 10 menit). Pelet yang diperoleh kemudian ditimbang sebanyak 0.4210 g dan kadar air diukur menggunakan moisture balance (Shimadzu Kyoto) (kadar air 47,0%). Sampel yang sudah ditimbang kemudian dimasukan
ke
dalam
conical
bottom
tube
dan
ditambahkan 10 ml aseton 100%. Ekstraksi dilakukan menggunakan vortex (IKA Vortex) skala
6 selama 4
menit. Ekstraksi dilakukan dalam kondisi inert dalam atmosfer gas N2 (UHP grade) dan pencahayaan merah. Ekstraksi diulang sebanyak dua kali hingga pelet tidak berwarna. Ekstrak pigmen kemudian disaring dengan nylon filter (Whatman, 0.2 µm) kemudian dikeringkan menggunakan gas N2. Kemudian
seleksi
bakteri
dilanjutkan
dengan
mengamati spektrum ekstrak kasarnya yang dilarutkan dalam aseton menggunakan spektrofotometer ultraviolettampak berkas rangkap Varian Cary 50 pada panjang gelombang 300–800 nm. 19
Karakterisasi β-karoten dengan KCKT Untuk
analisa
karakterisasi
pigmen,
ekstrak
pigmen kering kemudian dilarutkan kembali dalam 0.5 mL aseton dan siap untuk diinjeksi dalam analisa KCKT. Metode KCKT yang digunakan mengacu pada metode Hegazi dkk. (1998). Data KCKT dan spektra serapan dari pengukuran β-karoten digambarkan dengan Program Origin Pro 8.1. Identifikasi β-karoten dengan UV-Tampak Isolasi β-karoten dilakukan dengan menampung pigmen murni saat puncaknya muncul di kromatogram analisa KCKT pada menit-menit terakhir (60,24 menit). Pigmen murni kemudian dikeringkan dengan gas N 2 dan dilarutkan ke dalam pelarut
aseton, etanol, dan n-
heksana dan diukur menggunakan spektrofotometer 1700 pada panjang gelombang 300-500 nm (Shimadzu, Kyoto). Kuantifikasi Kandungan β-karoten Metode menggunakan
kuantifikasi metode
analisa
dilakukan
dengan
multi-kromatogram
(Indrawati dkk., 2013) parameter luas puncak yang
20
dideteksi pada panjang gelombang 450 nm hingga 600 nm dengan rentang selisih 1 nm. Nilai rata-rata luas puncak kemudian di masukan dalam persamaan garis : Y = 0,0108X + 12.677 (Limantara dkk., 2013) Dimana : X = Luas puncak serapan Y = Konsentrasi (mikrogram/ml)
21
