II. METODOLOGI
C. BAHAN DAN ALAT Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah pati sagu (Metroxylon sp.) yang diperoleh dari industri pati sagu rakyat di daerah Cimahpar, Bogor. Khamir yang digunakan untuk proses fermentasi adalah kultur
Saccharomyces
cerevisiae
yang
diperoleh
dari
Laboratorium
Bioindustri, Departemen Teknologi Industri Pertanian, FATETA–IPB. Adapun bahan-bahan kimia yang digunakan antara lain aquades, HCl, H2SO4, dan NH4OH untuk proses hidrolisis secara asam; PDA (Potato Dextrose Agar) dan PDB (Potato Dextrose Broth) sebagai medium perkembangbiakan; serta pupuk NPK dan ZA sebagai sumber nutrient dalam fermentasi etanol; NaOH, pereaksi Luff Schoorl, KI, larutan tio, indikator kanji, indikator fenolftalein, pelarut etanol, aseton, glukosa standar, pereaksi fenol, pereaksi DNS, dan katalis yang digunakan untuk analisis bahan. Alat-alat yang digunakan diantaranya alat-alat gelas, kertas saring, timbangan, neraca analitik, termometer, pipet, buret, labu Soxhlet, piknometer, stirrer, jarum ose, bunsen, oven, pH meter, otoklaf, inkubator, inkubator goyang, penangas listrik, waterbath, tanur, destilator, desikator, clean bench, lemari pendingin, spektrofotometer serta alat-alat analisis bahan baku dan produk.
D. METODE PENELITIAN 1. Karakterisasi Pati Sagu Pada penelitian tahap pertama dilakukan karakterisasi pati sagu untuk menganalisis sifat-sifat fisik dan kimia pati sagu yang digunakan. Analisis yang dilakukan meliputi kadar air, kadar abu, kadar serat kasar, kadar lemak, kadar protein, dan kadar pati. Prosedur analisis karakteristik pati sagu dapat dilihat pada Lampiran 1.
20
2. Penelitian Pendahuluan Penelitian pendahuluan dilakukan untuk mendapatkan konsentrasi HCl dan H2SO4 terbaik dari empat taraf konsentrasi yang dicobakan, yaitu (0,5 N; 1 N; 2 N; dan 3 N) yang digunakan dalam proses hidrolisis secara asam. Konsentrasi terbaik dari kedua jenis asam tersebut ditentukan dengan melakukan analisis terhadap hidrolisat pati sagu yang dihasilkan. Analisis tersebut meliputi penentuan kadar gula pereduksi (GP) dan total gula (TG). Prosedur analisis dapat dilihat pada Lampiran 2. Konsentrasi asam yang dinilai terbaik adalah yang menghasilkan nilai GP dan TG tertinggi pada hidrolisat pati sagu. Konsentrasi asam terbaik yang dihasilkan dari penelitian pendahuluan tersebut kemudian digunakan untuk produksi hidrolisat pati sagu pada penelitian utama. 3. Penelitian Utama i.
Produksi Hidrolisat Pati Sagu Pada tahap ini, dilakukan hidrolisis pati sagu dengan metode hidrolisis secara asam . Metode hidrolisis asam yang digunakan adalah modifikasi metode hidrolisis asam oleh Rahayu (2006). Proses dilakukan dalam dua tahap, yaitu gelatinisasi dan hidrolisis. Gelatinisasi bertujuan untuk memecah granula pati sehingga asam lebih mudah mencapai molekul-molekul pati. Gelatinisasi dilakukan pada suhu 100 oC selama 10 menit, serta pada kondisi asam dengan kisaran pH 2. Tahap berikutnya yaitu hidrolisis, yang bertujuan untuk memecah (mengurai) pati ataupun karbohidrat kompleks menjadi komponen sederhana (monosakarida) agar dapat difermentasi. Hidrolisis dilakukan dengan menggunakan otoklaf pada suhu 121 oC selama
30
menggunakan
menit.
Tahapan
pati sagu
hidrolisis
dengan
ini
konsentrasi
dilakukan 16%.
dengan
Penetapan
konsentrasi ini berdasarkan penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Rahayu (2006) yang menyatakan bahwa hidrolisat pati sagu dengan nilai total gula dan nitrogen tertinggi yang dihasilkan melalui hidrolisis
21
asam diperoleh dengan menggunakan konsentrasi pati sagu 16%. Diagram alir proses hidrolisis parsial pati sagu secara asam dapat dilihat pada Gambar 4.
Pati Sagu
Larutan Asam
Pembuatan Suspensi Pati
(HCl atau H2SO4)
16 % (b/b)
Gelatinisasi (T = 100 oC, t = 10 menit)
Hidrolisis (T = 121 oC, t = 30 menit)
NH4OH 3N
Netralisasi pH (pH = 4,5 - 5)
Karbon aktif
Purifikasi
(2% bk. pati)
(T = 80 oC t = 1 jam)
Penyaringan
Hidrolisat Pati Sagu Gambar 4. Diagram Alir Proses Hidrolisis Pati Sagu
22
Katalis asam yang dicobakan dalam penelitian ini adalah asam klorida (HCl) dan asam sulfat (H2SO4) dengan konsentrasi terbaik yang ditentukan dari hasil penelitian pendahuluan. Basa penetral yang digunakan adalah NH4OH. Penggunaan NH4OH sebagai basa penetral bertujuan untuk mendapatkan garam amonium klorida (NH4Cl) dan amonium sulfat ((NH4)2SO4) pada hidrolisat pati sagu yang dihasilkan yang kemudian dimanfaatkan sebagai sumber nitrogen. Untuk mendapatkan hidrolisat pati yang jernih, terlebih dahulu dilakukan proses pemucatan (purifikasi). Menurut Ciptadi dan Machfud (1980), proses pemucatan dilakukan pada suhu 60–70 oC dengan penambahan arang aktif sebanyak 2% dari berat tepung dan proses berlangsung selama satu jam. Hidrolisat pati yang dihasilkan tersebut selanjutnya digunakan sebagai medium bagi pertumbuhan Saccharomyces cerevisiae untuk produksi etanol. Analisis yang dilakukan terhadap hidrolisat pati sagu yang dihasilkan meliputi pengukuran nilai pH, nilai kadar gula total, kadar gula pereduksi, derajat polimerisasi (DP) dan ekivalen dekstrosa (Dextrose Equivalent/DE), serta nilai kadar nitrogen total. Analisis total gula ditetapkan berdasarkan metode fenol sulfat (AOAC, 1995), sedangkan analisis gula pereduksi ditetapkan menggunakan metode DNS (Apriyantono et al., 1989). Prosedur analisis hidrolisat pati sagu tersebut dapat dilihat pada Lampiran 2. ii.
Produksi Etanol 1. Penyegaran Kultur Khamir Sebelum proses fermentasi dilakukan, terlebih dahulu dilakukan penyegaran (regenerasi) kultur khamir pada medium padat PDA (Potato Dextrose Agar). Kultur murni Saccharomyces cerevisiae dibiakkan pada agar miring PDA selama 48 jam dalam inkubator dengan suhu 30 oC dan kondisi aerobik.
23
Pembuatan Inokulum Kultur khamir yang telah disegarkan tersebut selanjutnya dibiakkan pada medium cair PDB (Potato Dextrose Broth) sebelum digunakan untuk fermentasi hidrolisat pati sagu menjadi etanol. Sebanyak 10 ml medium cair PDB disterilisasi terlebih dahulu, kemudian + 3 jarum Ose hasil biakan khamir yang telah disegarkan
sebelumnya
diinokulasikan
secara
aseptis
dan
ditumbuhkan secara aerobik selama 24 jam menggunakan inkubator goyang pada suhu sekitar 30 oC atau suhu kamar. Hasil biakan pada PDB ini kemudian digunakan sebagai inokulum untuk fermentasi utama. Fermentasi Etanol Pada tahap ini, dilakukan proses fermentasi dengan menggunakan tiga jenis substrat yang masing-masing terdiri dari tiga kali ulangan, yaitu : A (substrat sirup glukosa teknis 10%,), B (substrat hidrolisat H2SO4 10%), dan C (substrat hidrolisat HCl 10%). Substrat sirup glukosa teknis 10% bertindak sebagai kontrol. Sirup tersebut diperoleh dengan cara melarutkan 10% glukosa teknis dalam air akuades. Metode fermentasi etanol yang digunakan merupakan modifikasi dari metode penelitian sebelumnya yang dilakukan Rinaldy (1987). Fermentasi utama dilakukan pada labu Erlenmeyer 300 ml. Substrat fermentasi yaitu hidrolisat pati sagu dan larutan glukosa teknis sebanyak 200 ml dengan total gula 10% dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer. Kemudian pada substrat larutan glukosa ditambahkan pupuk NPK dan ZA masing-masing sebanyak 0,08 g dan 0,3 g. Ketiga substrat tersebut kemudian diatur pHnya sehingga konstan pada kondisi pH 4,8. Kemudian dipasteurisasi pada suhu 85 oC selama 5 menit dan didinginkan hingga suhu + 30
o
C. Setelah itu ditambahkan inokulum
Saccharomyces cerevisiae hasil biakan dari PDB sebanyak 10% dari volume substrat. Fermentasi berlangsung pada suhu kamar
24
selama 3 hari dengan menggunakan inkubator goyang. Fermentasi berlangsung pada kondisi anaerob. Diagram alir proses produksi etanol dari hidrolisat pati sagu dapat dilihat pada Gambar 5.
Hidrolisat Pati Sagu / Sirup Glukosa Teknis (10%)
Penambahan Nutrien / Pupuk (0,04 g NPK dan 0,15 g ZA pada 100 ml substrat)
Kultur Khamir
Pengaturan pH (pH = 4,8)
Inkubasi pada PDA
Pasteurisasi
(Aerobik, t = 48 jam, suhu ruang)
(T = 85 oC, t = 5 menit)
Inokulasi pada PDB (Aerobik, t = 24 jam, suhu ruang)
Inokulum Saccharomyces cerevisiae (10% v/v)
Inokulasi (Inokulum = 10% dari volume substrat)
Fermentasi (Anaerobik, t = 3 hari, suhu ruang)
Pasteurisasi (T = 65 oC, t = 30 menit)
Etanol
Gambar 5. Diagram Alir Proses Produksi Etanol
25
Pipa plastik dipasang pada ujung leher angsa yang terhubung dengan labu erlenmeyer dan ditutup dengan sumbat. Ujung pipa plastik tersebut kemudian dihubungkan sedemikian rupa dengan gelas ukur yang dibenamkan ke dalam air. Gas CO2 yang dihasilkan dari proses fermentasi akan menekan air dalam gelas ukur sehingga dapat dibaca dengan skala yang terdapat pada gelas ukur tersebut. Skema peralatan pengukuran laju pembentukan gas CO2 dapat dilihat pada Gambar 6. H2SO4 pekat
Shaker
Gambar 6. Skema peralatan pengukuran laju pembentukan gas CO2 Laju pembentukan gas CO2 selama fermentasi diukur dengan menggunakan grafik hubungan antara jumlah gas CO2 yang terukur dengan waktu pengukuran. Pengukuran dilakukan setiap 6 jam, mulai dari jam ke-0, ke-6, ke-12, ke-18, ke-24, ke-30, ke-36, ke-42, ke-48, ke-54, ke-60, ke-66, dan ke-72. Selain pengukuran terhadap laju pembentukan gas CO2, juga dilakukan analisis terhadap produk etanol yang dihasilkan. Analisis tersebut meliputi pengukuran pH, total asam, penentuan biomassa, efisiensi pemanfaatan substrat dan kadar etanol. Penentuan kadar etanol dilakukan dengan metode piknometer dan GC (Gas Chromatography). Prosedur analisis cairan fermentasi secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 3.
26
