IDENTIFIKASI KARAKTER UNGGULAN DAN INTROGRESI DNA TURUNAN IR64-GAJAH MUNGKUR
IHSAN MENTAYA PUTRA
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Identifikasi Karakter Unggulan dan Introgresi DNA Turunan IR64-Gajah Mungkur adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Mei 2013 Ihsan Mentaya Putra NIM G840080064
ABSTRAK IHSAN MENTAYA PUTRA. Identifikasi Karakter Unggulan dan Introgresi DNA Turunan IR64-Gajah Mungkur. Dibimbing oleh DJAROT SASONGKO HAMI SENO dan KURNIAWAN RUDI TRIJATMIKO. Pertumbuhan jumlah penduduk yang terus berkembang membuat lahan pertanian mulai berkurang sehingga diperlukan varietas padi yang mampu meningkatkan hasil produksi padi. Salah satu alternatif dengan pemuliaan tanaman padi dengan bantuan teknologi marka molekuler. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari korelasi introgresi dengan perubahan karakter, serta untuk strategi pengembangan varietas unggul baru. Padi Bio-148 yang digunakan merupakan padi hasil persilangan IR64-Gajah Mungkur. Karakterisasi Padi Bio148 yang diamati dan diukur ialah tinggi tanaman, umur berbunga, jumlah malai per tanaman, jumlah biji per malai, jumlah cabang primer dan sekunder, bobot 1000 butir dibandingkan dengan kedua tetuanya. Marka molekuler yang digunakan adalah marka SSR (mikrosatelit) dengan 57 primer yang terletak pada kromosom 1 sampai 12. Hasil penelitian jumlah cabang primer, sekunder, jumlah gabah isi, dan hampa padi Bio-148 lebih unggul dari IR64 dan Gajah Mungkur. Hasil survei molekuler menggunakan gel akrilamid menghasilkan fragmen berukuran 100-200 pb. Hasil analisis molekuler menunjukkan bahwa terdapat introgresi beberapa segmen kromosom Gajah Mungkur yang bertanggung jawab terhadap karakter unggul padi Bio-148 seperti, jumlah gabah, bobot gabah, gabah isi, dan jumlah malai terletak pada kromosom 5,7, dan 10 padi Bio-148. Kata kunci: karakter unggul, padi, pemuliaan tanaman, SSR. ABSTRACT IHSAN MENTAYA PUTRA. Superior Character Identification and DNA Introgressed Derivatives IR64-Gajah Mungkur. Supervised by DJAROT SASONGKO HAMI SENO and KURNIAWAN RUDI TRIJATMIKO. The growth of a population that is constantly evolving to make farmland diminished so needed rice varieties which are able to increase the yield of rice. One alternative to breeding rice plants with the help of molecular markers technology. The objective of this study was find correlation between introgressed and character, then strategy of new superior varieties development. Bio-148 rice that used as result of cross IR64 rice-Gajah Mungkur. Characterization of Rice Bio- 148 was observed and measured plant height, days to flowering, number of panicles per plant, number of grains per panicle, number of primary and secondary branches, 1000 grain weight compared with both parent. Molecular markers used were SSR markers (microsatellites) with 57 primer located on chromosome 1 to 12. Results showed number of primary and secondary branches and number of grains. Molecular survey results using acrylamide gel fragment size of 100-200 bp. Molecular analysis of the results showed that there were introgressed chromosome segments Gajah Mungkur responsible for the superior character of Bio-148 i.e. grain number, grain weight, filled grains, and the number of panicles located on chromosome 5,7, and 10 Bio-148 rice. Keywords : Plant breeding, rice, SSR, superior character.
IDENTIFIKASI KARAKTER UNGGULAN DAN INTROGRESI DNA TURUNAN IR64-GAJAH MUNGKUR
IHSAN MENTAYA PUTRA
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
ii
Judul Skripsi : Identifikasi Karakter Unggulan dan Introgresi DNA Turunan IR64-Gajah Mungkur Nama : Ihsan Mentaya Putra NIM : G84080064
Disetujui oleh
Dr Djarot Sasongko Hami Seno, MSc Pembimbing I
Dr Kurniawan Rudi Trijatmiko Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MSc App Ketua Departemen Biokimia
Tanggal Lulus:
PRAKATA Untaian rasa syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT karena atas segala nikmat dan karunia-Nya penulisan penelitian yang berjudul “Identifikasi Karakter Unggulan dan Introgresi DNA Turunan IR 64-Gajah Mungkur” dapat diselesaikan. Kegiatan penelitian ini dilaksanakan sejak bulan Agustus 2012 bertempat di Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetika Pertanian (BB Biogen), Kampus Penelitian Pertanian Cimanggu, Bogor. Penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu penyusunan usulan penelitian ini antara lain Dr Djarot Sasongko Hami Seno, MSc dan Dr Kurniawan Rudi Trijatmiko selaku pembimbing skripsi. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu penyusunan penelitian ini. Penulis menyadari tentang kekurangan dalam penulisan penelitian ini, oleh karena itu penulis mengharapkan saran dan kritik yang dapat membuat penulisan berikutnya lebih baik. Akhir kata, penulis berharap tulisan ini dapat berguna bagi penulis sendiri maupun semua pihak demi kemajuan ilmu pengetahuan. Bogor, Mei 2013 Ihsan Mentaya Putra
DAFTAR ISI DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN PENDAHULUAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Bahan Alat Prosedur Percobaan HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Karakter Unggulan Isolasi DNA Amplifikasi DNA Padi Analisis Introgresi Pembahasan Karakter Unggulan Isolasi DNA Padi Amplifikasi DNA Padi Analisis Introgresi SIMPULAN DAN SARAN DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN
vi vi vi 1 2 2 2 2 3 4 4 4 6 6 7 8 8 10 10 11 12 12 14
DAFTAR TABEL 1 Karakter unggul padi 2 Rata-rata hasil pengamatan varietas padi 3 Koefisien korelasi Pearson lima komponen hasil 4 Konsentrasi dan kemurnian DNA 5 Jumlah introgresi kromosom Gajah Mungkur terhadap galur Bio-148
5 5 6 6 8
DAFTAR GAMBAR 1 Malai tanaman padi 2 Elektroforegram akrilamid menggunakan primer SSR kelompok 1-9 3 Elektroforegram akrilamid menggunakan primer SSR kelompok 10-22 4 Elektroforegram akrilamid menggunakan primer SSR kelompok 23-43 5 Posisi introgresi DNA Gajah Mungkur pada kromosom Bio-148
5 6 7 7 8
DAFTAR LAMPIRAN 1 Diagram alur penelitian 2 Primer SSR 3 Analisis statistik dengan sidik ragam (ANOVA) 4 Analisis statistik dengan uji Duncan 5 Reagen
14 15 17 19 20
PENDAHULUAN Pesatnya peningkatan populasi penduduk dan semakin berkurangnya lahan pertanian dapat menimbulkan kesulitan pangan di masa mendatang. Indonesia dengan jumlah penduduk 237.641.326 jiwa pada tahun 2010 dengan rata-rata pertumbuhan penduduk 1,49% per tahun dan luas areal panen 11,8 juta hektar dengan konsumsi per kapita rata-rata 113,48 kg per tahun dihadapkan ancaman bagi ketahanan pangan (BPS 2012). Konstribusi padi yang telah ada terhadap produksi padi nasional masih relatif rendah, sehingga pengembangannya masih terus diupayakan. Rendahnya produktivitas padi gogo disebabkan oleh kondisi iklim dan tanah yang bervariasi, penerapan teknologi budidaya yang belum optimal terutama dalam penggunaan varietas unggul. Target program ketahanan pangan adalah meningkatkan produksi padi sehingga dicapai swadaya nasional, diantaranya melalui pengembangan tanaman padi produktif. Intensifikasi kegiatan pemuliaan tanaman dapat dilakukan melalui perakitan varietas unggul baru yang berdaya hasil tinggi, berkualitas, serta resisten terhadap kendala biotik dan abiotik. Varietas unggul memberikan manfaat teknis dan ekonomis yang banyak bagi perkembangan pertanian, diantaranya pertumbuhan tanaman menjadi seragam sehingga panen serempak, rendemen lebih tinggi, mutu hasil lebih tinggi dan sesuai dengan selera konsumen, dan tanaman akan mempunyai ketahanan yang tinggi terhadap hama dan penyakit, serta adaptasi yang tinggi terhadap lingkungan sehingga dapat memperkecil penggunaan pupuk dan pestisida. (Shivanna & Sawhney 1997). Penelitian dan perakitan padi tipe baru di Indonesia telah dimulai sejak tahun 1995. Pada tahun 2001 program penelitian padi tipe baru menjadi program baru Balai Besar Penelitian Tanaman Padi. Pada tahun 2005 telah dihasilkan lebih dari 4000 kombinasi persilangan padi tipe baru, empat varietas unggul yaitu Cimelati, Ciapus, Gilirang, dan Fatmawati. Tiga varietas pertama adalah varietas unggul semi tipe baru (VUSTB), sedangkan Fatmawati adalah varietas unggul tipe baru (VUTB) perdana (Abdullah et al. 2005). Perakitan padi tipe baru dengan bantuan teknologi molekular terbukti dapat membantu introgresi gen ke dalam tanaman budidaya. Persilangan silang balik ( backcross ) dipandang sebagai teknik persilangan yang dapat diterapkan untuk mentransfer satu atau beberapa gen yang diinginkan dari tanaman donor ke tanaman penerima. Namun demikian diperlukan persilangan silang balik beberapa kali agar diperoleh introgresi yang diinginkan dan seminimal mungkin membawa introgresi negatif ( linkage drag ) fragmen liar yang tidak diinginkan (ReyesValdes 2000). Hasil penelitian Utami (2004) mengenai seleksi introgresi genotip tahan pathogen blas dari Oryza rufipogon ke dalam IR64 menyatakan Analisis introgresi pada galur populasi BC2F3 dari persilangan IR 64 dengan O. rufipogon menunjukkan adanya introgresi fragmen dari tanaman donor O. rufipogon yang bervariasi dari 9%–40% dari total kromosom yang terpetakan. Persilangan konvensional yang dipandu dengan analisis molekuler. Analisis digunakan untuk mempermudah pekerjaan sampai pada tahap molekuler serta menganalisis genom tanaman padi. Padi IR64 dipilih karena digunakan oleh banyak petani dan memiliki karakter unggul seperti anakan yang banyak, tahan wereng serta mempunyai daya adaptasi. Padi Gajah Mungkur memiliki karakter unggul bobot gabah yang besar dan toleran terhadap kekeringan (summited
2
Trijatmiko et al.). Hasil persilangan kedua tetua tersebut yang teramati pada penelitian sebelumnya, mengindikasikan adanya turunan (Bio-148) dengan karakter unggulan dari kedua tetua. Tujuan penelitian ini untuk mengidentifikasi karakter galur Bio-148 dibandingkan tetua IR64 dan Gajah Mungkur, serta mendeteksi introgresi kromosom dari donor Gajah Mungkur ke IR64. Hipotesis adalah introgresi beberapa segmen kromosom dari Gajah Mungkur pada galur Bio-148 yang diduga mempengaruhi karakter unggul padi. Potensi hasil galur Bio-148 yang lebih tinggi dari IR64 seperti jumlah gabah isi per malai, berat 1000 gabah isi, dan jumlah malai per tanaman. Informasi tersebut akan bermanfaat untuk mempelajari korelasi introgresi dengan perubahan karakter, serta untuk srategi pengembangan varietas unggul baru.
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Agustus-Desember 2012. Tempat penelitian di Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetika Pertanian (BB Biogen), Penelitian Pertanian Cimanggu, Jl. Tentara Pelajar No.3A, Bogor.
Bahan Bahan-bahan yang digunakan pada isolasi DNA meliputi daun padi (IR64, Gajah Mungkur, Bio-148), natrium bisulfit, bufer ekstraksi (10 mL Tris-HCl pH 8 M, 10 mL EDTA 0.5 M, 12.5 mL NaCl 4 M, 67.5 mL akuades), nitrogen cair, 20% SDS, natrium asetat, kalium asetat, isopropanol dingin, etanol 70%, bufer TE (Tris-EDTA), RNAse, 0.5 M NaOH. Bahan-bahan yang digunakan untuk PCR adalah bufer PCR, MgCl 25 mM, dNTP set 1 mM, primer SSR Padi 10 mM, Taq polymerase (5 U/µL), DNA (IR64, Gajah Mungkur, Bio-148) hasil isolasi 25 ng/µL, dan akuades steril. Bahan-bahan yang digunakan untuk elektroforesis yaitu loading dye, bufer TBE (Tris Boric EDTA) 1x, akrilamid 8%, APS (ammonium persulfat), TEMED (N,N,N’,N’-tetrametil etilenediamin), DNA marker, DNA hasil isolasi atau hasil PCR, etidium bromida, dan akuades. Alat Alat- alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca analitik, shaker, tissue lyser, cawan Petri, stirrer, gelas ukur 500 mL, labu Erlenmeyer 250 mL, oven, vortex, gelas piala, tabung Eppendorf (0.2 mL, 1.5 mL, dan 2 mL), grinding balls, pipet mikro, dan mesin sentrifus. Selain itu, digunakan pula elektroforesis, UV illuminator Chemidoc EQ Biorad, nanodrop (spektrofotometer), gel doc, dan mesin PCR Thermal Cycle.
3
Prosedur Percobaan Karakterisasi Komponen Unggulan Penumbuhan padi dilakukan secara bertahap. Padi disemai dalam cawan Petri yang telah dialasi kertas saring. Penyiraman dilakukan setiap hari untuk menghindari kekeringan. Penyemaian dalam cawan Petri dilakukan selama 10 hari. Padi yang sudah cukup tinggi dipindahkan ke dalam ember dan disimpan di rumah kaca. Padi yang ditanam adalah padi IR 64, Gajah Mungkur, dan Bio-148 dengan masing-masing tiga ulangan (Trijatmiko 2011). Parameter yang diamati dan diukur adalah tinggi tanaman, umur berbunga, jumlah malai per tanaman, jumlah biji per malai, jumlah cabang primer dan sekunder, bobot 1000 butir. Tinggi tanaman diukur dari permukaan tanah sampai ujung daun tertinggi. Hasil pengamatan diuji menggunakan analisis ragam dengan software statistik SAS 7. Isolasi DNA Padi Isolasi DNA padi menggunakan modifikasi Dellaporta et al. (1983) Sebanyak 0.1 gram daun padi potongan kecil (IR64, Gajah Mungkur, dan Bio148) dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1.5 mL yang berisi satu grinding ball, kemudian penggerusan menggunakan alat tissue lyser hingga menjadi serbuk dan disiram dengan nitrogen cair. Sebanyak 1000 µL bufer ekstraksi dan 68 µL SDS 20%, dipipet kedalam tabung yang berisi sampel, diinkubasi selama 15 menit pada suhu 65oC di dalam penangas air dan setiap 2 menit tabung dibolak-balikan agar tercampur dengan rata. Ditambahkan kalium asetat 5 M dipipet sebanyak 334 µL, dibolak-balik kembali hingga tercampur dengan rata, kemudian diinkubasi selama 1 jam di dalam es. Tabung-tabung disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 12000 rpm, sebanyak 800 µL supernatan dipindahkan ke dalam tabung 1.5 mL baru. Ditambahkan 600 µL isopropanol tabung dibolak-balik hingga tercampur rata kemudian diinkubasi selama 30 menit dalam freezer (-20oC). Selanjutnya disentrifugasi selama 10 menit pada 12000 rpm. Supernatan dibuang, disentrifugasi kembali 30 detik, 12000 rpm. Sisa supernatan dipipet menggunakan pipet mikro. Tabung yang berisi pelet di oven 10 menit, 65oC. Ditambahkan 200 µL ddH2O dan 2 µL RNAse, diinkubasi dalam penangas air 65oC, 30 menit sambil tabung dibolak-balik setiap 10 menit. Selanjutnya disentrifugasi 10 menit, 12000 rpm. Supernatan dipindahkan kedalam tabung baru dengan ukuran 1.5 mL. Ditambahkan 25 µL natrium asetat 3 M dan 150 µL isopropanol dingin, dikocok dan diinkubasi -20oC, 30 menit. Sampel di sentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm, 5 menit dan supernatan dibuang. Pelet yang diperoleh dicuci dengan 500 µL etanol 70%. Campuran disentrifugasi kembali 10 menit, 12000 rpm. Kemudian disentrifugasi kembali pada 12000 rpm, 30 detik. Pelet yang diperoleh dikeringkan dalam oven 65oC, 10 menit. Pelet yang telah kering dilarutkan kembali dengan buffer pada saat akan dianalisi lebih lanjut.
4
Uji Kuantitas DNA Genomik dengan Nanodrop Alat diatur untuk pengukuran konsentrasi DNA (Thermo Fisher Scientific 2009). Larutan bufer TE digunakan sebagai blanko. Sebanyak 2 µL larutan TE dimasukkan ke dalam lubang ukur. Setelah itu, nanodrop ditutup kemudian tombol read blank pada komputer ditekan. Setelah sisa buffer TE dibersihkan dengan tissue, 2 µL dimasukkan ke dalam lubang ukur, kemudian dipilih menu read sample. Hasil pengukuran berupa nilai kemurnian sampel akan muncul dalam satuan konsentrasi ng/µL. Amplifikasi DNA dengan PCR mikrosatelit (SSR) Amplifikasi DNA menggunakan metode Praetiyono (2010). Sebanyak 20 µL yang terdiri atas 15 µL larutan cocktail (1.8 µL buffer, 0.2 µL MgCl2 25 mM, 2 µL dNTP mix 1 mM, 2 µL enzim DNA taq polimerase 5 U/µL, dan 9 µL akuabides); 3 µL primer forward dan reverse, dan 2 µL DNA (25 ng/µL) diamplifikasi PCR dengan marka SSR_PD dengan kondisi amplifikasi: pra denaturasi (94oC, 5 menit), denaturasi (94oC, 30 detik), annealing (55oC, 30 detik), elongasi (72oC, 45 detik); siklus 35x dan pasca amplifikasi (72oC, 7 menit). Elektroforesis Hasil PCR Pembuatan gel akrilamid dilakukan dengan cara mencampurkan 60 mL larutan akrilamid 8%, 600 µL APS, dan 60 µL TEMED. Campuran larutan tersebut dituangkan ke dalam cetakan kaca yang telah dirangkai menggunakan klip. Sebanyak 3 µL loading dye ditambahkan pada hasil amplifikasi DNA, lalu dimasukkan ke dalam sumur gel. Elektroforesis dilakukan dengan daya 85 watt selama 100 menit. Gel akrilamid diwarnai dengan larutan etidium bromida (20 mg/L) selama 8 menit, kemudian dihilangkan pewarnaannya dengan air selama 16 menit. Pita-pita DNA divisualisasikan dengan chemidoc gel system (BIORAD) (Sambrook 2001).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Karakter Unggulan Hasil karakter unggul yang teramati pada Bio-148, IR64 dan Gajah Mungkur adalah tinggi tanaman, umur berbunga, jumlah malai per tanaman, jumlah biji per malai, bobot 1000 butir disajikan pada Tabel 1. Padi Bio-148 memiliki tinggi tanaman diantara kedua tetuanya, yaitu IR64 dan Gajah Mungkur. Hal serupa teramati pada bobot 1000 butir dan jumlah malai per tanaman. Umur berbunga, bobot gabah isi dan jumlah gabah per malai Bio-148 lebih besar dibandingkan kedua tetuanya.
5
Tabel 1 Karakter unggul padi Varietas
Bobot (g) 1000 Gabah butir isi
Jumlah Malai per Gabah tanaman per malai
Ulangan
Tinggi tanaman (cm)
Umur berbunga (hari)
1
122
56
35.5
56.9
14
143.2
2
130
56
35.9
41.4
10
135.5
3
117
57
34.7
36.7
10
151.4
1
107.5
60
19.4
108
54
178.6
2
101
62
20.8
78.3
47
137.6
3
103
63
19.1
100.6
50
166.8
1
117.5
64
21.7
103.2
36
225
2
105.5
65
23.9
99.4
43
171.5
3
107.5
67
23.3
85.8
30
258.9
GM
IR64
Bio-148
Hasil pengamatan komponen hasil pada Bio-148, IR64 dan Gajah Mungkur yang ditunjukkan pada Tabel 2. Panjang malai dan bobot 1000 butir Bio-148 diantara Gajah Mungkur dan IR64, sedangkan jumlah cabang primer, sekunder, jumlah gabah isi, dan hampa Bio 148 lebih besar dibandingkan Gajah Mungkur dan IR64. Tabel 2 Rata-rata hasil pengamatan varietas padi Varietas Panjang malai (cm) GM IR64 Bio-148
Bobot 1000 butir (g)
Jumlah Cabang primer Sekunder
Jumlah Gabah Isi Hampa
25.76a
35.37c
9.50b
25.47a
111.94a
26.23a
24.70b
19.75a
8.69a
23.07a
95.75b
23.96a
b
22.98 25.60a 10.68c 36.49b 117.42a 66.20b Keterangan: Angka-angka pada kolom yang diikuti huruf yang sama, menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf beda nyata 5% uji Duncan a
IR64
Bio-148
Gajah Mungkur
Gambar 1 Malai tanaman padi Hasil analisis koefisien korelasi Pearson pada komponen hasil disajikan pada Tabel 3. Panjang malai berkolerasi positif terhadap jumlah cabang primer, jumlah cabang sekunder, gabah isi, dan gabah hampa.
6
Tabel 3 Koefisien korelasi Pearson lima komponen hasil Komponen Hasil P. Malai J. C. Primer J. C. Sekunder J. G. Isi J. G. Hampa
Jumlah Cabang Primer
Panjang Malai
Jumlah Cabang Sekunder
Jumlah Gabah Hampa
Jumlah Gabah Isi
1 0.622**
1
0.688**
0.895**
1
0.743**
0.714**
0.818**
1
0.18** 0.636** 0.62** *berbeda nyata pada taraf 5%, **berbeda nyata pada taraf 1%
0.123*
1
Isolasi DNA Hasil pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA pada Bio-148, IR64 dan Gajah Mungkur ditunjukkan pad Tabel 4. Konsentrasi hasil isolasi Bio-148 memiliki nilai yang terendah dibandingkan varietas lainnya, akan tetapi memiliki kemurnian yang sama dengan IR64 dan lebih tinggi dibanding Gajah Mungkur. Hal ini cukup baik bagi ketiga sampel karena berada pada kisaran 1.8 sampai 2 yang berarti bebas dari kontaminan protein maupun RNA. Tabel 4 Konsentrasi dan kemurnian DNA Varietas
Konsentrasi (ng/µL)
GM IR64 Bio-148
A260/280 1.8 1.9 1.9
261.3 385.6 95.3
Amplifikasi DNA Padi Hasil elektroforesis amplikon 16 primer kromosom 1-3 (Gambar 2) menunjukkan 9 primer (RM 5, 104, 233A, 240, 262, 263, 132, 156, 186) yang memberikan pola yang sama dengan Bio-148 maupun IR64.
5 3
6
4
8 9
1 7 2
M
Gambar 2 Elektroforegram akrilamid hasil PCR menggunakan primer SSR M=marker, 1-9 menunjukkan amplikon dengan marka RM 5, 104, 233A, 240, 262, 263, 132, 156, 186. Masing-masing no. terdiri atas 3 sampel dengan urutan IR64, Bio-148, dan Gajah Mungkur.
7
Sedangkan penggunaan 16 primer kromosom 4-7 (Gambar 3) menunjukkan 13 primer yang memberikan pola amplikon DNA.
13
17
18
15 10
19
11 12
20
16
14
21 22
M
Gambar 3 Elektroforegram akrilamid hasil PCR menggunakan primer SSR M=marker, 10-22 menunjukkan amplikon dengan marka RM 255, 13, 31, 153, 159, 161, 178, 188, 162, 118, 125, 172, 214. Masing-masing no. terdiri atas 3 sampel dengan urutan IR64, Bio-148, dan Gajah Mungkur. Hasil elektroforesis amplikon 21 primer kromosom 8-12 (Gambar 4) menunjukan 12 primer yang memberikan pola amplikon DNA.
29 23
24
25
26
28 27
40 30
35 36 34
31 32
37
38
42 39
43
41
33
Gambar 4 Elektroforegram akrilamid hasil PCR menggunakan primer SSR M=marker, 23-43 menunjukkan amplikon dengan marka RM 72, 152, 210, 230, 264, 105, 201, 215, 242, 147, 171, 222, 244, 21R, 167, 209, 254, 4A, 20A, 179, 247. Masing-masing no. terdiri atas 3 sampel dengan urutan IR64, Bio-148, dan Gajah Mungkur. Analisis Introgresi Hasil pengamatan jumlah introgresi kromosom DNA Gajah Mungkur terhadap galur Bio-148 disajikan pada Tabel 5. Gambar 5 menunjukkam hasil analisis SSR introgresi segmen kromosom Gajah Mungkur pada Bio-148 (100-
8
200 pb) pada kelompok no. 11 (RM 13), no. 13 (RM 153) kromosom 5; no. 21 (RM 172) pada kromosom 7, dan no. 34 (RM 222) pada kromosom 10.
Gambar 5 Posisi introgresi DNA Gajah Mungkur pada kromosom Bio-148 Tabel 5 Jumlah introgresi kromosom Gajah Mungkur terhadap galur Bio-148 Kromosom 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Total
Jumlah marka SSR 2 5 8 2 8 2 6 7 5 4 4 4 57
Jumlah marka mengkuti GM 0 0 0 0 2 0 1 0 0 1 0 0 4
Persentase (%) 0 0 0 0 25 0 16.67 0 0 25 0 0 7.02
Pembahasan Karakter Unggulan Tinggi tanaman merupakan faktor penting yang mempengaruhi tingkat kepadatan daun dan kemampuan untuk fotosintesis untuk menghasilkan asimilat. Karakter tinggi tanaman untuk menjadi tanaman ideal dengan potensi hasil tinggi adalah sekitar 100 cm (Peng et al. 2008). Pengamatan tinggi tanaman pada penelitian ini dilakukan 12 minggu setelah masa tanam. Tinggi tanaman diukur dari permukaan tanah sampai ujung daun tertinggi. Hasil pengamatan Bio-148
9
memiliki tinggi rata-rata (110.2 cm) diantara IR64 (103.8 cm) dan Gajah Mungkur (123 cm). Hasil pengamatan tidak dilakukan analisis ragam karena hanya membandingkan tinggi tetua dengan turunan. Berdasarkan tinggi tanaman, Bio148 potensial sebagai padi unggul. Hasil penelitian ini menunjukkan tinggi tanaman yang didapatkan lebih tinggi dibandingkan galur Fatmawati/Way Rarem (106.3 cm) (Herawati 2009). Peralihan antara fase vegetatif menuju fase generatif ditunjukan dengan mulai berbunganya tanaman padi. Apabila 50% dari tanaman dalam satu hamparan bunganya telah keluar, maka pertanaman tersebut dianggap sudah memasuki fase pembungaan (Manurung dan Ismunadji 1988). Hasil pengamatan menunjukkan bahwa umur berbunga padi Bio-148 (65 hari) diantara varietas Gajah Mungkur (56 hari) dengan IR64 (62 hari) (Tabel 1). Secara statistik Hasil pengamatan tidak dilakukan analisis ragam karena hanya membandingkan umur berbunga tetua dengan turunan. Perbedaan pembungaan merupakan sifat agronomi yang dipengaruhi oleh faktor genetik dan fisiologi. Oleh sebab itu diduga terjadi akumulasi alel-alel dari kedua tetua pada individu (Trijatmiko 2001). Hasil penelitian ini menunjukkan umur berbunga padi yang digunakan lebih kecil dibandingkan galur Way Rarem (90 hari) dan Fatmawati (104 hari) (Herawati 2009). Untuk tipe tanaman ideal, bobot 1000 butir berkisar antara 28-30 g (Ma et al. 2006). Hasil penelitian ini (Tabel 1) menunjukkan, walaupun bobot Bio-148 (23 g) sudah lebih besar dari tetua IR64 (19.8 g) tetapi masih lebih kecil dari tetua Gajah Mungkur (35.4 g). Selain itu masih lebih kecil dari bobot ideal. Namun demikian, hasil ini relatif lebih baik dibandingkan hasil persilangan Fatmawati/SGJT-28 (17 g) (Herawati 2009). Analisis statistik (Tabel 2) menunjukkan bobot ke 3 sampel pada penelitian ini berbeda nyata. Jumlah malai per tanaman merupakan salah satu karakter yang terkait dengan hasil gabah (Rahmawati 2006). Varietas unggul baru (VUB) umumnya memiliki jumlah malai >20 per rumpun (LITBANG 2006). Jumlah malai per tanaman padi Bio-148 (36) didapatkan diantara IR64 (50) Gajah Mungkur (11) (Lampiran 2). Analisis statistik jumlah malai per tanaman tidak dilakukan karena hanya membandingkan jumlah malai tetua dengan turunan. Jumlah malai Bio-148 yang diperoleh ini masih lebih kecil dibandingkan hasil persilangan Fatmawati/Way Rarem (8) (Herawati 2009), namun sudah lebih besar umumnya VUB (LITBANG 2006) sehingga cukup potensial sebagai VUB. Tanaman ideal, jumlah gabah berkisar antara 180-240, dengan gabah isi lebih dari 85 persen (Ma et al. 2006). Hasil jumlah gabah per malai padi Bio-148 (218.5) lebih besar dibandingkan Gajah Mungkur (143.4) IR64 (161) (Tabel 1). Analisis statistik (Tabel 2) menunjukkan jumlah gabah isi per malai Bio-148 berbeda nyata dengan IR64 sedangkan jumlah gabah hampa per malai Bio-148 berbeda nyata dengan kedua tetua. Hasil penelitian ini menunjukkan gabah per malai Bio-148 lebih baik dari hasil persilangan Fatmawati/Way Rarem (164.7) (Herawati 2009). Oleh karena itu Bio-148 potensial sebagai VUB. Hasil pengamatan gabah (Tabel 2) menunjukkan panjang malai Bio-148 lebih besar dari IR64 dan lebih kecil dari Gajah Mungkur. Hasil serupa teramati pada bobot 1000 butir. Sementara untuk jumlah cabang primer dan sekunder Bio148 lebih besar dari IR64 dan Gajah Mungkur. Hal serupa teramati pada jumlah gabah isi dan hampa. Hasil penelitian Peng et al. (2008) menunujukkan bahwa
10
untuk meningkatkan hasil padi tipe baru dibutuhkan tetua dengan karakter jumlah gabah per malai dan ukuran malai yang besar. Fenomena segregasi transgresif dua arah ini kemungkinan menunjukkan tidak satupun tetua membawa semua alel positif atau alel negatif. Transgresi terjadi karena akumulasi alel-alel komplementer yang diwariskan oleh kedua tetua pada individu tertentu (Trijatmiko 2001). Berdasarkan korelasi Pearson (Tabel 2), diperoleh informasi bahwa rata-rata jumlah cabang primer, sekunder, jumlah gabah isi, dan hampa berkorelasi nyata terhadap panjang malai pada taraf kepercayaan 5% sedangkan rata-rata jumlah gabah hampa sangat berkorelasi nyata terhadap rata-rata jumlah gabah isi berdasarkan taraf 1%. Karakter unggul akan lebih efektif meningkatkan hasil apabila karakter unggul berkorelasi positif. Berdasarkan data pada Tabel 3 diketahui bahwa semua karakter unggul berupa panjang malai, jumlah cabang primer, cabang sekunder, gabah isi dan gabah hampa berkolerasi positif. Isolasi DNA Padi Daun tanaman padi Bio-148 yang merupakan hasil persilangan digunakan untuk isolasi DNA. Hasil isolasi DNA perlu dilakukan untuk mengetahui kualitas atau kemurnian DNA dan konsentrasi yang dibutuhkan untuk analisis PCR. Uji kuantitatif menggunakan spektrofotometer melalui pengukuran konsentrasi sampel DNA pada panjang gelombang 260 nm dan kemurnian sampel pada perbandingan panjang gelombang 260/280 nm. Hasil isolasi ketiga varietas padi memiliki kemurnian 1.8-1.9. Nilai kemurnian sampel yang baik menurut Sambrook et al. (2001) adalah 1.8-2.0. Adanya kontaminasi protein terlihat dari nilai kemurnian yang kurang dari 1.8, sedangkan nilai kemurnian sampel yang lebih dari 2.0 menunjukkan adanya kontaminasi RNA. Uji kualitatif DNA dapat dilakukan melalui elektroforesis gel akrilamid. Uji kualitatif ini berupa gambaran untuk mengetahui ada atau tidaknya DNA. DNA padi diisolasi untuk melihat komponen padi unggulan dari segi genotipe, diantaranya mendeteksi introgresi kromosom dari donor Gajah Mungkur. Isolasi DNA padi dilakukan menggunakan metode modifikasi Dellaporta et al. (1983). Konsentrasi DNA beragam (Tabel 4), secara umum konsentrasi DNA hasil isolasi memiliki konsentrasi yang relatif baik dan sudah cukup digunakan pada proses amplifikasi dengan mesin PCR. Hal ini juga sejalan dengan hasil pengukuran konsentrasi DNA padi menggunakan metode Dellaporta, sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Noferta (2011) yang memperlihatan konsentrasi DNA hasil isolasi sebesar 75 ng/µL. Amplifikasi DNA Padi Amplifikasi DNA dilakukan dengan mesin PCR TETRAD. DNA sampel digunakan sebagai cetakannya untuk diperbanyak dengan 57 primer yang ditargetkan pada kromosom 1-12. Tujuannya untuk mendapatkan primer-primer yang memberikan pola amplikon yang sama terhadap Bio-148, IR64, dan Gajah Mungkur. Hal ini akan menunjukkan sumber asal DNA pada Bio-148. Seleksi (Gambar 2) dilakukan melihat kesamaan pola amplikon sampel Bio-148 dari tetua (IR64 dan Gajah Mungkur). Hasil pengamatan kelompok primer kromosom 1-3 (Gambar 2) mendapatkan dari 16 primer, yang terlihat 9 primer (RM 5, 104, 233A, 240, 262, 263, 132, 156, 186) pola amplikon sampel Bio-148 sama dengan
11
IR64. Hal ini menunjukkan kromosom 1-3 Bio-148 tidak ada introgresi DNA dari Gajah Mungkur. Hasil pengamatan 16 kelompok primer pada kromosom 4-7 (Gambar 3) terdapat 13 pola amplikon DNA. Pola amplikon DNA Bio-148 yang didapatkan, 3 kelompok primer yang mirip tetua Gajah Mungkur pada no. 11 (RM 13), no. 13 (RM 153) yang terletak pada kromosom 5, dan 21 (RM 172) yang terletak pada kromosom 7 dengan ukuran berkisar antara 100-200 pb. Sedangkan, 11 primer lainnya mirip tetua IR64. Kelompok primer no. 18 didapatkan pola polimorfik pada Bio-148. Pita yang dihasilkan mengindikasikan bahwa penanda mikrosatelit bersifat kodominan bagi organisme diploid yang dapat membedakan genotip homozigot dan heterozigot (Pandin et al. 2008). Kromosom 5 dan 7 pada Bio-148 mengalami introgresi DNA Gajah Mungkur sedangkan kromosom 4 dan 6 boleh dikatakan masih asli tetua IR64. Hasil pengamatan (Gambar 4) 21 kelompok primer pada kromosom 8-12, primer no. 34 (RM 222) pada kromosom 10 menunjukkan DNA Bio-148 mirip tetua Gajah Mungkur dengan ukuran 100-200 pb. Perbedaan ukuran pita yang terjadi pada masing-masing primer menunjukkan adanya perubahan genomik. Perubahan tersebut dapat terjadi dari alel yang bersifat homozigot (satu pita) menjadi heterozigot (dua pita) atau sebaliknya (Megia dan Djuita 2010). Kelompok 20 primer lainnya pola amplikon yang mirip dengan tetua IR64. Hal ini menunjukkan kromosom 10 Bio-148 mengalami introgresi DNA Gajah Mungkur sedangkan kromosom 8, 9, 11, dan 12 masih asli tetua IR64. Banyak faktor yang menyebabkan perbedaan jumlah dan intensitas pita DNA yang terbentuk pada setiap primer dan pada masing-masing lokus. Tingey et al. (1994) menyatakan bahwa variasi yang terjadi pada jumlah dan intensitas pita DNA yang terbentuk setelah proses amplifikasi sangat tergantung pada cara primer mengenal urutan DNA komplementernya pada cetakan DNA (DNA template) yang digunakan. Kemurnian dan konsentrasi DNA cetakan juga berpengaruh. DNA cetakan yang mengandung kontaminan seperti polisakarida dan senyawa fenolik, serta konsentrasi DNA cetakan yang terlalu kecil sering menghasilkan pita DNA amplifikasi yang redup atau tidak jelas (Weeden et al. 1992). Selain itu sebaran situs penempelan primer pada DNA cetakan dan adanya kompetisi tempat penempelan primer pada DNA cetakan menyebabkan satu fragmen diamplifikasi dalam jumlah banyak sementara fragmen lainnya hanya sedikit. Weeden et al. (1992) juga menyatakan bahwa amplifikasi mungkin diinisiasi pada beberapa tempat, tetapi hanya beberapa set yang dapat dideteksi sebagai pita sesudah amplifikasi. Analisis Introgresi Total marka yang digunakan terdapat 4 marka yang mengikuti pola amplikon tetua Gajah Mungkur. Kromosom 5 (Tabel 5) dari 8 marka, 2 marka dapat mendeteksi kesamaan pola amplikon Bio-148 (persentase introgresi / PI 2/8x100%=25%), sedangkan untuk primer kromosom 7 dari 6 marka, hanya 1 marka menunjukkan kesamaan pola amplikon Bio-148 (persentase introgresi / PI 1/6x100%=16.67%). Sementara kromosom 10 dari 4 marka yang digunakan, hanya 1 marka mirip tetua Gajah Mungkur (persentase introgresi / PI 1/4x100%=25%). Introgresi kromosom Gajah Mungkur pada Bio-148 dengan cara silang baik (back cross) beberapa kali agar diperoleh introgresi
12
yangdiinginkan dan seminimal mungkin membawa introgresi negatif (linkage drag) fragmen liar yang tidak diinginkan (Reyes-Valdes 2000). Hasil penelitian Mulsanti (2011) diperoleh enam marka SSR yang polimorfis, yaitu RM 206, 263, 276, 346, 335, dan 570 yang dapat membedakan antara masing-masing tetua padi hibrida yang diuji.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Introgresi segmen kromosom padi Gajah Mungkur meningkatkan karakter (umur berbunga, panjang malai, bobot 1000 butir, jumlah cabang primer dansekunder, jumlah gabah per malai, jumlah gabah isi dan hampa) padi Bio-148. Introgresi kromosom padi Gajah Mungkur pada padi Bio-148 terjadi pada kromosom 5,7, dan 10 yang terkait pada produktivitas.
Saran Dilakukan penelitian lebih lanjut dalam menentukan gen pembawa sifat unggul. Selain itu perlu dilakukan penelitian terkait karakter selain komponen hasil.
DAFTAR PUSTAKA Abdullah B, Tjokrowidjojo S, Kustianto B, Daradjat AA. 2005. Pembentukan padi varietas unggul tipe baru. Penelitian Pertanian 24(1):1-7. [BPS] Badan Pusat Statistik. 2012. Berita Resmi Statistik. Jakarta: BPS. Chawla HS. 2004. Introduction to Plant Biotechnology second edition. India: Science Pb. Dellaporta SL, J Wood, and JB Hicks. 1983. A plant DNA minipreparation: Version II. Plant Mol. Biol. Reptr. 1:19-21. Herawati R, Purwoko BS, Dewi IS. 2009. Keragaman genetik dan karakter agronomi galur haploid padi gogo dengan sifat-sifat tipe baru hasi kultur antera. J Agron Indonesia 37(2):87-94. [LITBANG] Balai Penelitian Bahan Pangan. 2006. Mengenal padi VUTB Fatmawati. http://jakarta.litbang.deptan.go.id/klinikagribisnis. J Litbang 12:1-6. Ma J, W Ma, D Ming, S Yang, Q Zhu. 2006. Characteristics of rice plant with heavy panicle. Agricultural Sciences 5(12):101-105. Manurung SO dan M Ismunadji. 1988. Morfologi dan Fisiologi Padi. dalam Padi. PPPTP. Bogor: 55-98. Megia R dan Djuita Nina R. 2010. Deteksi integritas genomic pisang hasil iradiasi in vitro berdasarkan penanda mikrosatelit. MAKARA SAINS. 14 :151-157. Mulsanti IW. 2011. Identifikasi dan evaluasi kemurnian genetik benih padihibrida menggunakan marka mikrosatelit [tesis]. Bogor: Institut Pertanian Bogor.
13
Noferta A. 2011. Analisis genom geminivirus isolate agresif PSS 1-4 dari pesisir selatan Sumatera Barat [tesis]. Padang: Universitas Andalas. Pandin DS. 2010. Penanda DNA untuk pemuliaan tanaman kelapa (Cocos nucifera L.). Perspektif. 9: 21-35. Peng S, GS Khush, P Virk, Q Tang, and Y Zou. 2008. Progress in ideotype breeding in increase rice yield potential. Field Crop Res 108:32-38. Prasetiyono J. 2010. Studi Efek Introgresi Pup (p Uptake 1) untuk Meningkatkan Toleransi Padi Terhadap Defisiensi Fosfor [Disertasi]. Bogor: Program Studi Agronomi, Institut Pertanian Bogor. Rahmawati S. 2006. Status perkembangan dan perbaikan genetik padi menggunakan teknik transformasi Agrobacterium. AgroBiogen 2: 364-375. Reyes-valdes MH. 2000. A model for Marker-Based Selection in Gene Introgression Breeding Program. Crop Sci. 40:91–98. Sambrook J, Russell DW. 2001. Molecular Cloning a Laboratory Manual. Ed ke3. New York: Cold Spring Harbor Laboratory. Shivanna KR, Sawhney. 1997. Pollen Biotechnology for Crop Production and Improvement. UK: Cambridge University Pr. Thermo Fisher Scientific. 2009. Nanodrop 2000/200c Spectrpphotometer V1.0 User Manual. Wilmington: Thermo Fischer Scientific Inc. Tingey SV, Rafalski JA, Hanafey MK. 1994. Genetic analysis with RAPD markers. In: Coruzzi C and Puidormenech (eds). Plant Molecular Biology. Berlin: Springer-Verlag. Trijatmiko KR, Aswidinnoor H, Moeljopawiro S, dan Sopandie D. 2001. Keterpautan marka RAPD dengan sifat daya tembus akar tanaman padi IRAT112. Jurnal Bioteknologi Pertanian 6:29-35. Trijatmiko KR, Olivia N, Slamet-Loedin IH, Kohli A. 2011. Molecular Analyses of Transgenic Plants. NewYork: Springer Inc. Utami DW, Hajrial A, Asep S, Sugiono M, dan Edi G. 2004. Aplikasi teknik Marker Assisted Selection (MAS) dalam seleksi introgresi genotip tahan patogen blas dari Oryza rufipogon ke dalam IR 64. Zuriat 2:15. Weeden NF, Timmerman GM, Hemmat M, Kneen BE & Lodhi MA. 1992. Inheritance and Reliability of RAPD Markers. Application of RAPD Technology to Plant Breeding. Joint Plant Breeding Symposia Series CSSA/ASHS/AGA. Minneapolis, 1 November 1992.
LAMPIRAN Lampiran 1 Diagram alur penelitian
Tanam benih (IR64, Bio-148, da Gajah Mungkur)
Identifikasi karakter unggul
Isolasi DNA
Analisis kuantitatif DNA
Amplifikasi DNA dengan PCR
Elektroforsesis
Analisis data
15
Lampiran 2 Primer SSR No. 1
Primer RM5
Forward TGCAACTTCTAGCTGCTCGA GGAAGAGGAGAGAAAGATGTGTGC G GTCCCCTCCACCCAATTC CCAAATGAACCTACATGTTG CCTTAATGGGTAGTGTGCAC CATTCCGTCTCGGCTCAACT CCCAGGCTAGCTCATGAACC TTCGCCATGAAGTCTCTCG GGTTTGGGAGCCCATAATCT CCGTCGCCGTAGTAGAGAAG CCAAAGATGAAACCTGGATTG ATCTTGTTGTTTCGGCGGCGGC GCCGCACCCTCACTCCCTCCTC TGCTGCTTGCCTGCTTCCTTT TCCTCCATCTCCTCCGCTCCCG TCCTCCCTCCCTTCGCCCACTG TGTTGCGTGTGGAGATGTG TCCAACATGGCAAGAGAGAG GATCACGATCCACTGGAGCT GCCTCTCTCGTCTCCTTCCT GCCTCGAGCATCATCATCAG
2
RM104
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
RM6 RM233A RM240 RM262 RM263 RM7 RM22 RM55 RM85 RM132 RM156 RM168 RM186 RM131 RM255 RM13 RM31 RM39 RM153
22
RM159
GGGGCACTGGCAAGGGTGAAGG
23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50
RM161 RM178 RM188 RM50 RM162 RM118 RM125 RM134 RM172 RM214 RM248 RM25 RM38 RM72 RM152 RM210 RM230 RM264 RM105 RM201 RM215 RM242 RM245 RM147 RM171 RM222 RM244 RM21R
TGCAGATGAGAAGCGGCGCCTC TCGCGTGAAAGATAAGCGGCGC TCCGCCTCTCCTCTCGCTTCCC ACTGTACCGGTCGAAGACG GCCAGCAAAACCAGGGATCCGG CCAATCGGAGCCACCGGAGAGC ATCAGCAGCCATGGCAGCGACC ACAAGGCCGCGAGAGGATTCCG TGCAGCTGCGCCACAGCCATAG CTGATGATAGAAACCTCTTCTC TCCTTGTGAAATCTGGTCCC GGAAAGAATGATCTTTTCATGG ACGAGCTCTCGATCAGCCTA CCGGCGATAAAACAATGAG GAAACCACCACACCTCACCG TCACATTCGGTGGCATTG GCCAGACCGTGGATGTTC GTTGCGTCCTACTGCTACTTC GTCGTCGACCCATCGGAGCCAC CTCGTTTATTACCTACAGTACC CAAAATGGAGCAGCAAGAGC GGCCAACGTGTGTATGTCTC ATGCCGCCAGTGAATAGC TACGGCTTCGGCGGCTGATTCC AACGCGAGGACACGTACTTAC CTTAAATGGGCCACATGCG CCGACTGTTCGTCCTTATCA ACAGTATTCCGTAGGCACGG
51
RM167
GATCCAGCGTGAGGAACACGT
Reverse GCATCCGATCTTGATGGG
K 1
TCAACAGACACACCGCCACCGC
1
TCGTCTACTGTTGGCTGCAC GCATTGCAGACAGCTATTGA TGTAACCATTCCTTCCATCC CAGAGCAAGGTGGCTTGC GCTACGTTTGAGCTACCACG CCTCCCATCATTTCGTTGTT CTGGGCTTCTTTCACTCGTC TCCCGGTTATTTTAAGGCG GCACAAGGTGAGCAGTCC CATGGCGAGAATGCCCACGTCC TCTTGCCGGAGCGCTTGAGGTG GAAACGAATCAATCCACGGC GGGCGTGGTGGCCTTCTTCGTC CGATGTTCGCCATGGCTGCTCC CGAAACCGCTCAGTTCAAC GGTGGCATTCGATTCCAG AAGTCCATTACTCTCCTCCC AATTCAAACTGCGGTGGC ATCAACCTGCACTTGCCTGG GCTTGTGCTTCTCTCTCTCTCTCT CTCTC TGTGTCATCAGACGGCGCTCCG GATCACCGTTCCCTCCGCCTGC GCAACGCACAACCGAACCGAGC AAATTCCACGTCAGCCTCC CAAGGTCTTGTGCGGCTTGCGG CACATCCTCCAGCGACGCCGAG AGGGGATCATGTGCCGAAGGCC GCTCTCCGGTGGCTCCGATTGG CAACCACGACACCGCCGTGTTG AAGAACAGCTGACTTCACAA GTAGCCTAGCATGGTGCATG CTACCATCAAAACCAATGTTC TCGGTCTCCATGTCCCAC GCATCGGTCCTAACTAAGGG CCGTAGACCTTCTTGAAGTAG CGAGGATGGTTGTTCACTTG CACCGCAGTCACTTTTCAAG GATCCGTGTCGATGATTAGC TGGTCGAGGTGGGGATCGGGTC CTACCTCCTTTCTAGACCGATA TGAGCACCTCCTTCTCTGTAG TATATGCCAAGACGGATGGG CTGAGAATCCAATTATCTGGGG CCCCCGAATCCCATCGAAACCC ACGAGATACGTACGCCTTTG CAAAGCTTCCGGCCAAAAG CTGCTCTCGGGTGAACGT GCTCCATGAGGGTGGTAGAG AGTCCGACCACAAGGTGCGTTG TC
2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 5 5 5 5 5 5 5 5 6 6 7 7 7 7 7 7 8 8 8 8 8 8 8 9 9 9 9 9 10 10 10 10 11 11
16
No. Primer 52 RM209 53 RM254 54 RM4A 55 RM20A 56 RM179 57 RM247 K= Kromosom
Forward ATATGAGTTGCTGTCGTGCG AGCCCCGAATAAATCCACCT TTGACGAGGTCAGCACTGAC ATCTTGTCCCTGCAGGTCAT CCCCATTAGTCCACTCCACCACC TAGTGCCGATCGATGTAACG
Reverse CAACTTGCATCCTCCCCTCC CTGGAGGAGCATTTGGTAGC AGGGTGTATCCGACTCATCG GAAACAGAGGCACATTTCATTG CCAATCAGCCTCATGCCTCCCC CATATGGTTTTGACAAAGCG
K 11 11 12 12 12 12
17
Lampiran 3 Analisis statistik dengan sidik ragam (ANOVA) a) Panjang malai Source Corrected Model Intercept
Type III Sum of Squares
df
Mean Square
F
Sig.
76.545a
2
38.272
6.090
.003
127283.872
1
127283.872
20252.706
.000
6.090
.003
Perlakuan
76.545
2
38.272
Error
1828.872
291
6.285
Total Corrected Total
186631.710
294
1905.417
293
b) Jumlah cabang primer Source
Type III Sum of Squares
df
Mean Square
F
Sig.
Corrected Model Intercept
207.136a
2
103.568
47.155
.000
18151.190
1
18151.190
8264.271
.000
Perlakuan
207.136
2
103.568
47.155
.000
Error
639.136
291
2.196
Total Corrected Total
27020.000
294
846.272
293
c) Jumlah cabang sekunder Source
Type III Sum of Squares
df
Mean Square
F
Sig.
Corrected Model Intercept
9784.373a
2
4892.187
43.372
.000
154218.328
1
154218.328
1367.238
.000
Perlakuan
9784.373
2
4892.187
43.372
.000
Error
32823.494
291
112.796
Total Corrected Total
268923.000
294
42607.867
293
d) Jumlah gabah isi Source Corrected Model Intercept
Type III Sum of Squares
df
Mean Square
F
Sig.
29562.758a
2
14781.379
7.591
.001
2314326.513
1
2314326.513
1188.481
.000
7.591
.001
Perlakuan
29562.758
2
14781.379
Error
566663.667
291
1947.298
18
Total Corrected Total
3819751.000
294
596226.425
293
e) Jumlah gabah hampa Source Corrected Model Intercept
Type III Sum of Squares
Df
Mean Square
F
Sig.
93171.371a
2
46585.686
77.452
.000
277573.188
1
277573.188
461.486
.000
77.452
.000
Perlakuan
93171.371
2
46585.686
Error
175029.829
291
601.477
Total Corrected Total
701983.000
294
268201.201
293
19
Lampiran 4 Analisis statistik dengan uji Duncan a) Panjang malai Duncana,,b,,c Subset 1 2 24.5735
Varietas
N
IR64
151
Bio-148
109
25.5367
GM
34
25.7471
Sig.
1.000
.629
b) Jumlah cabang primer Duncana,,b,,c Varietas
N
IR64
151
GM
34
Bio-148
109
Sig.
Subset 2
1 8.6689
3
9.5000 10.4771 1.000
1.000
1.000
c) Jumlah cabang sekunder Duncana,,b,,c Subset
Varietas
N
IR64
151
1 22.8940
GM
34
25.4118
Bio-148
109
Sig.
2
35.1927 .173
1.000
d) Jumlah gabah isi Duncana,,b,,c Varietas
N
IR64
151
GM
34
Bio-148
109
Sig.
Subset 1 94.9868
2 112.8235 115.6514
1.000
.712
e) Jumlah gabah hampa Duncana,,b,,c Varietas
N
IR64
151
Subset 1 2 24.4834
GM
34
25.9412
Bio-148
109
Sig.
61.5963 .732
1.000
20
Lampiran 5 Reagen Larutan / Bufer TBE (TrisHCl-Boric Acid-EDTA) 10x APS 10% Akrilamid/bisakrilamid 40% Akrilamid 8% Marka 100 bp Ladder plus Loading dye 6x
Gel akrilamid Ekstraksi buffer 500 mL
20% SDS 5 M Kalium asetat
3 M Natrium asetat
TE 1 x
TE 0.1 x
Cara pembuatan Sebanyak 108 g Tris HCL, EDTA 40 mL pH 8, boric acid 55 g dilarutkan dengan aquades hingga volume akhir 1 L Amonium persulfat sebanyak 1 g dlarutkan dengan akuades hingga 10 mL Sebanyak 380 g akrilamid dan 20 g bisakrilamid dilarutkan dengan akuades hingga 1 L Sebanyak 200 mL akrilamid/ bisakrilamid 40% dan 50 mL TBE 10x dilarutkan dengan akuades 750 mL 50 µL stock 100 bp Ladder plus ditambah 950 µL TrisEDTA untuk menjadikan konsentrasi akhir 50 µg/ µL Bromofenol biru 0.03%, 10 mM TrisHCL (pH 7.6), gliserol 60%, 60 mM EDTA, dan xylenecyanol FF dilarutkan dalam akuades. Sebanyak 55 mL akrilamid 8%, 550 µL APS 10%, dan 55 µL TEMED lalu diaduk. Sebanyak 50 mL Tris-HCl pH 8, 50 mL 0.5 M EDTA, 62.5 mL 4 M NaCl, dan 337.5 mL dH2O dicampur dan diaduk hingga rata. Sebanyak 200 gram SDS dilarutkan dengan 800 mL akuades. Sebanyak 49.07 gram kalium asetat ditimbang dan ditambahkan dengan air steril sebanyak 70 mL lalu di sterilisasi kedalam autoklaf (121°C, 2atm, 20 menit). Ditimbang sebanyak 204.15 g natrium asetat kemudian dimasukkan 200 mL air steril dan 90 mL asam asetat 20ncubat kemudian di sterilisasi ke dalam autoklaf (121°C, 2atm, 20 menit). Sebanyak 10 mL Tris HCl 1M (pH 8) ditambah dengan 2 mL EDTA 0.5M (pH 8) dan ditera hingga 1000 mL menggunakan akuades. Sebanyak 15 µL larutan TE 1 x dilarutkan dengan akuades sebanyak 135 µL dengan volume akhir 150 µL
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Banjarbaru, Kalimantan Selatan pada tanggal 14 Juli 1990 sebagai putra kedua dari ayah Bambang Tri Saputra dan ibu Noorhasanah. Tahun 2008 penulis lulus dari SMA Negeri 11 Bandung dan pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Undangan Saringan Masuk IPB (USMI) dan diterima di Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten praktikum Kimia Dasar dan Biokimia Umum pada tahun ajaran 2010. Penulis pernah melakukan Praktik Lapangan (PL) di Laboratorium Biak Sel dan Mikropropagasi Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor selama periode Juli – Agustus 2011 dengan judul Pengaruh Asam Humat terhadap Pertumbuhan Planlet Tebu (Saccharum officinarum L) Hasil Aklimatisasi. Penulis juga aktif dalam organisasi kampus sebagai staf divisi Biomolekuler dalam Research and Education Himpunan Profesi Mahasiswa Biokimia (CREBs) 2010, ketua divisi Biomolekuler dalam Research and Education Himpunan Profesi Mahasiswa Biokimia (CREBs) 2011.
