IDENTIFIKASI ISOLAT JAMUR ENDOFIT POHON SENGON PROVENAN WAMENA BERDASARKAN ANALISIS RDNA ITS
SKRIPSI Untuk memenuhi sebagian persyaratan Mencapai derajat Sarjana S-1 pada Program Studi Biologi
disusun oleh: Fitria Sofiyani 10640029
PROGRAM STUDI BIOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SUNAN KALIJAGA YOGYAKARTA 2014
ii
iii
iv
v
Motto “Demi Masa. Sesungguhnya manusia itu benar-benar dalam kerugian. Kecuali orang-orang yang beriman, beramal shaleh, menasehati dalam kebenaran, menasehati dalam kesabaran” (Al-Ashr)
fabiayyi’ala irobbikuma tukadziban “Maka nikmat Tuhanmu yang manakah yang kamu dustakan?” (Ar-Rahman)
v
vi
HALAMAN PERSEMBAHAN
Bissmillahirahmanirahim Karya sederhana ini aku persembahkan kepada Sang Maha Pemilik Semesta, ALLAH Subhanahu waTa’ala atas limpahan nikmat Iman, Islam dan Ihsan yang diberikan kepadaku sehingga karya sederhana ini dapat ku tulis dengan baik, semoga karya ini bisa menjadi pemupuk ketaqwaanku akan kebesaranNya. Amin. Kepada kedua Cahaya Pelitaku, Arti Hidupku, dan Matahariku, Bapa’ dan Ibu terkasih ku persembahkan dengan bangga karya sederhana ini. Meski tak secuil dari pengorbanan kalian semoga menjadi ridho Allah kepada anakmu ini. Kepada sahabat-sahabatku yang senantiasa menyertai semangat dan senyum aku hadiahkan karya ini untuk kalian, semoga segala kebaikan kalian Allah balas dengan kebahagiaan. Kepada darah-darah muda yang haus akan ilmu dan pengalaman di Almamaterku tercinta kampus hijau UIN Sunan Kalijaga Yogyakarta, kupersembahkan karya penelitianku untuk kalian. semoga bermanfaat dan memberikan keberkahan bagi siapa saja yang membaca. Amin
vi
vii
KATA PENGANTAR Bismillahirrahmanirrahiim, Puji syukur kehadirat Ilahi rabbi yang senantiasa melimpahkan rahmat, hidayah dan inayah-Nya kepada segala makhluk ciptaan-Nya. Shalawat dan salam selalu tercurah kepada junjungan kita Nabi Agung Muhammad SAW beserta keluarga dan sahabat-sahabatnya, yang senantiasa kita nantikan syafa’atnya di yaumul qiyamah. Skripsi yang berjudul “Identifikasi Isolat Jamur Endofit Provenan Wamena Berdasarkan Ananlisis rDNA ITS” ini disusun sebagai syarat untuk menyelesaikan pendidikan strata-1 UIN Sunan Kalijaga Yogyakarta. Penulis sadar sepenuhnya bahwa skripsi ini tidak mungkin tersusun tanpa bantuan dari banyak pihak. Untuk itu, dengan segala kerendahan hati, penulis menyampaikan terimakasih yang sedalam-dalamnya kepada: 1.
Bapak Prof. H. Akhmad Minhaji, M.A., Ph.D. Selaku Dekan Fakultas Sains dan Teknologi.
2.
Ibu Anti Damayanti H., S.Si., M.Mol.Bio selaku Ketua Program Studi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi, juga selaku Pembimbing I dan Pembimbing Akademik, terimakasih atas bimbingan serta arahan dalam penulisan skripsi ini.
3.
Ibu Dr. Istiana Prihatini M.Si selaku Pembimbing II beserta Penguji I yang telah berjasa memberikan bimbingan, arahan, serta kesempatan
vii
viii
besar sehingga penulis mendapat pengalaman yang sangat berharga dan Insyaallah bermanfaat. 4.
Ibu Erny Qurotul Ainy, M.Si selaku penguji II yang telah memberi masukan, arahan dan bimbinganya sehingga skripsi ini dapat lebih baik.
5.
Ibu Dr. ILG. Nurtjahjaningsih dan Bapak Dr. AYPBC. Widyatmoko selaku Ketua Kelti Bioteknologi serta Bapak Dr. Anto Rimbawanto selaku kepala laboratorium Genetika Molekular BBPBPTH Yogyakarta yang telah mengijinkan melakukan penelitian di Lab. Genetika Molekular BBPBPTH.
6.
Ibu Maya, Mbak Yanti dll, yang telah membantu mengarahkan dalam pengerjaan penelitian di BBPBPTH Yogyakarta.
7.
Mbak Ethik, Mbak Anif beserta staff di Laboratorium Biologi UIN Sunan Kalijaga. Terimakasih atas segala bantuan dan kerjasamanya selama pelaksanaan penelitian ini.
8.
Ayahanda tercinta, Bp. Yahyo yang selalu memberi wejanganwejangan yang berarti, serta Ibunda terkasih, Tina Rahayu yang tanpa lelah senantiasa mendukung dan menyebut nama penulis di setiap tadahan tangan dan airmata dalam doanya. Terimakasih atas support yang tiada henti selama pengerjaan TA ini.
9.
Adik tersayang, Afifah Nur Faida yang dengan ikhlas dan sabar mendoakan kelancaran pengerjaan skripsiku ini.
10. Sahabat seperjuangan selama di tanah rantau: Huda, Arin (tante), Diska, Meilan, Dewi, Nurma, dan Anisa dkk. Terimakasih atas segala bentuk
ix
support dan bantuannya saat penulis sedang berproses dan berjuang untuk menyelesaikan apa yang sudah dimulai ini. Dan kesetiaannya menemani penulis dari pertama menjadi mahasiswa UIN, menemani seminar proposal Skripsi, hingga sidang munaqosah yang alhamdulillah sukses. 11. Kawan-kawan Biologi 2010 (GABINAS) yang telah menjadi keluarga selama menimba pengalaman dan ilmu di almamater tercinta Prodi Biologi UIN Sunan Kalijaga Yogyakarta. Semoga sukses untuk kita semua! Allahuakhbar!!! 12. Sahabat pena nan jauh disana, Meilan, Uci, ibu muda Mbak Uthe, Lilie, dua keponakan kembar ku Mira dan Najwa yang selalu memberikan alasan dan semangat untuk segera menyelesaikan TA ini. 13. Semua pihak yang telah memberikan manfaat sekecil papaun, yang turut membantu dalam memberikan bantuan, motivasi dan doanya. Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan sehingga kritik dan saran yang membangun sangat diharapkan untuk menjadi masukan yang berharga. Semoga skripsi ini dapat memberikan wawasan dan manfaat bagi kita semua. Amiin. Yogyakarta, 17 Agustus 2014 Penulis
x
IDENTIFICATION OF ENDOPHYTIC FUNGI ISOLATES FROM SENGON WAMENA PROVENANCE BASED ON RDNA ITS ANALYSIS by: Fitria Sofiyani 10640029 Fungal endophytes are fungi found in plant tissue system that do not cause disease symptoms on host plants. Endophytic fungi can produce antibacterial compounds that have potential as a biological control agent (BCA) Likewise, endophytic fungi isolated from sengon Wamena provenance could have potential as biological control agent. Twenty isolates of fungi with different morphological characters of colonies were isolated from leaves, petioles, barks and twigs of sengon. Three isolates were not included in the phylogenetic analysis as the result of sequencing were not clear. Identification based on ITS rDNA sequences (ITS15.8S-ITS2) and phylogenetic analysis of the seventeen isolates showed that the isolates are divided into three classes, namely Sordariomycetes taxa (75%), Dothideomycetes (20%) and Eurotiomycetes (5%). Fifteen isolates were identified to genus level, namely Fusarium, Phomopsis (Diaporthe telomorf), Phialemonium, Colletotrichum, Lasiodiplodia, and Penicillium. Two other isolates were identified only to the level of orders namely, Pleosporales. The result of molecular identification is supported by morphological data of each isolate. The frequently isolated fungal endophyte were Fusarium (40%), and the genus Phomopsis (Diaporthe telomorf) (20%).
Keywords: Identification, ITS, Endophytic Fungi, Sengon
x
xi
IDENTIFIKASI ISOLAT JAMUR ENDOFIT POHON SENGON PROVENAN WAMENA BERDASARKAN ANALISIS RDNA ITS Oleh: Fitria Sofiyani 10640029 Jamur endofit merupakan jamur yang terdapat pada sistem jaringan tanaman yang tidak menyebabkan gejala penyakit pada tanaman inang. Jamur endofit dapat menghasilkan senyawa antibakteri yang berpotensi sebagai agen pengendali hayati. Begitu pula dengan jamur endofit yang diisolasi dari pohon sengon provenan Wamena dapat memiliki potensi sebagai agen pengendali hayati. Sebanyak dua puluh isolat jamur endofit dengan karakter morfologi koloni yang berbeda telah diisolasi dari daun, tangkai daun, kulit batang dan ranting batang pohon. Tiga isolat diantaranya tidak disertakan dalam analisis filogenetik dikarenakan hasil sequensing yang kurang baik. Identifikasi berdasarkan sekuen rDNA ITS (ITS1-5.8S-ITS2) dan analisis filogenetik terhadap tujuh belas isolat menunjukan bahwa isolat terbagi menjadi tiga kelas taksa yaitu Sordariomycetes (75%), Dothideomycetes (20%) dan Eurotiomycetes (5%). Lima belas isolat teridentifikasi hingga tingkat genus yaitu genus Fusarium, Phomopsis (telomorf Diaporthe), Phialemonium, Colletotrichum, Lasiodiplodia, dan Penicillium. Dua isolat yang lain hanya teridentifikasi hingga tingkat ordo yaitu ordo Pleosporales. Hasil identifikasi molekular didukung oleh data morfologi masing-masing isolat. Isolat yang paling sering ditemukan yaitu jamur endofit dari genus Fusarium (40%), dan genus Phomopsis (telomorf Diaporthe) (20%). Kata kunci: Identifikasi, ITS, Jamur Endofit, Sengon
xi
xii
DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL ...................................................................................... i HALAMAN PENGESAHAN ......................................................................... ii HALAMAN PERSETUJUAN SKRIPSI ......................................................... iii HALAMAN PERSETUJUAN KEASLIAN .................................................... iv HALAMAN MOTTO ..................................................................................... v HALAMAN PERSEMBAHAN ...................................................................... vi KATA PENGANTAR .................................................................................... vii ABSTRACT ................................................................................................... x ABSTRAK ..................................................................................................... xi DAFTAR ISI .................................................................................................. xii DAFTAR TABEL .......................................................................................... xiv DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... xv DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................... xvi BAB I PENDAHULUAN ............................................................................... 1 A. Latar Belakang .................................................................................... 1 B. Rumusan Masalah ............................................................................... 8 C. Tujuan Penelitian ................................................................................ 8 D. Manfaat Penelitian............................................................................... 8 BAB II Tinjauan Pustaka ................................................................................ 9 A. Tanaman Sengon (Paraserianthes falcataria (L.)) ............................... 9 B. Jamur Endofit ...................................................................................... 11 C. Identifikasi Jamur ................................................................................ 15 a. Identifikasi jamur secara morfologi................................................ 15 b. Identifikasi jamur secara molekuler ............................................... 16 D. Internal Trancribed Spacer (ITS) ........................................................ 20 BAB III METODE PENELITIAN .................................................................. 21 A. Waktu dan Tempat Penelitian .............................................................. 21 B. Alat dan Bahan .................................................................................... 21 C. Prosedur Penelitian .............................................................................. 22
xii
xiii xiii
1. Pemurnian atau Subkultur Isolat Jamur Endofit ............................. 22 2. Seleksi Isolat Berdasarkan Karakter Morfologi .............................. 23 3. Identifikasi Molekuler Isolat Endofit ............................................. 24 a. Ekstraksi DNA dari Miselium .................................................. 24 b. Amplifikasi PCR dengan ITS region ........................................ 25 c. Elektroforesis Gel Agarose ...................................................... 26 d. Sequensing & Analisis Filogenetik ........................................... 27 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................... 28 A. Hasil.................................................................................................... 28 B. Pembahasan ........................................................................................ 44 BAB V KESIMPULAN .................................................................................. 53 A. Kesimpulan ......................................................................................... 53 B. Saran ................................................................................................... 53 DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 54 LAMPIRAN ................................................................................................... 64
xiv
DAFTAR TABEL Halaman Tabel 1. Karakterisasi morfologi koloni isolat jamur endofit pohon sengon
provenan Wamena ................................................................................30 Tabel 2. Deskripsi mikroskopis isolat jamur endofit pohon sengon provenance Wamena ...............................................................................................33 Tabel 3. Hasil pencocokan BLAST dari setiap sampel isolat jamur endofit sengon beserta prosentase (%) kesamaan identitas query sequen dengan sequen database genbank (GB) dari NCBI ...............................35
xiv
xv
DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Konidia Aspergilus sp. ......................................................................13 Gambar 2. Penampakan mikroskopis Penicillium sp ..........................................14 Gambar 3. Konidia Fussarium sp. ......................................................................14 Gambar 4. Grafik jumlah kultur murni hasil subkultur isolat jamur endofit dari beberapa jaringan pada pohon sengon provenan Wamena ................28 Gambar 5. Analisis filogenetik menggunakan Maximum Likelihood terhadap sekuen ITS jamur endofit sengon kelompok Dothideomycetes .........38 Gambar 6. Analisis filogenetik menggunakan Maximum Likelihood terhadap sekuen ITS jamur endofit sengon kelompok Eurotiomycetes............40 Gambar 7. Analisis filogenetik menggunakan Maximum Likelihood terhadap sekuen ITS jamur endofit sengon kelompok Sordariomycetes ..........43
.
xv
xvi
DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Hasil subkultur ...............................................................................64 Lampiran 2. Daftar sekuen referensi dari genbank (GB) yang digunakan dalam analisis filogenetik ...........................................................................65 Lampran 3. Hasil elektroforesis produk PCR ITS1F-ITS4 ke-20 sampel isolat jamur endofit pohon sengon provenan Wamena ...............................67 Lampiran 4. Pohon filogenetik ke-20 isolat jamur endofit provenan Wamena ....68 Lampiran 5. Proses PCR ....................................................................................69 Lampiran 6. Keterangan kode isolat ...................................................................70 Lampiran 7. Hasil pengamatan morfologi dan mikroskopis 20 sampel isolat jamur endofit pohon sengon provenan Wamena .........................................71 Lampiran 8. Hasil sequensing ............................................................................78
xvi
1
BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Sengon (Paraserianthes falcataria) merupakan tanaman hutan dan termasuk dalam famili Mimosoidae. Tanaman ini berasal dari Indonesia, Papua Nugini, Kepulauan Solomon dan Australia (Soerianegara dan Lemmens, 1993), serta hingga saat ini tersebar di Sulawesi Selatan, Maluku, Papua dan Jawa (Martawijaya et al., 1989). Di Maluku, tanaman sengon dapat ditemukan di Pulau Talibu, Mangolle, Sasan, Obi, Bacan, Halmahera, Seram dan Buru. Di Papua, sengon alam ditemukan di Sorong, Manokwari, Kebar, Biak, Serui, Nabire dan Wamena. Tanaman sengon memiliki waktu tumbuh yang relatif cepat. Pada umur 5 tahun pohon sengon sudah dapat dimanfaatkan kayunya sebagai kayu pertukangan, bahan baku pabrik kertas dan kayu bakar. Sengon juga mampu tumbuh pada lahan yang kurang subur sehingga dapat merehabilitasi lahan kritis dan menciptakan iklim mikro yang lebih baik bagi lingkungan (ICRAF, 2006 dalam Dwiyanti, 2009). Sifat kayu sengon yang ringan, agak padat, agak besar, dan putih segar menarik pengusaha properti untuk menggunakan kayu ini sebagai bahan utama produknya. Menurut Krisnawati et al., (2011) tanaman sengon akan menjadi jenis yang semakin penting bagi industri perkayuan di masa mendatang. Pasalnya, permintaan ekspor akan kayu sengon kian meningkat dan kebutuhan dalam
1
2
negeri pun belum seutuhnya terpenuhi (Siregar dan Tedi, 2008). Saat ini sengon banyak diusahakan di kawasan hutan, perkebunan maupun di kebunkebun milik rakyat (hutan rakyat) di pulau Jawa dan luar pulau Jawa. Akan tetapi, satu masalah yang dihadapi dalam pengembangan sengon sekarang ini adalah adanya wabah penyakit karat tumor (gall rust) yang dapat mematikan sengon di tingkat semai sampai tegakan (Anggraeni, 2008). Penyakit karat tumor mengakibatkan pertumbuhan sengon terhambat sehingga terjadi kegagalan penanaman dan menyebabkan kerugian secara ekonomi bagi petani. Notoatmodjo (1963) melaporkan perkiraan kerugian tanaman sengon di Jawa Timur akibat serangan hama dan penyakit adalah 12% pada saat tanaman dipanen umur 4 tahun dan sekitar 74% jika dipanen setelah 8 tahun. Potensi kerugian akibat serangan penyakit karat tumor di Propinsi Jawa Timur dapat mencapai 24 trilyun rupiah dan apabila dibiarkan akan berdampak pada ketersediaan bahan baku kayu untuk industri (Dwiyanti, 2009). Karat tumor pada sengon disebabkan oleh jamur Uromycladium tepperianum Sacc. Jamur ini masuk ke dalam divisi Basidiomycota, kelas Urediniomycetes, ordo Uredinales, famili Pileolariaceae. Jamur ini hanya mampu menginfeksi jaringan-jaringan tanaman yang muda (Anggraini, 2008). Dengan demikian, kemungkinan terjadinya infeksi baru pada jaringan tanaman dewasa di lapangan sangat kecil. Respon tanaman sengon terhadap penyakit karat tumor dipengaruhi oleh faktor genetik dari tanaman itu sendiri dan faktor di sekitar pertanaman (Rahayu, 2008).
3
Mengatasi penyakit karat tumor bukan hal yang mudah, mengingat penyebabnya adalah dari golongan jamur. Menurut Wiryadiputra (2007), beberapa upaya pengendalian serangan jamur penyebab karat tumor pada sengon adalah dengan pembatasan penyebaran penyakit, aplikasi fungisida, penanaman sengon tahan penyakit, dan pengendalian dengan agen biologis. Pembatasan penyebaran penyakit dilakukan dengan membatasi bahan tanaman atau produk tanaman sengon yang masuk dan keluar lokasi yang telah terserang. Hal ini telah dilakukan oleh pemerintah Filipina untuk membatasi penyebaran penyakit ke daerah lain yang masih bebas penyakit (Wiryadiputra, 2007). Pada kayu hasil panen yang terpaksa diangkut keluar dari lokasi yang terserang, sebelumnya harus dilakukan desinfeksi menggunakan fungisida. Aplikasi fungisida dimaksudkan untuk mengurangi sumber infeksi sebanyak-banyaknya sehingga spora jamur yang muncul dari karat tumor menjadi berkurang. Menurut penelitian yang dilakukan Anggaeni dan Lelana (2011), penggunaan belerang dan kapur (1:1) dapat menekan serangan penyakit karat tumor. Akan tetapi, belerang dan kapur tersebut hanya bersifat fungistat yaitu bahan yang hanya menghambat pertumbuhan patogen sementara (Anggraeni dan Lelana, 2011). Apabila bahan tersebut tidak diberikan maka patogen akan tumbuh kembali. Penggunaan fungisida juga perlu dilakukan dengan hati-hati karena akan berdampak buruk bagi lingkungan, berpengaruh pada jamur non-target, dan menyebabkan kekebalan terhadap jamur sasaran (Wiryadiputra, 2007).
4
Cara penanggulangan dengan penanaman sengon tahan penyakit merupakan cara yang paling efektif, murah, dan aman bagi lingkungan namun memerlukan waktu yang lama. Eksplorasi pada lokasi-lokasi asli tanaman sengon perlu dilakukan untuk mendapat jenis-jenis sengon yang tahan penyakit. Charomaini dan Ismail (2008) menyebutkan dalam penelitiannya bahwa tanaman sengon yang berasal dari beberapa provenan Papua (Irian Jaya) seperti Waga-waga, Hobikosi, Wamena dan Muliama Bawah lebih tahan terhadap serangan penyakit karat tumor. Pengendalian biologis adalah tindakan memanfaatkan agen hayati untuk menghambat perkembangan jamur U. tepperianum. Agen hayati yang efektif perlu dikaji dan diuji pada skala laboratorium dan lapangan. Jamur antagonis seperti Penicillium sp. dan Acremonium sp. dilaporkan dapat menghambat perkembangan jamur U. tepperianum dan beberapa jenis serangga juga dijumpai memakan karat tumor pada sengon di lapangan sehingga memiliki potensi sebagai agen hayati (Wiryadiputra, 2007). Pengendalian penyakit dengan agen hayati merupakan upaya yang paling efektif dan ramah lingkungan karena menggunakan musuh alami, seperti predator, parasitosis, patogen, maupun antagonis. Penggunaan mikroba antagonis seperti jamur endofit perlu diupayakan, pasalnya jamur endofit menghabiskan sebagian bahkan seluruh siklus hidup koloninya di dalam maupun di luar sel jaringan hidup tanaman inangnya, secara khas tanpa menyebabkan gejala penyakit yang nyata (Li et al., 2008). Sehingga jamur
5
endofit tidak harus bersaing dalam ekosistem yang baru dan kompleks pada tubuh inangnya (Chen et al., 1995 dalam Yulianti, 2013). Peranan endofit sebagai agensia hayati mulai banyak diteliti sejak diketahui adanya fenomena mengenai kemampuan tanaman dalam menghadapi stres biotik maupun abiotik terkait dengan keberadaan endofit di dalam jaringannya (Sturz et al., 2000). Webber (1981, dalam Yulianti, 2013) melaporkan terjadinya penurunan penyebaran penyakit Dutch pada pohon elm yang disebabkan oleh Ceratocystis ulmi. Setelah diteliti, ternyata vektor penyebar penyakit ini yaitu kumbang Physocnemum brevilineum yang juga menyerang pohon elm dan mengalami penurunan populasi akibat racun yang dihasilkan oleh jamur endofit Phomopsis oblonga. Jamur endofit merangsang pertumbuhan tanaman dan meningkatkan ketahanan inang terhadap jamur patogen (Perrig et al., 2007). Jamur endofit dapat ditemui pada sistem jaringan tumbuhan seperti daun, ranting atau akar. Menurut penelitian Prihatini (2012), ditemukan sebanyak 65 jenis jamur yang diisolasi dari jaringan daun Pinus radiata dengan identifikasi secara molekuler menggunakan metode direct PCR. Kelompok jamur endofit yang ditemukan pada tanaman inang dan berperan sebagai agen pengendali hayati antara lain adalah Fusarium solani, Acremonium zeae, Verticillium sp., Ampelomyces sp., Neotyphodium lolii (Gao et al., 2010). Identifikasi jenis jamur endofit yang bersimbiosis pada tanaman inang merupakan bagian dari upaya menggali potensi jamur endofit sebagai agen hayati pengendali penyakit. Identifikasi jamur endofit dapat dilakukan secara
6
morfologi maupun molekuler. Identifikasi secara morfologi dilakukan dengan memisahkan koloni yang berbeda pada media yang baru, seperti berbeda pada warna koloni, tekstur dan rata-rata waktu tumbuh koloni (Frohlich et al., 2000). Akan tetapi, susunan dari taksonomi morfospesies tidak dapat menggambarkan filogeni hingga tingkat spesies dan oleh karena itu diperlukan pendekatan identifikasi alternatif. Teknik identifikasi secara molekuler biasa dilakukan untuk mengatasi masalah taksonomi jamur (Takamatsu, 1998) dan beberapa penelitian juga menggunakan teknik ini untuk identifikasi jamur (Guo et al., 2000). Perbandingan sekuen pada gen penyandi ribosomal DNA dapat digunakan sebagai karakter untuk identifikasi molekular suatu organisme karena gen ini memiliki sekuen yang terkonservasi maupun variabel (Kurtzman dan Fell, 2006). Beberapa ribosomal DNA yang digunakan untuk mengidentifikasi suatu organisme eukariota hingga tingkat spesies yaitu small sub unil (SSU) (18S), internal transcribed spacer (ITS), 5.8 S, large sub unit (LSU) (18S), 5S, dan intergenic spacer (IGS) (Ediningsari, 2008). Pada penelitian kali ini ribosomal DNA yang digunakan sebagai sekuen karakter untuk identifikasi jamur endofit tanaman sengon adalah internal transcribed spacer (ITS). Daerah D1/D2 LSU (18S) juga dapat digunakan untuk mengidentifikasi jamur hingga tingkat spesies (Ediningsari, 2008), tetapi daerah D1/D2 LSU yang identik dapat ditemukan pada spesies jamur yang memiliki kekerabatan sangat dekat sehingga daerah sequence D1/D2 LSU tidak dapat digunakan untuk mengidentifikasi spesies-spesies tersebut (Fell et
7
al., 2004). Sementara itu, daerah ITS memiliki variasi sekuen yang lebih tinggi dari daerah D1/D2 LSU karena daerah tersebut merupakan daerah noncoding yang memiliki laju mutasi lebih tinggi dari daerah coding (SSU dan LSU) (James et al., 1996). Dengan demikian, identifikasi dengan analisis sekuen ITS dapat dilakukan pada beberapa spesies yang memiliki kekerabatan dekat. Beberapa penelitian yang pernah dilakukan di antaranya, Guo et al., (2000) menggunakan daerah ITS pada rDNA untuk membedakan Mycelia sterilia pada tanaman Livistona chinensis. Sette et al., (2006) mengidentifikasi jamur endofit dari tanaman kopi hingga tingkat genus dan hasilnya sesuai dengan karakter morfologi jamur sebelumnya. Menurut Li et al., (2007), 48,9% jamur non-sporulating dari Camptotheca acuminata teridentifikasi berdasarkan analisis sequens ITS rDNA. Youngbae et al., (1997 dalam Chen et al., 2010) membuktikan bahwa ITS dapat menyelesaikan hubungan kekerabatan pada tingkat takson yang lebih rendah seperti pada tingkat genus hingga spesies. Penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan data jenis jamur endofit yang ada pada tanaman sengon bibit asal Wamena yang memiliki tingkat resistensi tinggi terhadap penyakit karat tumor. Data jenis jamur yang diperoleh dari penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai sumber jamur endofit yang berpotensi untuk dikembangkan sebagai agen pengendali penyakit karat tumor dan mendukung kegiatan biosekuriti tanaman hutan.
8
B. Rumusan Masalah a. Bagaimana karakter morfologi isolat jamur endofit yang diisolasi dari organ daun, tangkai daun, ranting dan kulit batang pohon sengon provenan Wamena? b. Jenis jamur endofit apa saja yang terdapat pada jaringan daun, tangkai daun, ranting dan kulit batang tanaman sengon provenan Wamena?
C. Tujuan a. Mempelajari karakter morfologi isolat jamur endofit dari organ daun, tangkai daun, ranting dan kulit batang pohon sengon provenan Wamena. b. Mengidentifikasi jenis jamur endofit yang terdapat pada organ daun, tangkai daun, ranting dan kulit batang tanaman sengon provenan Wamena menggunakan penanda molekuler ITS.
D. Manfaat Penelitian 1. Sebagai database jenis jamur endofit yang ada pada tanaman sengon provenan Wamena. 2. Sebagai informasi pendukung dalam melihat peranan jamur endofit bagi lingkungannya seperti sebagai biosekuriti tanaman hutan.
53
BAB V PENUTUP A. Kesimpulan Dari 98 kultur isolat jamur endofit dari organ daun, tangkai daun, kulit batang, dan ranting pohon sengon provenan Wamena diperoleh 20 isolat dengan karakter morfologi yang berbeda. Berdasarkan analisis penanda molekuler ITS, sebagian isolat teridentifikasi hingga tingkat genus, yaitu genus Colletotrichum (isolat Pf64 dan Pf25), genus Fusarium (isolat Pf39, Pf58, Pf73, Pf76, Pf91, Pf103), genus Phomopsis (isolat Pf26, Pf39, Pf79, Pf90, Pf109), genus Phialemonium (isolat Pf65), genus Penicillium (isolat Pf23), dan genus Lasiodiplodia (isolat Pf110). Dan dua isolat lainnya hanya teridentifikasi hingga tingkat ordo Pleosporales yaitu isolat Pf44 dan Pf46. Isolat yang paling sering ditemukan yaitu jamur endofit dari genus Fusarium (40%), dan genus Phomopsis (telomorf Diaporthe) (20%). Kelas Sordariomycetes merupakan kelompok terbesar (75%) endofit yang ditemukan pada pohon sengon provenan Wamena. B. Saran Saran dari penelitian ini adalah adalah: 1. Diperlukan sekuen rDNA lain yang lebih terkonservasi untuk dapat mengidentifikasi isolat jamur endofit hingga tingkat spesies. 2. Diperlukan penelitian mengenai bioaktivitas dari setiap isolat jamur endofit untuk menyeleksi isolat yang berpotensi sebagai agen biologis di alam.
53
54
DAFTAR PUSTAKA Agrios, G. N. 1996. Ilmu penyakit tumbuhan. (M. Busnia, Terj.). Gadjah Mada University Press. Yogyakarta. Terjemahan dari Plant’s pathology 3rd ed. Alves, A., Crous, P.W., Phillips, A.J.L. 2008. Morphological and molecular data reveal cryptic speciation in Lasiodiplodia theobromae. Fungal diversity. 28: 1-13. Anggraeni, I., Lelana, N. E. 2011. Penyakit karat tumor pada sengon. Badan Penelitian dan Pengembangan Kehutanan. Jakarta. Anggraeni, I. 2008. Pengendalian penyakit karat tumor (Gall Rust) pada sengon (Paraseranthes Falcataria) di RPH Pandantoyo, PKPH Pare, KPH Kediri. Makalah Workshop Penanggulangan Karat Puru pada Tanaman Sengon. Balai Besar Penelitian Bioteknologi dan Pemuliaan Tanaman Hutan. 19 Nop 2008. Barnett, H. L & Hunter, B. B. 1998. Illustrated genera of imperfect fungi. Edisi ke-2. Burgress publishing company. West Virginia. Barnett, J.A., R.W. Payne, and D. Yarrow. 2000. Yeast: Characteristics and identification. 3rd Ed. Cambridge university press. Cambridge: ix + 1139 hlm Bessey, E. A. 1979. Morphology and taxonomy of fungi. Edisi ke-3. Vikas publishing house PVT LTD. New Delhi. Bills, G. F. & Polyshook, J.D. 1992. Recovery of endophytic fungus from Chamaechy parasthyoides. Sydowia. 44: hlm. 1-12. Boddy, L. & Griffith, G.S. 1989. Role of endophytes and latent invasion in the development of decay communities in sapwood of angiospermous trees. Dalam: Udayanga, D., Liu, X., McKenzie, E. H., Chukeatorote, E., Bahkali, A.H., Hyde, K. D. 2011. The genus Phomopsis: Biology, applications, species concepts and names of common phytopathogens. Fungal diversity. 50: 189-225. Carrol & Clay, K. 1988. Fungal endophytes of grasses: a Defensive mutualism between plants and fungi. Ecology. 69:10-16. Charomaini & Ismail, B. 2008. Indikasi awal ketahanan sengon (Falcataria moluccana) provenan Papua terhadap jamur Uromycladium tepperianum
54
55
penyebab penyakit karat tumor (Gall Rust). Jurnal pemuliaan tanaman hutan. Vol. 2 No. 2: September 2008. Chen, X. Y., Qi, Y.D., Wei, J. H., Zhang, Z., Wang, D. L., Feng, J. D,. Gan, B. C. 2011. molecular identification of endophytic fungi from medicinal plant Huperzia Serrata based on rDNA ITS analysis. Microbiol biotechnol. 27: 495-503. Dewi, G. A. 2011. Identifikasi molekuler dan keragaman genetik patogen penyebab penyakit pembuluh kayu pada tanaman kakao berdasarkan sekuens ITS. [Thesis] Universitas Udayana. Bali. Dismukes, W. E., Pappas, P.G., Sobel, J.D. 2003. Clinical mycology: Laboratory aspects of medical mycology. Oxford University Press, Inc. New York Dwiyanti, F. G. 2009. Keragaman sengon solomon (Paraserianthes falcataria (L) Nilsen) pada uji keturunan di hutan percobaan Cirangsad. [Skripsi] Fakultas Kehutanan Institut Pertanian Bogor. Ediningsari, Anisa R. 2008. Identifikasi khamir dari perairan mangrove dan laut cagar alam pulau rambut berdasarkan daerah Internal Transcribed Spacer (ITS). [Skripsi] Fakultas MIPA Universitas Indonesia. Depok Elfina, D., Martina, A., Roza., R.M. 2013. Isolasi dan karakterisasi fungi endofit dari kulit buah manggis (Garcinia mangostana L) sebagai Antimikroba terhadap Candida albicans, Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. [Skripsi]. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Kampus Binawidya Pekanbaru. Faeth, S. H & Fagan, W.F. 2002. Fungal endophytes: common host plant syimbionts but uncommon mutualists. Integrative and comperative biotechnology. 42: 360-368. Fell, J.W., A, Statzell-Tallman & C.P. Kurtzman. 2004. Lachancea meyersii sp. nov., an ascosporogenous yeast from mangrove regions in the Bahama island. Studies in mycology. 50: 359-363 Frohlich, J., Hyde, K.D., Petrini, O. 2000. Dalam: Guo, L.D., K.D. Hyde and E.C.Y, Liew. 2000. Identification of endophytic fungi from Livistona Chinensis based on morphology and rDNA sequences. Research New Phytol. 147: 617-630 Fujita, S., Y. Senda, S. Nakaguchi and T. Hashimoto. 2001. Multipex PCR using Internal Transcribed Spacer 1 and 2 regions for rapid detection and
56
identification of yeast strains. Journal of clinical microbiology. 39 (10): 3617-3622 Gams, W., McGinnis, M.R. 1983. Phialemonium, a new anamorph genus intermediate between Phialophora and Acremonium. Mycologia. 75: 977987. Gandjar, Indrawati., Sjamsuridjal, W. 2006. Mikologi: dasar dan terapan. Yayasan obor Indonesia. Jakarta. Gao, F.K., Dai, C.C., Liu, X.Z. 2010. Mechanisms of fungal endophytes in plant protection against pathogens. African journal of microbiology research. 4: 1346-1351. Gardes, M., Bruns, T.D. 1993. ITS primer with enhanced specificity for basidiomycetes application to the identification of mycorrhizae and rusts. Molecular ecology. 2:113-118 Geiser, D.M. 2004. a Higher Level phylogenetic clasification of the fungi. Mycological research. 111: 509-547. Glen, M., Tommerup, I,C., Bougher, N.L. & O’Brien, P.A. 2002. Are sebacinaceae common and widespread ectomycorrhzal associates of eucalyptus species in australian forest?. Original paper of mycorrhyza. 12: 243-247 Guaro, J., J. Gene, A.M. Stchigel. 1999. Developments in fungal taxonomy. Cllinical microbiology reviews. 12(3): 454-500 Guo, L.D., K.D. Hyde and E.C.Y, Liew. 2000. Identification of endophytic fungi from Livistona chinensis based on morphology and rDNA sequences. Research new phytol. 147: 617-630 Hall, B. G. 2004. Phylogenetic trees made easy: a how to manual. 2nd ed. Sinauer assiciates, Inc., Massachusets: xiii + 221 hlm. [ICRAF] World Agroforestry Center. 2006. Agroforestry tree database. Paraserianthes falcataria. Dalam: Dwiyanti, F. G. 2009. Keragaman sengon solomon (Paraserianthes falcataria (L) Nilsen) pada uji keturunan di hutan percobaan Cirangsad. [Skripsi] Fakultas Kehutanan Institut Pertanian Bogor.
57
Ilyas, Muhammad. 2006. Isolasi dan identifikasi kapang pada relung rrizosfir tanaman di kawasan cagar alam gunung Mutis, Nusa Tenggara Timur. Biodiversitas. Vol. 7 No. 3: 216-220. James, S.A., M.D. Collins, I.N. Roberts. 1996. Use of an rRNA Internal Transcribed Spacer of the genera Zygosaccharomyces and Torulaspora. International journal of systematic bacteriology. 46(1): 189-194. James, R.S, Ray, J., Tan, Y.P, Shivas, R.G. 2014. Colletotrichum siamense, C. theobromicola and C. queenslandicum from several plant species and the identification of C. asianum in the Northern Territory, Australia. Autralian plant pathology. 13314-014-0138 Jamil, I. 2005. Analisis sekuen daerah its DNA ribosom (rDNA) dan desain primer untuk mendeteksi Phytophthora palmivora butl pada kakao. Dalam: Mulyatni, A.S., Priatmojo, A., Purwantara, A. 2011. Sekuen Internal Trancribed Spacer (ITS) DNA ribosomal Oncobasidium theobromae dan jamur sekerabat pembanding. Menara perkebunan. 79(1): 1-5. Johnston, C.L. 2008. Identification of Penicillium species in the South African litchi export chain. [Thesis]. Faculty of natural and agricultural sciences University of Pretoria. South Africa. Jos, A.M.P., Jens, C. F., Samson, R. 2010. Taxonomy of Penicillium citrium and related species. Fungal diversity. 44: 117-133. Kanematsu, S., Kobayashi, T., Kudo, A., Ohtsu, Y. 1999. Conidial morphology, pathogenicity and culture characteristics of Phomopsis isolates from peach, Japanese pear and apple in Japan. Ann phytopathol society Japan. 65:264273. Katsu, M., A. Kidd, A. Ando, M.L. Moretti-Branchini, Y. Mikami, K. Nishimura, W. Meyer. 2003. The Internal Transcribed Spacer and 5.8S rRNA gene show extensive diversity among isolates of the Cryptococcus neoformans species complex. FEMS yeast research. 1608:1-12. Kirk, P.M., Cannon, P.F., Minter, D.W., Staplers, J.A. 2008. Dictionary of the fungi 10th edn. CABI bioscience. UK. Krisnawati, H., Varis, E., Kallio, M., Kanninen, M. 2011. Paraserianthes falcataria (L.) nielsen, ekologi, silvikultur dan produktivitas. Central for international forestry research. Bogor.
58
Kruys, Å., Eriksson, O.E., Wedin, M. 2006. Phylogenetic relationships of coprophilous Pleosporales (Dothideomycetes, Ascomycota), and the classification of some bitunicate taxa of unknown position. Mycology. 110:527–536. Kurtzman, C.P., P.A. Blanz. 1998. Ribosomal RNA/DNA sequence comparison for assessing phylogenetic relationship. Dalam: Ediningsari, Anisa R. 2008 Identifikasi khamir dari perairan mangrove dan laut cagar alam pulau rambut berdasarkan daerah Internal Transcribed Spacer (ITS). [skripsi] Fakultas MIPA Universitas Indonesia. Depok. Kurtzman, C.P., T. Boekhout, V. Robert, J.W.Fell, T. Deak. 2003. Methods to identify yeasts. Dalam: Ediningsari, Anisa R. 2008. Identifikasi khamir dari perairan mangrove dan laut cagar alam pulau rambut berdasarkan Daerah Internal Transcribed Spacer (ITS). [skripsi] Fakultas MIPA Universitas Indonesia. Depok. Kurtzman, C.P. and J.W. Fell. 2006. Yeast systematics and phylogeny implications of molecular identification methods for studies in ecology. Dalam: Ediningsari, Anisa R. 2008. Identifikasi khamir dari perairan mangrove dan laut cagar alam pulau rambut berdasarkan daerah Internal Transcribed Spacer (ITS). [skripsi] Fakultas MIPA Universitas Indonesia: Depok Li, J., Zhao J.L., Xu, L.J., Zhou, L.G., Li, X. 2008. Endophytic fungi from rhizomes of Paris polyphylla Var. yunnanensis. World journal microbiol biotechnol. 24:733-737 Li, N., Chen, X., Zhu, D.Y. 2007. Effect of the fungi on the rooting of Huperzia Serrata and mechanism. Jiangsu agritechnology science. (5): 181-184. Li, W.H and D. Graur. 1991. Fundamentals of molecular evolution. Sinauer associates, Inc. Publisers, Sunderland: 18Altschul, S.F., W. Gish, W. Miller, E.W. Myers and D.J. Lipman. 1990. Basic Local Aligment Search Tool. Journal of molecular biology. 215: 403-410 Martawijaya, A. Kartasujana, I., Mandang, Y.I., Prawira, S.A. dan Kadir, K. 1989. Atlas kayu Indonesia jilid II. Pusat Penelitian dan Pengembangan Hasil Hutan. Bogor. Nair, K.S.S dan Sumardi. 2000. Insect pests and diseases of major plantation species. Research efforts and literature. Center of International Forestry Research. Bogor.
59
Notoatmodjo, S.S. 1963. Cara-cara mencegah serangan masal dan boxtor xystrocera festiva pascoe pada tegakan Albizia falcataria. Laporan lembaga penelitian hutan No. 92. Bogor. Noverita, Fitria., D. Sinaga, E. 2009. Isolasi dan uji aktivitas antibakteri jamur Endofit dari daun dan rimpang Zingiber ottensii Val.. Jurnal farmasi Indonesia Vol. 4 No.4: 171-176 Olliphant. 2006. BioEdit. Dalam: Ediningsari, Anisa R. 2008. Identifikasi khamir dari perairan mangrove dan laut cagar alam pulau rambut berdasarkan daerah Internal Transcribed Spacer (ITS). [skripsi] Fakultas MIPA Universitas Indonesia. Depok. Pavlic, D., Slippers, B., Coutinho, T.A., Gryenhout, M., Wingfield, M.J. 2004. Lasiodiplodia gonubiensis sp. nov., a new Botryosphaeria anamorph from native Syzygium cordatum in South Africa. Study of mycology 50:313–322. Perrig, D., Boiero, M.L., Masciarelli, O.A., Penna, C., Ruiz, O.A., Cassán, F.D., Luna, M.V. 2007. Plant growth promoting compounds produced by two aronomically import strains of Azospirillum Brasilense, and implications for inoculant formulation. Microbiology biotechnology. 75: 1143-1150 Petrini, O., T. N. Sieber, L. Toti and O. Viret. 1992. Ecology metabolite production and substrate utilization in endophytics fungi. Dalam Sinaga, E. 2009. Isolasi dan uji kemampuan antifungal bakteri endofit dari andaliman (Zanthozylum acanthopodium DC.) Terhadap fungi perusak Makanan. [Skripsi] Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara. Medan. Photita, W., Taylor, P. W. J., Ford, R., Kevin, D. H., Lumyong. S. 2005. Morphological and molecular characterization of Colletotrichum species from herbaceus plant in Thailand. Fungal diversity. 18: 117-133. Price, T. V. 2000. Plant parasitic nematodes. Pelatihan Nematodologi. Jakarta. Prihatini, Istiana. 2012. Identifikasi jamur endofit pada tanaman hutan menggunakan penanda molekuler. Prosiding seminar nasional bioteknologi hutan, 9 Oktober 2012. Hal: 109-118 Proia, L. A., Hayden, M.K., Kammeyer, P.L., Ortiz, K., Sutton, D.A, Clark, T., Schtoers, H., Summerbell, R.C. 2004. Phialemonium: an emerging mold pathogen that caused 4 cases of hemodialysis-associated endovascular infection. Clinical infectious diseases. 39: 373-9.
60
Punithalingam, E. 1980. Plant diseases attributed to Botryodiplodia theobromae. Dalam: Alves, A., Crous, P.W., Phillips, A.J.L. 2008. Morphological and Molecular data reveal cryptic speciation in Lasiodiplodia theobromae. Fungal diversity. 28: 1-13. Purwanto. 2011. Isolasi dan identifikasi senyawa penghambat polimerisasi HEM dari fungi endofit tanaman artemisia annua L. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta. Rahayu, Sri. 2008. Penyakit karat tumor pada sengon. Makalah Workshop Penanggulangan Karat Puru pada Tanaman Sengon. Balai Besar Penelitian Bioteknologi dan Pemuliaan Tanaman Hutan. 19 Nop 2008. Reader, U. and Broda, P. 1985 Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Dalam: Prihatini, Istiana. 2012. Identifikasi jamur endofit pada tanaman hutan menggunakan penanda molekuler. Prosiding seminar nasional bioteknologi hutan 09 Oktober 2012. Hal: 109-118 Rhoden, S. A., Garcia, A., Rubin Filho, C. J., Azevedo, J. L., Pamphile, J. A. 2012. Phylogenetic diversity of endophytic leaf fungus isolates from the medicinal tree Trechilia elegans (Meliaceae). Genetics and molecular research. 11 (3): 2513-2522. Rubini, M.R., Silva-Ribeiro, R.T., Pomella, A.W., Maki, C.S., Araujo, W.L., dos Santos, D.R. and Azevedo, J.L. 2005. Diversity of endophytic fungal community of cacao (Theobroma cacao L.) and biological control of Crinipellis perniciosa, causal agent of witches' broom disease. International journal of biological sciences. 1: 24-33. Sakayaroj, J., Preedanon, S., Supaphon, O., Jones, E. B. G., Pongpaichit, S. 2010. Phylogenetic diversity of endophyte assemblages associated with the tropical seagrass Enhalus acoroides in Thailand. Fungal diversity. 42: 2745. Sambrook, J. and D.W. Russel. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd ed. Cold spring harbor laboratory press. New York: xxvii:11-18 Sette, L.D., Passaridi, M.R.Z., Delarmelina, C., Salati, F., Duarti, M.C.T. 2006. Molecular characterization and antimicrobial activity endophytic fungi from coffe plants. World journal micobiol biotechnol. 22:1185-1195 Shiono Y, Yokoi M, Koseki T, Murayama T, Aburai N, Kimura K. 2010. Allantopyrone A, a new alpha-pyrone metabolite with potent cytotoxicity from an endophytic fungus, Allantophomopsis lycopodina KS-97. Dalam:
61
Selim KA, El-Beih AA, AbdEl-Rahman TM, El-Diwany AI. 2012. Biology of Endophytic Fungi. Current research in environmental & applied mycology. 2(1): 31–82. Sikora, R. A. & Niere, B. 2003. Endophytic microbial diversity and plant nematode management in African agriculture, Neuenschwer P, Borgemeister C and Langewald J (Eds), Biological control in IPM systems in Africa. CAB International. Wallingford. 179-192. Siregar, I.Z., Tedi, Y. 2008. Kayu sengon. Penebar Swadaya. Bandung. Soerianegara, I. dan Lemmens, R.H.M.J. 1993 Plant resources of South-East Asia 5(1): Timber trees: major commercial timbers. Pudoc Scientific Publishers. Wageningen. Southcott, K. A & Johnson, J. A. 1997. Isolation of endophytes from two species of palm, from Bermuda. Canadian Journal of Microbiology. 43: 789792.Stoval, M.E. (1987). An investigations of the fungal Balansis cyperi and its effect on purple nutsedge. Cyprus rotundus. Dalam: Suniarsih, N. L., Suada, I. K., Suniti, N.W. (2014). Identifikasi jamur endofit dari biji padi dan uji daya hambatnya terhadap Pyricularia oryzae Cav. Secara in Vitro. Agroteknologi Tropika. 3: 52-55. Stalpers, J.A. 1978. Identification of wood-inhabiting Aphyllophorales in pure culture. Studies in Mycology. 16. Sturz, A.V., B.G. Christie, J. Nowak. 2000. Bacterial endophytes: potential role in developing sustainable systems of crop production. Critical Review of Plant Science. 19:1-30 Starr, C., R. Taggart. 2004. Biology: The unity and diversity of life. 10th ed. Brooks/Cole-Thomson Learing. Belmont: xxv+1022 hlm. Sunariasih, L. Niputu., Suada, I ketut., Suniti, Ni Wayan. 2014. Identifikasi jamur endofit dari biji padi dan uji daya hambatnya terhadap Pyricularia oryzae Cav. Secara in Vitro. Agroteknologi Tropika. 3: 52-55. Sunarmi, N. 2010. Isolasi dan identifikasi jamur endofit dari akar tanaman kentang sebagai antijamur (Fusarium sp, Phytoptora infestans) dan antibakteri (Ralstonia solanacaerum). [skripsi]. Universitas Islam Negeri Malang Maulana Malik Ibrahim. Malang. Syahirul, A. 2008. Isolasi dan identifikasi jamur endofit dari biji pinang (Areca catechu l.) sebagai penghasil senyawa antibakteri terhadap bakteri Vibrio
62
cholerae dan Staphylococcus aureus. [Skripsi]. Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Malang. Takamatsu S. 1998. PCR Applications in Fungal Phylogeny, dalam: Bridge, PD, Arora, DK, Reddy, CA, Elander, RP, eds. Applications of PCR in mycology. Wallingford. UK: CAB International: 125-152 Tamura, K., Ddudley, J., Nei, M and Kumar, S. 2007. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular biology evolution. 24: 1596-1599 Tan, R. X dan Zou, W. X. 2001. Endophytes: A rich source of functional metabolites. Institute of Functional Biomolecule. School of life sciences. Nanjing University. Udayanga, D., Liu, X., McKenzie, E. H., Chukeatorote, E., Bahkali, A.H., Hyde, K. D. 2011. The genus Phomopsis: Biology, applications, species concepts and names of common phytopathogens. Fungal diversity. 50: 189-225. Vossen, V.D., J.M.B.M., H. Rahaoui, M.W.C.M. De Nus & B.J. Jartog. 2003. PCR methods for tracing and detection of yeasts in the chain. Dalam: Ediningsari, A. R. (2008). Identifikasi khamir dari perairan mangrove dan laut cagar alam pulau rambut berdasarkan daerah Internal Trancribed Spacer (ITS). [Skripsi]. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Indonesia. 115 hal. Wahyuningtias, Retno. R. 2013. Isolasi dan identifiksi fungi endofit pada jaringan muda tanaman gaharu (Aquilaria malaccencis Lamk.). [Skripsi]. Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara. 31 hal. White, T.J., Bruns, T.D., Lee, S., and Taylor, J.W. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. Dalam: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JS, White TJ,ads. PCR Protocols: a guide to methods and applications. New York, USA: Academic Press, 315-322 Wiryadiputra, S. 2007. Epidemi penyakit tumor pada sengon (Paraserianthes falcataria) di Jawa Timur Indonesia. Jurnal ilmu kehutanan. Vol. 1 No. 1 (2007). Youngbae S, Kim S, Park CW. 1997. Dalam: Chen XY, Yao DQ, Jian HW, Zheng Z, De LW, Jin DF, and Bing CG. 2010. Molecular identification of endophytic fungi from medicinal plant Huperzia serrata based on rDNA analysis. World journal micobiology bitechnology. 27: 495-503
63
Yulianti, Titiek. 2013. Pemanfaatan endofit sebagai agensia pengendali hayati hama dan penyakit tanaman. Buletin tanaman tembakau, serat & minyak industri. 5(1): 40-49. Zabalgogeazcoa, I. 2008. Fungal endophytes and their interaction with plant pathogens. Spanish journal of agricultural research. 2008, 6 (special issue), 138- 146. Zhang, Y., W. Pedro, L., Conrad, Hyde., K.D. 2012. Pleosporales. Fungal diversity. 53:1-221.
64
LAMPIRAN Lampiran 1. Hasil Subkultur Jumlah Kultur Murni Hasil Subkultur Isolat Jamur Endofit Pohon Sengon Daerah asal isolat
Jumlah isolat dari jaringan tumbuhan Daun Tulang Ranting Kulit daun batang batang
Hobikosi
Kode isolat
J51/L J51/LS 2 2 2 2 J51/B J51/T Nifasi J35/L J35/LS 2 1 0 2 J35/B J35/T Worbeg J37/L J37/LS 2 1 1 3 J37/B J37/T Keterangan : /L = daun, /LS = Tangkai daun, /B = Ranting, /T = Kulit batang
64
65
Lampiran 2. Daftar sekuen referensi dari genbank (GB) yang digunakan dalam analisis filogenetik. No. Akses GB JF710584 EU732734 FJ194523
species
No. Akses GB JN418795 NR_103636 AB299414
Microdiplodia sp. E10 Mucor guilliermondii Neosartorya coreana
AB299413
Neosartorya laciniosa
GU325660
Penicillium camemberti
NR_111492
Penicillium chrzaszczii
JQ901861
Penicillium citrinum
JN617685 NR_121516
Penicillium copticola Penicillium copticola
AY313621
Penicillium decaturense
JN617681 NR_111495 NR_111488 DQ123664 AF455437 NR_121515
Penicillium sanguifluum Penicillium shearii Penicillium steckii Penicillium sp. P. roseopurpureum Penicillium terrigenum Peyronellaea arachidicola Phialemoniopsis curvata Phialemonium dimorphosporum Phialemoniopsis ocularis
GQ305306 NR_111855 AB245446 HM595720 DQ459834 KC817122
Alternaria sesami Alternaria tenuis Ascochyta pinodes Colletotrichum fructicola Colletotrichum gloeosporioides Colletotrichum incarnatum Colletotrichum thailandicum Diaporthe carpini Diaporthe cf. nobilis Diaporthe endophytica Didymella fabae Diaporthe novem Diaporthe sp. MI 02 Fusarium asiaticum Fusarium asiaticum F. chlamydosporum
KF494038
F.chlamydosporum
KF679754
KF493867
Fusarium equiseti
EU035984
KJ000430
Fusarium fujikuroi
JN559402
KF494108
Fusarium oxysporum
KJ573444
KJ185130 AY266402 GQ369600 JN050242 KC343044 KC343150 NR_111847
KJ767073 KF918580 AB563193 KJ458978 KM051401 JF740930 KF428712 KJ801959 GQ924900 KJ638946 AB738850 KJ756381
Fusarium proliferatum Fusarium solani Fusarium sp. MF-27 Fusarium sp. 079M Fusarium sp. BAB Fusarium sp. NRRL Fusarium sp. Fusarium verticillioides Colletotrichum acutatum Glomerella cingulata Glomerella septospora Lasiodiplodia
species
KF850377
Phoma medicaginis
JF502462 EU573028 JQ613999 JN198407 HM439635 JF441201
Phoma sp. 1-12 Peyronellaea pinodella Phomopsis asparagi Phomopsis fukushii Phomopsis occulta Phomopsis sp. RP
JX139559
Phomopsis sp. A5
KJ739488
Diaporthe vaccinii
KC005686
Phyllosticta sp. JF
AB938189
Pleospora herbarum
HQ008911
Pleosporales sp. E8006
66
No. Akses GB KJ885546 KC218447 AF383965
species sp.CMB Lasiodiplodia jatrophicola Massarinaceae sp. Fataf Massarina walkeri
No. Akses GB
species
JN545760
Rhizopycnis sp. E9303f
KJ471488
Rhizopycnis vagum
Catatan: Sekuens yang digunakan sebagai referensi adalah sekuen yang memiliki kecocokan paling tinggi (closely related species) terhadap sekuen sampel (query)
67
Lampiran 3. Hasil Eelektroforesis produk PCR ITS1F-ITS4 ke-20 sampel isolat jamur endofit pohon sengon Provenance Wamena
M
pf pf Pf 23 25 26
pf 37
pf Pf 39 44
M
pf 46
pf pf pf pf 48 58 64 48
500 400 200 100
500 400 200 100
Gambar. Elektroforesis PCR ITS1F-4 sampel isolat Pf 23, 25, 26, 37, 39, 44 M
Gambar. Elektroforesis PCR ITS1F-4 sampel isolat Pf 46, 48, 58, 64, 65
pf pf pf pf pf pf 73 76 79 90 91 96
500 400 200 100
pf pf pf
M 103 109 110
500 400 200 100
Gambar. Elektroforesis PCR ITS1F-4 sampel isolat Pf 73, 76, 79, 90, 91, 96
Gambar. Elektroforesis PCR ITS1F-4 sampel isolat PF 103, 109, 110
68
Lampiran 4. Pohon filogenetik ke-20 isolat jamur endofit provenan Wamena Fusarium solani (KF918580) Fusarium sp. (KM051401) Pf91 Pf103 97 Pf76 Fusarium equiseti (KF493867) Fusarium chlamydosporum (KC817122) Pf73 76 Pf58 Fusarium sp. (JF740930) 78 Pf39 80 Fusarium oxysporum (KF494108) Fusarium proliferatum (KJ767073) Fusarium fujikuroi (KJ000430) 99 89 Fusarium verticillioides (KJ801959) Colletotrichum fructicola (KJ185130) 87 Colletotrichum ignotum (KC790967) Pf25 98 Pf64 53 Colletotrichum gloeosporioides strain (AY266402) 85 Colletotrichum incarnatum (GQ369600) 73 Diaporthe longicolla (KJ466980) Pf26 89 Phomopsis sp. (JF441201) Pf90 70 95 Phomopsis vaccinii clone FN-4-W1-1-6 internal transcribed spacer 1, 69 56 Pf79 59 Diaporthe helianthi (JQ936143) Diaporthe lusitanicae (KC343136) 38 Diaporthe endophytica (NR_111847) Pf109 Diaporthe sp. (AB245446) 72 Phialemonium dimorphosporum (JN559402) Phialemonium sp. (KF746157) 100 Phialemoniopsis ocularis (KJ573444) Pf65 Penicillium sanguifluum (JN617681) 61 Penicillium camemberti (GU325660) 100 Pf23 Penicillium sp. (DQ123664) 54 Penicillium copticola (NR_121516) Penicillium roseopurpureum (AF455437) Lasiodiplodia sp. (KJ756381) Lasiodiplodia jatrophicola (KJ885546) 100 Pf110 Massarina walkeri (AF383965) Phoma sp. (JF502462) 93 Massarinaceae sp. (KC218447) 51 Pf44_ Pf46 55 Pleosporales sp. (HQ008911) Phoma medicaginis (KF850377) Mucor guilliermondii (NR_103636)
Sordariomycetes
Eurotiomycetes
Dothideomycetes
0.05
Analisis filogenetik menggunakan Maximum Likelihood model Tamura-Nei terhadap sekuen ITS jamur endofit sengon. Sekuen jamur Mucor guilliemondii digunakan sebagai outgroup dalam analisis ini.
69
Lampiran 5. Proses PCR Komposisi PCR Master Mix Bahan
Konsentrasi
Volume
MgCl2
2.0 mM
1µl
5X Buffer PCR BioLine
67mM Tris HCl; 16mM (NH4)2SO4 (dalam NH4- based reaction buffer)
5µl
BSA
0.2µg/µl
0.5µl
Primer Forward (ITS1F)
5µM
0.25µl
Primer Reverse (ITS4)
5µM
0.25µl
dNTP
200 mM
0.25µl
Mangotaq Polymerase by Bioline
0.02units/µL
0.1µl
Sample genomic DNA
10-20 ng
ddH2O
-
5µl 12.65µl
Cycling Protocol of amplification PCR Fase Fase denaturation Fase amplifikasi (35 siklus) denaturation annealing extention Fase final extension Duration of protocol
Suhu 95 ºC
Waktu 120 sec
95ºC 55ºC 72ºC 72ºC
30 sec 30 sec 60 sec 600 sec 2 hr 3 min
Primer ITS Primer ITS 1F ITS 4
Urutan basa DNA (CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA) (Gardes and Brun, 1993) (GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG) (White et al., 1990)
Keterangan: Konsentrasi Primer 5 µM (pmol/ µl) dalam buffer TBE
70
Lampiran 6. Keterangan Kode Isolat
Kode Sampel Pf23 Pf58 Pf25 Pf26 Pf90 Pf91 Pf46 Pf48 Pf37 Pf96 Pf64 Pf65 Pf39 Pf44 Pf103 Pf109 Pf110 Pf73 Pf76 Pf79
Identitas Isolat J51/1/1/L/4 J51/3/1/L/7 J35/1/1/L/6 J35/2/1/L/7 J37/3/1/L/2 J37/1/1/L/3 J51/1/1/LS/2 J51/1/1/LS/4 J35/2/1/LS/5 J37/3/1/LS/1 J51/3/3/B/3 J51/3/3/B/4 J35/2/1/B/1 J35/2/1/B/6 J37/1/1/B/1 J37/1/1/B/7 J37/3/1/B/8 J51/3/1/T/1 J51/3/3/T/4 J37/2/1/T/1
Keterangan Asal Organ Lokasi Daun Hobikosi Daun Hobikosi Daun Nifasi Daun Nifasi Daun Worbeg Daun Worbeg Tangkai Daun Hobikosi Tangkai Daun Hobikosi Tangkai Daun Nifasi Tangkai Daun Worbeg KulitBatang Hobikosi KulitBatang Hobikosi KulitBatang Nifasi KulitBatang Nifasi KulitBatang Worbeg KulitBatang Worbeg KulitBatang Worbeg Ranting Hobikosi Ranting Hobikosi Ranting Worbeg
71
Lampiran 7. Hasil pengamatan morfologi dan mikroskopis 20 sampel isolat jamur endofit pohon sengon provenance Wamena No 1
Kode Sampel Pf23
Koloni
Mikroskopis Konidia Phialides Klamidiospora
Surface
Reverse 400X
2
1000X
Pf25
Klamidiospora
Surface
Reverse 400X
3
1000X
Pf26 Klamidiospora Klamidiospora
Surface
Reverse 400X
1000X
72
(Lanjutan) No Kode Sampel 4 Pf37
Koloni
Hifa
Konidia
Surface
5
Klamidiospora
Konidiofor
400X
1000X
Reverse
Pf39 Konidiofor
Klamidiospora
Surface
6
Reverse 400X
1000X
400X
400X
Pf44 Hifa
Surface
Reverse
73
(Lanjutan) No Kode Sampel 7 Pf46
Koloni
Hifa
Hifa
Surface
Reverse 400X
8
1000X
Pf48 Klamidiospora Clamps
Surface
Konidiofor
Reverse 400X
9
Konidia
1000X
Pf58
Makrokonidia
Surface
Konidiofor
Reverse 400X
1000X
74
(Lanjutan) No Kode Sampel 10 Pf64
Koloni
Hifa Hifa
Klamidiospora
Surface
Klamidiospora
Reverse 400X
11
1000X
Pf65 Hifa
Konidia
Surface
Reverse 400X
12
1000X
Pf73 Mikrokonidia Konidiofor
Surface
Reverse 400X
1000X
75
(Lanjutan) No Kode Sampel 13 Pf76
Koloni
Hifa
Rantai Klamidospora
Surface
Inti sel
Reverse 400X
14
Konidiofor
1000X
Pf79
Klamidiospora Konidia
Surface
Konidiofor
Reverse 400X
15
1000X
Pf90 Klamidiospora Hifa
Surface
Reverse 400X
1000X
76
(Lanjutan) No Kode Sampel 16 Pf91
Koloni
Hifa
Konidiofor
Klamidiospora
Makrokonidia
Surface
Reverse 400X
17
1000X
Pf96 Klamidiospora Hifa
Surface
Reverse 400X
18
1000X
Pf103 Konidiofor
Hifa
Surface
Klamidiospora
Reverse 400X
1000X
77
(Lanjutan) No Kode Sampel 19 Pf109
Koloni
Surface
Hifa
Reverse
Klamidiospora
400X 20
400X
Pf110
Konidia
Surface
Hifa
Reverse 400X
1000X
Klamidiospora
78
Lampiran 8.Hasil Sequencing
79
80
81
82
83
84
85
86
87
