Identifikace geneticky modifikovaných organismů (GMO) v plodinách pro výrobu potravin a potravinách

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav pěstování, šlechtění rostlin a rostlinolékařství

Identifikace geneticky modifikovaných organismů (GMO) v plodinách pro výrobu potravin a potravinách Disertační práce

Vedoucí práce:

Vypracovala:

Prof. Ing. Oldřich Chloupek, DrSc.

Ing. Veronika Kýrová

Brno 2011

PROHLÁŠENÍ

Prohlašuji, že jsem disertační práci na téma IDENTIFIKACE GENETICKY MODIFIKOVANÝCH ORGANISMŮ (GMO) V PLODINÁCH PRO VÝROBU POTRAVIN A POTRAVINÁCH vypracovala samostatně a použila jsem jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Disertační práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího disertační práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.

dne ………………………………………………… podpis doktoranda …………………………………

PODĚKOVÁNÍ

Děkuji prof. Ing. Oldřichu Chloupkovi, DrSc. za cenné rady, připomínky a odborné vedení, které mi poskytl při vypracování této disertační práce. Současně bych ráda poděkovala doc. MVDr. Jiřímu Ruprichovi, CSc. a doc. MVDr. Vladimíru Ostrýmu, CSc. ze Státního zdravotního ústavu (SZÚ) v Brně za poskytnutý materiál, podklady, přístrojové vybavení a cenné rady pro zpracování disertační práce. Zpracovaná disertační práce

byla

finančně

podpořena z prostředků projektu

MŽP/750/33/GMO/08 o zabezpečení uchovávání vzorků a ověřování metodik detekce geneticky modifikovaných organismů provedeného na SZÚ v Brně. Dále bych ráda poděkovala svému manželovi za podporu a tvorbu potřebného zázemí při studiu a zpracování této práce.

ABSTRAKT Téma disertační práce je „Identifikace geneticky modifikovaných organismů (GMO) v plodinách pro výrobu potravin a v potravinách“. Cílem práce byla diagnostika schválených a neschválených geneticky modifikovaných organismů (GMO) ve vybraných zemědělských plodinách a potravinách rostlinného původu. Jednalo se o plodiny a potraviny na bázi sóji a kukuřice, dále to byly rajčata, brambory, rýže a papája. Vzorky byly analyzovány v letech 2005-2008 na Státním zdravotním ústavu – Centru zdraví, výživy a potravin v Brně. K diagnostice byly využity metody kvalitativní a kvantitativní polymerázové řetězové reakce (PCR) a imunochemická metoda ELISA. Byl také hodnocen vliv zpracování a použité extrakční metody pro následnou amplifikaci, zejména u brambor, rýže, papáji, kukuřičné mouky a sójových výrobků. Celkem bylo zpracováno 792 vzorků potravin a rostlinného materiálu. 46 vyšetřených vzorků (kukuřice, vzorky na bázi sóji) bylo vyrobeno nebo obsahovalo GMO. Roundup Ready sója (RRS) byla přítomna ve 24 vzorcích (3%), dále hybrid kukuřice MON 810 v 10 vzorcích (1,3%), Bt 176 ve čtyřech vzorcích (0,5%), StarLink v jednom vzorku (0,1%) a NK 603 ve dvou vzorcích (0,2%). Kromě těchto GMO byla také detekována genetická modifikace (GM) u pěti (0,6%) vzorků rýže. Žádná GM nebyla zjištěna u vzorků čerstvé papáji a rajčat. Vliv zpracování na amplifikaci byl prokázán u vzorků předvařené rýže a papáji (sušená, kandovaná a konzervovaná), kde nebylo možné metodou PCR prokázat přítomnost transgenu. U 13 vzorků brambor nebyl prokázán vliv kulinárních úprav na detekci transgenu. Použitá PCR metoda byla vhodná pro identifikaci genetické modifikace i u kulinárně upravených brambor.

Klíčová slova: GMO, výskyt, Česká republika, sója, rýže, rajče, kukuřice, brambory, papája, PCR, ELISA

ABSTRACT The topic of my dissertation was “Identification of genetically modified organisms in crops for food production and in foods”. The aim was the detection and identification of approved and non-approved genetically modified organisms (GMOs) in some agricultural crops and foodstuffs. The food which was evaluated in National Institute of Public Health in Brno during the years of 2005-2008 include soybean and soybean products, maize and maize flour, tomato, rice, potato and papaya. Qualitative and quantitative polymerase chain reaction (PCR)-based methods and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) were used for the detection of GMOs. Impact of processing on DNA amplification, mainly in potatoes, rice, papaya, maize flour and soybean products was also evaluated. A total of 792 samples of foodstuffs (maize flour, soybean products, tomato, rice, papaya) and agricultural products (maize, potato) were analyzed. 46 samples (maize, soybean and soybean products) contained GMOs. Roundup Ready soybean (RRS) was detected in 24 samples (3%), maize line MON 810 in 10 samples (1.3%), Bt 176 in four samples (0.5%), Star Link in one sample (0.1%) and NK 603 in two samples (0.2%). GM rice was detected in five (0.6%) samples. All investigated samples of tomato and raw papaya were negative for GMOs. The impact of processing on DNA amplification was proved in samples of parboiled rice and papaya. The recombinant DNA was detected in all samples of potato (raw tubers and after culinary processing). The PCR method was suitable for the detection of transgenic potato in processed food. The recombinant DNA was detected in all samples of potato (raw and after processing.

Keywords: GMO, food, PCR, ELISA, soybean, rice, tomato, maize, potato, papaya, Czech republic

OBSAH

1 ÚVOD ……………………………………………………………………………….8

2 LITERÁRNÍ PŘEHLED …………………………………………………………10 2.1 Charakteristika geneticky modifikovaných organismů……….…………………..10 2.2 Situace v ČR a ve světě ….…………………………………………………….…12 2.2.1 Rizika GMO a jejich vnímání veřejností …………………………………..…...19 2.3 Geneticky modifikované vyšší rostliny …………………………………….….…21 2.3.1 Geneticky modifikovaná sója …………………………………………….….…21 2.3.2 Geneticky modifikovaná kukuřice ……………………………………….…..…22 2.3.3 Geneticky modifikovaný brambor ……………………………………….…..…25 2.3.4 Geneticky modifikované rajče …………………………………………….…....26 2.3.5 Geneticky modifikovaná rýže …………………………………………………..26 2.3.6 Geneticky modifikovaná papája ………………………………………………..28 2.4 Metody využívané pro detekci GMO ………………………………………….....29 2.4.1 Metody založené na detekci nukleových kyselin ……………………………....30 2.4.2 Metody založené na detekci proteinu ……………………………………….….32 2.4.3 Ostatní techniky pro detekci GMO …………………………………………….33 2.4.3.1 Chromatografie ……………………………………………………………….33 2.4.3.2 Infračervená spektroskopie …………………………………………….……..33 2.4.4 Kontrola kvality detekce ………………………………………………………..33

3 CÍL PRÁCE ……………………………………………………………………….35

4 MATERIÁL A METODY ………………………………………………………..36 4.1 Materiál …………………………………………………………………….…….36 4.2 Extrakce a izolace DNA …………………………………………………………37 4.3 Polymerázová řetězová reakce …………………………………………….…….38 4.3.1 Kvalitativní PCR ………………………………………………………….…...38 4.3.1.1 Sója a sójové výrobky ……………………………………………………….40 4.3.1.2 Kukuřice a kukuřičné výrobky ……………………………………………....41 4.3.1.3 Rýže ………………………………………………………………………….43

4.3.1.4 Rajčata ……………………………………………………………………….44 4.3.1.5 Papája …………………………………………………………………….….44 4.3.1.6 Brambor ……………………………………………………………………...45 4.3.2 Kvantitativní PCR ……………………………………………………………...45 4.4 Imunochemické metody – ELISA ……………………………………………….46

5 VÝSLEDKY A DISKUSE ………………………………………………………..47 5.1 Vliv zpracování na amplifikaci DNA ……………………………………………49 5.2 Detekce Roundup Ready sóji ………………………………………………….…50 5.3 Detekce GM kukuřice ……………………………………………………………53 5.4 Detekce GM rajčat …………………………………………………………….…55 5.5 Detekce GM papáji ………………………………………………………………56 5.6 Detekce GM rýže ………………………………………………………………...58 5.7 Detekce GM brambor ……………………………………………………………59

6 ZÁVĚR ……………………………………………………………………………62

7 LITERATURA ……………………………………………………………………66

8 SEZNAM ZKRATEK

9 SEZNAM TABULEK

10 SEZNAM OBRÁZKŮ

1 ÚVOD V posledních desetiletích došlo k rozvoji genového inženýrství, což umožnilo vývoj geneticky modifikovaných organismů. Geneticky modifikované organismy (GMO) jsou organismy do nichž byl vnesen gen (geny) z nepříbuzného organismu kromě člověka, jejichž dědičný materiál byl změněn genetickou modifikací. První GMO byly použity pro produkci léků. Organismy takto vytvořené mají geny kódující nové vlastnosti, např. toleranci k herbicidům, rezistenci k hmyzím škůdcům, zpomalené dozrávání nebo sterilitu potomstva. Transgenóze začala také postupně pronikat do šlechtění rostlin, jako výsledek zavádění moderních biotechnologických metod. Přenos genů provádí šlechtitel, aby získal odrůdu s určitou vlastností, kterou nelze získat konvenčním šlechtěním. První geneticky modifikovanou potravinou bylo rajče, u něhož se genetickou modifikací utlumil enzym štěpící pektin, což zabránilo měknutí rajčat a tak i transport na delší vzdálenost; komerční název je Flavr-savr. S rozvojem biotechnologií stále více a více GMO vstupuje na trh, zejména ve farmaceutickém a potravinářském průmyslu. Ke komerčnímu pěstování na území EU je povolen pouze GM kukuřice hybrid MON 810 a klon bramboru EH92-527-1. Ve světě se nejvíce pěstují odrůdy geneticky modifikované sóji, kukuřice, bavlníku a řepky. Několik členských států EU však uplatnilo tzv. bezpečnostní doložku (čl. 23 směrnice 2001/18/EC). Podle této doložky mohou členské státy dočasně omezit nebo zakázat použití nebo prodej GM produktů na jejich území. V současné době tuto bezpečnostní položku uplatnilo šest členských států: Rakousko, Francie, Řecko, Maďarsko, Německo a Lucembursko. V současnosti se GMO využívají také jako geneticky modifikované potraviny a krmiva. Na evropský trh je povoleno uvádět pro potravinářské a krmné účely produkty těchto geneticky modifikovaných plodin: sója, kukuřice, řepka, brambor a bavlník. Produkce GMO živočišného původu (např. ryby) pro potravinářské účely není v Evropské unii povolena. Spotřebitelé se obávají negativních dopadů GM potravin na jejich zdraví, a proto požadují vědecké studie a informace, že GMO používané jako potraviny či krmiva jsou bezpečné. Z toho důvodu evropská legislativa požaduje označování potravin, které jsou vyrobeny, obsahují či sestávají z GMO. Tyto potraviny musí být na obalu označeny

-8-

nápisem

„geneticky

modifikovaný

organismus“

popř.

konkrétně

„geneticky

modifikovaná kukuřice, sója“ apod. a doplněny tzv. jednoznačným identifikačním kódem, který přesně určuje, jaká modifikace byla v rámci šlechtění u rostliny použita. Taková informace umožňuje spotřebiteli svobodnou volbu a možnost rozhodování při výběru potravin, které konzumuje. Jednoznačný identifikační kód by měl zajistit identifikaci GM plodiny v průběhu celého procesu od pěstování, přes zpracování až ke spotřebiteli, tzv. od vidlí až po vidličku. Aby bylo možné sledovat výskyt GMO na trhu a v potravinách, je nutné provádět laboratorní detekci. Metody využívané k detekci GMO jsou založeny na detekci transgenní DNA nebo transgenního proteinu. V současné době je pro detekci transgenní DNA nejvíce používanou metodou polymerázová řetězová reakce (PCR). Pro detekci transgenního proteinu je využívána imunochemická metoda ELISA. Moje disertace byla zaměřena na diagnostiku schválených a neschválených GMO ve vybraných zemědělských plodinách pocházející z konvenčního a ekologického zemědělství a potravin rostlinného původu odebraných v obchodní síti. K diagnostice byly využity metody kvalitativní a kvantitativní PCR a imunochemická metoda ELISA. Je tedy věnována studiu bezpečnosti potravin (food safety) na našem trhu.

-9-

2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Charakteristika geneticky modifikovaných organismů Mezi geneticky modifikované organismy patří organismy, do kterých byl vnesen gen o známé sekvenci a funkci, kódující požadovanou vlastnost za použití metod genového inženýrství. Ostatní geny zůstanou prakticky nedotčeny (ZDEŇKOVÁ et al., 2002). Výzkum je v současné době zaměřen na přenos příslušných genových sekvencí do zemědělsky a potravinářsky významných rostlin. Stále častěji se také diskutuje využití transgenních rostlin k odstraňování kontaminantů z životního prostředí a využití transgenních rostlin se zvýšenou schopností akumulace nebo přeměny látek znečišťujících životní prostředí (FRANČOVÁ et al., 2001). Ke vzniku geneticky modifikovaných vyšších rostlin (GMVR) se nejčastěji využívají dva odlišné způsoby k přenosu cizí DNA do genomu rostlin. Vkládaný genetický konstrukt musí obsahovat promotor, sekvenci kódující požadovaný gen a terminátor. První způsob využívá přenosu DNA do rostlinných buněk pomocí půdních bakterií Agrobacterium tumefaciens (viz. obr. 1) a A. rhizogenes. Metoda je založena na přirozené vlastnosti bakterií napadat vyšší rostliny. Tato bakterie vnáší své specifické geny, lokalizované do části velkého plazmidu, tzv. Ti plazmid, do rostlinného genomu. Tato část plazmidu Ti se nazývá T-DNA (transferred DNA) (ONDŘEJ et al., 1999, FRANČOVÁ et al., 2001, VEJL, 2007). Při použití této metody se do rostlinné DNA introdukuje nízký počet kopií T-DNA. Postupy jsou většinou méně účinné a nevýhodou je i začlenění transgenů ve větším počtu kopii. To vede k jejich různé přestavbě v důsledku homologních rekombinací a také umlčování transgenů (ŘEPKOVÁ, RELICHOVÁ, 2001). Další způsob využívá přímého přenosu genu do rostlinné buňky (např. biolistické metody). Tyto metody umožňují vnášet geny do buněk i do celých neporušených rostlin. Vnášenou DNA se obalí mikročástečky zlata nebo wolframu a speciálním přístrojem se nastřelí přímo do buněk rostlin (ONDŘEJ et al., 1999, FRANČOVÁ et al., 2001, VEJL, 2007).

- 10 -

Obr. 1: Přenos DNA do rostlinných buněk (KARCHER et al., 2011)

GMO můžeme rozdělit do několika skupin (ROBINSON, 2001): 1) GMO první generace – vyznačují se přínosy zejména pro pěstitele. Nově získané vlastnosti vedou k novým typům GM odrůd, které jsou odolné proti hmyzím škůdcům (tzv. Bt odrůdy), tolerantní k herbicidům (HT odrůdy), rezistentní vůči bakteriálním, houbovým a virovým chorobám. 2) GMO druhé generace – produkty mají zvýšené nebo změněné nutriční vlastnosti (vhodnější složení mastných kyselin, upravený obsah vitamínu apod.). 3) GMO třetí generace – odolné biotickým stresům (např. rezistence/tolerance k chladu suchu, zasolení půdy, nedostatku světla).

- 11 -

2.2 Situace v ČR a ve světě GMVR se také využívají jako potraviny a krmiva. GMVR povolené v EU jsou uvedeny v tzv. registru společenství pro potraviny a krmiva. Přehled povolených GMVR pro dovoz a zpracování jako potraviny a krmiva, příp. pro komerční pěstování dle registru je uveden v tabulce 1 (EU, 2010a). V roce 2008 opět došlo celosvětově k nárůstu ploch osetých GM plodinami na 125 mil. ha. Komerčně byly GM plodiny pěstovány v 25 státech; nejvíce jsou pěstovány v USA (62,5 mil ha), Argentině (21), Brazílii (15,8), Indii a Kanadě (7,6) (GMO COMPASS, 2010h). Plochy oseté GM kukuřicí měly do roku 2008 v ČR vzrůstající trend. V roce 2009 došlo k poklesu (tab. 2). Hlavním důvodem poklesu je problematický odbyt pro tento

typ

kukuřice,

kterou

je

nutno

oddělovat

od

klasické

produkce

a označovat jako geneticky modifikovaný organismus. Zmenšení ploch Bt kukuřice také může souviset s celkovým poklesem ploch kukuřice na zrno v roce 2009 (dle údajů ČSÚ z cca 108 tis. ha v roce 2008 na 92 tis. ha v roce 2009) (MZe ČR, 2009). V roce 2009 došlo globálně ke zvýšení pěstování GM plodin. Ve srovnání s rokem 2008 vzrostly plochy o 9 milionů ha na celkem 134 milionů ha. Ve vyspělých zemích došlo k nárůstu o 2 miliony ha (3%) a v rozvojových zemích o 7 milionů ha (13%). Nadprůměrný nárůst byl zaznamenám v Brazílii a Burkina Faso (GMO COMPASS, 2010a). V roce 2009 byli největšími producenty GM plodin USA (64 mil. ha), Brazílie (21,4), Argentina (21,3), Indie (8,4) a Kanada (8,2), Čína (3,7). Nejčastěji pěstované plodiny a jejich plocha v roce 2009 jsou uvedeny v tabulce 3 (GMO COMPASS, 2010a). V EU je k pěstování povolena kukuřice MON 810, která je toxická pro zavíječe kukuřičného (Ostrinia nubilalis Hübner, 1796). Pěstitelé kladně hodnotí úroveň dosaženého výnosu, případně zlepšenou kondici porostů. Zápory byly zejména ve vysoké ceně osiva, nutnosti evidence (KUČERA, ČEŘOVSKÁ, 2006). V současné době je v procesu schvalování kukuřice T 25. V roce 2008 bylo pěstování Bt kukuřice zakázáno ve Francii a v roce 2009 i v Německu. Tyto státy uplatnily tzv. bezpečnostní doložku (čl. 23 směrnice 2001/18/EC). Podle této doložky mohou členské státy dočasně omezit nebo zakázat použití nebo prodej GM produktů na jejich území. V roce 2009 došlo k poklesu ploch osetých GM plodinami v EU. Své plochy snížil i největší

- 12 -

evropský producent Bt kukuřice, Španělsko (GMO COMPASS, 2010b). Plochy pěstování GM plodin (Bt kukuřice, sójové boby) v EU jsou uvedeny v tabulce 4. V roce 2010 evropská komise povolila pěstování brambor EH92-527-1 (Amflora) v EU pro průmyslové použití (např. výroba papíru) a využití vedlejších produktů škrobu z těchto brambor jako krmiva. V ČR se v současné době jako v jediné zemi EU pěstují jak GM kukuřice, tak GM brambory (stav 2010: Bt kukuřice – 4 680 ha, GM brambory Amflora – 150 ha) (MZe, 2010).

Tab. 1: Přehled povolených GMO jako potraviny a krmiva (ke dni 10. 2. 2011) GM plodina

Jednoznačný

Výrobce

identifikátor

Vložený gen /Získaná vlastnost

Bavlník MON1445

MON-01445-2

Monsanto

cp4 epsps gen – tolerance k herbicidu glyfosátu

Bavlník MON15985

MON-15985-7

Monsanto

Cry1A(c) a cry2Ab2 gen – rezistence k lepidopterám

Bavlník MON15985 x MON-15985-7 MON1445 MON-01445-2

x Monsanto

cp4 epsps gen – tolerance k herbicidu glyfosátu Cry1A(c) a cry2Ab2 gen – rezistence k lepidopterám

MON-00531-6

Monsanto

Cry1A(c) gen – insekt rezistence

Bavlník MON531 MON1445

x MON-00531-6 MON-01445-2

x Monsanto

Cry1A(c) gen – insekt rezistence cp4 epsps gen – tolerance k herbicidu glyfosátu

Bavlník LLCotton25

ACS-GH001-3

Bayer

Pat gen – tolerance k herbicidu glufosinátu amonnému

Kukuřice Bt 11

SYN-BT011-1

Syngenta

Cry1A(b) gen – insekt rezistence Pat gen – tolerance k herbicidu glufosinátu amonnému

Bavlník MON531

- 13 -

Pioneer and Cry1F gen – rezistence Dow k European corn borer a AgroSciences dalším lepidopterám Pat gen – tolerance k herbicidu glufosinátu amonnému Kukuřice DAS1507xNK DAS-01507Pioneer and Cry1F gen – rezistence 603 1xMON-00603-6 Dow k European corn borer AgroSciences (Ostrinia nubilalis) a dalším druhům rodu Sesamia Pat gen – tolerance k herbicidu glufosinátu amonnému CP4 EPSPS protein – tolerance k herbicidu glyfosátu Kukuřice DAS59122 DAS-59122-7 Pioneer and Cry34Ab1 a cry35Ab1 Dow proteiny – ochrana proti AgroSciences určitým coleopterám (Diabrotica spp.) PAT protein – tolerance k herbicidu glufosinátu amonnému Kukuřice 1507x59122 DASPioneer Cry1F gen – ochrana 01507xDASproti lepidopterám 59122-7 Cry34Ab1 a cry35Ab1 geny – ochrana proti coleopterám Pat gen – tolerance k herbicidu glufosinátu amonnému Kukuřice GA 21 MON-0021-9 Syngenta mEPSPS protein – tolerance k herbicidu glyfosátu Kukuřice MON 810 MON-00810-6 Monsanto Cry1A(b) gen – rezistence k lepidopterám Kukuřice MON 863 MON-00863-5 Monsanto Úsek genu Cry3Bb1 – insekt rezistence nptII gen – selekční marker Kukuřice MON 863 x MON-00863-5 x Monsanto Úsek genu Cry3Bb1 – NK 603 MON-00603-6 insekt rezistence nptII gen – selekční marker cp4 epsps gen – tolerance k herbicidu glyfosátu Kukuřice DAS1507

DAS-01507-1

- 14 -

Kukuřice MON 863 x MON-00863-5 MON 810 MON-00810-6

Kukuřice NK 603

Kukuřice NK 603 MON 810

x Monsanto

MON-00603-6

Monsanto

x MON-00603-6 MON-00810-6

x Monsanto

Kukuřice MON-00863MON863xMON810xNK 5xMON-00810603 6xMON-00603-6

Monsanto

Kukuřice T25

ACS-ZM003-2

Bayer

Kukuřice MON88017

MON-88017-3

Monsanto

Kukuřice MON89034

MON-89034-3

Monsanto

Kukuřice 59122xNK603 DAS-591227xMON-00603-6

Pioneer

Kukuřice MIR604

Syngenta

SYN-IR604-5

- 15 -

Cry1A(b) gen – rezistence k lepidopterám Úsek genu Cry3Bb1 – insekt rezistence nptII gen – selekční marker cp4 epsps gen – tolerance k herbicidu glyfosátu cp4 epsps – tolerance k herbicidu glyfosátu Cry1Ab protein – rezistence k lepidopterám (Ostrinia nubilalis, Sesamia spp.) Cry3Bb1 gen –ochrana proti coleopterám Cry1Ab gen – ochrana proti lepidopterám cp4 epsps gen – tolerance k herbicidu glyfosátu nptII gen – vložen jako selekční marker Pat gen – tolerance k herbicidu glufosinátu amonnému Cry3Bb1 gen – ochrana proti coleopterám cp4 epsps gen – tolerance k herbicidu glyfosátu Cry1A.105 a cry2Ab2 geny – ochrana proti lepidopterám Cry34Ab1 a cry35Ab1 geny –ochrana proti coleopterám Pat geny – tolerance k herbicidu glufosinátu amonnému cp4 epsps geny – tolerance k herbicidu glyfosátu Cry3A gen – ochrana proti coleopterám pmi gen – vložen jako selekční marker

Kukuřice Bt 11xGA 21

SYN-BT0111xMON-00021-9

Syngenta

Kukuřice MON88017xMON 810

MON-880173xMON-00810-6

Monsanto

Kukuřice MON89034xNK 603

MON890343xMON-00603-6

Monsanto

Kukuřice 59122x1507xNK 603

DAS-591227xDAS01507xMON00603-6

Pioneer

Bakteriální biomasa (pCABL-Bacterial Biomass)

Ajinomoto Eurolysine SAS

Kvasniční biomasa (pMT742 nebo pAK729 – kvasniční biomasa)

NOVO Nordisk A/S

- 16 -

Cry1Ab gen – ochrana proti lepidopterám Pat gen – tolerance k herbicidu glufosinátu amonnému mEPSPS gen – tolerance k herbicidu glyfosátu Cry1Ab gen – ochrana proti lepidopterám Cry3Bb1 gen – ochrana proti coleopterám cp4 epsps gen – tolerance k herbicidu glyfosátu Cry1A.105 a cry2Ab2 geny – ochrana proti lepidopterám cp4 epsps gen – tolerance k herbicidu glyfosátu Cry1F gen – ochrana proti lepidopterám Cry34Ab1 a cry35Ab1 geny – ochrana proti coleopterám Pat gen – tolerance k herbicidu glufosinátu amonnému cp4 epsps gen – tolerance k herbicidu glyfosátu Bakteriální protein, vedlejší produkt při fermentaci L-lysinu HCl získaného z (Brevibacterium lactofermentum kmen SO317/pCABL) mrtvých mikroorganismů NOVO Yeast Cream je produkován z GM kvasinkových kmenů (Saccharomyces cerevisiae kmeny MT663/pMT742 nebo pAK729) kultivovaných na substrátech zeleninového původu

Řepka GT73

Řepka MS8, MS8xRF3

MON-00073-7

Monsanto

Geny cp4 epsps a goxv247 – tolerance k herbicidu glyfosátu

bar (pat) gen – rezistence k herbicidu glufosinátu amonnému Gen barnáza – pylová sterilita Gen barstar – pylová sterilita Bayer Pat gen – tolerance k herbicidu glufosinátu amonnému BASF Inhibovaný gen gbss odpovědný za biosyntézu amylázy, hlízy produkují amylopektin nptII gen – vložen jako selekční marker Monsanto cp4 epsps – tolerance k herbicidu glyfosátu Bayer Pat gen – tolerance k herbicidu glufosinátu amonnému Monsanto cp4 epsps – tolerance k herbicidu glyfosátu KWS SAAT cp4 epsps – tolerance a Monsanto k herbicidu glyfosátu

RF3, ACS-BN005Bayer 8,ACS-BN003-6, ACS-BN005-8 x ACS-BN003-6

Řepka T45

ACS-BN008-2

Brambor EH92-527-1

BPS-25271-9

Sója MON40-3-2

MON-04032-6

Sója A2704-12

ACS-GM005-3

Sója MON89788

MON-89788-1

Cukrovka H7-1

KM-00071-4

Zdroj EU: http://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm

Tab. 2: Plochy oseté GM kukuřicí v ČR v letech 2005-2009 Rok

Výměra Bt kukuřice v ha

Počet pěstitelů

2005

270

52

2006

1290

85

2007

5000

131

2008

8380

171

2009

6480

125

Zdroj: Ministerstvo zemědělství ČR, 2009

- 17 -

Tab. 3: Celosvětové plochy pěstování GM plodin v roce 2009 Plocha (mil. ha) Plocha GM (mil. ha) Podíl GM (%) Sója

90

69

77

Kukuřice

158

42

26

Bavlník

33

16

49

Řepka

31

6,4

21

Cukrovka

4,4

0,5

9

Zdroj: http://www.gmocompass.org/eng/agri_biotechnology/gmo_planting/257.global_gm_planting_2008.html

Tab. 4: Pěstování GM plodin v EU v letech 2005-2009 v ha 2005

2006

2007

2008

2009

53 225

53 667

75 148

79 269

76 057

Francie

492

5 000

21 147

-

-

Česká

150

1 290

5 000

8 380

6 480

Portugalsko

750

1 250

4 500

4 851

5 094

Německo

342

947

2 685

3 171

-

Slovensko

-

30

900

1,900

875

Rumunsko

110 000

90 000

350

7 146

3 344

(sójové

(sójové

boby)

boby)

-

100

320

3 000

3 000

54 959

62 284

110 050

107 717

94 750

Španělsko

republika

Polsko Celkem GM kukuřice

Zdroj: http://www.gmocompass.org/eng/agri_biotechnology/gmo_planting/392.gm_maize_cultivation_europe_2008.html

- 18 -

Zdroj: http://www.gmocompass.org/eng/agri_biotechnology/gmo_planting/257.global_gm_planting_2008.html

Obr. 2: Celosvětové plochy pěstování GM plodin v letech 1996-2009 (v mil.ha)

2.2.1 Rizika GMO a jejich vnímání veřejností Pomocí genového inženýrství získávají rostliny další nové vlastnosti a význam pro pěstování a posklizňové použití. GM rostliny „první generace“ měly vlastnosti přínosné pro producenty, zatímco GM plodiny následných „generací“ jsou určeny k zajištění užitných vlastností pro spotřebitele, např. zlatá rýže (YONEKURASAKAKIBARA, SAITO, 2006). Potraviny vyrobené z geneticky modifikovaných organismů musí být zdravotně bezpečné, jinak by nemohly být schváleny k použití. Všechny GM produkty jsou testovány, zda mohou vyvolávat alergie nebo obsahují toxické látky, které by mohly být nebezpečné pro lidské zdraví (GMO COMPASS, 2010g). Potraviny, které jsou vyrobeny, obsahují či sestávají z GMO a obsah GMO je vyšší než 0,9% musí být v EU na obalu označeny dle nařízení 1830/2003. Na obalu musí být označeny nápisem „geneticky modifikovaný organismus“ popř. konkrétně „geneticky modifikovaná kukuřice, sója“ apod. a doplněny tzv. jednoznačným identifikačním kódem, který přesně určuje, jaká modifikace byla v rámci šlechtění u rostliny použita. Taková - 19 -

informace umožňuje spotřebiteli svobodnou volbu a možnost rozhodování při výběru potravin, které konzumuje. Toto označení se nevztahuje na potraviny a krmiva vyrobené s pomocí GMO (např. enzymy, potraviny ze zvířat krmených GM krmivy). Hranice pro označování potravin je odlišná na různých místech světa, např. 1% v Austrálii a na Novém Zélandu, 3% v Koreji a 5% v Japonsku a Indonésii (BERDAL et al., 2008). Zásah do našich systémů potravinové produkce vždy vyvolal veřejný zájem. Největší zájem spotřebitelů je o možné riziko spojené s GMO. Zvažování rizik komplikuje otázka snižování použití chemických pesticidů, snižování nákladů a zvyšování nutriční hodnoty (SINGH et al., 2006, FERBER, 1999). RUPRICH (2006) uvádí, že u potravin se zejména posuzují následující zdravotní rizika: 1. Výskyt signálních a selekčních genů, 2. toxické účinky, 3. alergenní účinky, 4. nutriční účinky, 5. patogenita (u GM mikroorganizmů). Největší obavy vyvolává možnost alergenních účinků. Proto je zásadní, aby posuzovatelé sledovali schopnost nového GMO tvořit proteiny, které v původním organizmu nebyly, a u těchto proteinů pak hodnotit jejich alergenní potenciál (RUPRICH, 2006). Geny pro rezistenci k antibiotikům se používají jako selektovatelné geny, způsobující necitlivost k určitému antibiotiku (např. gen pro rezistenci ke kanamycinu). Daný gen pro rezistenci ke kanamycinu kóduje enzym neomycinfosfotransferázu (NPTII), který inaktivuje příslušné antibiotikum. V trávícím traktu je NPTII rychle rozštěpen a totéž platí i pro veškerou DNA. Možnost, že by se snad nějaký gen mohl potravou přenést do genomu konzumenta je naprosto vyloučena (ŘEPKOVÁ, RELICHOVÁ, 2001). Spotřebitelé se hlavně zajímají o složení jejich potravin a musí mít právo výběru kvalitních potravin. Spolehlivý a efektivní způsob zajištění kvality je označování GM potravin (SINGH et al., 2006). Jako velký nedostatek uvádí DOMINGO (2007), že vědecké studie zaměřené na hodnocení toxických účinků a zdravotní rizika z GM plodin uvádí data, která jsou nedostatečná. Většina vyšetření byla prováděna jako krátkodobé studie, zejména nutriční studie s velmi limitovanými toxikologickými informacemi.

- 20 -

2.3 Geneticky modifikované vyšší rostliny 2.3.1 Geneticky modifikovaná sója Sója (Glycine max L.) má 2n = 40 chromozómů, je ekonomicky důležitá luštěnina. Pro vysoký obsah proteinů (40%) a oleje (20%) v semenech má široké použití jako potravina, krmivo i jako surovina pro zpracovatelský průmysl (SINGH, HYMOWITZ, 1999). GM sója linie GTS 40-3-2 (Roundup Ready sója), která byla vyvinuta

firmou

Monsanto,

je

tolerantní

k herbicidu

glyfosátu.

K přenosu

rekombinantní DNA byla využita biolistická metoda. Inhibice k herbicidu glyfosátu je dána

genem

5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate

synthase

z

Agrobacterium

tumefaciens kmene CP4 (CP4 EPSPS). GM sója obsahuje jednu funkční kazetu CP4 EPSPS genu, která je tvořena promotorem viru květákové mozaiky (CaMV E35S), chloroplast tranzitním peptidem (CTP4 z Petunia hybrida), kódující sekvence CP4 EPSPS a terminátorem nopalin syntázou (T-nos) z A. tumefaciens), jak je uvedeno na obr. 3 (PADGETTE et al., 1995). V roce 1996 byla v EU povolena k dovozu a zpracování jako potravina a krmivo dle nařízení pro potraviny nového typu.

Rostlinná DNA

P-E35S

CTP4

CP4 EPSPS

T-nos

Rostlinná DNA

P-E35S – promotor CaMV 35S, CTP – chloroplast tranzitní peptid, CP4 EPSPS - 5enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase z Agrobacterium tumefaciens kmene CP4, T-nos – terminátor nopalin syntáza

Obr. 3: Schéma genové kazety Roundup-Ready sóji (GTS-40-3-2)

Celosvětově došlo v průběhu 12 let k nárůstu ploch, kde se pěstuje GM sója (obr. 4). V roce 1997 se pěstovala na 5,1 ha (7,6%) v USA a Argentině. V roce 2009 to již bylo 69 ha (77%) (tab. 3). Největšími pěstiteli jsou USA, Argentina a Brazílie (GMO COMPASS, 2010c).

- 21 -

Zdroj:http://www.gmocompass.org/eng/agri_biotechnology/gmo_planting/342.genetically_modified_soybean_global_area_und er_cultivation.html

Obr. 4: Plochy oseté GM sójou z celkové plochy oseté sojovými boby v letech 1997-2009 (v procentech)

2.3.2 Geneticky modifikovaná kukuřice Kukuřice (Zea mays L.) má 2n = 20 chromozomů, je pěstována v mírném a teplém klimatu téměř na celém světě. Její největší producenti jsou USA, Čína, Brazílie, Mexiko, Indie. Používá se jako krmivo, potravina, výroba škrobu i v průmyslu. Metodami genového inženýrství vznikly nové odrůdy, jejichž nejčastěji nově získané vlastnosti se využívají v zemědělství. Nové vlastnosti umožňují ochranu proti hmyzím škůdcům (Bt odrůdy) a toleranci k herbicidům (HT odrůdy). Tyto GM hybridy se od konvečních hybridů liší pouze v nově získaných vlastnostech. Bt odrůdy jsou odrůdy, které mají vložený gen z bakterie Bacillus thuringiensis pro Cry-proteiny (nebo pro jejich účinnou část) přímo do genomu rostliny, která pak tvoří ve svých buňkách příslušný toxický protein (δ-endotoxin) a hmyz konzumující tuto rostlinu je usmrcen. Zabudování genu pro produkci tohoto endotoxinu do rostliny umožnilo vzhledem k mnoha kmenům Bt specifické působení proti nejrůznějšímu hmyzu (Cry1, Cry2 proti lepidopterám, Cry3 proti coleopterám, Cry1 a Cry4 proti dipterám). Vysoká specifičnost účinnosti toxinu vylučuje škodlivost pro zvířata a lidí po - 22 -

požití těchto plodin (CHLOUPEK, 2000). Patří sem hybridy MON 810, Bt 11, Bt 10, StarLink, DAS 1507, Bt 176. Přehled genů pro tvorbu cry-proteinů u jednotlivých linií je uveden v tabulce 5.

Tab. 5: Přehled genů pro cry-proteiny (CERA) Kukuřice - linie

Producent

Gen

MON 810

Monsanto

Cry1Ab

Bt 176

Ciba-Geigy

Cry1Ab

Bt 11

Syngenta

Cry1Ab

Bt 10

Syngenta

Cry1Ab

DAS 1507

Monsanto

Cry1Fa2

StarLink (CBH351)

Aventis CropScience

Cry9C

Zdroj: databáze CERA

Odrůdy tolerantní k herbicidům tolerují účinné látky, jako jsou glufosináty (fosfinotriciny) nebo glyfosáty. Glyfosát inhibuje enzym účastnící se na syntéze aromatických kyselin. Glufosinát je produktem druhů aktinomycet Streptomyces hygroscopicus a Streptomyces viridochromogenes. Fosfinotricin blokuje enzym glutaminsyntázu, který je významný pro detoxikaci amoniaku v rostlinných buňkách. Tyto plodiny se vyznačují schopností tolerovat ošetření neselektivními herbicidy, které by za normální situace zahubily veškerou vegetaci (ONDŘEJ, DROBNÍK, 2002, HOLEC, SOUKUP, 2006). Hybridy tolerantní ke glyfosátu jsou GA 21, NK 603 a hybrid tolerantní ke glufosinátu je označen T 25. Tolerance ke glyfosátu je kódována genem epsps původem z Agrobacterium spp. Tolerance k herbicidu glufosinátu je kódována

geny

pat

(phosphinotricin

acetyltransferase)

ze

Streptomyces

viridochromogenes nebo bar (bialaphos resistence) získaný ze Streptomyces hygroscopicus. Genové kazety jednotlivých hybridů jsou uvedeny na obrázku 5.

- 23 -

MON 810 P-35S

Hsp70

Cry1Ab

IVS2

Pat

Bt 11 P-35S

T-nos

P-35S

IVS6

Cry1Ab

T-nos

Bt 176 PEPC

Cry1Ab

T-35S poly(A)

P-CDPK

Cry1Ab

T-35S poly(A)

Cry1Fa2

ORF25 poly(A)

TC1507 P-35S

pat

T-35S poly(A)

P-Ubi ZM

StarLink P-35S

bar

T-nos

P-35S

CTP

Cry9c

T-35S poly(A)

GA 21 P-ract1

CTP

m-epsps

CTP2

CP4 EPSPS

T-nos

NK 603 P-ract1

Ract1 int

T-nos

P-35S

Hsp70

CTP2

CP4 EPSPS

Tnos

T 25 P-35S

pat

T-35S poly(A)

P-35S - promotor CaMV 35S, hsp70 - , cry1Ab – delta endotoxin z Bacillus thuringiensis subsp. Kurstaki, T-nos – terminator nopalin syntáza z A. tumefaciens, pat – fosfinotricin N-acetyltransferáza, PEPC – fosfoenolpyruvát karboxyláza, CDPK – calcium-dependent protein kináza, T-35S – terminátor CaMV 35S, CTP – chloroplast tranzitní peptid, Ubi – ubiqiutin ZM (Zea mays), cry1F – delta endotoxin z Bacillus thuringiensis var. Aizawai, ORF – otevřený čtecí rámec, bar – fosfinotricin Nacetyltransferáza, cry9c – delta endotoxin z Bacillus thuringiensis subsp. Tolworthi, P-ract - promotor z rýžového actinu, epsps – 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfát syntáza.

Obr. 5: Schémata genových kazet hybridů kukuřic (CERA – GMO databáze, 2011)

V současné době se nově vyvíjí také hybridní linie (tzv. stacked gene), které kombinují vlastnosti odrůd tolerantních k herbicidu a Bt odrůd (např. MON 810xNK 603). Evropská komise v roce 2010 povolila GM odrůdu MON 863xMON 810, MON

- 24 -

863xNK 603 a MON 863xMON 810xNK 603 pro použití jako potraviny a krmiva a pro dovoz a zpracování (EU, 2010).

2.3.3 Geneticky modifikovaný brambor Brambor (Solanum tuberosum L.) má 4n = 48 chromozomů, pochází z Jižní Ameriky. Patří mezi lilkovité. Je to jednoletá, dvouděložná rostlina, rozmnožující se jak generativně, tak vegetativně (CHLOUPEK et al., 2005). Bramborové hlízy se využívají v potravinářství i v průmyslu. S geneticky modifikovanými odrůdami se v ČR nakládá v rámci polních pokusů. Nejčastěji využívané modifikace mají za cíl změněnou skladbu škrobu v bramborových hlízách (snížený obsah amylázy). Z celkové struktury vlastností GM bramboru lze vysledovat také zvyšující se trend využívání genu ahas na úkor selekčních markerů založených

na

rezistenci

k antibiotikům

(gen

nptII).

Další

vlastnosti

GM

modifikovaných brambor jsou rezistence k houbovým a virovým chorobám (ŘÍHA, 2006). V roce 2010 byla v EU povolena ke komerčnímu pěstování odrůda brambor Amflora EH92-527-1 firmy BASF s vysokým obsahem amylopektinu pro použití jako krmivo i jako potravina a také ke komerčnímu pěstování. Potraviny obsahující, sestávající nebo vyrobené z GM odrůdy (klonu) brambor EH92-527-1 by neměla převyšovat podíl 0,9% v potravině (EU, 2010a). V roce 2010 bylo v ČR osázeno GM odrůdou Amflora celkem 146 ha (MŽP, 2011). GM odrůda Amflora má ve svých hlízách zvýšený obsah amylopektinu ( 98%) ve srovnání s konvenčními odrůdami. Mateřská odrůda byla přeměněna pomocí konstruktu nesoucí fragment kódující gbss gen v antisense orientaci. Výsledkem modifikace je produkce škrobu obsahující více amylopektinu než amylosy (WANDELT, 2007). Výsledný produkt obsahuje ve dvou kazetách následující DNA (EU, 2010b): Kazeta 1: gen nptII z Tn5, řízený promotorem pro nopalin syntázu zajišťující expresi genu, ukončený polyadenylační sekvencí z genu pro nopalin syntázu z A. tumefaciens; Kazeta 2: úsek genu gbss kódující protein syntázy škrobu vázaný v granulích, který byl vložen v antisense orientaci řízený promotorem gbss a ukončený polyadenylační sekvencí z genu pro nopalin syntázu z A. tumefaciens.

- 25 -

2.3.4 Geneticky modifikované rajče Rajče (Lycopersicum esculentum Mill.) má 2n = 24 chromozomů, patří do čeledi lilkovitých. Pochází ze střední a jižní Ameriky. Plodem je bobule. Zralé plody jsou bohaté na beta karoten, vitamín C, v menší míře obsahují také vitamín B a lykopen. Existují dva typy transgenních rajčat. První typ jsou rajčata Flavr-savr. Obsahují transgen, který inhibuje nebo tlumí funkci genu pro tvorbu enzymu polygalakturonasy (PG). PG je syntetizována během zrání a svým rozkladem pektinu ve střední lamele buněčné stěny plodu způsobuje měknutí rajčat. V roce 1994 uvedla firma Calgene Inc. na trh zcela první GM plodinu, kterou byla právě odrůda Flavr-savr. U plodů se silně redukovanou aktivitou PG (pod 10%) došlo k několika změnám vlastností. Plody byly podstatně větší, méně napadány bakteriálními a houbovými chorobami, šťáva měla hustší konzistenci, větší viskozitu a více sušiny. Jinak se ale proti původnímu předpokladu příliš nezměnila jejich tendence k měknutí (FRANČOVÁ et al., 2001, ONDŘEJ, DROBNÍK, 2002). V roce 1996 byl na trh ve Velké Británii úspěšně uveden první produkt z GMO rajčatové pyré vyrobené z GM rajčat firmy Zeneca. V roce 1999 však musel být tento výrobek stažen z trhu (NCBE, 2011). Druhým typem jsou rajčata, do jejichž genomu byl vnesen transgen, který zamezuje expresi rostlinného genu pro syntézu ethylenu, jenž spouští procesy vedoucí ke zrání plodů (FRANČOVÁ et al., 2001). V letech 1992-2003 probíhaly v EU polní pokusy s GM odrůdami rajčat v Itálii, Španělsku, Francii, Portugalsku, Holandsku, Velké Británii a Řecku (GMO COMPASS, 2010d).

2.3.5 Geneticky modifikovaná rýže Rýže (Oryza sativa) má 2n = 24 chromozomů, tvoří hlavní zdroj potravin pro téměř více než polovinu světové populace. Největšími producenty jsou Čína, Indie a jižní Asie. Největším světovým exportérem je Thajsko. Nejdůležitějším evropským pěstitelem je Itálie. Vzhledem k tomu, že rýže obsahuje málo železa a vitamínu A, je v zemích, kde je převážně hlavním zdrojem obživy široce rozšířen nedostatek vitamínu A v potravě. To vede ke zdravotním problémům, např. slepotě. Proto se vědci rozhodli vytvořit odrůdu rýže, který obsahuje vyšší množství beta-karotenu, prekurzoru vitamínu A. Díky

- 26 -

tomu má rýže žluté zbarvení, proto dostala označení „Zlatá rýže“ (GMO COMPASS, 2010i). Kromě změny nutričních hodnot rýže, se metody genového inženýrství uplatnily při tvorbě odrůd tolerantních k herbicidům. Odrůdy LLRICE601, LLRICE06 a LLRICE62 jsou rezistentní k herbicidu fosfinotricinu (glufosinát amonný). Bar gen, který kóduje enzym PAT, byl izolován ze Streptomyces hygroscopicus kmene HP632. Podobnosti mezi liniemi LLRICE601 a -06, -62: 1. Všechny obsahují jednoduchý transgen bar řízený 35S CaMV promotorem. 2. Všechny jsou rezistentní k herbicidu glufosinátu. 3. Odlišnost od konvenční rýže je pouze přidáním sekvence bar genu do genomu a expresí PAT proteinu. Odlišnosti mezi liniemi LLRICE601, -06 a -62: 1. DNA konstrukt u linií LLRICE06 a -62 byl vložen metodou bombardování, ale u linie LLRICE601 byla provedena transformace pomocí Agrobacterium tumefaciens. 2. 35S CaMV promotor je nepatrně delší pro -601 než -06 a-62. 3. LLRICE601 má NOS terminátor, ačkoli -06 a-62 mají 35S CaMV terminátor. 4. LLRICE06, -62 a -601 reprezentují odlišné odrůdy rýže, které mají transformovaný bar gen. LLRICE06 byla transformována do odrůdy se středně velkým zrnem M202, LLRICE62 do střednězrnné odrůdy Bengál a LLRICE601 do dlouhozrnné odrůdy Cocodrie. 5. Jsou také nepatrné rozdíly v obsahu PAT proteinu mezi všemi 3 liniemi. Hladina PAT proteinu v semenech LLRICE601 je nižší než u -62 a -06. Hladina PAT proteinu v listech LLRICE601 je nižší než u – 62, ale nepatrně vyšší než u –06 (CUMMINS, 2001). Rýže LL 601 není toxická a neškodí v životním prostředí a na cílové organismy. LL 601 se neliší v morfologických, agronomických a biochemických vlastnostech od konvenčních linií. Odlišnost je dána pouze nově získanou vlastností (USDA-APHIS, 2006). Odrůda LL 62 byla v roce 2006 povolena jako potravina a krmivo v Kanadě

- 27 -

a v roce 2008 v Austrálii (pouze jako potravina). Odrůda LL601 byla jako potravina a krmivo povolena v roce 2008 v Kolumbii. GM rýže Bt 63 byla vyvinuta v Číně. Do svého genomu má vnesené geny cry1Ab a Cry1Ac z Bacillus thuringiensis pro produkci Bt toxinu. Transgenní rýže Bt 63 není povolena v EU.

2.3.6 Geneticky modifikovaná papája Papája (Carica papaya L.) má 2n = 18 chromozomů, pochází ze střední Ameriky (Mexiko, Guatemala), v současné době se pěstuje v řadě tropických a subtropických oblastí světa (např. Brazílie, jižní Amerika, Indie). Plody se konzumují syrové nebo se z nich připravují kompoty, džemy apod. Geneticky modifikovaná papája odrůd 55-1 a 63-1 byla vyvinuta z důvodu zvyšujících se výskytů virového onemocnění působeného Papaya Ring Spot Virus (PRSV), který způsoboval problémy farmářům na celém světě. PRSV je celosvětově příčinou virového onemocnění. Klony 55-1 a 63-1 jsou rezistentní k infekci působené virem kroužkovitosti (PRSV). Byla vložena odvozená virová sekvence, která kóduje plášťový protein (CP) PRSV. Vložená virová sekvence nevytváří žádné infekční částice. Exprese PRSV CP genu je kontrolována promotorem a terminátorem 35S. Do genomu těchto klonů byl vložen markerový gen neo kódující enzym neomycinfosfotransferázu II (nptII), který způsobuje rezistenci k antibiotiku kanamycinu a neomycinu. Schéma genové kazety je uvedeno na obrázku 6 (CERA – GMO Database, 2011). V roce 2010 byla v Japonsku povolena GM papája k prodeji. Plody musí být přísně označeny. Jedná se o první produkt, který může být prodáván a konzumován v nezpracované formě (GMO COMPASS, 2011).

P-35S

Prsv-cp

T-35S

P-nos

nptII

T-nos

P-35S

gus

Gus - beta-D-glucuronidase, nptII – neomycin fosfotransferáza II, prsv – papaya ringspot virus

Obr. 6: Schéma genové kazety papáji 55-1/63-1

- 28 -

T-nos

2.4 Metody využívané pro detekci GMO Základní schéma detekce GMO zahrnuje odběr vzorku matrice, homogenizaci, extrakci nukleové kyseliny nebo proteinu, testovací metody potvrzující přítomnost transgenu a jeho kvantifikaci. Doporučený postup je uveden na obrázku 7. Existuje několik analytických metod, jak kvalitativních, tak kvantitativních, které byly vyvinuty pro určení přítomnosti a/nebo množství GMO v zemědělských plodinách, potravinách a vysoce zpracovaných potravinách. Kromě „klasických“ metod založených na detekci DNA nebo proteinu, lze využít i další chemické metody zaměřené na určitou složku GM matrice, jakou jsou chromatografie nebo infračervená spektroskopie (ANKLAM, 2002). Odběr vzorků Homogenizace

Extrakce DNA

Kontrola kvality DNA

Detekce rostlinné DNA metodou PCR

+

-

Screeningové metody

+

-

GMO přítomny

Identifikace transgenu metodou PCR

Detekce GMO metodou ELISA

Kvantifikace transgenu metodou real-time PCR

Obr. 7: Doporučený postup detekce GMO

- 29 -

2.4.1 Metody založené na detekci nukleových kyselin K detekci nukleových kyselin se nejčastěji využívá metoda polymerázové řetězové reakce (PCR) a její modifikace (multiplex PCR, nested PCR, DNA čipy). Princip PCR byl objeven K. Mullisem v roce 1985 a od té doby byl mnohokrát publikován (např. SAMBROOK, RUSSEL, 2000; ANKLAM et al., 2002). Je to in vitro reakce, umožňující amplifikaci vybraného úseku DNA, který se nachází mezi dvěma místy o známé sekvenci nukleotidů. PCR je metoda vysoce citlivá a specifická. Princip PCR využívají i některé komerčně dodávané kity např. GeneScan nebo TaqMan (Applied Biosystem, USA). 

Multiplex PCR – mnohonásobná PCR, kdy je do reakční směsi přidáno více párů primerů umožňující detekci několika genů současně v jedné reakci.



Nested PCR – využívá vnitřní a vnější primery. Primární produkt získaný reakcí s vnějšími primery je templátem pro reakci s vnitřními primery. Zvyšuje se specifita reakce (ŠMARDA et al., 2005).



Real-time PCR - umožňuje přímou kvantifikaci PCR–produktu v průběhu reakce. Kvantifikace se provádí prostřednictvím detekce a kvantifikace fluorescenčního signálu ve speciálním zařízení, které kromě cyklického střídání teplot umožňuje detekci fluorescence a monitorování postupu v reálném čase bez nutnosti detekovat produkty PCR elektroforeticky. K detekci produktu existují tři obecné metody založené na použití: interkalačního barviva vázajícího se na DNA (např. SybrGreen), fluorescenčně značených sond vázajících se na střední část amplifikovaného produktu (např. TaqMan sondy) a fluorescenčně značených primerů (např. AmpliFluor) (ŠMARDA et al., 2005).



DNA čipy (DNA microarrays) – principem je spojení polymerázové řetězové reakce a mikročipové gelové elektroforézy. Proces je založen na miniaturizaci nástřiku, zpracování i analýze v jednom zařízení. Systém umožňuje možnost stanovit současně více GMO (ZDEŇKOVÁ et al., 2002). Tento systém dovoluje detekovat rozdílné GM odrůdy a také neschválené GMO. Další výhodou je, že tato technologie může být pravidelně doplňována o nově schválené GMO (RIZZI et al., 2004). Nevýhodou je však vysoká cena.

- 30 -

Metody PCR pro detekci GMO lze rozdělit podle jejich specifiky nejméně do 4 kategorií (HOLST-JENSEN et al., 2003): 1) Metoda k detekci rostlinné DNA – detekce specifické sekvence chloroplastového genu vyskytujícího se u rostlin: - detekce chloroplastového genu intron tRNALeu. 2) Metody detekující specifický druh – detekce specifické sekvence typické pro daný druh: - genomická DNA - virus květákové mozaiky (CaMV), - kukuřice – hmg, invertázový gen, zein, - sója – lectinový gen, - rajče – polygalacturonasový gen. 3) Screeningové metody (kategorie 1) – detekce nejčastěji používaných elementů vyskytující se v konstruktu. Potvrzuje, že je přítomna transgenní DNA, neidentifikuje však GMO: - promotor CaMV (P-35S), - terminátor CaMV (T-35S), - terminátor nopalin syntéza z Agrobacterium tumefaciens (T-nos), -neomycinfosfotransferáza

II

(nptII)

kódující

rezistenci

k neomycinu/kanamycinu, - beta laktamásový gen (bla) kódující rezistenci k ampicilinu u prokaryot. 4) Genově-specifické metody (kategorie 2) – detekují daný gen, je možné identifikovat daný typ GMO: - bar (fosfinotricin acetyltransferase) gen, - Cry1A(b) gen (syntetický). 5) Metody pro detekci specifického konstruktu (kategorie 3) – detekují přechodnou část mezi sousedními elementy konstruktu: - Bt 11: IVS6-Cry1A(b) gen, - Bt 176: CDPK promotor – syntetický Cry1A(b) gen, - MON 810: P-35S – hsp70 intron; hsp70 intron-Cry1A(b) gen, - RR sója: P-35S – CTP. 6) Metody odrůdově specifické (kategorie 4) – detekují přechod v místě mezi recipientním genomem a inzertem. MON 810

- 31 -

Obr. 8: Specifita PCR metod (4 kategorie) (HOLST-JENSEN et al., 2003)

2.4.2 Metody založené na detekci proteinu K detekci proteinu se nejčastěji využívá imunochemická metoda ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay). Metoda je založena na reakci antigenu (transgenního proteinu – např. CP4 EPSPS, Cry1Ab, PAT) s protilátkou, u níž se měří množství navázaných látek pomocí přidání enzymem značeného antigenu či protilátky. Měření se provádí spektrofotometricky (závislost absorbance na koncentraci) (OSTRÝ et al., 2001). Metody mají dvě nevýhody, které brání použití jako rutinních detekčních metod. První nevýhodou je dispozice jen mála protilátek specifických proti proteinům produkovaným expresí vloženého genu. Druhou nevýhodou je degradace proteinů v průběhu zpracování potravin (ZDEŇKOVÁ et al., 2002). Tato metoda nemůže být použita, jestliže vložená DNA neexprimuje žádný protein (HELLER, 2006). K detekci lze využít rychlé a jednoduché metody tzv. stripů, které využívají principů ELISA metod. Imunochemické metody se použily jako semi-kvantitativní analýza a potvrzení výsledků získaných metodou PCR.

- 32 -

2.4.3 Ostatní techniky pro detekci GMO 2.4.3.1 Chromatografie Chromatografické metody se využívají k detekci rozdílu chemického profilu určité složky v GMO od nemodifikovaných (např. změněné mastné kyseliny nebo triglyceridy). Tato metoda je použitelná pouze při významné změně ve složení GMVR nebo odvozených produktů (ANKLAM et al., 2002). Metoda je spíše vhodná pro kvalitativní analýzu než pro kvantifikaci GMO. Např. nízké přídavky řepkového oleje se změněnou skladbou triacylglyceridů k tradičnímu řepkovému oleji nebudou s vysokou pravděpodobností detekovány vzhledem k přirozeně se vyskytujícím změnám ve složkách nemodifikovaného oleje (ZDEŇKOVÁ et al., 2002).

2.4.3.2 Infračervená spektroskopie Pomocí této metody mohou být detekovány určité zásahy do struktury vláken v rostlinách, zatímco nemusí být pozorovány žádné významné rozdíly ve složení proteinů nebo olejů (HURBURGH et al., 2000, ANKLAM et al., 2002). Rozlišit malé množství GMO v nemodifikovaných produktech je v tomto případě také značně obtížné.

2.4.4 Kontrola kvality detekce GMO V průběhu celého procesu stanovení GMO metodou PCR je vhodné sledovat systém kontrol kvality detekce, které umožňují správnou interpretaci výsledků a ukazují na případnou kontaminaci. Tento systém zahrnuje duplicitní odběr vzorků, extrakční negativní kontrolu, extrakční pozitivní kontrolu, pozitivní a negativní kontrolu mastermixu: 

Duplicitní odběr – kontrola kontaminace během homogenizace, odběru vzorku a celého procesu analýzy.



Extrakční negativní kontrola – sterilní voda nebo negativní materiál zpracovaný současně s vyšetřovaným vzorkem. Kontrola čistoty práce během extrakce a izolace.



Extrakční pozitivní kontrola – templátová DNA o známém množství obsahu GMO, nejlépe v hraničním množství detekovatelném danou metodou.



Negativní kontrola mastermixu – sterilní destilovaná voda. Kontrola kontaminace mastermixu.

- 33 -



Pozitivní kontrola mastermixu – templátová DNA – slouží ke kontrole správného složení mastermixu a celého průběhu amplifikace.

HELLER (2006) doporučuje několik metod k ověření PCR výsledků, které se liší spolehlivostí, přesností a cenou. Nejjednodušší metodou k identifikaci amplifikačních produktů je specifické štěpení restrikčními endonukleázami. Více specifickou metodou je přenos separovaných PCR produktů na membránu následované hybridizací se specifickou sondou (Southern Blot). PCR produkty mohou být také ověřeny přímým sekvenováním. To je nejpřesnější důkaz amplifikované DNA. 5 000 zemědělců 52 5

- 34 -

3 CÍL PRÁCE Moje disertace byla zaměřena na GMO

ve

vybraných

zemědělských

identifikaci schválených a neschválených plodinách

pocházejících

z konvenčního

a ekologického zemědělství a potravinách rostlinného původu odebraných v obchodní síti. Byly vybrány zejména plodiny, které mohou sloužit pro výrobu potravin a mohou se vyskytovat na českém trhu. Jednalo se zejména o plodiny a potraviny na bázi sóji a kukuřice, dále to byly rajčata, brambory, rýže a papája. K diagnostice byly využity metody kvalitativní a kvantitativní PCR a imunochemická metoda ELISA. Vzorky byly analyzovány

v laboratoři

molekulárně-biologických

metod

(LMBM)

Státního

zdravotního ústavu (SZÚ) v Brně v letech 2005-2008.

Disertace sestává ze: 1. Zhodnocení vlivu zpracování na amplifikaci DNA, zejména u brambor a zpracovaných potravin. 2. Prokázání výskytu a identifikace typu GMO v potravinách rostlinného původu odebraných v obchodní síti (sója, rajčata, kukuřice, rýže, papája) metodou PCR. 3. Prokázání výskytu a identifikace typu GMO v zemědělských plodinách (kukuřice, brambor) metodou PCR. 4. Srovnání použitých PCR metod u sóji a kukuřice s výsledky imunochemické metody ELISA.

- 35 -

4 MATERIÁL A METODY 4.1 Materiál K detekci GMO byl použit rostlinný materiál (zejména listy a zrna kukuřice, hlízy brambor, plody rajčat a papáji, sójové boby) a potraviny (sójové výrobky, sójové boby, mouka kukuřičná, rýže, sušená, kandovaná a konzervovaná papája). Listy a zrna kukuřice i hlízy brambor byly odebrány ve spolupráci s Českou inspekcí životního prostředí (ČIŽP) a s Ministerstvem životního prostředí (MŽP) na polích v ČR. Odběr vzorků byl proveden dle metodického pokynu GMO-2001-8. Potraviny, plody rajčat a papáji byly nakoupeny v tržní síti ve spolupráci se Zdravotními ústavy v rámci projektu GENOMON. Vzorky potravin byly nakoupeny na 12 místech ČR (obr. 9) ve čtyřech termínech za rok (březen, květen, září, listopad). Celkem bylo zpracováno 792 vzorků potravin a rostlinného materiálu. Hlízy GM brambor (EH92-527-1) byly použity syrové i kulinárně upravené. Byly použity běžné kulinární úpravy jako je loupání, vaření (s/bez soli), smažení. Vzorky byly odebrány v letech 2005 – 2008. Přehled odebraných a vyšetřovaných vzorků potravin a rostlinného materiálu je uveden v tabulce 6. Vzorky byly zpracovány a vyšetřeny v laboratoři molekulárně biologických metod (LMBM) Státního zdravotního ústavu – Centra zdraví, výživy a potravin v Brně.

Obr. 9: Odběrná místa potravin

- 36 -

Tab. 6: Přehled vyšetřovaných vzorků Matrice

Počet vzorků (n)

Sójové boby

134

Sójové boby bio

34

Sójové výrobky

168

Mouka kukuřičná

168

Rajčata

96

Rýže

126

Papája

27

Brambory

13

Kukuřičné listy

20

Kukuřičné zrno

6

Celkem

792

Jako negativní a pozitivní kontroly byly použity certifikované referenční materiály (CRM) vyrobené IRMM (Geel, Belgie) v rozmezí 0-2% GMO (RRS, IRMM 410; Bt 176, IRMM 411; MON 810, IRMM 413; Bt 11, IRMM 412). Protože pro některé GMO nebyly dostupné CRM, byla použita genomická DNA dodaná firmou GeneScan Europe, Německo (kukuřice T 25, GA 21, StarLink, DAS 1507, rýže Bt 63 a papája 55-1/63-1), interní referenční materiál (IRM) (brambor EH92-527-1, kukuřice NK 603), kukuřičná mouka Bt 10 dodaná Referenční laboratoří společenství (CRL, Ispra). Níže uvedené metody použité k analýze jsem v laboratoři molekulárně biologických-metod zavedla a zpracovala do formy standardních operačních postupů (SOP). Metody jsou validované a akreditované u Českého institutu pro akreditaci (ČIA) dle ČSN/ISO EN 17025. Laboratoř se pravidelně s úspěchem účastní mezilaboratorních porovnávacích zkoušek GeMMA.

4.2 Extrakce a izolace DNA Rostlinný materiál (hlízy, listy, klasy, čerstvá papája) a kulinárně upravené hlízy, sušená a kompotovaná papája byly homogenizovány ve sterilní třecí misce

- 37 -

s tloučkem. Rajčata, rýže, sójové boby a výrobky byly homogenizovány na mixovacím zařízení KitchenAid. Nerezové nástavce byly sterilní pro každý homogenizovaný vzorek. Genomická DNA vyšetřovaných vzorků byla izolována ze 100 mg metodou CTAB – cetyltrimetylamoniumbromid (ISO 21571, 2005). Princip je založen na fyzikálně – chemických principech a centrifugačních operacích s využitím lyzačního pufru CTAB a organických rozpouštědel (chloroform, isopropanol) vedoucí k odstranění kontaminantů (polysacharidy, proteiny). Postup sestává ze tří základních kroků: lyze buněčné membrány, extrakce genomické DNA a její precipitace. Peletka DNA byla rozpuštěna ve 100 µl sterilní deionizované vody. DNA CRM a IRM byla extrahována z 50 mg stejnou metodou. Kvantita a čistota DNA byla stanovena spektrofotometricky (Helios Gamma, Thermo spectronic, Velká Británie) z poměru absorbancí 260/280 (ISO 21571, 2005). Čistá DNA by měla mít poměr přibližně 1,8, zatímco hodnota poměru čisté RNA je přibližně 2,0.

4.3 Polymerázová řetězová reakce 4.3.1 Kvalitativní PCR Amplifikace byla provedena v celkovém objemu 25 µl reakční směsi na přístroji GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer, Německo). Oligonukleotidy byly syntetizovány firmou Invitrogen (USA) nebo byl použit kit pro detekci GMO (GeneScan, Německo). Přehled použitých primerů a velikost amplikonů jsou uvedeny v tabulce 7. K detekci byly použity metody screeningové, metody detekující specifický rostlinný druh, detekující specifický konstrukt nebo byly odrůdově specifické. Metoda je verifikována souběžnou analýzou GM pozitivního a GM negativního materiálu. Čistota práce při izolaci DNA je sledována tzv. extrakční kontrolou. Jako kontrola kontaminace reakčních komponent slouží vodní kontrola. PCR amplikony byly vyhodnoceny elektroforeticky na 2% nebo 4% agarózovém gelu v prostředí 1X TAE pufru. Elektroforéza probíhala při napětí 100 V po dobu 45 minut. Produkt byl vizualizován na UV transiluminátoru po obarvení ethidium bromidem. Výsledky byly zaznamenány na videodokumentační zařízení. K určení velikosti amplifikovaného produktu byl použit délkový standart (pUC 18 DNA MSp I digest – Sigma nebo 100bp – MoBio), který byl nanášen současně se vzorky.

- 38 -

Tab. 7: Přehled použitých primerů Cílová sekvence

Sekvence primerů (5´- 3´)

CaMV 35S promotor 35s-cf3/35s-cr4 NOS terminátor HA-nos118f/ HA-nos118r nptII gen APH2 short/ APH2 reverse Lectin GM03/ GM04 Roundup Ready sója 35S-f2/ petu-r1 Invertázový gen IVR1-F/ IVR1-R MON 810 VW01/ VW03 Bt 176 Cry03/ Cry04 Bt 11 IVS2-2/ PAT-B T 25 T25-F7/ T25-R3 GA 21 GA21 1-5/ GA21 1-3 StarLink CM03/ CBH02 NK 603 NK603 primer 1/ NK603 primer 2

f: CCACGTCTTCAAAGCAAGTGG´ r: TCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCC

DAS 1507 Bt 10 JSF5/ JSR5 Polygalakturoná sový gen PG34L/ PG34R Chloroplastový gen A1/ A2

Velikost amplikonu (bp) 123

Reference

f: GCATGACGTTATTTATGAGATGGG r: GACACCGCGCGCGATAATTTATCC

118

ISO 21569:2005

f: CTCACCTTGCTCCTGCCGAGA r: CGCCTTGAGCCTGGCGAACAG

215

ISO 21569:2005

f: GCCCTCTACTCCACCCCCATCC r: GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG f: TGATGTGATATCTCCACTGACG r: TGTATCCCTTGAGCCATGTTGT

118

ISO 21569:2005

172

ISO 21569:2005

f: CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACT r: GGAGCCCGTGTAGAGCATGACGATC f: TCGAAGGACGAAGGACTCTAACG r: TCCATCTTTGGGACCACTGTCG f: CTCTCGCCGTTCATGTCCGT r: GGTCAGGCTCAGGCTGATGT f: CTGGGAGGCCAAGGTATCTAAT r: GCTGCTGTAGCTGGCCTAATCT f: ATGGTGGATGGCATGATGTTG r: TGAGCGAAACCCTATAAGAACCC f: ACGGTGGAAGAGTTCAATGTATG r: TCTCCTTGATGGGCTGCA

226

ISO 21569:2005

170

ISO 21569:2005

211

ISO 21569:2005

189

ISO 21569:2005

209

ISO 21569:2005

270

CHIUEH, al. (2002)

et

f: CCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATA r: GTAGCTGTCGGTGTAGTCCTCGT f: TTTGTTTTATTTTGGACTATCCCGACTC r: CAAGAAGGGGAGGAGGTAAACAGAT

170

CHIUEH, al. (2002)

et

305

Kit GMO Ident Herculex I Corn 133 manual, verze 2.1 (1/2007)

SOP firmy Monsanto (BQ-QC-020301) GENESCAN (2006)

f: CACACAGGAGATTATTATAGGGTTACT 117

CRL (2005)

CA r: ACACGGAAATGTTGAATACTCATACTC T f: GGATCCTTAGAAGCATCTAGT r: CGTTGGTGCATCCCTGCATGG

383

ISO 21569:2005

614 (rýže) 550 (brambor)

JAMES, SCHMIDT (2004)

f: CGAAATCGGTAGACGCTACG r: GGGGATAGAGGGACTTGAAC

- 39 -

ISO 21569:2005

Bt 63

Papain papain papain 1-3 55-1/63-1

GMOIDENT MINI-KIT BT63 RICE 119 manual, GeneScan – Eurofins, Německo, verze 1.2 (6/2007) f: GGGCATTCTCAGCTGTTGTA 211 1-5/ r: CGACAATAACGTTGCACTCC

GENESCAN (2007b)

GMOIdent Sunup Papaya manual, 152 GeneScan – Eurofins, Německo, verze 1.0 Instruction for PREMaster NOSP-npt- 130 P/G Mod. GSE –P-0,5.37 GeneScan – Eurofins, Německo

GENESCAN (2004)

Amflora

WALL et al. (2004)

GENESCAN (2007a)

4.3.1.1 Sója a sójové výrobky Analýza byla zaměřena na detekci geneticky modifikované Roundup Ready sóji (GTS-40-3-2). Bylo provedeno stanovení specifické sekvence (lectin) vyskytující se v sóji (Glycine max) a specifického konstruktu (region mezi CaMV 35S promotor a oblast signálu Petunia hybrida předcházející Agrobacterium EPSPS sekvenci) dle ISO 21569, 2005. Analýzou lectinového genu zjistíme, zda je DNA v dostatečné kvalitě pro další amplifikaci. Metoda specifická pro tento konstrukt detekuje přímo tento specifický konstrukt tzv. Roundup Ready (RR) sóji. Reakční směs pro detekci lectinového genu obsahovala 3 l genomické DNA (50 ng), 1X PCR pufr, 1,5 mM MgCl2, 800 M dNTP, 0,25 M primerů a 0,5 U Taq polymerázy. Amplifikace byla provedena dle následujícího teplotního cyklu: Počáteční denaturace

10 min/ 95°C

Denaturace

30s/95°C

Annealing

30s/60°C

Extenze

60s/72°C

Závěrečná extenze

3 min/72°C

35x

Reakční směs pro detekci specifického konstruktu RR sóji obsahovala 3 l genomické DNA (50 ng), 1X PCR pufru, 1,5 mM MgCl2, 800 M dNTP, 0,25 M primerů a 0,5 U Taq polymerázy.

- 40 -

Amplifikace byla provedena dle následujícího teplotního cyklu: Počáteční denaturace

10 min/ 95°C

Denaturace

30s/95°C

Annealing

30s/60°C

Extenze

25s/72°C

Závěrečná extenze

3 min/72°C

40x

4.3.1.2 Kukuřice a kukuřičné výrobky Materiál na bázi kukuřice byl analyzován na přítomnost/nepřítomnost GM kukuřice Bt 11, Bt 176, T 25, MON 810, GA 21, Bt 10, NK 603, StarLink, DAS 1507. Metoda detekující specifickou sekvenci byla provedena detekcí invertázového genu dle ISO 21569, 2005. Hybridy kukuřice Bt 11, Bt 176, T 25 byly analyzovány metodou detekující specifický konstrukt dle ISO 21569 (2005). Hybrid MON 810 byl vyšetřen odrůdově specifickou metodou dle ISO 21569 (2005). Hybridy tolerantní k herbicidu GA 21 a StarLink (CBH-351) byly vyšetřeny specifickou PCR (CHIUEH et al., 2002). Pro detekci kukuřice Bt 10 byla použita odrůdově specifická metoda (CRL, 2005). Detekce kukuřice NK 603 byla provedena podle doporučení firmy Monsanto. Složení mastermixů a průběhy reakčních cyklů jsou uvedeny v tabulkách 8 a 9. Detekce kukuřice DAS 1507 (Herculex) byla provedena pomocí GMO detekčního kitu (GENESCAN, 2006) dle doporučení výrobce.

- 41 -

Tab. 8: Složení mastermixů pro detekci GM kukuřice Komponenty

IVR

Bt176 Bt11 T25 MON GA21 StarLink Bt10 NK603

mastermixu

810

Genomická

2

2

1

1

2

5

3

5

3

PCR pufr

1X

1X

1X

1X

1X

1X

1X

1X

1X

MgCl2 (mM)

1,5

1,5

2

2

2

1,5

1,5

1,5

1,5

Primer 1 (M)

0,5

0,25

0,5

0,5 0,5

3

1,6

0,6

0,2

Primer 2 (M)

0,5

0,25

0,5

0,5 0,5

3

1,6

0,6

0,2

dNTP (mM)

0,4

0,4

0,1

0,4 0,4

0,064 0,128

0,64

0,8

0,5

1

0,5 1

0,1

0,04

0,032 2,5

MON GA

Star

810

Link

DNA (50 ng) l

Taq polymeráza 1 (IU)

Tab. 9: Teplotní cykly amplifikace pro GM kukuřice Kroky

IVR

Bt176 Bt11

T25

amplifikace

21

Bt10

NK

DAS

603

1507

1. Počáteční 12min 12min 12min 12min 12min 3 min 10min

10min

1min

10min

denaturace

95°C

95°C

95°C

95°C

95°C

95°C 95°C

94°C

94°C

94°C

2.

30 s

30 s

30 s

30 s

30 s

1min 30 s

25 s

30 s

25 s

Denaturace

95°C

95°C

95°C

95°C

95°C

95°C 95°C

94°C

94°C

94°C

3.

30 s

30 s

30 s

30 s

30 s

1min 30 s

30 s

30 s

30 s

Amplifikace 64°C

63°C

64°C

64°C

64°C

57°C 60°C

62°C

64°C

62°C

4. Extenze

60 s

30 s

30 s

30 s

30 s

1min 30 s

45 s

90 s

45 s

72°C

72°C

72°C

72°C

72°C

72°C 72°C

72°C

72°C

72°C

5.

10min 6min

10min 10min 10min 7min 7 min

7min

10min

3min

Finální

72°C

72°C

72°C

72°C

72°C

72°C 72°C

72°C

72°C

72°C

35

38

38

40

40

40

40

38

50

extenze Opakování 2.-4. kroku

- 42 -

40

4.3.1.3 Rýže Pro detekci místo druhově specifické DNA byla použita metoda pro detekci chloroplastového genu (chloroplast trnL intron), který se vyskytuje běžně v rostlinách. Metoda je vhodná ke kontrole, zda byla extrakce DNA úspěšná a zda vzorek obsahuje rostlinnou DNA (TABERLET et al., 1991, JAMES, SCHMIDT, 2004). Vzhledem k tomu, že ve většině GMO jsou přítomny regulační sekvence CaMV 35S promotor a nopalin syntéza (NOS) terminátor, může být pro detekci využita screeningová reakce (PIETSCH et al., 1997, HEMMER, 1997, ISO 21569, 2005). Detekce rýže Bt 63 byla provedena za použití GMO detekčního kitu (GENESCAN, 2007b) podle doporučení výrobce. Složení mastermixů a teplotní cykly jsou uvedeny v tabulkách 10 a 11. Tab. 10: Složení mastermixù pro screeningovou reakci Komponenty mastermixu

Chloroplastový gen

Genomická DNA (ng)

35S CaMV NOS

10-50

10-50

10-50

1X

1X

2,5

1,5

1,5

Primer 1 (M)

1

0,6

0,6

Primer 2 (M)

1

0,6

0,6

dNTP (mM)

1

0,64

0,64

Taq polymeráza (IU)

1

0,8

0,8

PCR pufr MgCl2 (mM)

Tab. 11: Teplotní cykly pro screeningovou reakci a detekci rýže Bt 63 Kroky amplifikace

1. Počáteční denaturace 2. Denaturace 3. Amplifikace 4. Extenze 5. Finální extenze Opakování 2.-4. kroku

Chloroplastový 35S gen

CaMV

10 min 95°C 30 s 95°C 30 s 50°C 2 min 72°C 5 min 72°C 35

10 min 95°C 25 s 95°C 30 s 62°C 45 s 72°C 7 min 72°C 50 - 43 -

NOS

Bt63

10 min 95°C 25 s 95°C 30 s 62°C 45 s 72°C 7 min 72°C 50

10 min 94°C 25 s 94°C 30 s 62°C 45 s 72°C 3 min 72°C 50

4.3.1.4 Rajčata Detekce polygalakturonásového genu (PG gen) byla použita jako druhově specifická metoda dle ISO 21569 (2005). Rajčata byla vyšetřena pomocí screeningových metod na přítomnost CaMV 35S promotoru, NOS terminátoru a genu neomycinfosfotransferázy II (nptII) dle ISO 21569 (2005). Reakční směs pro detekci CaMV 35S promotoru a NOS terminátoru je uvedena v tabulce 10. Reakční směs pro detekci PG genu obsahovala 1 l genomické DNA (50 ng), 1X PCR pufru, 1,5 mM MgCl2, 400 M dNTP, 0,4 M primerů a 1 U Taq polymerázy. Amplifikace byla provedena dle následujícího teplotního cyklu: Počáteční denaturace

10 min/ 95°C

Denaturace

30s/94°C

Annealing

60s/60°C

Extenze

60s/72°C

Závěrečná extenze

6 min/72°C

35x

Reakční směs pro detekci nptII genu obsahovala 5 l genomické DNA (50 ng), 1X PCR pufru, 1,5 mM MgCl2, 200 M dNTP, 0,4 M primerů a 2 U Taq polymerázy. Amplifikace byla provedena dle následujícího teplotního cyklu: Počáteční denaturace

10 min/ 95°C

Denaturace

25s/95°C

Annealing

30s/60°C

Extenze

45s/72°C

Závěrečná extenze

7 min/72°C

35x

4.3.1.5 Papája Detekce GM papáji 55-1/63-1 byla provedena za použití GMO detekčního kitu (GENESCAN, 2004). Metoda je založena na amplifikaci specifické DNA sekvence, typické pro GM papáju (152 bp). Pro každý vzorek je dále nutná kontrolní reakce (papain - 211 bp) k potvrzení přítomnosti DNA pocházející z papáji. Systém detekuje GM klony 55-1 a 63-1. Sekvence primerů byly přejaty z GENESCAN Europe. Pro specifickou druhovou detekci papáji byly použity podklady z WALL et al. (2004). Pozitivní kontrolní reakce (papain - 211 bp) slouží k informaci, že vzorek obsahuje - 44 -

dostatek amplifikovatelné DNA. Ve specifické reakci je přítomnost příslušných amplikonů (152 bp) důkazem genetické modifikace. Reakční směs pro detekci papainu obsahovala 3 l genomické DNA (50 ng), 1X PCR pufru, 1,5 mM MgCl2, 200 M dNTP, 0,6 M primerů a 1 U Taq polymerázy. Reakční směs pro detekci GM papáji 55-1/63-1 obsahovala 3 l genomické DNA (50 ng), 1X PCR pufru, 1,5 mM MgCl2, 200 M dNTP, 0,6 M primerů a 1 U Taq polymerázy. Amplifikace byla provedena pro obě reakční směsi dle následujícího teplotního cyklu: Počáteční denaturace

10 min/ 94°C

Denaturace

25s/94°C

Annealing

30s/62°C

Extenze

45s/72°C

Závěrečná extenze

7 min/72°C

38x

4.3.1.6 Brambor K identifikaci byla použita metoda pro detekci chloroplastového genu (chloroplast trnL intron), který se vyskytuje běžně v rostlinách (TABERLET et al., 1991, JAMES, SCHMIDT, 2004). Složení mastermixu je uvedeno v tab. 10. Brambory byly dále vyšetřeny za použití PCR screeningové metody (nptII gen, viz. bod č. 4.3.1.4) a specifické metody pro detekci EH92-527-1. K detekci EH92-527-1 byl použit kit firmy GENESCAN (2007a). Složení mastermixu a amplifikační cyklus byl proveden dle pokynů výrobce.

4.3.2 Kvantitativní PCR Kvantitativní analýza byla provedena u vzorků na bázi sóji (detekce RR sóji) a na bázi kukuřice (Bt 176). Ke kvantifikaci byly použity komerční kity firmy Roche pro analýzu na LightCycleru 2.0 (Roche diagnostic). Složení mastermixů a amplifikační teplotní cykly byly provedeny dle pokynů výrobce. Ke kalibraci byla použita metoda relativní kvantifikace. Kalibrační křivky amplikonů byly vytvořeny s tzv. kalibrátorem

- 45 -

(zahrnutý v kitu). Kalibrátor je typicky pozitivní vzorek se stabilním poměrem cílového genu k referenčnímu genu a je použit k normalizaci všech vzorků v daném běhu (ROCHE, 2001). Kalibrace byla založena na hmotnostní frakci.

4.4 Imunochemické metody – ELISA Metoda ELISA byla použita k detekci CP4 EPSPS proteinu exprimovaného v Roundup Ready sóji. Analýza byla provedena za použití komerčního kitu (SDI, 2003). K detekci

Cry9C

proteinu

produkovaného

geny

Bacillus

thuringiensis

(Bt)

a k detekci Cry1Ab proteinu byly také použity komerční kity (SDI, 2000, SDI, 2001). Postup byl proveden dle pokynů výrobce komerčních kitů. Kity zajišťují semikvantitivní analýzu a potvrzení PCR výsledků.

- 46 -

5 VÝSLEDKY A DISKUSE Práce byla zaměřena na detekci a identifikaci povolených i nepovolených GMO v zemědělských plodinách, které mohou být použity pro výrobu potravin. Celkem bylo zpracováno 792 vzorků potravin a rostlinného materiálu. Jednalo se zejména o plodiny a potraviny na bázi sóje a kukuřice, dále rajčat, brambor, rýže a papáji. Vzorky byly odebrány a zpracovány v průběhu let 2005-2008 v LMBM Státního zdravotního ústavu – Centra zdraví, výživy a potravin v Brně. Z každého vzorku byla izolována DNA metodou CTAB a následně byla provedena detekce GMO kvalitativní a kvantitativní metodou PCR, příp. ELISA. Kvalitativně byl proveden screening (35S promotor, NOS terminátor, nptII) a specifické reakce (RRS, MON 810, Bt 176, Bt 11, T 25, NK 603, GA 21, DAS 1507, StarLink, Amflora, Bt 63, 55-1/63-1). Real-time PCR byla použita pro kvantifikace RRS a Bt 176. Celkem bylo pozitivních 59 vzorků, jak je uvedeno v tabulce 12. Z toho u 13 vzorků brambor byl test zaměřen na vliv kulinární úpravy a následnou amplifikaci DNA. K této analýze byla použita GM odrůda Amflora (EH92-527-1). Výskyt pozitivních nálezů v jednotlivých letech je uveden na grafu obr.10. Z grafu je zřejmé, že dochází k poklesu výskytu RRS a naopak se zvyšuje výskyt GM hybridů kukuřice a rýže. Podle nařízení Rady 834/2007 je použití GMO v ekologickém zemědělství zakázáno. Je však stanoven technický limit příměsí pro náhodný a technicky nevyhnutelný výskyt GMO v bioproduktech. Tento limit je stejný jako pro konvenční zemědělství (0,9%). Zemědělci již nemusí mít obavu, že díky stopové, nezaviněné kontaminaci GMO do 0,9% přijdou o svůj biocertifikát. Nebude však už tak jednoduché u výrobků z kukuřice a sóji zajistit, aby byly skutečně „GMO free“ (IFOAM EU GROUP, 2009). Záchyty RRS v potravinách jsou detekovány i v jiných zemích, např. Srbsko, Turecko, Brazílie apod. Vyšetřené vzorky na bázi kukuřice obsahovaly GM Bt 176, MON 810, NK 603 a StarLink. V zahraničí je detekce zaměřena zejména na hybridy MON 810, Bt 11.

- 47 -

Tab. 12: Počet vzorků obsahující GMO vyšetřených v letech 2005-2008 Matrice

Počet vyšetřených Počet pozitivních vzorků (n)

vzorků (+ n)

Sójové boby

134

4

Sójové boby bio

34

1

Sójové výrobky

168

19

Mouka kukuřičná

168

9

Rajčata

96

0

Rýže

126

5

Papája

27

0

Brambory

13

13

Kukuřičné listy

20

5

Kukuřičné zrno

6

3

Celkem

792

59

Výskyt pozitivních nálezů GMO v letech 2005-2008

počet nálezů

10 9 8 7 6

sójové boby

5 4 3 2

mouka kukuřičná

sójové boby bio sójové výrobky rýže kukuřičné listy kukuřičná zrna

1 0 2005

2006

2007

2008

rok

Obr. 10: Graf výskytu pozitivních nálezů GMO v letech 2005-2008

Jedním z hlavních problémů analytické analýzy je proces vzorkování. Vzorek musí být reprezentativní. Na jedné straně musí vzorkovací plán zajistit odběr

- 48 -

reprezentativního vzorku s ohledem na velikost a jeho homogenitu. Na druhé straně musí být vzorek dostatečně velký, aby byla spolehlivá detekce při navrhované senzitivitě (ANKLAM et al., 2002). Pro provádění úředních kontrol je důležitá fáze odběru vzorků. Správná aplikace metodologie vzorkování pro účely stanovení přítomnosti GMO je nezbytná pro zajištění požadavků kontroly dodržování legislativních opatření a zabezpečujících dohledatelnost GMO v potravním řetězci a sledování výskytu v životním prostředí. V současné době je možné využít mezinárodně uznávané normy vzorkování při vzorkování zrnin (KUČERA, OVESNÁ, 2009).

5.1 Vliv zpracování na amplifikaci DNA Použitá metoda CTAB izolace byla vhodná jak pro vzorky tepelně neopracované (listy a zrna kukuřice, syrové brambory, čerstvá papája, sójové boby), tak i pro vzorky upravené jako potraviny (sójové výrobky, rýže, papája, kukuřičná mouka, brambory). Amplifikovatelnost DNA byla potvrzena za použití specifických rostlinných primerů pro lectin (sója), sekvence invertázového genu (kukuřice), chloroplastový gen (rýže, brambory), PG gen (rajčata), papain (papája). Pouze u sedmi vzorků parboiled rýže a osmi vzorků papáji (sušená, kandovaná, konzervovaná) se nepodařilo izolovat a dále amplifikovat DNA. Potraviny jsou komplexní systém, který obsahuje ještě další složky než DNA; ty mohou inhibovat PCR reakci a vést k falešně negativním výsledkům. Proto se doporučuje rutinní použití interních pozitivních kontrol v PCR reakci (HELLER, 2006). Kvalita DNA se mění podle vyšetřovaného materiálu, stupně zpracování vzorku a požadované DNA extrakční metody. Je důležité mít na mysli, že DNA izolovaná ze zpracovaných potravin a některých zemědělských materiálů (konzervované tabákové listy) jsou nízké kvality. Proto se doporučuje výběr vhodných primerů, které mají krátkou cílovou sekvenci (např. 100-400 bp) (ANKLAM et al., 2002). Citlivost PCR závisí na několika faktorech, zejména na počtu cyklů v běhu, pozici reakčních nádobek v termocykleru, afinitě primerů k cílové sekvenci, délce amplikonů, přítomnosti inhibičních složek, složení reakční směsi a na kvalitě a kvantitě DNA (HELLER, 2006). Problémem identifikovatelnosti spočívá v tom, že měřený obsah GMO ve zpracovaném materiálu nemusí vždy odrážet skutečný obsah GMO v syrovém - 49 -

materiálu; v extrémních případech nemůže být specifická GM sekvence snadno detekována (RIZZI et al., 2004). Tepelné ošetření, pH, enzymatické ošetření a fermentace jsou běžnými podmínkami při zpracování potravin, které mají za následek degradaci nukleových kyselin nebo proteinu. Přítomnost vhodného analytu závisí na stupni degradace během zpracování (BAUER et al., 2003, HELLER, 2006). Prakticky žádná DNA není detekovatelná ve vysoce tepelně ošetřených potravinách, hydrolyzovaných rostlinných proteinech, purifikovaném lecitinu, škrobových derivátech a rafinovaných olejích vyrobených z GMO (KUIPER, 1999). MARMIROLI et al. (2008) uvádí, že nejvhodnější extrakční metoda pro DNA závisí jak na potravinové matrici, tak na potřebách výzkumu. Nejlépe se osvědčila metoda CTAB ve srovnání s ostatními extrakčními metodami. K hodnocení byly vzaty v úvahu následující parametry: výtěžnost DNA, přítomnost inhibitorů, cena na vzorek, požadovaný čas k extrakci. Několik studií popisuje vliv zpracování potravin na fragmentaci DNA, např. průměrný délkový fragment DNA extrahovaný z tepelně ošetřeného vepřového masa byl redukován z 1,1 kb na 0,3 kb. Podobný efekt byl pozorován u DNA ze zpracovaných rajčatových produktů. Silážování je další příklad zpracování, který ovlivňuje stabilitu DNA (HELLER, 2006).

5.2 Detekce Roundup Ready sóji Vzorky sójových bobů a výrobků na bázi sóji byly analyzovány na přítomnost Roundup Ready sóji (GTS-40-3-2). Pět vzorků sójových bobů (z toho 1x bio boby) a 19 vzorků sójových výrobků obsahovaly RRS. Relativní obsah RRS v pozitivních vzorcích byl v rozmezí 0,01% - 1,0%. Hraniční hodnota pro značení 0,9% byla překročena u dvou vzorků sójových výrobků. Limit detekce kvalitativní PCR byl 0,1% GMO. Množství RRS bylo stanoveno za použití metody real-time PCR a ELISA. Výrobce garantuje, že kit spolehlivě kvantifikuje relativní obsah 0,1% GM sóji (ROCHE, 2004a). Vlastní analýzou bylo ověřeno, že kit kvantifikuje již od 0,01% GM sóji. Množství je vyjádřeno v hmotnostních procentech. Semikvantitativní metoda ELISA byla použita pouze pro srovnání výsledků získaných kvalitativní a kvantitativní metodou PCR. ELISA spolehlivě kvantifikovala množství v rozmezí 0-2,5%.

- 50 -

RRS (GTS 40-3-2) byla poprvé povolena pro použití jako potravina nejdříve v USA, a poté v EU, Kanadě, Japonsku, Rusku. RRS bývá běžně detekována v potravinách nejen v zemích EU, ale také na celém světě (FVO, 2003; FVO, 2005a; FVO, 2005b; FVO, 2005c; FVO, 2006; SANHOTY et al., 2002; CARDARELLI et al., 2005; OGIYA et al., 2006). Např. transgenní DNA z GM sójových bobů byla detekována

v 17.2%

vyšetřených

vzorků

potravin

nakoupených

v Moskvě

(TUTEL´IAN et al., 2003). V letech 2000 – 2001 byla RRS také detekována v potravinách na trhu v Brazílii. V roce 2000 to bylo ve 13% vyšetřených vzorků a v roce 2001 ve 21% vyšetřených vzorků (GREINER et al., 2005). ZAULET et al. (2008) uvádějí, že většina výrobků na rumunském trhu je GM a obsahují RRS. V Turecku byla RRS také prokázána ve vysoce zpracovaných potravinách (sójové maso, sójová mouka, tofu, sójové mléko) za použití screeningové metody (ARI, CAKIR, 2008). Studie provedená v Srbsku byla zaměřena na detekci RRS ve zpracovaných masných výrobcích (např. mortadela, salámy, lunchmeat, hot-dog) a byla pozitivní ve 12 vzorcích z celkem 50 vyšetřených. U pozitivních vzorků byl obsah pod 0,1% a nebylo tedy nutné značení na obalu. V Srbsku je limit pro označování stejný jako v EU 0,9% (TASKI-AJDUKOVIC et al., 2008). Podobně byla provedena detekce RRS v masných výrobcích i v Brazílii. RRS byla přítomna ve třech výrobcích ze 47 vyšetřených vzorků. Detekce byla provedena metodou nested PCR. Kvantita nebyla stanovena. Limit pro označování je v Brazílii 1%

(TREML, ARISI, 2008).

BRANQUINHO et al. (2008) provedli v Brazílii studii zaměřenou na dodržování legislativního označování potravin. Kvantitativní analýza prokázala přítomnost RRS a množství v rozmezí 0,01% - 1% u 42 vzorků z celkem 265 a množství převyšující 1% u 45 vzorků z celkem 265. Tyto potraviny nebyly na obalu označeny dle platné legislativy. Přítomnost RRS na trhu je v ČR každoročně potvrzena v rámci studie GENOMON, která probíhá od roku 2002 (KÝROVÁ et al., 2006; KÝROVÁ et al., 2008a, d). V průběhu let 2002 – 2007 byla RRS detekována u 14 (4,9 %) vzorků sójových bobů z 288 a u 88 (30,5 %) vzorků sójových výrobků z 288. Množství RRS stanovené metodou real-time PCR se pohybovalo v rozmezí 0,01% - 75,3% (KÝROVÁ et al., 2010). GRYSON et al. (2008) uvádí, že více DNA detekovali z plnotučné než odtučněné mouky. To může být vysvětleno nižší extrakční efektivitou pro plnotučnou

- 51 -

mouku kvůli tučnější matrici a nižšímu obsahu sušiny. Ze sójové mouky po tepelném ošetření byla získána DNA s nižší molekulovou hmotností, délka DNA fragmentů byla pod 600 bp, která byla dostatečná pro analýzu PCR. Žádná DNA nebyla detekována ze vzorků sójové vlákniny. CORBISIER et al. (2005) potvrdili, že tepelné ošetření má velký vliv na detekci DNA, ale vzhledem k tomu, že detekovali krátké úseky DNA, byla RRS (GTS 40-3-2) ve všech vyšetřovaných vzorcích. U vzorků s vysokou hladinou degradace DNA byla přesnost měření závislá na použité extrakční metodě. Detekce rekombinantního genu RRS metodou PCR a stanovení obsahu CP4 EPSPS rekombinantního proteinu testovaného pomocí Strip kitu a ELISA kitem ukazují, že obě použité metody mohou zajistit shodné výsledky v detekci RRS (LIN et al.,

2001).

Mohou

se

však

vyskytnout

problémy

s rozvojem

PCR

nebo

imunochemických metod (LIN et al., 2000): 1) Zpracované potraviny: u vysoce zpracovaných nebo fermentovaných potravin mohou být změněné geny nebo denaturované proteiny obtížně detekovatelné. 2) U různých odrůd se identifikace může lišit. Je pěstováno velké množství různých odrůd GM plodin, což vede k potřebě vývoje velkého množství detekčních metod. 3) Míchání GM produktů: různé odrůdy GM plodin jsou míchány před, nebo po sklizni. 4) Nedostatek informací týkající se sekvence vložených genů, které mohou mít za následek obtížnost v navrhování vhodných primerů. Firmy svoje patenty střeží z komerčních důvodů. 5) Obchod mezi zeměmi, kde GM potraviny nejsou regulované mohou vytvořit problém v detekci GM potravin (LIN et al., 2001).

ONDŘEJ a DROBNÍK (2002) uvádějí, že byly srovnávány odrůdy sóji obsahující jediný transgen – gen pro enzym EPSPS s netransgenními odrůdami, ze kterých byly odvozeny. Transgenní protein není podobný žádnému ze známých toxických proteinů. V polních studiích nebyly zjištěny žádné rozdíly v citlivosti k chorobám a škůdcům. Ve srovnání obsahu tuků, bílkovin, vlákniny polysacharidů a popelovin byla zjištěna podstatná shoda.

- 52 -

5.3 Detekce GM kukuřice Materiál na bázi kukuřice byl analyzován na přítomnost/nepřítomnost GM hybridu Bt 11, Bt 176, T 25, MON 810, GA 21, Bt 10, NK 603, StarLink, DAS 1507 a endogenu (invertázový gen). Všechny vyšetřované vzorky byly pozitivní na invertázový gen, který se používá pro zjištění, zda je DNA amplifikovatelná. Potom byly vzorky vyšetřeny na přítomnost MON 810, Bt 11, Bt 176, T 25, GA 21, StarLink, Bt 10, DAS 1507, NK 603. GM byla zjištěna v 17 vzorcích. Byly detekovány modifikace MON 810, Bt 176, StarLink a NK 603. Počet jednotlivých modifikací je uveden v tabulce 13 a na obr. 11. Limit detekce kvalitativní PCR byl 0,1% GMO (MON 810, Bt 11, Bt 176, T 25, GA 21, StarLink, Bt 10, NK 603) a ≤0.1% GMO (DAS 1507). Kvantitativní analýza byla provedena u vzorků, které obsahovaly Bt 176. Relativní obsah byl v rozmezí 0,010,14%. Kvantifikační kit detekuje relativní obsah 0,1% GM Bt 176 (ROCHE, 2004b). Množství 0,01-0,1% kukuřice Bt 176 bylo ověřeno analýzou vzorků o známé koncentraci a spolehlivě detekováno také tímto kitem. Modifikace MON 810, StarLink a NK 603 byly potvrzeny pouze metodou kvalitativní PCR. Metoda ELISA potvrdila přítomnost transgenních proteinů v tzv. Bt kukuřicích (MON 810, Bt 176, StarLink). Semikvantitativní metoda ELISA byla použita pouze pro srovnání získaných výsledků. ELISA spolehlivě kvantifikovala množství v rozmezí 0-2,5%. V současné době jsou pro různé odrůdy dostupné komerční ELISA kity. Zejména se jedná o kity, které detekují specifické proteiny v potravinových plodinách jako jsou Cry1Ac, Cry1C, Cry3A, Cry2A, Cry9C, CP4 EPSPS a PAT. ELISA metody nabízí vyšší stupeň automatizace. Nicméně se musí zdůraznit, že obsah nově exponovaných proteinů není rovnoměrně distribuován v celé rostlině. Například v kukuřici je nejvyšší obsah zjištěn v listech a ne v zrnech (ANKLAM et al., 2002). S ohledem na složení potravin musí být bráno v úvahu, že imunochemické metody nejsou schopny rozlišení mezi stejnými rekombinantními proteiny exprimovanými v různých GM plodinách. ELISA metody byly používány k určení GM plodin, vyskytujících se jako příměs v potravinách (např. sójová mouka v mouce pšeničné), ale bylo zjištěno, že jsou méně vhodné pro zjištění GMO ve směsných potravinách. Výroba potravin, zrání a procesy kažení zahrnují několik enzymatických reakcí, které vedou k hlavním změnám ve struktuře proteinů. Byla také sledována stabilita Cry1Ab proteinu u Bt kukuřice během procesu silážování, kdy došlo k degradaci proteinu vlivem snížení pH a působením mikrobiálních proteáz.

- 53 -

Po čtyřech měsících silážování nebylo možné detekovat transgenní protein metodou ELISA (HELLER, 2006).

Tab. 13: Počet a typ modifikace u pozitivních vzorků kukuřice 35S

MON 810

BT 176

NK 603

StarLink

9

4

4

0

1

5

5

0

1

0

3

1

0

1

0

17

10

4

2

1

promotor Mouka kukuřičná Kukuřičné listy Kukuřičná zrna Celkem

Počet vzorků obsahující GM kukuřici vyšetřených v letech 2005-2008 6

Počet vzorků

5 MON810

4

Bt 176

3

NK 603

2

StarLink

1 0 kukuřičná mouka

kukuřičné listy

kukuřičná zrna

Matrice

Obr. 11: Počet vzorků obsahující GM kukuřici vyšetřených v letech 2005-2008

Kukuřice MON 810 a NK 603 jsou povoleny pro použití jako potravina a krmivo. Kukuřici Bt 176 a produktům z ní vyrobených skončilo období (18. 4. 2007),

- 54 -

kdy mohly být uváděny na trh. Přítomnost materiálu, který obsahuje, skládá se nebo je vyroben z odrůdy Bt 176 v potravinách nebo krmivech bude ještě tolerován po dobu pěti let (EU, 2007). GM hybrid MON 810 byl detekován ve dvou vzorcích, Bt 176 také ve dvou vzorcích a StarLink v jednom vzorku z celkem 288 vyšetřených vzorků v letech 2002 – 2007 (KÝROVÁ et al., 2010). Potraviny, které jsou vyrobeny nebo mohou obsahovat GM (genetickou modifikaci) byly také analyzovány v dalších zemích (FVO, 2003; FVO 2005a; FVO, 2005b; FVO, 2005c; FVO, 2006). Žádná Bt 176 a MON 810 nebyla detekována v Brazílii (CARDARELLI et al., 2005). V Egyptě byla detekována kukuřice Bt 176 a Bt 11 (SANHOTY et al., 2002). AL-HMOUD et al. (2010) uvádějí, že na jordánském trhu se vyskytují neoznačené potraviny obsahující MON 810. Kukuřice StarLink je povolena jako krmivo pouze v USA (CERA, 2010), pro potravinářské použití není v EU povolena. Kontaminace krmnou kukuřicí v potravinářské byla hlášena v USA a Japonsku (CHIUEH et al., 2002). V Brazílii byla detekována kukuřice Bt 11 jak v zrnech, tak v kukuřičné mouce a škrobu. První záchyt byl v roce 2003. Sledované období bylo 2000-2007 (MARCELINO et al., 2008). V procesu identifikace a kvantifikace GM plodin se vyskytuje několik problémů. Jde zejména o ploiditu chromozómů v buňkách a počet vložených kopií genetické modifikace je často neznámý. Stejné genové kazety mohou být použity u různých druhů plodin (např. sója, kukuřice) a použití rozdílných genových kazet u stejného druhu vede ke vzniku kombinovaných vlastností, tzv. stacked gene, které mohou vést k neurčitým výsledkům. „Gene stacking“ vyvolává další otázku týkající se správného použití referenčních materiálů kvantitativních principů (HELLER, 2006).

5.4 Detekce GM rajčat Vzorky rajčat s pozitivním signálem na PG gen (obr. 12) byly analyzovány screeningovou detekční metodou na CaMV 35S promotor, NOS terminátor a nptII gen. Limit detekce byl 0,1%. Nebyla zjištěna žádná GM rajčata v letech 2005- 2006. GM rajčata byla jako první komerčně dostupná plodina v USA v roce 1994. V roce 1998 však musela být stáhnuta z trhu a nejsou ani pěstována v severní Americe, ani v Evropě. V 90. letech bylo ve Velké Británii úspěšně vyráběno a prodáváno rajčatové pyré z GM rajčat. I když vědecká komise EU vyhodnotila rajčatové pyré jako - 55 -

neškodné, žádost o schválení byla zamítnuta v roce 2002. V současné době všechna rajčata dostupná na trhu (čerstvá nebo konzervovaná) nejsou geneticky modifikována (GMO COMPASS, 2010e; KÝROVÁ et al., 2010).

383 bp

ST - délkový standard (pUC18 DNA Msp I Digest), 65, 69, 73 –vzorky rajčat, 109 – 0,1% CRM RRS, V – PCR voda, EK – negativní extrakční kontrola

Obr. 12: Detekce amplikonů PG genu u rajčat pomocí gelové elektroforézy

5.5 Detekce GM papáji Vyšetření papáji bylo sledováno, protože bylo podezření, že se na český trh mohla dostat geneticky modifikovaná papája z Havaje. Papája byla vyšetřena v letech 2005-2006. Byly analyzovány vzorky papáji čerstvé, sušené, kandované a konzervované. Použitá extrakční metoda byla vhodná pro čerstvou papáju, u ostatních vzorků musely být před extrakcí ze vzorků odstraněny barviva. Toho se dosáhlo máčením vzorků ve vodě. Tepelné ošetření a vysoká hladina cukrů a barviv, to jsou podmínky, které mohou způsobit degradaci nukleových kyselin. Vzorky papáji s pozitivním signálem na papain byly analyzovány specifickou metodou detekující odrůdu 55-1/63-1. Limit detekce PCR systému je validovaný pro 20 kopií na PCR reakci (GENESCAN, 2004). Pozitivní signál na papain vykázaly pouze vzorky čerstvé papáji (obr. 11). U těchto vzorků nebyla zjištěna GM (KÝROVÁ et al., 2008b). Přehled získaných výsledků je uveden v tabulce 14.

- 56 -

211 bp

152 bp

ST - délkový standard (pUC18 DNA Msp I Digest), 105 - čerstvá papája, 106 - sušená papája kostky, 107 - sušená papája hranolky, 108 - sušená papája, PK – pozitivní PCR kontrola (papája linie 55-1 a 63-1), V - voda, EK – negativní extrakční kontrola

Obr. 13: Detekce amplikonů papáji pomocí gelové elektroforézy Tab. 14: Počet pozitivních vzorků na papain Vzorky

n

+n na papain

Čerstvá papája

19

19

Sušená papája

1

0

Konzervovaná papája

5

0

Kandovaná papája

2

0

Celkem

27

19

WALL et al. (2004) uvádějí, že testovali DNA z osmi zpracovaných papájových produktů (kandovaná papája, sušená papája, papájová pomazánka, tropický ovocný džus, ovocný míchaný džus, nektar, konzervovaná papája a kousky míchaného ovoce) komerčně dostupných na kanadském trhu. Použité extrakční metody (Wizard nebo křemičité kolonky) nebyly vhodné pro amplifikaci endogenu nebo transgenu. Příčinou může být přítomnost PCR inhibitorů nebo degradovaná DNA. XU et al. (2008) uvádějí, že metoda real-time PCR může být použita k detekci endogenního referenčního genu - 57 -

papainu obsahu GM papáji ve zpracovaných produktech. Tento fragment nebyl detekován u dalších testovaných druhů (např. sójové boby, bavlník, kukuřice, rýže, tabák, slunečnice, rajčata, brambory, banán apod.) a je tedy specifický pro papáju. GM papája není povolena jako potravina ani jako krmivo v EU. Dosud nebyla podána žádná žádost pro její schválení. Proto je také zakázán její import a prodej. Papája 55-1/63-1 je povolena pro lidskou spotřebu buď čerstvá nebo zpracovaná v USA a Kanadě od roku 1997 (CERA, 2010). AESA (2005) provedla specifickou studii zaměřenou na detekci GM papáji. Všechny vyšetřené vzorky byly negativní. V současné době několik asijských zemí vyvíjí transgenní odrůdy papáji rezistentních k místním virovým kmenům (GMO COMPASS, 2010f).

5.6 Detekce GM rýže Rýže byla vyšetřena na základě informací z USA, že by se na evropském trhu mohla vyskytnout GM rýže LL 601. Organizace Greenpeace a Přátelé Země oznámily, že by se také na trhu mohla vyskytnout rýže a její produkty, které mohou obsahovat tzv. čínskou rýži Bt 63. Rýže byla vyšetřena v letech 2007-2008 (1. polovina roku). Vzorky, které měly pozitivní signál pro chloroplastový trnL intron byly analyzovány screeningovou metodou (CaMV 35S promotor, NOS terminátor) a také vyšetřeny specifickou metodou k detekci rýže Bt 63. Limit detekce screeningové metody byl 0,1% GMO. Limit detekce specifické metody byl 20 kopií nebo méně na PCR reakci (GENESCAN, 2007). U sedmi vzorků parboiled rýže se nepodařilo použitou extrakční metodou získat DNA, která by byla vhodná k amplifikaci. GM rýže byla detekována v pěti vzorcích. Ve dvou vzorcích rýže byl detekován CaMV 35S promotor a ve třech vzorcích rýže Bt 63. U vzorků,

které byly pozitivní na 35S

promotor nebyla dále provedena specifikace transgenu. GM rýže není v EU povolena jako potravina. Podle obecných analytických strategií oficiálních evropských GMO kontrolních laboratoří se nejprve provede screeningový test cílových elementů, které jsou běžně používány u GM rostlin a teprve v dalších krocích dochází k identifikaci druhu GMO. Pomocí detekce běžně používaného CaMV 35S promotoru a nos terminátoru lze detekovat Bt rýži „GM Shanyou 63“ (MÄDE et al., 2006). LL 601 byla také nalezena ve 43% vzorků rýže nakoupené v Mexiku a ve 27% vzorků nakoupených v USA. Přítomnost LL 601 v komerční rýži není povolena ani jako - 58 -

náhodná příměs. Zajímavé je, že LL 62 nebo neznámé LL rýže s podobným konstruktem byly detekovány ve stopovém množství u jednoho vzorku mexické a dvou vzorků americké rýže. To poukazuje na kontaminaci rýže nekomerční linií jinou než LL 601. Rýže Bt 63 nebyla detekována u žádného vzorku (QUIRASCO et al., 2008). GM rýže LL 62 a LL 06 byly v USA schváleny pro použití jako potravina a krmivo v roce 2000, GM rýže LL 601 nebyla určena pro komerční použití, pouze pro polní testování. V USA v roce 2008 byla rýže LL 601 detekována v jednom z 18 vyšetřených vzorků. Ačkoliv počet vyšetřených vzorků byl malý, tak i přesto to poukazuje na snižující se tendenci výskytu LL rýže na americkém trhu ve srovnání s rokem 2006 (SCHOEL et al., 2008). V roce 2010 Evropská komise zrušila rozhodnutí o mimořádných opatřeních týkajících se nepovolené příměsi GM rýže „LL RICE 601“ v jiných produktech rýže. Důvodem bylo to, že v rámci testů provedených organizací US Rice Federation na sklizni rýže z roku 2009 nebyly nalezeny žádné partie obsahující „LL RICE 601“. Členské státy by však měly situaci neustále monitorovat formou namátkového testování produktů z rýže na trhu (EU, 2010c).

5.7 Detekce GM u bramboru Cílem bylo získat vhodnou extrakční a izolační metodou DNA v dostatečném množství a kvalitě pro detekci geneticky modifikovaných amylopektinových linií bramboru před a po kulinářské úpravě (vaření, smažení; brambory se slupkou a bez slupky). K průkazu GM brambor bylo využito kvalitativní screeningové metody a specifické metody detekující EH92-527-1 polymerázové řetězové reakce (PCR). Detekce amplikonů pomocí gelové elektroforézy je na obrázku 14. K analýze byl použit klon (odrůda) Amflora (EH92-527-1). Přítomnost genomické DNA byla potvrzena prokázáním chloroplastového genu. Následně bylo provedeno vyšetření pomocí kvalitativní screeningové metody (nptII gen – 215 bp) a specifické metody pro detekci EH92-527-1. Rekombinantní DNA byla detekována ve všech vzorcích. Bylo zjištěno, že použitá PCR metoda je vhodná jak pro kulinárně zpracované potraviny, tak zejména pro syrové hlízy. Lepších výsledků bylo dosaženo u syrových hlíz. Limit detekce kvalitativní PCR byl 0.1%. Výsledky jsou

- 59 -

uvedeny v tabulce 15 a na obrázku 13. Bylo provedeno testování hlíz při různém kulinárním zpracování, které je typické v domácnosti (loupání, vaření, smažení). Jako negativní kontrola byly použity brambory nakoupené v běžné tržní síti. U nich byl detekován pouze chloroplastový gen, kterým byla potvrzena amplifikovatelnost DNA.

Tab. 15: Přehled vyšetřených vzorků brambor

Syrové hlízy

4

Chloroplast – počet pozitivních vzorků 4

4

Amflora – počet pozitivních vzorků 4

Slupky

3

3

3

3

Vařené hlízy

3

3

3

3

Smažené hlízy

3

3

3

3

Celkem

13

13

13

13

Typ zpracování

Počet vyšetřených vzorků

nptII – počet pozitivních vzorků

130 bp

ST – délkový standard (pUC18 DNA Msp I Digest), 10, 11, 12 – syrové hlízy, 22, 23, 24 – slupky, 34, 35, 36 – vařené hlízy, 112, 113, 114 – smažené hlízy, V – voda, EK – negativní extrakční kontrola

Obr. 14: Detekce GM odrůdy Amflora pomocí gelové elektroforézy

- 60 -

SADOWSKA et al. (2005) sledovala, zda dochází k rozdílům mezi odrůdou Irga a jejími GM klony v mechanickém působení v průběhu tepelného ošetření. Žádné významné rozdíly nebyly pozorovány. V EU dosud zatím byly v roce 2010 povoleny GM klon bramboru EH92-527-1 pro použití jako potravina či krmivo i pro jejich komerční pěstování (EU, 2010a). Osm klonů GM bramboru bylo dříve povoleno pro použití v potravinách a krmivech v Japonsku. Jedná se o dva klony brambor NewLeaf, tři klony NewLeaf Plus a tři klony NewLeaf Y (WATANABE et al., 2004).

- 61 -

6 ZÁVĚR Cílem práce byla detekce a identifikace schválených a neschválených GMO v potravinách a plodinách, které mohou být použity pro výrobu potravin. Šest typů matric (sója, kukuřice, rajčata, rýže, papája, brambor) bylo analyzováno v letech 20052008. Vyšetření vzorků brambor bylo zaměřeno na to, zda použitá extrakční metoda je vhodná jak pro syrové hlízy, tak pro hlízy kulinárně upravené a následnou detekci pomocí metody PCR. Podobně byl hodnocen vliv zpracování a použité extrakční metody pro následnou amplifikaci u vzorků rýže, papáji, kukuřičné mouky a sójových výrobků. 46 vyšetřených vzorků (kukuřice, rajčata, rýže, papája a vzorky na bázi sóji) bylo vyrobeno nebo obsahovalo GMO. Roundup Ready sója (RRS) byla přítomna ve 24 vzorcích (3%), dále hybrid kukuřice MON 810 v 10 vzorcích (1,3%), Bt 176 ve čtyřech vzorcích (0,5%), StarLink v jednom vzorku (0,1%) a NK 603 ve dvou vzorcích (0,2%). Kromě těchto GMO byla také detekována GM u pěti (0,6%) vzorků rýže. Žádná GM nebyla zjištěna u vzorků čerstvé papáji a rajčat. U 13 vzorků GM brambor upravených různým způsobem byla potvrzena přítomnost transgenu. Pro dovoz a zpracování jako potraviny a krmivo jsou v EU povoleny RRS, NK 603 a MON 810, která je povolena také pro komerční pěstování. Hybridy kukuřice Bt 176, StarLink a GM rýže, rajčat a papáji nejsou v EU povoleny pro použití jako potravina či krmivo. Přítomnost hybridu Bt 176 v potravinách nebo krmivech v množství max. do 0,9% bude tolerován do roku 2012. Použitý klon bramboru Amflora je v EU povolen pro použití jako potravina a krmivo a také ke komerčnímu pěstování. Komerční pěstování slouží k výrobě potravin, krmiv a pro technické využití.

1) Zhodnocení vlivu zpracování na amplifikaci 

Použitá extrakční a izolační CTAB metoda je vhodná pro následnou PCR jak u syrových brambor, tak u hlíz kulinárně upravených.



U vzorků papáji byla metoda vhodná pouze pro čerstvé plody, nevhodná byla pro sušenou, kandovanou a konzervovanou papáju.



U vzorků tzv. parboiled rýže nebylo možné použitou CTAB extrakční metodou izolovat DNA.



Použitá extrakční metoda byla vhodná pro vzorky sójových výrobků.

- 62 -

2) Prokázání a identifikace GMO v potravinách rostlinného původu odebraných v obchodní síti (sója, rajčata, kukuřice, rýže, papája) metodou PCR a srovnání použitých PCR metod u sóji a kukuřice s výsledky imunochemické metody ELISA

a) Zhodnocení analýzy vzorků na bázi sóji: 

Detekce byla zaměřena na přítomnost RRS.



5 vzorků sójových bobů (z toho 1x bio boby) a 19 vzorků sójových výrobků obsahovaly RRS.



Vzorky byly analyzovány metodami PCR, real-time PCR a ELISA.



Relativní obsah RRS v pozitivních vzorcích byl v rozmezí 0,01% - 1,0%.



Hraniční hodnota pro značení na obalu 0,9% byla překročena u 2 vzorků sójových výrobků. Výrobky nebyly na obalu označeny dle platné legislativy.



Metoda ELISA potvrdila přítomnost transgenního proteinu u vzorků obsahující RRS.

b) Zhodnocení analýzy vzorků na bázi kukuřice: 

Detekce byla zaměřena na následující modifikace: Bt 11, Bt 176, T 25, MON 810, GA 21, Bt 10, NK 603, StarLink, DAS1507.



V kukuřičné mouce byly detekovány modifikace MON 810, BT 176 a StarLink.



Kvantitativní analýza byla provedena pouze pro modifikace Bt 176.



Množství Bt176 bylo od 0,01% do 0,14%.



Metoda ELISA spolehlivě detekovala transgenní protein u Bt hybridů.



Použité metody nedokázaly odhalit, zda se jedná o jednoduchou modifikaci nebo tzv. stacked gene.

c) Zhodnocení analýzy vzorků na bázi rajčat: 

Vzorky byly vyšetřeny pouze screeningovou detekční metodou.



V žádném vzorku nebyla prokázána přítomnost GMO.

d) Zhodnocení analýzy vzorků na bázi rýže: 

Vzorky byly vyšetřeny screeningovou metodou a metodou detekující linii Bt63.



2 vzorky obsahovaly CaMV 35S promotor.



3 vzorky byly pozitivní na přítomnost rýže Bt63.

- 63 -

e) Zhodnocení analýzy vzorků na bázi papáji: 

Detekce byla zaměřena na modifikaci 55-1/63-1.



GMO u čerstvé papáji nebyly prokázány.

3) Prokázání a identifikace GMO v zemědělských plodinách metodou PCR (kukuřice, brambor) a srovnání s výsledky imunochemické metody ELISA u kukuřice

a) Zhodnocení analýzy vzorků na bázi kukuřice 

Detekce byla zaměřena na následující modifikace: Bt 11, Bt 176, T 25, MON 810, GA 21, Bt 10, NK 603, StarLink, DAS1507.



V kukuřičných listech byly detekovány modifikace MON 810, NK 603.



V kukuřičných zrnech byly detekovány modifikace MON 810, NK 603.



Metoda ELISA spolehlivě detekovala transgenní protein u Bt hybridu.



Použité metody nedokázaly odhalit, zda se jedná o jednoduchou modifikaci nebo tzv. stacked gene.

b) Zhodnocení analýzy vzorků na bázi brambor: 

K analýze a kulinářským úpravám byl použit klon Amflora (EH92-527-1).



Detekce byla zaměřena na modifikaci EH92-527-1.

Použité metody jsou vhodné pro analýzu potravin a potravinových surovin s výjimkou parboiled rýže a výrobků z papáji (sušené, kandované, konzervované). U těchto výrobků se nepodařilo získat genomickou DNA použitou extrakční metodou v dostatečné kvalitě i kvantitě vhodné pro amplifikaci. Pro označování potravin je z legislativního hlediska důležité vedle kvalitativního obsahu GMO sledování i kvantitativního obsahu GMO. Vzorky, které překročily obsah 0,9% nebyly na obale označeny podle legislativních předpisů EU. Disertace prokázala, že dochází k poklesu výskytu RRS ve sledovaných potravinách a naopak se zvyšuje výskyt GM hybridů kukuřice a nepovolené GM rýže. Spotřebitelé musí mít možnost výběru mezi GM a konvenčními potravinami. Často se obávají negativních dopadů na své zdraví a očekávají, že potraviny na trhu jsou

- 64 -

bezpečné a zdravé. Transgenóze však také může přispět k zajištění výživy rychle se zvětšující

lidské populace.

V současné době však

nejsou žádné

informace

o nežádoucích vlivech na zdraví lidí po konzumaci GM potravin, které jsou v současné době na trhu. Nejčastěji se celosvětově vyskytují na trhu potraviny obsahující RRS a kukuřici MON 810. V poslední době se však také na trhu vyskytují potraviny obsahující nepovolené GMO.

- 65 -

7 LITERATURA AESA (2005): GMO foods in Spain. Risk Assessment and Enforcement, Agencia española de seguridad alimentaria, Power Point Presentation, 14 s. AL-HMOUD, N., AL-ROUSAN, H., HAYEK, B.O., IBRAHIM, M.A.(2010): Detection of genetically modified maize and soybean food products in the Jordanian market. Biotechnology, 9 (4), s. 499-505. ANKLAM, E., GADANI, F., HEINZE, P., PIJNENBURG, H., VAN DEN EEDE, G. (2002): Analytical methods for detection and determination of genetically modified organisms in agricultural crops and plant-derived food products. Eur Food Res Tech, 214, s. 3-26. ARI, S., CAKIR, O. (2008): Detection of genetically modified soy in processed foods sold commercially in Turkey by PCR-based method. In: Sborník 1st Global Conference on GMO Analysis, Villa Erba, Como, Italy, JRC- EC, s. 55. BAUER, T., WELLER, P., HAMMES, W.P., HERTEL, C. (2003): The effect of processing parameters on DNA degradation in food. Eur Food Res Technol, 217, s. 338-343. BERDAL, K. G., BYDLER, C., TENGS, T., HOLST-JENSEN, A. (2008): A statistical approach for evaluation of PCR results to improve the practical limit of quantification (LOQ) of GMO analysis (SIMQUANT). Eur Food Res Technol, 227, s. 1149-1157. BRANQUINHO, M.R., TROTTA, R., CARDARELLI-LEITE, P. (2008): Evaluation of the compliance with the labeling legislation in a great diversity of food products sold commercially in Brazil. In: Sborník 1st Global Conference on GMO Analysis, Villa Erba, Como, Italy, JRC- EC, s. 66. CARDARELLI, P, BRANQUINHO, M.R., FERREIRA, R.T.B., DA CRUZ, F.P. & GEMAL, A.L. (2005): Detection of GMO in food products in Brazil: the INCQS experience. Food Control, 16, s. 859-866. CERA. (2010). GM Crop Database. Maize. Center for Environmental Risk Assessment (CERA), ILSI Research Foundation, Washington D.C. [cit. 2011-02-10]. Dostupné na:

http://cera-

gmc.org/index.php?evidcode=&hstIDXCode=1&gType=&AbbrCode=&atCode=&s tCode=&coIDCode=&action=gm_crop_database&mode=Submit

- 66 -

CERA – GMO DATABASE (2011): GM crop database. Center for Environmental Risk Assessment (CERA), ILSI Research Foundation, Washington D.C. [cit. 2011-0330]. Dostupné na: http://cera-gmc.org/index.php?action=gm_crop_database CORBISIER, P., TRAPMANN, S., GANCBERG, D., HANNES, L., VAN IWAARDEN, P., BERBEN, G., SCHIMMEL, H., EMONS, H. (2005): Quantitative determination of Roundup Ready soybean (Glycine max) extracted from highly processed flour. Anal Bioanal Chem, 383, s. 282-290. CRL (2005): PCR Assay for Detection of Maize Transgenic Event Bt10 ( European Commission, Community Reference Laboratory for GM Food and Feed) – version 2.

Dostupné

na:

http://gmo-crl.jrc.it/summaries/Bt10%20validation%20report%20version2.pdf

CUMMINS J. (2001): Liberty Link Rice: Herbicide Tolerant Rice for the Masses. Dostupné

na:

http://www.amberwaves.org/articlePages/articles/cummins/libertyLink.pdf

DOMINGO, J. L. (2007): Toxicity studies of genetically modified plants: A review of the published literature. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 47, s. 721733. EU (2007): Commission decision (2007/304/EC) of 25 April 2007 on the withdrawal from the market of Bt176 (SYN-EV176-9) maize and its derived products. OJ L 117, 5.5.2007, s. 14-16. EU (2010): Komise oznamuje svůj návrh, na základě nějž by členské státy mohly v budoucnu samy rozhodnout o pěstování geneticky modifikovaných organismů, a schvaluje pět rozhodnutí o geneticky modifikovaných organismech, 2 s. Dostupné na: http://europa.eu/rapid/pressReleasesAction.do?reference=IP/10/222&format=HTM L&aged=0&language=CS&guiLanguage=en EU (2010a): EU register of genetically modified food and feed. [cit. 2011-02-10]. Dostupné na: http://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm EU (2010b): Rozhodnutí komise ze dne 2. března 2010, kterým se v souladu se směrnicí Evropského parlamentu a Rady 2001/18/ES uvádí na trh produkt z brambor (Solanum tuberosum L. linie EH92-527-1) geneticky modifikovaný za účelem zvýšení obsahu amylopektinové složky ve škrobu. Úřední věstník Evropské unie, OJ L53, s. 11-14. - 67 -

EU (2010c): Rozhodnutí komise ze dne 8. června 2010, kterým se zrušuje rozhodnutí 2006/601/ES o mimořádných opatřeních týkajících se nepovoleného geneticky modifikovaného organismů „LL RICE 601“ v produktech z rýže a stanoví se namátkové

testy

nepřítomnosti

tohoto

organismu

v produktech

z rýže

(2010/315/EU). Úřední věstník Evropské unie, OJ L 141, s. 10-11. FERBER, D. (1999): GM crops in the cross hairs. Science 28, s. 1662-1666 FRANČOVÁ, K., MACEK, T., DEMNEROVÁ, K., MACKOVÁ, M.(2001): Transgenní rostliny – Potenciální nástroj pro dekontaminaci polutantů životního prostředí. Chemické listy, 95, s. 630-637 FVO (2003): Final report of a mission carried out in Austria from 23/06/03 to 26/06/03 in order to evaluate official control systems on foods consisting of or produced from genetically modified organisms (GMO). DG (SANCO)/9141/2003 – MR Final. Dostupné

na:

http:// ec.europa.eu/food/fvo/act_getPDF.cfm?PDF_ID=3848 FVO (2005a): Final report of a mission carried out in Italy from 06/06/2005 to 10/06/2005 concerning controls on food and feed containing, consisting of

or

produced from genetically modified organisms (GMO). DG (SANCO)/7653/2005 – MR

Final.

Dostupné

na:

http:// ec.europa.eu/food/fvo/act_getPDF.cfm?PDF_ID=4827 FVO (2005b): Final report of a mission carried out in Portugal 17/10/2005 to 21/10/2005 concerning controls on food and feed containing, consisting of or produced from genetically modified organisms (GMO). DG (SANCO)/7669/2005 – MR

Final.

Dostupné

na:

http:// ec.europa.eu/food/fvo/act_getPDF.cfm?PDF_ID=5061 FVO (2005c): Final report of a mission carried out in Spain 07/03/2005 to 11/03/2005 concerning controls on food and feed containing, consisting of or produced from genetically modified organisms (GMO). DG (SANCO)/7632/2005 – MR Final. Dostupné na: http://ec.europa.eu/food/fvo/act_getPDF.cfm?PDF_ID=4804 FVO (2006): Final report of a mission carried out in Slovak Republic from 03/01/2006 to 3/02/2006 concerning controls on food and feed containing, consisting of or produced from genetically modified organisms. DG (SANCO)/8100/2006 – MR Final. Dostupné na: http://ec.europa.eu/food/fvo/act_getPDF.cfm?PDF_ID=5148 GENESCAN (2004): GMOIdent SunupTM Papaya (Manual, V 1.0), Germany, 36 s. - 68 -

GENESCAN (2006): GMOIdent HerculexTM I Corn (Manual, V2.0 (10/2006), Germany, 32 s. GENESCAN (2007): GMO Ident Kit Potato Amflora (5211607401) GENESCAN (2007): GMOIdent Mini-kit Bt63 Rice (Manual, V1.2 (6/2007), Germany, 28 s. GMO COMPASS (2011): Japan allows genetically modified papayas. [cit. 2011-0325]. Dostupné na: GMO COMPASS (2010a): Field areas 2009. Genetically modified plants: Global cultivation on 134 million hectares. [cit. 2011-01-21]. Dostupné na: GMO COMPASS (2010b): GM plants in the EU in 2009. Field area for Bt maize decreases. [cit. 2011-01-21]. Dostupné na: GMO COMPASS (2010c): Genetically modified plants: Global cultivation area – soybean. [cit. 2010-11-21]. Dostupné na: GMO COMPASS (2010d): Tomato. [cit. 2010-11-21]. Dostupné na: < http://www.gmo-compass.org/eng/database/plants/70.tomato.html> GMO COMPASS (2010e): Tomatoes. [cit. 2010-11-21]. Dostupné na: < http://www.gmocompass.org/eng/grocery_shopping/fruit_vegetables/15.genetically_modified_tomat oes.html> GMO COMPASS (2010f): Papayas. [cit. 2010-11-21]. Dostupné na: GMO COMPASS (2010g): Human health. [cit. 2010-11-21]. Dostupné na:

- 69 -

GMO COMPASS (2010h): Rising trend: genetically modified crops worldwide on 125 million hectares. [cit. 2010-11-21]. Dostupné na: GMO COMPASS (2010i): Rice. [cit. 2010-11-21]. Dostupné na: GREINER, R., KONIETZNY, U., VILLAVICENCIO, A. L. C. H. (2005): Qualitative and quantitative detection of genetically modified maize and soy in processed foods sold commercially in Brazil by PCR-based methods. Food Control, vol. 16, issue 8, s. 753-759. GRYSON, N., MESSENS, K., DEWETTINCK, K. (2008): PCR detection of soy ingredients in bread. Eur Food Res Technol, 227, s. 345-351. HELLER K.J. (Ed.) (2006): Genetically engineered food. Methods and detection. 2nd ed., Wiley-Vch Verlag GmbH  Co. KGaA, Weinheim, 299 s., ISBN 3-527-313931. HEMMER, W. (1997): Foods Derived from Genetically Modified Organisms and Detection Methods. In: BATS-report (Agency for biosafety research and assessment of technology Impacts of the Swiss priority Programme Biotechnology of the Swiss National Science Foundation, Basel, Switzerland), 2/97, s. 40-44. HOLEC, J., SOUKUP, J. (2006): Pěstování transgenních odrůd polních plodin – stav a perspektivy. In Sborník přednášek ze semináře Geneticky modifikované organismy. Ministerstvo zemědělství ČR, s. 10-16., ISBN 80-7084-510-4. HOLST-JENSEN, A., RNNING, S. B., LVSETH, A., BERDAL, K. G. (2003): PCR technology for screening and quantification of genetically modified organisms (GMOs). Analytical and Bioanalytical Chemistry, 375, s. 985-993. HURBURGH, C. R., RIPPKE, G.R., HEITHOFF, C., ROUSSEL, S.A., HARDY, C.L. (2000): Detection of genetically modified grains by near-infrared spectroscopy. Proceedings PITTCON 2000 – Science for the 21st Century, 1431. New Orleans, La.

12-17

March

2000

or

Internet

http://pittcon2487.omnibook-sonline.com/1 290

- 70 -

(2000).

Dostupné

na:

CHIUEH, L. C., CHEN, Y.L., SHIH, Y.C.D. (2002): Study on the detection method of six varieties of genetically modified maize and processed foods. Journal of Food and Drug Analysis, 10, 1, s. 25-33. CHLOUPEK, O., PROCHÁZKOVÁ, B., HRUDOVÁ, E. (2005): Pěstování a kvalita rostlin. Vydala MZLU Brno, 1. vydání, 2005, 181 s., ISBN 80-7157-897-5. CHLOUPEK, O. (2000): Genetická diverzita, šlechtění a semenářství. Vydala Academia, Praha, 2. vydání, 311s., ISBN 80-200-0779-2. IFOAM EU GROUP (2009) (ed. MZe ČR): Nové nařízení EU o biopotravinách a ekologickém zemědělství: (ES) č. 834/2007- pozadí, zhodnocení, interpretace. Ed. MIKKELSEN, C., SCHLÜTER, M., Vydal Brusel 2009. Úprava a vydání české verze Bioinstitut Olomouc, s. 66. ISO 21569:2005 Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Qualitative nucleic acid based methods ISO 21571:2002 Foodstuffs – Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products – Nucleic acid extraction JAMES, D., SCHMIDT, A. M. (2004): Use of an intron region of a chloroplast tRNA gene (trnL) as a target for PCR identification of specific food crops including sources of potential allergens. Food Research International 37, 4, s. 395-402. KARCHER, S. J., GELVIN, S. B. (2011): Blue plants: Transgenic plants with the GUS reporter gene for the undergraduate biology curriculum. [cit. 2011-03-26] Dostupné na: http://www.bio.purdue.edu/people/faculty/karcher/blue2000/blue.html> KUČERA, L., OVESNÁ, J. (2009): Metody vzorkování pro účely stanovení GMO. In: Metody odběru a analýzy vzorků komodit, potravin a půdy – Sborník ze semináře pořádaného MZe ČR a Vědeckým výborem fytosanitárním a životního prostředí (listopad, 2009), s. 17-18, 39-47, ISBN 978-80-7427-025-3. KUČERA, L., ČEŘOVSKÁ, M. (2006): První české zkušenosti s GMO. In: Geneticky modifikované

organismy

–

Sborník

přednášek

ze

semináře

pořádaného

Ministerstvem zemědělství ČR a Českou zemědělskou univerzitou v Praze, (květen 2006), s. 36-40. KUIPER, H.A. (1999): Summary report of the ILSI Europe workshop on detection methods for novel foods derived from genetically modified organisms. Fd Control, 10, s. 339-349.

- 71 -

KÝROVÁ, V., OSTRÝ, V., CIPROVÁ, I., RUPRICH,J. (2007): Výskyt geneticky modifikované rýže na trhu v EU. In: Sborník souhrnných sdělení 12. konference Monitoringu a konference Hygieny životního prostředí, Milovy, s. 17. KÝROVÁ, V., OSTRÝ, V., LAICHMANNOVÁ, L., CIPROVÁ, I., RUPRICH,J. (2008a): Geneticky modifikované potraviny v České republice. In: Sborník souhrnných sdělení 13. konference Monitoringu a konference Hygieny životního prostředí, Milovy, s. 35. KÝROVÁ, V., OSTRÝ, V., LAICHMANNOVÁ, L., RUPRICH, J. (2008b): The effect of peeling, cooking and frying on the analysis of GM potato tubers Amflora (EH92527-1). In: Sborník 1st Global Conference on GMO Analysis, Villa Erba, Como, Italy, JRC- EC, s. 56. KÝROVÁ, V., OSTRÝ, V., LAICHMANNOVÁ, L., RUPRICH, J. (2008c): The surveillance of transgenic papaya on the market in the Czech Republic in year 2005-2006. In: Sborník 1st Global Conference on GMO Analysis, Villa Erba, Como, Italy, JRC- EC, s. 101. KÝROVÁ, V., OSTRÝ, V., LAICHMANNOVÁ, L., RUPRICH, J. (2008d): GENOMON – Specialized monitoring of GM foodstuffs in the Czech Republic during 2002-2007. In: Sborník 1st Global Conference on GMO Analysis, Villa Erba, Como, Italy, JRC- EC, s. 100. KÝROVÁ, V., OSTRÝ, V., LAICHMANNOVÁ, L., RUPRICH, J. (2010): An occurrence of genetically modified foodstuffs on the Czech food market. Acta Alimentaria, Vol. 39 (4), s. 387-396, ISSN 0139-3006 (Print), 1588-2535 (Online). KÝROVÁ, V., OSTRÝ, V., RUPRICH, J. (2006): Monitoring of Genetically Modified Organisms in Food in Years 2002-2005. In: Sborník MendelNet 2006, Mendel University of Agriculture and Forestry in Brno, s. 215, ISBN 80-7375-000-7 LIN, H.Y., CHIANG, J.W., SHIH, D.Y.C. (2001): Detection of genetically modified soybeans by PCR method and immunoassay kits. Journal of Food and Drug Analysis, Vol. 9, No. 3, s. 160-166. LIN, H.Y., CHIUEH, L.C., SHIH, D.Y.C. (2000): Detection of genetically modified soybeans and maize by the polymerase chain method. Journal of Food and Drug Anal. 8, s. 200-207.

- 72 -

METODICKÝ POKYN GMO-2001-8 (srpen 2001): Vzorkování pro účely stanovení přítomnosti a podílu GMO a odvozených produktů, Část.: Vzorkování pro účely kontroly přítomnosti GMVR – kukuřice a sóji ve vzorcích semen. 7 s. MÄDE, D., DEGNER, CH., GROHMANN, L. (2006): Detection of genetically modified rice: a construct-specific real-time PCR method based on DNA sequences from transgenic Bt rice. Eur Food Res Technol, 224, s. 271-278. MARCELINO, F.C., GUIMARÃES, M.F., GUIMARÃES, M. (2008): Detection and quantification of genetically modified foods: the Brazilian profile from 2000 to 2007. In: Sborník 1st Global Conference on GMO Analysis, Villa Erba, Como, Italy, JRC- EC, s. 102. MARMIROLI, N., MAESTRI, E., GULLI, M., MALCEVSCHI, A., PEANO, C., BORDONI, R., DE BELLIS, G. (2008): Methods for detection of GMOs in food and feed. Anal Bioanal Chem, 392, s. 369-384. MINISTERSTVO ZEMĚDĚLSTVÍ ČR (2010): Tisková zpráva Geneticky modifikované plodiny jsou příslibem, ne hrozbou. 25. 11. 2010. [cit. 2011-03-21]. Dostupné na: http://eagri.cz/public/web/mze/zemedelstvi/gmo-genetickymodifikovane-organismy/geneticky-modifikovane-plodiny-jsou.html MINISTERSTVO ZEMĚDĚLSTVÍ ČR (2009): Tisková zpráva Plochy s GM kukuřicí v ČR letos poklesly, srpen 2009. Dostupné na : http://www.mze.cz/Index.aspx?ch=270&typ=1&val=44783&ids=2515 MINISTERSTVO ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ (2011): Pěstební plochy GM bramboru „Amflora“ v roce 2010 oznámené na základě § 23 zákona č. 78/2004 Sb., 2 s., [cit. 2011-03-25]. Dostupné na: NÁVOD PRO DETEKCI od Bavarian Health and Food Safety Authority, Germany NCBE (2011): Tomato purée. [cit. 2011-03-21]. Dostupné na: http://www.ncbe.reading.ac.uk/ncbe/gmfood/tomato.html OGIYA, Y., TSUBOI, H., MIYASHITA, T., FUJITA, K. (2006): Detection of genetically modified soybean gene in processed foods containing soy protein. Annual report of Sapporo City Institute of Public Health, 33, s. 50-56. ONDŘEJ M., DROBNÍK J. (2002): Transgenóze rostlin. Vydala Academia, Praha, 1. vydání. 316 s., ISBN 80-200-0958-2. - 73 -

ONDŘEJ, M, DROBNÍK, J., GARTLAND, K.M.A., GARTLAND, J.S. (1999): Genové inženýrství rostlin. Praha, 122 s., ISBN 80-7080-370-3 OSTRÝ, V., RUPRICH, J., ADAMÍKOVÁ, V. (2001): Diagnostika GMO produktů a potravin nového typu na bázi GMO metodou PCR a ELISA. In: Sborník příspěvků ze XIV. semináře s mezinárodní účastí Kontaminanty a další rizikové látky v potravinách a ekosystémech, Praha, Vydal VŠCHT Praha a Česká společnost chemická, s. 53-56, ISBN 80-7080-472-6. PADGETTE, S.R., KOLACZ,K.H., DELANNAY, X.Re, D.B., LaVALLEE, B.J., TINIUS, C.N., RHODES,W.K., OTERO, Y.I., BARRY, G.F., EICHHOLTZ, D.A., PESCHKE, V.M., NIDA, D.L., TAYLOR, N.B., KISHORE, G.M. (1995): Development, identification, and characterization of a glyphosate-tolerant soybean line. Crop Science, 35, s. 1451-1461. PIETSCH, K., WAIBLINGER, H. U., BRODMANN, P. & WURZ, A. (1997): Screeningverfahren zur Identifizierung "gentechnisch veränderter" pflanzlicher Lebensmittel. Dtsch Lebensm Rundsch 93, s. 35-38. QUIRASCO, M., SCHOEL, B., CHHALLIYIL, J., FAGAN, J., GÁLVEZ, A. (2008): Real-time and conventional PCR detection of Liberty Linkrice varieties and transgenic soy in rice sampled in the Mexican and American retail markets. Anal Bioanal Chem, 392, s. 395-404. RIZZI, A., SORLINI, C., DAFFONCHIO, D. (2004): Practicality of detection of genetically modified organisms (GMOs) in food. AgBiotech Net 2004 Vol. 6, ABN 130, s. 1N-9N. ROBINSON, C. (2001): Genetic modification technology and food – Consumer health and safety. ILSI Europe Concise monographs, Belgium: International Life Science Institute, 45 s. ISBN 1-57881-125-2. ROCHE (2001): Technical Note No. LC 13/2001. Roche Applied Science, 28 s. ROCHE (2004a): LightCycler® GMO Maize Quantification Kit (Manual, Version November 2004), 27 s. ROCHE (2004b): LightCycler® GMO Soya Quantification Kit (Manual, Version August 2004), 27 s. RUPRICH, J. (2006): Transgenní organizmy využívané jako potraviny. In: Geneticky modifikované

organismy

–

Sborník

přednášek

- 74 -

ze

semináře

pořádaného

Ministerstvem zemědělství ČR a Českou zemědělskou univerzitou v Praze, (květen 2006), s. 41-45. ŘEPKOVÁ, J., RELICHOVÁ, J. (2001): Genetika rostlin. Vydala Masarykova univerzita Brno, 1. vydání, 269 s., ISBN 80-210-2736-3. ŘÍHA, K. (2006). Uvolňování geneticky modifikovaných organismů do prostředí – komentovaný výtah z databáze WebSNIF, zpráva 2/2006, 18 s. SADOWSKA, J., VACEK, J., FORNAL, J., ZAGÓRSKI-OSTOJA, W. (2005): Effect of antiviral genetical modification on softening of potato tubers during cooking. Eur Food Res Technol, 221, s. 336-341. SAMBROOK, J., RUSSEL, D. (2000): Molecular Cloning - A Laboratory Manual. Third Edition; Vydal Cold Spring Harbor Laboratory Press, Vol. 2, s. 8.18-8.24. ISBN 0-87969-577-3. SANHOTY, R.E., BROLL, H., GROHMANN, L., LINKE, B., SPIEGELBERG, A., BÖGL, K.W., ZAGON, J. (2002): Genetically modified maize and soybean on the Egyptian food market. Nahrung/Food, 46, s. 360-363. SCHOEL, B., QIRASCO, M., CHHALLIYIL, P., FAGAN, J., GALVEZ, A. (2008): Screening for Liberty Link LLRICE601 in USA retail stores. In: Sborník 1st Global Conference on GMO Analysis, Villa Erba, Como, Italy, JRC- EC, s. 96. SDI (2000): Bt9 maize kit user’s guide: a guide for using the GMO Bt maize test kit to detect thresholds of GMOs in food ingredients, Ver. 2.2, Strategic Diagnostics Inc., Newark, USA, 10 s. SDI (2001): Bt maize kit user’s guide: a guide for using the GMO Bt maize test kit to detect thresholds of GMOs in food ingredients, Ver. 1.4, Strategic Diagnostics Inc., Newark, USA, 12 s. SDI (2003): Soya Kit User’s Guide: A guide for using GMO Soya test kit to quantitatively detect thresholds of GMOs in food, Ver. 2.1, Strategic Diagnostics Inc., Newark, USA, 11 s. SINGH, O.V., GHAI, S., PAUL, D.,JAIN, R. K. (2006): Genetically modified crops: success, safety assessment and public concern. Appl Microbiol Biotechnol, 71, s. 598-607. SINGH, R.J., HYMOWITZ, T. (1999): Soybean genetic resources and crop improvement. Genome 42, s. 605-616. STANDARTNÍ OPERAČNÍ POSTUP firmy Monsanto (BQ-QC-0203-01)

- 75 -

ŠMARDA, J., DOŠKAŘ, J., PANTŮČEK, R., RŮŽIČKOVÁ, V., KOSTÍKOVÁ, J. (2005): Metody molekulární biologie,1. vyd., Brno, s. 73-103. ISBN 80-210-3841-1. TABERLET, P., GIELLY, L., PATOU, G. & BOUVET, J. (1991): Universal primers for amplification of three non-coding region of chloroplast DNA. Plant Mol. Biol., 17, s. 1105-1109. TASKI-AJDUKOVIC, K., NIKOLIC, Z., VUJAKOVIC, M., MILOSEVIC, M., INGJATOV, M., PETROVIC, D. (2008): Monitoring of Roundup Ready soya in processed meat product on the Serbia food market. In: Sborník 1st Global Conference on GMO Analysis, Villa Erba, Como, Italy, JRC- EC, s. 56. TREML, D., ARISI, A.C.M. (2008): Monitoring of Roundup Ready soybean in processed meat products sold in Brazilian markets from 2007 to 2008. In: Sborník 1st Global Conference on GMO Analysis, Villa Erba, Como, Italy, JRC- EC, s. 65. TUTEL´IAN, V.A., FILATOV, N.N., SOROKINA, E.I.U., CHERNYSHEVA, O.N., SALOVA, N.I.A., SIZYKH, E.V., ANISIMOVA, O.V. (2003): Monitoring of food products from genetically modified sources in Moscow. Vopr. Pitan, 72, s. 20-23 ( Článek je v ruštině). USDA-APHIS: Summary of the evidence that the inadvertent release of LLRICE601 poses no safety concerns, Biotechnology Regulatory Services, August 22, 2006, 7 s. VEJL, P. (2007): Geneticky modifikovaný organismus z pohledu genetiky a šlechtění. In sborník GMO v agroekosystému a jeho okolí. Ministerstvo zemědělství ČR, 2007, Praha, s. 3-14. ISBN 978-80-7084-588-2. WALL, EM., LAWRENCE, TS., GREEN, MJ., ROTT, ME. (2004): Detection and identification of transgenic virus resistant papaya and squash by multiplex PCR. EUR Food Res Technik 219, s. 90-96. WANDELT, C. (2007): Implementation of general surveillance for Amflora potato cultivation – Data management. J. Verbr. Lebensm. 2, Supplement 1, s. 70-71. WATANABE, T., KURIBARA, H., MISHIMA, T., KIKUCHI, H., KODAMA, T., FUTO, S., KASAMA, K., TOYOTA, A., NUONO, M., SAITA, A., TAKAHASHI, K., HINO, A., AKIYAMA, H., MAITANI, T. (2004): New qualitative detection methods of genetically modified potatoes. Biol. Pharm. Bull. Vol. 27, No 9, s. 13331339. XU, W., BAI, W., GUO, F., LUO, Y., YUAN, Y., HUANG, K. (2008): A papayaspecific gene, papain, used as an endogenous reference gene in qualitative and real-

- 76 -

time quantitative PCR detection of transgenic papayas. Eur Food Res Technol, Vol. 228, Number 2, s. 301-309. YONEKURA-SAKAKIBARA, K., SAITO, K. (2006): Review: genetically modified plants for the promotion of human health. Biotechnol Lett, 28, s. 1983-1991. ZAULET, M., GEORGESCU, S., PETCU, C., POPOVICI, A., TANASUICA, R., REBEDEA, M. (2008): PCR technology for screening and quantification of genetically modified soybeans from foods. In: Sborník 1st Global Conference on GMO Analysis, Villa Erba, Como, Italy, JRC- EC, s. 52. ZDEŇKOVÁ, K., PAZLAROVÁ, J., MACKOVÁ, M., DEMNEROVÁ, K. (2002): Přehled a

metod

detekce

potravinářských

geneticky

surovinách.

modifikovaných Chemické

- 77 -

organismů listy,

96,

v potravinách s.

25-32.

8 SEZNAM ZKRATEK Ahas – acetohydroxyacid synthase Bar – bialaphos resistence Bt – Bacillus thuringiensis CaMV – virus květákové mozaiky CERA - Center for Environmental Risk Assessment CP – coat protein, plášťový protein CRL – referenční laboratoř společenství, Community Reference Laboratory CRM – certifikovaný referenční materiál CTAB – cetyltrimetylamoniumbromid CTP – chloroplast tranzitní peptid ČIA – Český institut pro akreditaci ČIŽP – Česká inspekce životního prostředí ČR – Česká republika DNA – deoxyribonukleová kyselina EDTA – etyldiamintetraoctová kyselina ELISA – imunochemická metoda (Enzyme linked imunnosorbent assay) EU – Evropská unie GeMMA – Genetically Modified Material Analysis, testování způsobilosti GM – geneticky modifikovaný GMO – geneticky modifikovaný organismus GMVR – geneticky modifikované vyšší rostliny HT odrůdy – herbicid tolerantní odrůdy IFOAM EU GROUP – International Federation of Organic Agriculture Movements EU Group IRM – interní referenční materiál IRMM – Institute for Reference Materials and Measurements LMBM – laboratoř molekulárně biologických metod MZe ČR – Ministerstvo zemědělství České republiky MŽP ČR – Ministerstvo životního prostředí České republiky NOS – nopalin syntáza NptII – neomycin fosfotransferáza II Pat – fosfinotricin acetyltransferáza

PCR – polymerázová řetězová reakce PG – polygalakturonáza PRSV – papaya ringspot virus RRS – Roundup Ready sója, herbicid tolerantní SZÚ – Státní zdravotní ústav TAE – Tris-acetát-EDTA USA – Spojené státy americké USDA-APHIS – United States Department of Agriculture - Animal and Plant Health Inspection Service UV – ultrafialový

9 SEZNAM TABULEK Tabulka 1: Přehled povolených GMO jako potraviny a krmiva (ke dni 10. 2. 2011) ... 13 Tabulka 2: Plochy oseté GM kukuřicí v ČR v letech 2005-200 .………………………17 Tabulka 3: Celosvětové plochy pěstování GM plodin v roce 2009..…………………..18 Tabulka 4: Pěstování GM plodin v EU v letech 2005-2009 v ha ...……………………18 Tabulka 5: Přehled genů pro cry-proteiny ..…………………………………………....23 Tabulka 6: Přehled vyšetřovaných vzorků ..…………………………………………...37 Tabulka 7: Přehled použitých primerů ..……………………………………………….39 Tabulka 8: Složení mastermixů pro detekci GM kukuřice ..…………………………..42 Tabulka 9: Teplotní cykly amplifikace pro GM kukuřice ..……………………………42 Tabulka 10: Složení mastermixů pro screeningovou reakci ..………………………….43 Tabulka 11: Teplotní cykly pro screeningovou reakci a detekci rýže Bt 63 ..…………43 Tabulka 12: Počet vzorků obsahující GMO vyšetřených v letech 2005-2008 ..……….48 Tabulka 13: Počet a typ modifikace u pozitivních vzorků kukuřice ..…………………54 Tabulka 14: Počet pozitivních vzorků na papain ..……………………………………..57 Tabulka 15: Přehled vyšetřených vzorků brambor ..…………………………………...60

10 SEZNAM OBRÁZKŮ Obrázek 1: Přenos DNA do rostlinných buněk ………………………………………..11 Obrázek 2: Celosvětové plochy pěstování GM plodin v letech 1996-2009 (v mil. ha) .19 Obrázek 3: Schéma genové kazety Roundup-Ready sóji (GTS-40-3-2) .……………..21 Obrázek 4: Plochy oseté GM sójou z celkové plochy oseté sójovými boby v letech 1997-2009 (v procentech) …...…………………………………………………………22 Obrázek 5: Schémata genových kazet hybridů kukuřic .………………………………24 Obrázek 6: Schéma genové kazety papáji 55-1/63-1.………………………………….28 Obrázek 7: Doporučený postup detekce GMO .……………………………………….29 Obrázek 8: Specifita PCR metod (4 kategorie) .……………………………………….32 Obrázek 9: Odběrná místa potravin .…………………………………………………...36 Obrázek 10: Graf výskytu pozitivních nálezů GMO v letech 2005-2008 .…………….48 Obrázek 11: Počet vzorků obsahující GM kukuřici vyšetřených ve letech 2005-2008 .54 Obrázek 12: Detekce amplikonů PG genu u rajčat pomocí gelové elektroforézy …….56 Obrázek 13: Detekce amplikonů papáji pomocí gelové elektroforézy .……………….57 Obrázek 14: Detekce GM odrůdy Amflora pomocí gelové elektroforézy .……………60

ANOTACE Cílem disertační práce byla diagnostika schválených a neschválených geneticky modifikovaných organismů (GMO) ve vybraných zemědělských plodinách (kukuřice, brambor) a potravinách rostlinného původu (sója, rajčata, rýže, papája, kukuřice) odebraných

v obchodní síti.

K diagnostice

byly

využity metody kvalitativní

a kvantitativní polymerázové řetězové reakce (PCR) a imunochemická metoda (ELISA). Byl také hodnocen vliv zpracování a použité extrakční metody pro následnou amplifikaci, zejména u brambor, dále u rýže, papáji, kukuřičné mouky a sójových výrobků. Práce je zaměřena na studium potravinové bezpečnosti (food safety) na našem trhu. Práce byla provedena za podpory projektu MŽP/750/33/GMO/08 o zabezpečení uchovávání vzorků a ověřování metodik detekce geneticky modifikovaných organismů.