Identifikace bakterií pomocí MALDI MS
Ondrej Šedo Centrální laboratoř speciálních technik, Oddělení funkční genomiky a proteomiky
Ústav experimentální biologie, Přírodovědecká fakulta
Masarykova univerzita
Pracovní den ČSKB Brno 10. 11. 2010 1
Identifikace bakterií pomocí MALDI MS 1. Princip metody MALDI MS
2. Využití v praxi
3. Rozlišovací schopnosti metody
2
1. Princip metody MALDI MS - MALDI MS = Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry 1. Princip metody MALDI MS = Hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací za účasti matrice
+
O
OH
OH O
O
OH
OH
CH3
O
OH
OH
CH3
O
O OH
CH3
3
Intens. [a.u.]
1. Princip metody MALDI MS 66431
300
250
200
150
+ 100
50 40000
50000
60000
70000
80000
90000
100000 m /z
4
Intens. [a.u.]
1. Princip metody MALDI MS 14306
600
400
200
0 10000
11000
12000
13000
14000
15000
16000
17000
18000 m /z
5
Intens. [a.u.]
1. Princip metody MALDI MS x104
5381
3.0
4364
6255
2.5
2.0
5096
1.5
9553
4183
1.0
6507
2833
7158
0.5
4776 2545
3125 8368 7869
8993 10299
0.0 2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
11000 m /z
6
Intens. [a.u.]
x10 4
5381
4364
6255
2
5096 4183
2833
9553
6507
4776
7158
7869
8368
8993
10299
Escherichia coli
0 2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
11000
Intens. [a.u.]
m /z
4000 2000
5050
2524 4426
3154 3592 2212
4120 2746
5968
4704
7184
5320
Kingella kingae
0 2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
11000
Intens. [a.u.]
m /z 4435
1000
6048 5211
500 2213
3020
6678
7236 7923 8357
3613
9091
9700 Pseudomonas aeruginosa
0 2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
11000
Intens. [a.u.]
m /z
x10 4
8488 3815
4 2
4692 2388
5748
2945
4246
3457
5053
5560
7841
6246
Acinetobacter baumanii
0 2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
11000
Intens. [a.u.]
m /z 5053
600 400 200
4259 2955
9186
7351 6533
3702 4700
3202
9402
6307
4867
5714
7749 8343
6669
10311
8967
11383 Aeromonas hydrophila
9000
10000
0 2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
11000
7
m /z
Identifikace bakterií pomocí MALDI MS 1. Princip metody MALDI MS
2. Využití v praxi
3. Rozlišovací schopnosti metody
8
2. Využití v praxi
1. Hmotnostní spektrometr
a.i.
4491
4000
2. Využití v praxi
4368 3500
4363 3000
2. Databáze hmotnostních spekter referenčních kmenů
4356 4354
2500
2807
2000
1909 1500
1769 1000
667 658
500
655
0 6000
8000
10000
m/z
3. Vyhodnocovací software
9
Intens.[a.u.]
2. Využití v praxi
9626
4305
6000
4000 4812
6423 6888
2000 5932 3208 2962
3583
4044
4588 5051
6613
8890 8090
5506
9177 10103
0 2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
11000
m /z
10
2. Využití v praxi
skóre ≥ 2,30
Vysoce pravděpodobná identifikace na úrovni druhu
2,30 ≥ skóre ≥ 2,00 Vysoce pravděpodobná identifikace na úrovni rodu, pravděpodobná identifikace na úrovni druhu 2,00 ≥ skóre ≥ 1,70
Pravděpodobná identifikace na úrovni rodu
1,69 ≥ skóre
Nesignifikantní skóre 11
2. Využití v praxi
Mikroorganismus
MALDI BioTyper identifikace
Biochemické metody identifikace
Nefermentující Gram-negativní bakterie
94%
86%
Enterobacteriaceae
99%
97%
Ostatní Gram-negativní bakterie
96%
91%
Gram-pozitivní bakterie
97%
92%
Kvasinky
97%
97%
Celkem
97%
93%
0.61% Identifikace pouze na úrovni rodu (Biochemické metody: 0.52%) 1.91% Neidentifikováno (Biochemické metody: 2.34%) 0.69% Falešně pozitivní identifikace (Biochemické metody: 4.42%)
12
2. Využití v praxi Výhody: - doba analýzy ~ minuty - identifikace na úrovni druhu, případně i detailnější - minimální náklady na analýzu - identifikace vzorků s abnormálním fenotypem - možnost identifikace v hemokulturách a v moči
13
2. Využití v praxi Nevýhody: - vysoká pořizovací cena - vyplatí se v závislosti na počtu analýz
- problémy s rozlišením blízce přibuzných druhů - změna v metodě přípravy vzorku umožní detekci většího počtu specifických signálů
- identifikace ze směsných vzorků - vývoj nových bioinformatických nástrojů
14
Identifikace bakterií pomocí MALDI MS 1. Princip metody MALDI MS
2. Využití v praxi
3. Rozlišovací schopnosti metody
15
Aeromonas Acinetobacter Achromobacter Candida Pseudomonas Staphylococcus bakterie mléčného kvašení ...
16
Acinetobacter genomic sp. 10
Acinetobacter genomic sp. 11
17
Intens. [a.u.]
x104
A_sp10_NIPH_521
5175
6
9251
4
6105 6643
5009 4266
2
6961
3053
3484
7182
0 x104
Intens. [a.u.]
7408
4626 5000
2590
9524 7822
8319
10001
8972
A_sp11_NIPH_522
5175
8
6 6104
4 5010
6810
2
2590 3054
4625
3490
9249
6975
4266 5000
7377 9523
8312
6512 7813
8970
10003
9000
10000
5427
0 2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
11000
m/z
18
Intens. [a.u.]
x104
6978
6642
2.5
6813 7378 2.0
6960
1.5
6668 7407
6513 1.0
7813
0.5
7822 7156 7181
7796
0.0 6400
6600
6800
7000
7200
7400
7600
7800 m/z
19
Acinetobacter genomic sp. 10
Acinetobacter genomic sp. 11
20
Intens. [a.u.]
x104
6642
6
6513 6513
6690
4
6978 6978 6668
6813
7378 7378
2
7156 7156 7407
7344 7407
7813 7813 7796 7796
7181
7822 0 6400
6600
6800
7000
7200
7400
7600
7800 m/z
21
A_sp10_NIPH_521_II A_sp10_NIPH_521_III A_sp10_NIPH_521_I A_sp10_NIPH_2532 A_sp10_NIPH_2274_II A_sp10_NIPH_2260 A_sp10_NIPH_870 A_sp10_NIPH_1741 A_sp10_NIPH_2524 A_sp10_NIPH_2542 A_sp10_NIPH_2537 A_sp10_NIPH_2528 A_sp10_NIPH_2274_I A_sp10_NIPH_1054 A_sp11_NIPH_522_II A_sp11_NIPH_522_I A_sp11_NIPH_2273_II A_sp11_NIPH_2689 A_sp11_NIPH_682 A_sp11_NIPH_2127 A_sp11_NIPH_769 A_sp11_NIPH_3626 A_sp11_NIPH_2273_I A_sp11_NIPH_2272 A_sp11_NIPH_2169 A_sp11_NIPH_820 A_sp11_NIPH_522_III A_sp11_NIPH_2681
22
1000
900
800
700
600
500 Distance Level
400
300
200
100
0
Acinetobacter haemolyticus NIPH 510T
Acinetobacter beijerinckii NIPH 838
Acinetobacter beijerinckii NIPH 2111
23
1.0
0.5
0.0
2000 3000 4000
h
5000
h h
h 6000
h 7000
h h h
8000
h h
h 9000
h
b
h
10000
10518
bb
h
11060
10846
b
b b b
11207
b 10846
b
b
hh 11048
h
9993
b
b
10857
0 x104 9551
b
9992
b 9319
8986
8769
9319
5176
b
10076
b
9553
8985
8348
7448
b
9567
9295
b 8769
0 x104
9394
bb 8351
b
8986
h 8185
7229
6105
6929
6629
6436
b
8766
h
7781
b
8335
7815
7448
b
7450
6928
6628
6106
5604
5424
5039
b
7629
h 6757
b
6929
b 5604
5176
3
6644
b b b 4996
4660
b 4777
4494
4266
b
6823
2.0 6104
4660
4176
b
b
5865
2.5 5176
4777
4493
4266
3724
3465
3052
Intens. [a.u.]
3
5430
4648
2
5040
1.5 4266
3725
3465
3052
2806
2587
2
4541
4169
3929
3725
3465
3052
1 2587
Intens. [a.u.]
1
2587
Intens. [a.u.]
x104
A_beijerinckii_NIPH_2111_1a\0_I13\1\1SLin
bb
A_beijerinckii_NIPH_838_1a\0_C13\1\1SLin
b b
A_haemolyticus_NIPH_510T_1a\0_B13\1\1SLin
11000 m/z
24
A_haemolyticus_NIPH_510T
A_beijerinckii_NIPH_838
A_beijerinckii_NIPH_2111
1000
900
800
700
600 500 400 Distance Level
300
200
100
0
25
1.0
0.5
0.0
2000 3000 4000
h
5000
h h
h 6000
h 7000
h h h
8000
h h
h 9000
9394
h
b
h
10000
b b b
h
11207
b
10518
bb 11060
10846
b
hh 11048
h
b
10846
b
b
10857
b
9993
9551
b
9992
b 9319
8986
8769
9319
5176
b
10076
b
9553
8985
8348
7448
b
9567
9295
b 8769
b
8986
bb 8351
7781
7229
6105
6929
6629
6436
b
8766
h h
8185
7815
7448
b
7450
6928
6628
b
8335
h
b
7629
b 6757
6106
5604
5424
5039
*
6929
* b 5604
5176
3
6644
b b b 4996
4660
b 4777
4494
4266
b
6823
2.0 6104
4660
4176
b
b
5865
2.5 5176
4777
4493
4266
3724
Intens. [a.u.]
3
5430
4648
2
5040
1.5 4266
3725
3465
3052
2806
2
4541
4169
3929
3725
3465
2587
* **
3465
0 x104 3052
0 x104
3052
1 2587
Intens. [a.u.]
1
2587
Intens. [a.u.]
x104
A_beijerinckii_NIPH_2111_1a\0_I13\1\1SLin
bb
A_beijerinckii_NIPH_838_1a\0_C13\1\1SLin
b b
A_haemolyticus_NIPH_510T_1a\0_B13\1\1SLin
11000 m/z
26
Acinetobacter haemolyticus NIPH 510T
Acinetobacter beijerinckii NIPH 838
Acinetobacter beijerinckii NIPH 2111
27
A_beijerinckii_NIPH_838_c
A_beijerinckii_NIPH_838_b
A_beijerinckii_NIPH_838_a
A_beijerinckii_NIPH_2111_b
A_beijerinckii_NIPH_2111_c
A_beijerinckii_NIPH_2111_a
A_haemolyticus_NIPH_510T_c
A_haemolyticus_NIPH_510T_b
A_haemolyticus_NIPH_510T_a
1000
900
800
700
600 500 400 Distance Level
300
200
100
0
28
Acinetobacter haemolyticus NIPH 510T
Acinetobacter beijerinckii NIPH 838
Acinetobacter beijerinckii NIPH 2111
29
A_haemolyticus_NIPH_510T_1c A_haemolyticus_NIPH_510T_1b A_haemolyticus_NIPH_510T_1a A_haemolyticus_NIPH_510T_3b A_haemolyticus_NIPH_510T_3a A_haemolyticus_NIPH_510T_2b A_haemolyticus_NIPH_510T_3c A_haemolyticus_NIPH_510T_2c A_haemolyticus_NIPH_510T_2a A_beijerinckii_NIPH_2111_1c A_beijerinckii_NIPH_2111_3b A_beijerinckii_NIPH_2111_3c A_beijerinckii_NIPH_2111_2c A_beijerinckii_NIPH_2111_2b A_beijerinckii_NIPH_2111_2a A_beijerinckii_NIPH_2111_3a A_beijerinckii_NIPH_2111_1b A_beijerinckii_NIPH_2111_1a A_beijerinckii_NIPH_838_3c A_beijerinckii_NIPH_838_1a A_beijerinckii_NIPH_838_1b A_beijerinckii_NIPH_838_3b A_beijerinckii_NIPH_838_2c A_beijerinckii_NIPH_838_2b A_beijerinckii_NIPH_838_2a A_beijerinckii_NIPH_838_3a A_beijerinckii_NIPH_838_1c 1000
900
800
700
600 500 Distance Level
400
300
200
100
0
30
Poděkování Kultivace kmenů Andrea Teshim, Tereza Vaňousová, Ludmila Tvrzová Oddělení mikrobiiologie, Ústav experimentální biologie, Přírodovědecká fakulta MU
Ivo Sedláček Česká sbírka mikroorganismů, Ústav experimentální biologie, Přírodovědecká fakulta MU
Alexandr Nemec Státní zdravotní ústav
Marta Dušková, Renáta Karpíšková Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Filip Růžička Fakultní nemocnice U Svaté Anny, Lékařská fakulta MU
MALDI MS analýza Ondrej Šedo, Aleš Voráč, Magdaléna Kačalová, Zbyněk Zdráhal Oddělení funkční genomiky a proteomiky, Ústav experimentální biologie, Přírodovědecká fakulta MU
Zpracování dat Thomas Meier, Markus Kostrzewa, Michal Boháč postup I Daltonik
Matej Lexa Katedra informačních technologií, Fakulta informatiky MU
Finanční podpora Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy, projekty č. MSM0021622415, MSM0021622416 and LC06034.
31
Děkuji za pozornost ! Přátelské bakterie !
Intens. [a.u.]
=
x104
74 81 84 14
1.50
1.25
1.00 5 30 2
0.75
9 39 6
0.50
58 73 47 92
0.25
676 0 1 039 1
1 238 6
344 3 14 093
163 68
176 89
0.00 2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000 m /z
32
