Az anthrax fágoktól a MALDI-TOF-ig;

Az anthrax fágoktól a MALDI-TOF-ig; egy klinikai mikrobiológus pályájának alakulása

Gerlóczy-emlékelőadás Prof. Dr. Nagy Erzsébet

A Magyar Infektológiai és Klinikai Mikrobiológiai Társaság 40. Kongresszusa, 2012, Budapest

Dr. Gerlóczy Zsigmond, egyetemi tanár (1863-1937)

(www.google.hu)

1968-1977 SZOTE Orvosi Mikrobiológiai Intézet

Ivánovics György akadémikus

B. cereus specifikus fágok Anthrax-specifikus AP50

Elektronmikroszkópos képek negatív festéssel

Mi volt ennek a kutatásnak a jelentősége a későbbi klinikai mikrobiológusi pálya szempontjából???

1977- 1993 SZOTE Központi Klinikai Mikrobiológiai Laboratórium 

A laboratórium rutin bakteriológiai tevékenységének tervezése (1977-1980) és beindítása Prof. Dr. Földes József



A modern anaerob diagnosztika beindítása



Korai alkalmazott és alapkutatás a klinikai mikrobiológia területén

MIDI (Thiry Lajos) home-made, gyors módszer fejlesztése aerob és anaerob baktériumok identifikálására

Orvosi Hetilap 1985

A toxin detektálásra kipróbált szövetek : HeLa Hep-2 GMK McCoy MDCK RK

Szelektív CCFA

Anaerob véres

Sikertelen fágtipizálás oka: a törzsek nagyfokú lizogenitása !!! (+ 15 további közlemény)

28 C. difficile izolátum 15 toxintermelő 13 toxin negatív

18 törzs bizonyult lizogénnek, ép és defektív fágokat mutattunk ki

A Bacteroides klinikai izolátumok is igen sok változatos fágot hordoznak

Nagy, Kreutz, Werner: Influence of B. vulgatus on growth and toxin production of C. difficile. In: Medical and dental aspects of anaerobes (1993)

Vizsgálataink alátámasztják az egyre gyakrabban használt széklet transzplantáció hasznosságát súlyos C. difficile okozta hasmenésben

Elektronmikroszkópia a rutin diagnosztikában

Virális gastroenteritisek rutin diagnosztikája Rota vírus

Adeno vírus

Kovács, Deák, Nagy, Földes: Rotavirus okozta gastroenteritis járvány Hódmezővásárhelyen 1983 tavaszán. (Gyermekgyógyászat 1984)

1993- 2009 Laboratórium majd intézet vezetése 

 





 

Az önálló parazitológiai részleg kialakítása, diagnosztika és kutatás fejlesztés Gombadiagnosztika, majd később jelentős kutatás fejlesztés A vírusdiagnosztika területén a szerológiai módszerek automatizálása, molekuláris módszerek bevezetése Új bakteriológiai módszerek bevezetése, automatizált hemokultura vizsgálat, identifikáló automaták, molekuláris módszerek alkalmazása Széklet tenyésztés és egyéb ritka kórokozók kimutatásának megteremtése A konzultatív mikrobiológiai tevékenység intenzív támogatása Alkalmazott- és alapkutatás

Antibiotikumokkal, antibiotikum rezisztenciával kapcsolatos kutatások 

Antibiotikum kombinációk hatása vegyes baktérium tenyészetekre

Induló B. frag. csíraszám 108 CFU/ml Metronidazol 4 μg/ml Inkubálás 24 h, anaerob chamber

Antibiotikumokkal, antibiotikum rezisztenciával kapcsolatos kutatások 

Szinergizmus vizsgálatok

Fodor et al.: Use of Etest to assess synergy of antibiotic combinations againts clinical isolates of P. aeruginosa . IJAA 2005

MIC A

MIC B

P. aeruginosa

CTZ MIC:8

CIP MIC:>32

MIC A(B)

8 ug/ml

MIC B(A)

1 ug/ml

>32 ug/ml

1 ug/ml

Antibiotikumokkal, antibiotikum rezisztenciával kapcsolatos kutatások

mecA gén kimutatása home-made PCR módszerrel Veréb, Sóki, Deák, Nagy: Infektológia és klinikai mikrobiológia (1998)

475 bp

K Kp

SHV2 enzimet termelő K. pneumoniae

Antibiotikumokkal, antibiotikum rezisztenciával kapcsolatos kutatások 

Anaerob baktériumok rezisztencia vizsgálata 

Első hazai rezisztencia felmérés, B. fragilis csoport (Anaerobe 1995)



Penicillinkötő fehérjék szerepe a béta-lactam rezisztenciában (CID 1997)



Az első hazai carbapenemase termelésen alapuló imipenem rezisztens B. fragilis törzsek genetikai vizsgálata. (Inf. Klin Mikro. 2000)



CfiA és nim gének előfordulása hazai klinikai és normál flóra izolátumok, valamint európai nagy törzsgyűjteményben (JMM 2000, IJAA 2006)



Gram-pozitív anaerob coccusok európai antibiotikum rezisztencia felmérés (IJAA 2008)



Anaerob baktériumok tigecyclin érzékenysége, Európai felmérés ( SJID 2010)



1-3. Európai B. fragilis group antibiotikum rezisztencia felmérés (CMI 2011)

Kutatások az anaerob baktériumok körében 

Anaerobok szerepe különböző kórképekben  

Bakteriális vaginosis Krónikus prostatitis

Lactobacillus-dominálta hüvely flóra. Inkubálás 5% CO2 körülmények között 48 h

Gyakori izolátumok BV esetén: Gardnerella vaginalis Mobiluncus mulieris (long curved rod) Mobiluncus curtisii (short curved rod) Bacteroides urealyticus és más speciesek Prevotella bivia és más speciesek Prophyromonas spp Fusobacterium nucleatum Peptostreptococcus spp BV flóra 96 hmorbillorum anaerob Streptococcus körülmények között történt Atopobium vaginae inkubálást Mycoplasma követően hominis stb.

Bakteriális vaginosis     

Korrekt diagnózis bevezetése (anaerob tenyésztés) Felmérés az előfordulással kapcsolatban BV és IUD használat összefüggése nőgyógyászokkal BV és PID összefüggése Flóraváltozásért mi felelős?  

  

krónikus prostatitis

„jó” és „rossz” lactobacillusok – fibronektin kötés antibiózis lactobacillusok és BV izolátumok között

Anaerobok szerepe a krónikus prostatitisekben Terápiás lehetőségek BV és prostatitis összefüggése

svéd együttműködés

urulógusokkal

2000-2006 Kirándulás a gombák világába 

Transzgénikus gombatörzsek előállítása és molekuláris genetikai jellemzése (mint a MTA-SZTE Mikrobiológiai kutatócsoport vezetője)



A csoport tagjai: Ferenczy Lajos, Kredics László, Antal Zsuzsa, Szekeres Ferenc, Papp Tamás, valamint Dóci Ilona, Somogyvári Ferenc



24 in extenso, angol nyelvű közlemény sarjadzó és fonalas gombák területén végzett molekuláris genetikai alapkutatási eredményekből, valamint klinikai mikrobiológiai jellegű témákból Direkt Candida kimutatás vérből RT-PCR technikával

C. albicans

kontrol

Trichoderma longibrachium

Kredics László (Somogyvári F. et al.: Diag. Microbiol. Infect. Dis. 2007)

2000-2006 Kirándulás a gombák világába

Doczi et al: Acta Microbiologica 2012

2003-2012 ESCMID vezetőségi tagság 

Professional Affaires Officer for Clinical Microbiology (2003-2007, 2010-2012)

  

Treasurer (2007-2010) Kapcsolat a UEMS-sel (2003-2010), ECDC–vel (2005-2012) Kezdeményezések:    

  

Summerschool (2005 Szeged) Postgraduális kurzusok Observership/Collaborative Centre program Trainees association

ESCMID / Germany ESCMID / Switzerland Kapcsolat építés az ESCMID és a MIFKM között Számos hazai fiatal pályázatának támogatása

2003-2012 ESCMID vezetőségi tagság 

Professional Affaires Officer for Clinical Microbiology (2003-2007, 2010-2012)

  

Treasurer (2007-2010) Kapcsolat a UEMS-sel (2003-2010), ECDC–vel (2005-2012) Kezdeményezések:    

  

Summerschool (2005 Szeged) Postgraduális kurzusok Observership/Collaborative Centre program Trainees association

ESCMID / Germany ESCMID / Switzerland Kapcsolat építés az ESCMID és a MIFKM között Számos hazai fiatal pályázatának támogatása

2009 MALDI-TOF MS a klinikai mikrobiológiai diagnosztika szolgálatában Matrix-assisted laser desorption ionisation – time-of-flight mass spectrometry

Baktériumok gombák species identifikálása, tipizálása <10 perc alatt

Microflex LTTM Bruker Daltonik

MALDI Biotyper 3.0

Ismeretlen izolátum

Referencia MSP

Összehasonlítás az adatbázisban lévő spektrumokkal

Minta MSP

Species meghatározás

Intens. [a.u.]

Különböző Bacteroides speciesek tipikus tömegspektrogramja x10 4

Bacteroides fragilis ATCC 25285\0_M11\1\1SLin

3 2 1

Intens. [a.u.]

0

Bacteroides m assiliensis DSM 17679_DSM\0_A12\1\1SLin Raw 4 000 2 000

Intens. [a.u.]

0

Bacteroides eggerthii DSM 20697_DSM\0_K11\1\1SLin Raw

4 000 3 000 2 000 1 000

Intens. [a.u.]

0 x10 4 1.00

Bacteroides nordii DSM 18764_DSM\0_I3\1\1SLin Raw

0.75 0.50

Intens. [a.u.]

0.25 0.00 x10 4

Bacteroides intestinalis DSM 17393_DSM\0_A22\1\1SLin Raw

1.5 1.0 0.5 0.0 3000

4000

50 00

6 000

7000

8000

m/z

(Nagy E. et al. : CMI 2009)

277 Bacteroides izolátum identifikálása MALDITOF MS és hagyományos biokémiai módszerekkel Species

Number of isolates

with an identification score >2.0 by MALDI-TOF MS Bacteroides fragilis Bacteroides thetaiotaomicron Bacteroides ovatus Bacteroides vulgatus Bacteroides uniformis Bacteroides eggerthii Bacteroides nordii Bacteroides salyersiae Bacteroides massiliensis Inconclusive identification by MALDI-TOF MS

179 43 15 20 5 1 4

with discrepant species identification by biochemical tests

270 (97%)

selected for 16S rDNA sequencing*

5 5 6 1 3 0 3 1 2

2 4 1 1 2

7

7

1 0 0

*Only strains with a log(score) 2.0-2.5 were selected for sequencing

Nagy E. et al: CMI 15: 796-802 (2009)

Bacteroides törzsek összehasonlító species meghatározása Sample number Species determined by ______________________________________________________________________________________________ _ biochemical tests MALDI-TOF MS 16S rDNA sequencing 1 B. ovatus B. fragilis B. fragilis 2 B. uniformis B. fragilis B. fragilis 3 B. ovatus B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron 4 B. uniformis B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron 5 B. uniformis B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron 6 B. ovatus B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron 7 B. uniformis B. ovatus B. ovatus 8 B. thetaiotaomicron B. vulgatus Bacteroides sp (new?) 9 B. ovatus B. uniformis B. uniformis 10 B. ovatus B. uniformis B. uniformis 11 B. ovatus B. nordii B. nordii ______________________________________________________________________________________________ _ 12 13 14 15 16 17 18

B. thetaiotaomicron P. (B.) distasonis P. (B.) distasonis P. (B.) distasonis B. thetaiotaomicron B. merdae Bacteroides sp

II*(log(score)>2.5)** II II(log(score)>2.5) II(log(score)>2.5) II II II

P. (B.) distasonis P. (B.) distasonis P. (B.) distasonis P. (B.) distasonis B. eggerthii B. goldsteinii B. intestinalis

Dendogram of Bacteroides strains according to MALDI-TOF MALDI-TOF 16S rDNA Phenotypic identification

M S P D e n d ro g ra m

x _B. B aovatus c _ H U 2 9 1 0 5 P N 99.5% U x _B. B aovatus c _ H U 2 9 1 0 4 _ 4 99.7% PNU

B. thetaiotaomicron B. eggerthii x _B. B avulgatus c_HU 40347_2 P N U B. vulgatus x _B. B athetaiotaomicron c _ H U 3 3 8 6 6 _ 2 _ 1 8 P N U B thetaiotaomicron x _B. B athetaiotaomicron c_HU 26686_6 P N U B. thetaiotaomicron x _P. B adistasonis c_HU 36220 P NU P. distasonis x _B. B auniformis c _ H U 3 3 1 2 0 _ 3 _ 1 3 P N U B. unifomis x_B ac_HU 32405_3 P N U

B. fragilis

x_B ac_HU 26868_1 P N U

B. fragilis

x_B ac_HU 35328_4 P N U

B. fragilis

x_B ac_HU 35225 P NU

B. fragilis

x_B ac_HU 35300_2 P N U

B. fragilis

x_B ac_HU 37251_1 P N U

B. fragilis

x_B ac_HU 33120_3_12 P N U

B. fragilis

x_B ac_HU 27912 P NU

B. fragilis

x_B ac_HU 28715 P NU

B. fragilis

x_B ac_HU 36562_1 P N U x_B ac_HU 33866_2_19 P N U x_B ac_HU 34886_3 P N U

99.5%

x_B ac_HU 26938_2 P N U

x _ B a c _ H U 3 2 7 5 9 P 99.5% NU

Bacteroides sp. B. fragilis B. fragilis B. capillosus B. thetaiotaomicron

x_B ac_HU 33488 P NU

B. fragilis

x_B ac_HU 36111_2 P N U

B. fragilis

x_B ac_HU 26938_1 P N U

B. fragilis B. fragilis

1000

900

800

700

600 500 D is t a n c e L e ve l

400

300

200

100

0

16S rRNA gene sequencing confirmed the identification based on MS

B. fragilis Division I és II törzsek elkülönítése 02 - CZE60 05 - R19811 01 - TAL3636 03 – 1672 06 – O21 04 – BF8

cfiA+

07 15470

cfiA-

08 – 15476 09 – 15361 10 – 72232_1 11 – 638R 12 9343

Nagy E, et al.: JMM (2011)

02 - CZE60

Intens. [a.u.]

Kifejezet különbségek a csúcsok között a 4650 és 4850 Da között x104

4688 Da 4711 Da

1.0

Division II.

05 - R19811 01 - TAL3636 03 – 1672

0.8

4826 Da

06 – O21 04 – BF8

cfiA + ______________ cfiA -

0.6

07 15470

4817 Da

Division I.

08 – 15476 0.4

09 – 15361 10 – 72232_1 11 – 638R

0.2

12- 9343

0.0

Nagy E, et al.: JMM 2011

4650

4700

4750

4800

4850

145 B. fragilis izolátum retrospektív MS analízise 

145 B. fragilis törzs közül 9 mutatta a division II (cfiA pozitív) törzsekre jellemző csúcsokat Strains B. fragilis A20

Characteristic peaks 4826,

9375, 9649

CfiA (PCR)

Imipenem MIC (mg/L)

+

<0.125

B. fragilis Ba16

4826, 9375, 9649

+

<0.125

B. fragilis Bb15

4826, 7321, 9375, 9649

+

2

B. fragilis Bb32

4826, 7321, 9375, 9649

+

2

B. fragilis Be3

4826, 7321, 9375, 9649

+

0.5

B. fragilis Bm2

4826, 7321, 9375, 9649 4688, 5002,5189

+

1

B. fragilis Fr19

4826, 7321, 9649

+

1

B. fragilis NL3

4688, 4826,5002, 5189, 7321, 9375, 9649

+

B. fragilis NL1

4688, 4826, 5002, 5189, 7321, 9375, 9649

+

Strains with silent cfiA gene

(IS614)

>32 2

Propionibacterium acnes törzsek tipizálása Nagy et al.: Anaerobe, sent for publ.

12S

Type III Asn12

ATCC11828

Type II

6609

Type IB

PRP-38

Type IB/IC

P.acn33

Type IA PRP-60

A vakon végzett vizsgálatok eredménye 100 %-ban megegyezik az eMLST molekuláris tipizáló módszer eredményével