Optimalizace podmínek přípravy vzorků pro MALDI-MS profilování bakterií. Diplomová práce

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE

Optimalizace podmínek přípravy vzorků pro MALDI-MS profilování bakterií Diplomová práce Magdaléna Kačalová

Vedoucí diplomové práce: Mgr. Ondrej Šedo, Ph.D.

Brno 2011

Bibliografický záznam Autor:

Bc. Magdaléna Kačalová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie

Název práce:

Optimalizace podmínek přípravy vzorků pro MALDI-MS profilování bakterií

Studijní program:

Biologie

Studijní obor:

Obecná biologie

Vedoucí práce:

Mgr. Ondrej Šedo, Ph.D.

Rok obhajoby:

2011

Klíčová slova: MALDI TOF MS; Lactobacillus; identifikace; hmotnostní spektrometrie

ii

Bibliographic entry Author:

Bc. Magdaléna Kačalová Faculty of Science, Masaryk University Institute of Experimental Biology

Title of thesis:

Optimization of sample preparation conditions for MALDI MS profiling of lactic acid bacteria

Degree programme: Biology

Field of study:

General Biology

Supervisor:

Mgr. Ondrej Šedo, Ph.D.

Year of defence:

2011

Keywords: MALDI TOF MS; Lactobacillus; identification; mass spectrometry

iii

Poděkování Ráda bych na tomto místě srdečně poděkovala vedoucímu mé diplomové práce Mgr. Ondreji Šedovi, Ph.D. za velkou ochotu, neocenitelnou pomoc při řešení problémů a odborné rady, které mi během práce poskytoval. Dále bych chtěla poděkovat Mgr. Andreji Teshim za připomínky, konzultace a za poskytnuté vzorky bakterií. Mgr. Martě Duškové z VFU za poskytnuté kmeny bakterií a Václavovi Juchelkovi za vytvoření softwaru pro vyhodnocení výstupních dat. RNDr. Zbyňku Zdráhalovi, Dr. a kolektivu z Oddělení funkční proteomiky a genomiky za přijetí a vytvoření příjemné atmosféry.

Prohlášení Prohlašuji, že jsem svou diplomovou práci vypracovala samostatně a použila jen citovaných dokumentů, uvedených v seznamu použité literatury.

V Brně 12. května 2011

............................................ jméno, příjmení

iv

Abstrakt Po provedení standardního protokolu přípravy dokáže MALDI-TOF MS robustně poskytovat reprodukovatelná hmotnostní spektra, ale některé blízce příbuzné druhy nedokáže spolehlivě odlišit. V této diplomové práci jsme se zaměřili především na studium podmínek přípravy vzorku pro MALDI-TOF MS analýzu a nastavení parametrů pro vyhodnocení MALDI-TOF MS profilů, které vedly k vytvoření metody spolehlivě rozlišující vybrané skupiny bakterií na druhové úrovni. Byl studován vliv podmínek složení roztoku MALDI matrice či metody nanášení vzorku na desku spektrometru na kvalitu a reprodukovatelnost MALDI MS profilů a diskriminační schopnosti metody. Byly nalezeny nové druhově a rodově specifické signály některých zástupců rodu Lactobacillus.

Abstract Following the standard protocol preparation, the MALDI-TOF MS is capable to provide reproducible mass spectra in a significant way, but is not able to reliably distinguish some closely related species. In this thesis we focused primarily on the study of specimen preparation conditions for MALDI-TOF MS analysis and the parameter settings for evaluation of MALDI-TOF MS profiles, which led to the creation of a method able to reliably distinguish chosen groups of bacteria on the species level. The influence of the conditions of solution composition of the MALDI matrix as well as methods of specimen application on the spectrometer plate on the quality and reproducibility of the MALDI MS profiles and the discrimination capability of the method have been studied. New specific and generic specific signals of different members of the Lactobacillus genus have been found.

v

Obsah 1.

Úvod .................................................................................................................................. 1

1.1

MALDI–TOF MS.............................................................................................................. 2 1.1.1

Historie hmotnostní spektrometrie........................................................................ 2

1.1.2

Princip MALDI – TOF MS .................................................................................. 2

1.1.3

Princip TOF .......................................................................................................... 3

1.1.4

Matrice .................................................................................................................. 4

1.1.5

MALDI-TOF MS při analýze mikroorganismů.................................................... 7

1.1.6

Příprava mikrobiálních vzorků ............................................................................. 7

1.1.7

Získaná hmotnostní spektra a jejich zpracování ................................................... 8

1.2

MALDI-TOF MS v klinické mikrobiologii ...................................................................... 9

1.3

Vliv metod přípravy vzorků na vzhled MALDI-TOF hmotnostních spekter s ohledem na detekci proteinů s vyšší molekulovou hmotností ................................. 12

1.4

Rod Lactobacillus............................................................................................................ 13 1.4.1

Morfologické a fyziologické vlastnosti .............................................................. 15

1.4.2

Kultivace ............................................................................................................. 15

1.4.3

Identifikace bakterií rodu Lactobacillus ............................................................. 16

1.4.4

Problematika v taxonomii laktobacilů ................................................................ 16

2.

Cíl diplomové práce ........................................................................................................ 18

3.

Experimentální část ......................................................................................................... 19

3.1

Vyšetřovaná skupina bakteriálních kmenů...................................................................... 19

3.2

Použitý materiál ............................................................................................................... 19

3.3

3.4

3.2.1

Kultivační médium MRS médiu s 0,05% cysteinem .......................................... 19

3.2.2

Chemikálie .......................................................................................................... 19

3.2.3

Přístroje a pomůcky ............................................................................................ 20

Příprava vzorků kmenů pro analýzu a jejich uchovávání................................................ 20 3.3.1

Kultivace kmenů ................................................................................................. 20

3.3.2

Sterilizace etanolem ............................................................................................ 21

3.3.3

Úprava vzorků před nanesením na MALDI destičku ......................................... 21

3.3.4

Analýza vzorků a kalibrace metod...................................................................... 21

Metody provedených experimentů .................................................................................. 22 3.4.1

Použitá metoda pro test vlivu intenzity laseru a koncentrace extraktu na kvalitu spekter ..................................................................................................... 22

3.4.2

Vliv změny poměrů vody a organické složky v roztoku matrice ....................... 22

3.4.3

Změna poměrů vody a acetonitrilu v extrakčním rozpouštědle .......................... 23

3.4.4

Testování různých druhů matric pro získání kvalitních signálů s ohledem na detekci látek s vyšší molekulovou hmotností ................................................ 23

3.4.5

Ověření použitelnosti metod, které dle publikovaných studií vedly detekci látek vyššími molekulovými hmotnostmi ........................................................... 24 vi

4.

3.4.6

Modifikace metody dle Madonny a kol. 2000 .................................................... 25

3.4.7

Analýza laktobacilů s použitím HCCA a FerA jako matrice.............................. 27

Výsledky .......................................................................................................................... 28 4.1.1

Vyhodnocení výsledků ....................................................................................... 28

4.1.2

Výsledky kontroly stability zamražených vzorků .............................................. 28

4.1.3

Test vlivu intenzity laseru a koncentrace vzorku na získaná spektra ................. 28

4.1.4

Vliv změny poměrů vody a organické složky v roztoku matrice ....................... 30

4.1.5.

Test vlivu změny poměru vody a acetonitrilu v rozpouštědle pro extrakci proteinů ............................................................................................................... 34

4.1.6.

Testování různých druhů matric pro získání kvalitních signálů s ohledem na detekci látek s vyšší molekulovou hmotností ................................................ 35

4.1.7.

Ověření použitelnosti metod, které dle studií vedou detekci látek vyššími molekulovými hmotnostmi ................................................................................. 36

4.1.8.

Modifikace metody dle Madonny a kol. 2000 .................................................... 40

4.1.9.

Analýza laktobacilů s použitím matrice HCCA dle společnosti Bruker a FerA dle Madonny .............................................................................................. 43

5.

Diskuse ............................................................................................................................ 48

6.

Závěr ................................................................................................................................ 53

Použitá literatura: ...................................................................................................................... 54 Seznam zkratek: ........................................................................................................................ 62

vii

1. Úvod Tato diplomová práce je zaměřena na získávání znalostí směřujících k rozvinutí metody MALDI-TOF MS (hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací za účasti matrice s průletovým analyzátorem: Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight

mass

spectrometry)

s cílem

zvýšení

spolehlivosti

klasifikace

bakteriálních kmenů. Byla zkoumána především možnost zvýšení diskriminačních schopností metody na základě detekce proteinů v oblasti vyšších molekulových hmotností. V oblastech jako je monitoring životního prostředí, zpracování potravin, ochrana veřejného zdraví či klinická diagnostika je velmi důležité zjistit přítomnost patogenních mikroorganismů a pak zejména jejich správná identifikace. Velká pozornost proto patří v posledních letech metodě MALDI-TOF MS jako k potenciální technice, která by tuto rychlou a spolehlivou identifikaci bakterií i jiných mikroorganismů umožnila. Dosavadní znalosti a výsledky pokusů provedených pomocí MALDI-TOF MS dokazují schopnost rozlišit bakterie či jiné mikroorganismy na rodové, druhové a často i kmenové úrovni. Zároveň mnohé studie naznačují, že pro určité geneticky příbuzné druhy metoda neposkytuje jednoznačné výsledky identifikace, a právě v těchto případech je zapotřebí zavedené analytické postupy vhodným způsobem upravovat.

1

1.1 MALDI–TOF MS 1.1.1 Historie hmotnostní spektrometrie Zrod myšlenky principu hmotnostní spektrofotometrie se připisuje J. J. Thomsonovi, který již před rokem 1913 přišel s myšlenkou analýzy látek pomocí jejich ionizace, zrychlení v elektrickém poli a následné separaci iontů dle molekulových hmotností v magnetickém poli. V roce 1919 E. W. Aston postavil prototyp magnetického hmotnostního analyzátoru. Postupem času se vylepšovaly části spektrometru např. iontové zdroje, analyzátory či technika detekce iontů. První hmotnostní spektrometr s TOF (Time of Flight) analyzátorem byl sestaven A. E. Cameronem a D. F. Eggersem v roce 1948. Toto zařízení mělo však velmi nízké rozlišení. První TOF spektrometr s lepším rozlišením pochází z roku 1953. První studie o využití hmotnostní spektrometrie pro identifikaci bakterií pocházejí z roku 1975 (Anhalt 1975). Ionizační metoda MALDI pak byla popsána koncem osmdesátých let. Význam metody potvrzuje udělení Nobelovy ceny za chemii v roce 2002 K. Tanakovi za její objev (Karas 1987, Tanaka 1988).

1.1.2 Princip MALDI – TOF MS Hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací za účasti matrice s průletovým analyzátorem je poměrně mladá separační technika využívající tzv. měkké ionizace. Rychle se rozvíjí jako cenný nástroj pro měření molekulové hmotnosti biopolymerů např. peptidů, bílkovin, oligosacharidů, nukleotidů, či k detekci posttranslačních změn bílkovin. Lze jí také stanovovat glykoproteiny, oligosacharidy, protilátky a jejich konjugáty s léky, nukleové kyseliny, produkty PCR a řadu dalších látek. Postupně se stává nepostradatelnou součástí laboratorní praxe v biotechnologii, molekulární biologii a mnoha dalších odvětvích. Mezi velké přednosti této metody patří rychlost a malé množství vzorku potřebné pro analýzu. Metoda je založena především na smíchání vzorku s nadbytkem matrice v poměru asi 1:104. Při použití UV laseru (trváni pulzu 4 ns o vlnové délce 337 nm při použití dusíkového laseru) se jako matric nejčastěji využívá derivátů kyseliny skořicové či benzoové. Tato směs je pak nanesena na kovový nosič, nejčastěji nerezovou nebo hliníkovou destičku (obrázek 1). Destička je inertní vůči matrici či rozpouštědlům, před

2

analýzou je vždy vyčištěna, zbavena nečistot a prachu. Na povrchu destičky jsou vyryty kruhové zářezy, tzv. terčíky, které pomáhají udržet roztok analytu a matrice na stanoveném místě a zabraňují rozlití a smíchání vzorků.

Obrázek 1: Destička MALDI (Převzato: Oddělení funkční genomiky a proteomiky, PřF MU)

Po zaschnutí je nosič vložen do hmotnostního spektrometru, kde je vystaven hlubokému vakuu. Laserový paprsek pak způsobí sublimaci matrice, která přednostně paprsek absorbuje, přechází do plynné fáze a strhává s sebou molekuly analytu. Přenos části energie mezi matricí a analytem není dosud zcela vyjasněný, ale tato energie umožní jeho ionizaci bez značné fragmentace a tím i snazší interpretaci výsledného hmotnostního spektra. Ionty postupují přes silné elektrické pole, ve kterém jsou urychleny a zaostřeny. Vstupují pak do hmotnostního analyzátoru doby letu TOF.

1.1.3 Princip TOF Jedná se o pulzní hmotnostní analyzátor. Ionty jsou zde separovány na základě různých poměrů hmotnosti a náboje m/z. Trubice vyplněná vakuem zde poskytuje prostor pro pohyb iontů různou rychlostí vzhledem k jejich hmotnosti a náboji. Částicím se stejným nábojem je urychlením v elektrickém poli dána stejná kinetická energie, proto se lehčí ionty pohybují rychleji než těžké. Měří se celková doba letu iontů od aplikace laseru po dopad iontů na detektor. Platí zde vztah: 1

1

 eV  2  m  2 t =l     2  z kde (t) je celková doba letu, (l) je délka trubice, (m/z) molekulová hmotnost / náboj daného iontu, (V) urychlovací napětí v iontovém zdroji a e elementární náboj. 3

Pro zvýšení rozlišení se často používá reflektoru, tzv. iontového zrcadla, který kompenzuje disperzi kinetické energie iontů, tedy různost kinetické energie iontů se stejným m/z. Ionty s vyšší kinetickou energií proniknou hlouběji do reflektoru, čímž se prodlouží doba letu vůči iontům s nižší kinetickou energií. Ke kompenzaci nevyrovnaných počátečních kinetických energií u iontů se stejným m/z se také využívá tzv. zpožděné extrakce. Spočívá v malém časovém posunu mezi aplikací laseru na vzorek a aplikací urychlovacího napětí. Vyrovnávají se tím rozdíly v rychlosti iontů způsobené při desorpci. Detektor je propojen s počítačem a pomocí softwaru je výsledek zpracován. Vzhledem k tomu, že je náboj iontů po procesu MALDI většinou roven 1, výsledná hodnota je vyhodnocena přímo jako spektrum molekulových hmotností daných iontů. Schéma MALDI-TOF hmotnostního spektrometru je uvedeno na obrázku 2.

Obrázek 2: Schéma MALDI-TOF MS (převzato: http://biomikro.vscht.cz/maldiman/cz/theory/basics.php)

1.1.4 Matrice Volba matrice je jedním z nejdůležitějších faktorů analýzy. Matricemi bývají většinou slabé organické kyseliny s aromatickým jádrem např. deriváty kyseliny benzoové

či

skořicové.

Používají

se

většinou

jako

roztoky

ve

směsích

obsahujících acetonitril (ACN), kyselinou trifluoroctovou (TFA), k. mravenčí (FA), vodu či aceton. TFA a FA se používají pro úpravu pH, protože okyselení matrice zlepšuje kvalitu signálu. Kouzlo matrice spočívá v její schopnosti ochránit analyt před přímou ionizací paprskem laseru, a jeho následné nežádoucí fragmentaci. Správný výběr druhu matrice 4

bývá zcela zásadní pro analýzu. Tyto sloučeniny by měly vykazovat vysokou fotostabilitu, měly by mít určitou afinitu ke vzorku a se vzorkem kokrystalovat za vzniku homogenního filmu, který umožňuje získávat kvalitní spektra. Ukázka krystalizace některých matric je uvedena na obrázku 4. Zároveň je nutná schopnost absorbovat vlnovou délku záření laseru a mísitelnost rozpouštědla matrice s rozpouštědlem analytu. Matrice by však neměly se vzorkem reagovat, aby nekomplikovaly interpretaci spekter. Analýza probíhá ve velkém nadbytku matrice nad molekulami analyzovaných látek (v molárním poměru řádově 1:10-4), které se tedy vlivem laseru méně fragmentují a poskytují jednoduchá hmotnostní spektra. Matrice přebírá energii laseru a předává ji na analyt, čímž způsobí jeho přechod z pevné do plynné fáze. Excitované molekuly matrice ionizují molekuly analytu přenosem protonu, jehož mechanismus není zcela znám (obrázek 3).

Obrázek 3: Schéma ionizace MALDI (převzato z http://www.magnet.fsu.edu/education/tutorials/tools/ionization_maldi.html)

Všechny tyto požadavky a nejasnosti znesnadňují výběr správné matrice pro daný analyt. Výběr je tedy založen na empirických vlastnostech. Různé matrice odlišně ionizují analyty, jinak krystalizují a dávají i odlišná hmotnostní spektra. Správně zvolená matrice by měla schnout co nejvíce homogenně a tvořit na destičce co nejmenší směsné krystaly.

5

Strukturní vzorce nejpoužívanějších matric u MALDI-TOF MS analýzy bakterií:

kyselina 2,5 – dihydroxybenzoová DHB – gentisic acid

kyselina α-kyano-4-hydroxyskořicová HCCA

kyselina 5-metoxysalicylová 5-MS

kyselina 3,5-dimetoxy-4-hydroxyskořicová SA – sinapinic acid

4-hydroxy-3-metoxyskořicová kyselina FerA-ferulic acid

kyselina 2-(4´hydroxyfenylazo)benzoová HABA

Obrázek 4: Krystalizace některých matric na MALDI desce A – HCCA, B – SA, C – DHB (Převzato: http://biomikro.vscht.cz/maldiman/cz/theory/basics.php)

6

1.1.5 MALDI-TOF MS při analýze mikroorganismů Tradiční bakteriologické techniky, jako je kultivace na selektivní médium nebo testy na biochemickou aktivitu jsou často časově náročné a pracné. Proto metoda MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie představuje zajímavou alternativu pro bakteriální diferenciaci. MALDI-TOF MS nabízí možnost rychlé a detailní identifikace a diferenciace bakterií či kvasinek, hub a spor. Poskytuje hmotnostní spektra části látek obsažených v bakteriální buňce, které jsou charakteristické pro analyzovaný rod, druh či kmen. Pro identifikaci neznámých bakterií je třeba vytvořit rozsáhlou databázi spekter, kde je možno porovnat získané spektrum se spektrem popsaného kmene a na základě jejich podobnosti pak určit pravděpodobnost správné klasifikace vzorku. Samotný proces analýzy a získání výsledku je velmi rychlý a je uskutečnitelný během několika minut. Samozřejmě předchází kultivace bakterií, která proces značně zpomaluje, ale tento proces je nezbytný i u většiny ostatních taxonomických metod.

1.1.6 Příprava mikrobiálních vzorků Příprava vzorku (výběr, koncentrace matrice a organických rozpouštědel) je jedním z rozhodujících kroků pro optimalizaci citlivosti, reprodukovatelnosti a správnosti stanovení m/z MALDI-TOF MS (Fenselau 2001). Analýze můžeme podrobit celé buňky i jejich extrakty, tedy izolované proteiny. Nejrychlejším postupem je přímé nanesení nakultivovaných bakterií z agaru i tekutých půd na MALDI destičku. Proces extrakce také nebývá příliš zdlouhavý, jako vhodné rozpouštědlo se často používá silná organická kyselina, aceton či acetonitril ve směsi s vodou. Pro vytvoření homogenního filmu krystalů na destičce jsou vhodná více těkavá rozpouštědla. Existuje několik studií, které zkoumaly vliv podmínek růstu kultury na výsledné spektrum. Byly nalezeny rozdíly mezi spektry, ale identifikace vzorku byla stále možná. Inkubační doba má také vliv na kvalitu spektra (Valentine 2005). Existuje několik metod nanášení vzorků na MALDI destičku (obrázek 5). „Dried-droplet“ metoda zahrnuje nanesení směsi vzorku a roztoku matrice, měla by umožňovat detekci vysokomolekulárních látek. Metoda „two-layer“ zahrnuje nejdříve nanesení kapky matrice a po jejím zaschnutí převrstvení směsí vzorku a matrice. Signály nízkomolekulárních látek by měla poskytovat lépe tzv. metoda „bottom-layer“, kdy je v objemu od 0,5 – 2 µl nanesen nejprve rozpuštěný vzorek a po zaschnutí nanesena ve stejném objemu rozpuštěná matrice (Vaidyanathan 2002). 7

Obrázek 5: Metody nanášení vzorku před analýzou (Upraveno podle: Williams a kol. 2003)

Rozdíl v přípravě gram-pozitivních (G+) a gram-negativních (G-) bakterií je dán jejich odlišnou stavbou buněčné stěny, a tedy rozdílem v uvolňování proteinů. U přípravy vzorků z G+ je pro získání kvalitního spektra většinou nutná extrakce proteinů. K narušení peptidoglykanové vrstvy v buněčné stěně, která nedovoluje MALDI ionizaci proteinů, se používá enzymů lysozymu, který rozrušuje β-1,4-glykosidické vazby mezi N-acetylglukosaminem a kyselinou N-acetylmuramovou v peptidoglykanu, chemických rozpouštědel či mechanického rozrušení sonikací či teplem. G- bakterie můžeme obvykle přímo nanést na MALDI destičku po proplachu vodou.

1.1.7 Získaná hmotnostní spektra a jejich zpracování Vstupní informací u identifikace bakterií pomocí MALDI – TOF MS je peptidový/proteinový profil, který je zobrazen jako hmotnostní spektrum. Je zobrazením četnosti ionizovaných částic bakteriálního proteomu. Zpracování spektra zahrnuje identifikaci a kvalifikaci píků a následné určení podobnosti s referenčními spektry. Píky, které se opakují při měření jednoho kmene, jsou považovány za charakteristické markery. Za dodržení standardních podmínek kultivace a analýzy jsou některé z těchto signálů charakteristické pro určitý rod, druh či kmen. Správná interpretace získaných dat pro charakterizaci bakterií je velmi důležitá a ne vždy snadná, protože někdy se vyskytují jen nepatrné rozdíly ve spektrech příbuzných kmenů. Spektra použitá pro identifikaci musejí být vysoce reprodukovatelná. Studie zabývající se MALDI-TOF hmotnostními spekry bakterií ukázaly, že 90 % signálů pochází z oblasti 600 - 10 000Da. Ionty s molekulovou hmotností pod 600Da jsou výsledkem ionizace vlastní matrice. Ionty s vysokou molekulovou hmotností jsou signály vhodnými k rozlišení bakterií díky minimálnímu pozadí přítomnému ve vysokomolekulární oblasti spekter (Lay 2001). Identita signálu je dále posouzena na základě přesnosti stanovení molekulové hmotnosti na použitém typu hmotnostního spektrometru za daných podmínek analýzy. Intenzita signálu je projevem ionizovatelnosti molekuly během procesu MALDI a je 8

rovněž závislá na relativní koncentraci proteinu v místě ionizace. Proto není MALDITOF MS kvantitativní metodou. Vhodná spektra mohou být získána automatickým sběrem dat pomocí softwaru, pokud je vzorek dobře homogenizován a správný signál poskytuje většina míst na terčíku. V případě, že dojde ke krystalizaci po obvodu terčíku či ve shlucích, je nutné ručně vyhledávat vhodná místa pro aplikaci laseru, která po ionizaci poskytují nejlepší poměr signál/šum, a tedy kvalitní výsledné spektrum. Pro

účinné

zavedení

MALDI-TOF,

jako

techniky

pro

identifikaci

mikroorganismů, je nutné zamezit získávání rozdílných spekter u analýzy stejných vzorků v různých laboratořích. Důvodem je pravděpodobně rozdílnost přípravy vzorků, které pak dávají rozdílná spektra. Je tedy nutné zavést standardní protokoly přípravy vzorků. Mezi zkoumané vlivy patří např. typy použité matrice a její ředění, různá intenzita laseru, kultivační média či stáří kultury apod. U charakteristických MALDI-TOF hmotnostních spekter pozorujeme na ose x záznam molekulové hmotnosti části proteinů z bakteriální buňky, na ose y potom intenzitu jejich signálu.

1.2 MALDI-TOF MS v klinické mikrobiologii V posledních

letech

byla

identifikace

bakterií

či

kvasinek

v klinické

mikrobiologické laboratoři založena především na fenotypových vlastnostech, jako je růst na selektivních médiích, morfologie kolonií, Gramovo barvení či různých biochemických reakcích buď pomocí komerčních kitů, nebo automatizovaných systémů. Tyto techniky dohromady dokáží identifikovat většinu bakteriálních izolátů s velkou správností, ale jsou časově náročné a nákladné. Fenotypové markery mohou být navíc jako identifikační znaky nestabilní kvůli jisté variabilitě v důsledku změny kultivačních podmínek. Alternativní variantou rychlé identifikace bakterií je v molekulární biologii polymerázová řetězová reakce (PCR), která v případě real-time PCR výsledky poskytne ve velmi krátké době. Nevýhodou jsou ovšem velmi náročné postupy pro identifikaci bakterií na druhové úrovni, vyžadují vysokou úroveň odborných znalostí a obdobně jako u jiných molekulárně biologických identifikačních technik výška provozních nákladů znemožňuje využití pro rutinní identifikace (Carbonnelle 2011). Rychlá a správná identifikace je nutná pro zlepšení péče o pacienty s infekčními chorobami. V současné době je v oblasti mikrobiologie velká tendence prohlubovat 9

dosavadní poznatky, upravovat zavedené metody a vyvíjet nové technologie pro rychlou diagnostiku. MALDI-TOF MS je jednou z technik, které mají velký potenciál pro zlepšení rutinní identifikace bakterií či kvasinek. Díky získaným specifickým referenčním spektrům a jejich zařazení do databází mohou být bakterie rychle identifikovány. MALDI-TOF MS profilování bakteriálních buněk je založeno na charakteristických pících pro rody a druhy.

Jsou vytvářeny databáze a standardní

protokoly analýzy, které jsou postaveny na reprodukovatelně detekovatelných proteinech. Tyto podléhají genetické regulaci a reakcím na podněty z prostředí. Proto je důležité stanovení postupů pro zpracování mikrobiálních vzorků a pro vytvoření MALDI-TOF MS profilů (Carbonnelle 2011). Prvních úspěchů ve využití MALDI-TOF MS pro analýzu bakterií bylo dosaženo v roce 1994, kde bylo použito lyzátu buněk (Cain a kol. 1994) a v roce 1996, kdy byly analyzovány celé bakteriální buňky (Holland 1996). V tomtéž roce Krishnamurthy a kol. na základě biomarkerů rozlišili patogenní bakterie Bacillus anthracis, Yersinia pestis a Brucella meliteusis od nepatogenních druhů (Krishnamurthy 1996). V roce 2009 byly publikovány práce, jejichž autoři posoudili použitelnost MALDI-TOF MS z hlediska identifikace bakteriálních kmenů izolovaných z klinických vzorků. Z 1660 testovaných kmenů bylo 95,4 % správně identifikováno, studie prokázala správnost identifikace na úrovni druhu 84,1 % a 11,3 % na úrovni rodu. V případě 2,8 % izolátů nebylo identifikace dosaženo a nesprávná identifikace se objevila u 1,7 % izolátů. Tyto nedostatky byly připsány na vrub chybám v databázi. Hlavní obtíže byly pozorovány u identifikace Streptococcus pneumoniae a Streptococcus mitis, jelikož jsou to příbuzné druhy a dávají velmi podobná MALDITOF hmotnostní spektra. Zjištěná doba potřebná pro identifikaci jednoho izolátu byla 6 minut (Seng 2009). Na základě MALDI-TOF MS analýzy 559 izolátů G- bakterií z pacientů s cystickou fibrózou bylo zařazeno do správného druhu 549, zbývajících 10 do správného rodu (Degand 2008). Rozsáhlá studie zhodnocující úspěšnost MALDI-TOF MS identifikace bakteriálních druhů v klinické mikrobiologické laboratoři prokázala správnou identifikaci u 1062 (95,2 %) z 1116 vzorků (Eigner 2009). Bizzini v roce 2010 porovnával MALDI-TOF MS s konvenčními fenotypovými metodami. Mezi 1371 izoláty identifikovanými konvečními metodami bylo pomocí

10

MALDI-TOF MS stejně zařazeno 1278 (93,2 %) zjištěných druhů a 73 (5,3 %) bylo identifikováno na úrovni rodu (Bizzini 2010). Uváděná průměrná doba analýzy a identifikace vzorků bývá méně než 10 minut, nesmí být však opomenuta doba kultivace bakterií, která ovšem zpomaluje i většinu dalších identifikačních metod. MALDI-TOF MS je brána jako 3 až 5 krát levnější ve srovnání s konvenčními metodami identifikace. Tyto výsledky potvrzují význam MALDI-TOF MS pro použití v klinické mikrobiologii, ale také zdůrazňují význam aktualizace databází a metod analýzy, přípravy vzorků atd. pro další zlepšení správnosti identifikace. MALDI-TOF MS může být také využita pro diagnostiku infekcí krevního řečiště či moči přímo ze vzorku. Důležitým krokem je oddělení bakterií od buněčných komponent a jejich lýze. Z některých studií vyplývá, že by tato metoda mohla být použita pro real-time diagnostiku, která by umožnila identifikaci do 30 až 45 minut (Prod'hom a kol. 2010). V současnosti se ukazuje i potenciální užití MALDI-TOF MS

při detekci

antibiotické rezistence bakterií. Pozornost získává především výzkum rozlišení meticilin-rezistentních a meticilin-senzitivních kmenů stafylokoků (Jackson 2005). Přehled studií, které se zabývají využitím MALDI – TOF MS v klinické mikrobiologii, je uveden v tabulce č. 1.

11

Tabulka 1: Shrnutí hlavních studií pro identifikaci bakterií pomocí MALDI – TOF MS (převzato z Carbonnelle a kol. 2011) Id: identifikace Původ a počet Id na druhové Id na rodové Problémově identifikovatelné Autor Seng

a

vzorků

úrovni

úrovni

bakterie

kol. rutinní vzorek

83,8%

95%

Propionobacterium acnes

(2009)

1660

Streptococcus pneumoniae Stenotrophomonas maltophilia Shigella sp.

van Veen a kol. rutinní vzorek (2010)

980

Blondiaux a kol.

rutinní vzorek

(2009)

362

Prod'hom a kol.

z krve

(2010)

126

La Scola a kol. z krve (2009)

92%

98.8%

anaerobní bakterie 72,9%

87%

(2009)

212

Ferroni a kol.

z krve

(2010)

685

Christner a kol. z krve (2010)

277

Ferreira a kol.

z krve

(2010a)

300

Streptococcus viridans Shigella sp.

77.8%

78.7%

Streptococcus mitis Staphylococcus sp.

76%

76%

599

Stevenson a kol. z krve

Streptococcus pneumoniae

Streptococcus sp. polymicrobial samples

80,2%

80,2%

Streptococcus mitis Propionobacterium acnes

89%

98%

Streptococcus pneumoniae Streptococcus mitis

94,2%

95%

G+ koky

42.6%

71.6%

Streptococcus mutans Staphylococcus sp. Staphylococcus aureus

Ferreira (2010b)

a

kol. z moči

91.8%

92.7%

220

Streptococcus sp. Enterococcus sp. Raoultella sp.

1.3 Vliv metod přípravy vzorků na vzhled MALDI-TOF hmotnostních spekter s ohledem na detekci proteinů s vyšší molekulovou hmotností Mnoho studií předpokládá, že získání spekter z oblasti vysokomolekulárních iontů (40kDa), může být pro diferenciaci bakterií velmi důležité. Předpokládají, že tyto oblasti obsahují specifické píky s minimálním pozadím (Lay 2001). Bylo zjištěno, že relativní intenzita signálů v bakteriálních MALDI-TOF MS profilech je ovlivňována složením rozpouštědla použitého pro suspenzi buněk (Ruelle

12

2004) či extrakci buněčné bílkoviny (Elhanany 2001). Pro detekci vysokomolekulárních proteinů je nejúčinnější zpracovat bakteriální buňky povrchově aktivní látkou před analýzou MALDI-TOF (Chong 1997, Nilsson 1999, Meetani 2005), přítomnost povrchově aktivních látek přímo v matrici žádné zlepšení nepřinesla (Williams 2003). Možnost zvýšit poměr signál-šum pro vysokomolekulární proteiny popsal Easterling 1998, který vystavil buňky ultrazvuku. Ukazuje se, že přítomnost či nepřítomnost vysokomolekulárních signálů je často spojena s volbou matrice. Použití ferulové kyseliny (FerA) jako matrice umožňuje detekovat bílkoviny s vysokou molekulovou hmotností až do 70kDa (Lay 2001, Nilsson 1999, Madonna 2000, Meetani 2005, Dieckmann 2008), určitý pozitivní vliv má i použití kyseliny sinapové (Ryzhov 2001, Shaw a kol. 2004, Moura 2008). Schopnost detekce vysokomolekulárních bílkovin také ovlivňuje složení rozpouštědla matrice (Madonna 2000, Vaidyanathan 2002, Ruelle 2004). Rovněž metoda nanesení vzorku má značný dopad na možnosti detekce vysokomolekulárních bílkovin (Vaidyanathan 2002). Přesto,

že

byly

mnoha

autory

popsány

možnosti

zlepšení

detekce

vysokomolekulárních proteinů, žádný z nich nedefinoval přesně vztah těchto změn k diskriminačním schopnostem metody.

1.4 Rod Lactobacillus Rod Lactobacillus je co do počtu zástupců nejbohatším rodem skupiny bakterií mléčného kvašení. Podle taxonomického přehledu Prokaryot se rod Lactobacillus fylogeneticky řadí do domény Bacteria, kmene Firmicutes, třídy Bacilli, řádu Lactobacillales, čeledi Lactobacillaceae. Taxonomie tohoto rodu prochází neustálými změnami. Kromě klasifikace rodu nejsou dořešeny otázky konkrétních druhů, což má vliv na identifikaci a názvosloví kmenů. Podle současných poznatků se tento rod rozděluje do sedmi fylogenetických skupin Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus

delbrueckii,

Lactobacillus

plantarum,

Lactobacilus

reuteri,

Lactobacillus sakei a Lactobacillus salivarius; klasifikace je založena zejména na sekvenování genů pro hsp 60 a 16S rDNA, dále pak rpoA, pheS a tuf. Momentálně je rozlišováno 171 kmenů a 27 podkmenů (http://www.bacterio.cict.fr).

13

Obrázek 6: Lb. casei, Lb. paracasei, Lb. rhamnosus (Převzato z http://www.biology.usu.edu)

Tento rod byl poprvé popsán v r. 1901 Beijerinckem. Vyskytuje se velmi běžně v různých prostředích. Tvoří část přirozené mikroflóry dutiny ústní, gastrointestinálního traktu a vaginy dospělých žen, kde zkvašují cukry na kyselinu mléčnou a tím snižují pH (kolem 4,5) vagíny potřebné pro ochranu sliznice proti nepříznivým mikroorganismům. Dalším ochranným mechanismem je tvorba antibakteriálních či toxických látek (lakticinů).

Většinou

jsou

nepatogenní,

pokud

dojde

k infekci

(zejména

Lactobacillus jensenii a Lactobacillus rhamnosus, izolovány jako původci endokarditid, bakteriémií, peritonitid, abscesů a meningitid), laktobacily jsou rezistentní na vankomycin a k léčbě je třeba vysokých dávek penicilinu. Často se laktobacilů využívá v moderním potravinářství např. při konzervaci potravin, kde díky snižování pH potravin zastavují množení hnilobných bakterií. Bohaté využití nacházejí při výrobě krmiv, např. při silážování píce. V mlékárenském průmyslu se využívají jako startovací kultury, pro zlepšení chuti a organoleptických vlastností jogurtů, acidofilních mlék, sýrů. Z jiných potravinářských produktů, ve kterých se laktobacilů využívá, mohou být uvedeny např. fermentované salámy nebo kysané zelí. Laktobacily patří mezi bakterie mléčného kvašení. Některé kmeny tvoří přirozenou mikroflóru mléka. Jsou součástí probiotik , mají tedy významnou roli v lidské výživě a díky tomu je jim v poslední době věnována velká pozornost. Laktobacily jako probiotika kolonizují sliznici střeva a zabraňují přemnožení nežádoucích mikroorganismů (klostridií, enteropatogennů či enterotoxigenních kmenů). Obecně jsou považovány za bakterie bezpečné, ale při užívání probiotik by měl být brán zřetel na rizikové skupiny, jako jsou staří lidé nebo lidé s imunodeficiencí, u kterých mohou vzácně způsobit endokarditidu a různé formy sepsí u dětí.

14

1.4.1 Morfologické a fyziologické vlastnosti Na pevných kultivačních půdách se vyskytují ve tvaru pravidelných grampozitivních tyček, občas kokovitého tvaru. Někdy se mohou vyskytovat v palisádovém uspořádání či ve formě krátkých řetízků. Nevytvářejí spory a jsou nepohyblivé (obrázek č.4). Většinou jsou obligátní anaerobové či mikroaerofilové, někteří zástupci jsou kapnofilní. Jsou striktně fermentativní a jako hlavní konečný produkt jejich fermentace je kyselina mléčná, patří tedy mezi bakterie mléčného kvašení. Nevytvářejí katalázu, i když některé kmeny mají pseudokatalázovou aktivitu. Jsou schopny zkvašovat laktózu a jiné cukry. Na základě konečných produktů fermentace cukrů je možno laktobacily charakterizovat fenotypicky do tří skupin (Sedláček 2007). •

obligátně homofermentativní

Hexózy jsou fermentovány na kyselinu mléčnou. Pentózy ani glukonát fermentovány nejsou. Zástupci: Lb. delbrueckii ssp. delbrueckii, Lb. delbrueckii ssp. lactis, Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus, Lb. acidophilus, Lb. helveticus, Lb. crispatus, Lb. gallinarum, Lb. gasseri, Lb. johnsonii, Lb. salivarius a další. •

fakultativně heterofermentativní

Hexózy jsou fermentovány na kyselinu mléčnou nebo směs kyseliny mléčné, octové, mravenčí a ethanolu. Pentózy jsou fermentovány na kyselinu mléčnou a octovou. Zástupci: Lb. casei, Lb. plantarum, Lb. sakei, Lb. paracasei, Lb. curvatus, Lb. acetotolerans, Lb. zeae, Lb. rhamnosus a další. •

obligátně heterofermentativní

Hexózy jsou fermentovány na kyselinu mléčnou, octovou, ethanol a oxid uhličitý. Pentózy jsou fermentovány na kyselinu mléčnou a octovou. Zástupci: Lb. buchneri, Lb. fermentum, Lb. gastricus, Lb. parabuchneri, Lb. composti, Lb. brevis, Lb. mucosae a další.

1.4.2 Kultivace Rostou na bohatých komplexních médiích. Kultivační půda pevná či tekutá, nejběžněji používané je selektivní médium MRS (de Man, Rogosa a Sharp), která obsahuje

pepton,

masový

extrakt,

kvasničný

extrakt,

glukózu,

tween

80,

15

hydrogenfosforečnan draselný, octan sodný, citran amonný, síran hořečnatý a síran manganatý. Optimální růstová teplota se pohybuje mezi 30°C až 40°C.

1.4.3 Identifikace bakterií rodu Lactobacillus Laktobacily můžeme charakterizovat na základě vlastností fenotypových, např. pomocí biochemické charakteristiky, proteinových profilů, fyziologické analýzy či morfologie buněk. Tyto metody jsou často používány a většinou nejsou příliš pracné. Bývají však nespolehlivé při identifikaci blízce příbuzných druhů. Genotypové metody (molekulárně biologické), např. PCR v různých podobách, které jsou schopny rozlišit laktobacily až na úroveň kmene (nutné je mít k dispozici druhově či rodově specifické primery), metody ribotypizace, sekvencování či analýza plazmidové DNA, se využívají spíše k taxonomickým účelům. Molekulárně-biologické techniky bývají založeny na 16S rDNA sekvencích, na znalostech genomu či různých specifických sondách. Díky blízké příbuznosti některých druhů je taxonomie rodu Lactobacillus velmi složitá. Klasifikace a nomenklatura např. kmenů Lb. casei, Lb. paracasei a Lb. rhamnosus je velmi ztížena jejich blízkou příbuzností. Pomocí tradičních metod je lze rozeznávat obtížně. Mají podobné fyziologické vlastnosti a požadavky na podmínky kultivace. Klasifikační schémata, aplikovaná v posledních desetiletích pro tyto druhy se neustále mění. Změny jsou ovlivňovány novými poznatky založenými na znalostech sekvencí DNA a také rozmachem molekulárně-biologických metod. Neustálé změny v klasifikaci této skupiny laktobacilů působí obtíže v průmyslovém využití kmenů a ztěžují orientaci v literárních zdrojích (Desai a kol. 2006).

1.4.4 Problematika v taxonomii laktobacilů Taxonomie rodu Lactobacillus je velmi složitá z důvodu blízké příbuznosti některých druhů. Neustálé změny v taxonomii a zvyšující se počet popsaných druhů je toho důkazem. Zvláště pak nejsou dořešeny otázky některých druhů, např. u druhů Lb. casei, Lb. paracasei, Lb. rhamnosus a Lb. zeae. Tyto druhy jsou si velmi blízké,

16

mají podobné fyziologické vlastnosti, nutriční požadavky a rostou za podobných podmínek. Proto byly v minulosti velmi těžko odlišitelné pomocí tradičních metod. Pojmenování Lb. casei bylo uskutečněno v roce 1916 (Orla-Jensen, 1919). Na základě fenotypické identifikace byl jako typový kmen označen Lb. casei subsp. casei ATCC 393T Hansenem a Lesslemem v roce 1971 a schválen v Approved Lists of Bacterial Names v roce 1980. Studie využívající DNA-DNA hybridizační techniky označily kmen ATCC 393T jako nevhodný typový kmen Lb. casei pro svou nízkou genetickou podobnost s kmeny patřící do druhu Lb. casei (Dellaglio a kol., 1975). Collins a kol. v roce 1989 našel vysokou hladinu DNA homologie mezi kmeny patřícími do druhu Lb. casei a Lb. casei NCDO 151 a překlasifikoval Lb. casei subsp. casei, Lb. casei subpsp. alactosus a Lb. casei subsp. pseudoplantarum na Lactobacillus paracasei (Collins a kol. 1989). Došlo tedy k reklasifikaci velkého množství kmenů Lb. casei na Lb. paracasei. Dellaglio podal první žádost o zamítnutí druhu Lb. paracasei a změnu typového kmene Lb. casei z kmene ATCC 393 na kmen ATCC 334 (Dellaglio, 1991). Tato žádost však byla odmítnuta (Wayene 1994). Další žádost o reklasifikaci typového kmene Lb. casei ze stávajícího ATCC 393 na ATCC 334 a odmítnutí jména Lb. paracasei byla přednesena v roce 1996 (Dicks a kol., 1996). Žádost byla opět zamítnuta, nicméně tento návrh byl podporován ve studiích (Mori a kol. 1997; Chen a kol. 2000; Felis a kol. 2001). Tito navrhují přeřazení kmene ATCC 393T z druhu Lb. casei do druhu Lb. zeae. Judicial Commission of the International Committee on Systematics of Bacteria (2008) uvádí, že typovým kmenem Lb. casei je stále Lb. casei ssp. casei ATCC 393T.

17

2. Cíl diplomové práce Cílem práce bylo nalezení podmínek přípravy vzorku pro MALDI MS analýzu a nastavení parametrů pro vyhodnocení MALDI MS profilů, které by vedlo k vytvoření metody spolehlivě rozlišující vybrané skupiny bakterií na druhové úrovni. Byl studován vliv podmínek extrakce, frakcionačních kroků, složení roztoku MALDI matrice či metody nanášení vzorku na desku spektrometru na kvalitu a reprodukovatelnost MALDI MS profilů a diskriminační schopnosti metody. Základní taxonomickou skupinou pro práci byl rod Lactobacillus. Součástí práce bylo řešení následujících úkolů: •

Vliv ředění vzorků rozpouštědly na výslednou kvalitu MALDI-TOF MS profilů

•

Vliv změny poměrů organické a vodné fáze v roztoku matrice na MALDITOF MS profily

•

Vliv změn poměrů organické a vodné fáze v rozpouštědle pro extrakci bakteriálních proteinů na MALDI-TOF MS profily

•

Testování různých druhů matric pro získání kvalitních signálů s ohledem na proteiny s vyšší molekulovou hmotností

•

Optimalizace metody MALDI-TOF MS pro detekci signálů z oblasti vyšších molekulových hmotností

•

Test vlivu intenzity laseru na získání spekter v oblasti s vyššími molekulovými hmotnostmi

•

Srovnání standardní metody analýzy s nově vyvinutou metodou

•

Možnost rozlišení Lb. paracasei a Lb. rhamnosus s použitím nově vyvinuté metody

18

3. Experimentální část 3.1 Vyšetřovaná skupina bakteriálních kmenů Kmeny analyzované v této diplomové práci byly získány z České sbírky mikroorganismů a Veterinární a farmaceutické univerzity v Brně. Celkově bylo využito 32 kmenů z rodu Lactobacillus. Z toho byly tyto typové kmeny: Lactobacillus casei ssp. casei

CCM 7088T

Lactobacillus rhamnosus

CCM 1825T

Lactobacillus paracasei ssp. paracasei

CCM 1825T

Lactobacillus acidophilus

CCM 4833T

Lactobacillus crispatus

CCM 7010T

Lactobacillus amylovorus

CCM 4380T

Lactobacillus gallinarum

CCM 4383T

Lactobacillus gasseri

CCM 7009T

Lactobacillus johnsonii

CCM 4384T

Pro kalibraci hmot metody bylo použito kmene Escherichia coli DH5 alpha.

3.2 Použitý materiál 3.2.1 Kultivační médium MRS médiu s 0,05% cysteinem V 1000 ml destilované vody bylo rozpuštěno 52g M.R.S. Broth (Oxoid) a médium bylo sterilizováno v autoklávu (121 °C, 20 min), po zchladnutí média bylo sterilně přidáno 10 ml cysteinu (zásobní roztok 5 % byl 100 x zředěn na výslednou koncentraci 0,05 %). 3.2.2 Chemikálie • acetonitril (Merck, Darmstadt, Německo) • destilovaná voda (Milli-Q plus 185) (Millipore, Bilerica, Massachusetts, USA) • kyselina mravenčí (Riedel de Haën, Německo) • kyselina α-kyano-4-hydroxyskořicová (Bruker Daltonik, Německo) • etanol (Merck, Darmstadt, Německo) • 0.5mM Tris (pH 7.4) 19

• Triton X – 100 (Sigma-Aldrich, Německo) • guanidine hydrochlorid (Sigma-Aldrich, Německo) • TFA (Sigma-Aldrich, Německo) • kyselina ferulová (Riedel de Haën, Německo) • 2-propanol (Sigma-Aldrich, Německo) • kyselina dihydroxybenzoová (Sigma-Aldrich, Německo) • kyselina sinapová (Bruker Daltonik, Německo) • N,N-dimethyldodecylamine-N-oxide (Sigma-Aldrich, Německo)

3.2.3 Přístroje a pomůcky • sterilní pasteurky skleněné • eppendorfky zn. Eppendorf kalibrované 1,5 ml • špičky (BIOHIT, Finsko) • pipety (BIOHIT, Finsko) • analytické váhy (AB104-S, Mettler Toledo, USA) • vortex (MS2 Minishaker, IKA® Werke GmbH & Co. KG, Německo) • centrifugy (Hettich, Německo), (MiniSpin, Eppendorf, Německo). • ultrazvuková čistička (Ultrasonic compact cleaner PS03000A, Powersonic, USA) • MALDI TOF hmotnostní spektrometr Ultraflex III (Bruker, Německo) • software: BioTyper I, BioTyper II, FlexControl, FlexAnalysis (Bruker, Německo)

3.3 Příprava vzorků kmenů pro analýzu a jejich uchovávání 3.3.1 Kultivace kmenů Bakterie byly kultivovány pro MALDI-TOF MS analýzu v tekutém médiu MRS obohaceném cysteinem po 24h při 37°C. Následně byly přeočkovány opět do zkumavek s MRS bujónem (Oxoid), ze kterých byly po 20h kultivace při 37°C odebrány sterilní pipetou pro sterilizaci etanolem.

20

3.3.2 Sterilizace etanolem V laminárním boxu byly sterilní pipetou nakultivované buňky odebrány do sterilních zkumavek Eppendorf a centrifugovány při 4500 ot. 2 minuty. Odstředěné médium bylo odebráno a zbylé buňky byly promyty dvakrát v 900 µl demineralizované vody (DDW), při čemž byl použit vortex po dobu 20s a centrifuga při 4500ot. po dobu 2 min. Po druhém promytí bylo k buňkám přidáno 300 ml DDW, mícháno na vortexu a přidáno 900 µl 96% etanolu, znovu mícháno na vortexu 20s a poté proběhla konečná centrifugace 13300ot. po 2 min. Vzniklý supernatant byl odpipetován a zbylý pelet byl do doby analýzy uchováván v lednici.

3.3.3 Úprava vzorků před nanesením na MALDI destičku Pro analýzy prováděné z celých buněk byly použity pelety upravené pouze etanolovou extrakcí, které byly naneseny přímo na terčík MALDI destičky. Pro potřeby analýz bakteriálních extraktů byl použit následující postup extrakce: Pelety byly krátkou centrifugací zbaveny mikropipetou zbytků etanolu. Poté bylo přidáno 25 µl 70% FA, které byly důkladně s peletem promíchány špičkou pipety. Následně bylo dodáno 25 µl ACN a promícháno na vortexu. Následovala dvouminutová centrifugace při maximálních otáčkách (13300 ot./min.). Vzniklý supernatant byl odpipetován do nové zkumavky Eppendorf a uchován v mrazícím boxu při -20°C do doby analýzy. Pro kontrolu stability v mrazícím boxu uchovávaných extrahovaných vzorků byla srovnána hmotnostní spektra čerstvě a půl roku zmražených extrahovaných vzorků laktobacilů. Vzorky byly analyzovány standardní metodou s matricí HCCA dle popsaného protokolu.

3.3.4 Analýza vzorků a kalibrace metod Měření byla prováděna MALDI-TOF hmotnostním spektrometrem Ultraflex III TOF/TOF (Bruker Daltonik, Německo) v lineárním pozitivním módu (urychlovací napětí bylo 25kV). K ionizaci bylo využito laseru SmartBeam pracujícího na vlnové délce 335 nm. Automatický mód byl použit pro sbírání dat u vzorků s homogenní krystalizací matrice. Laser byl zaměřován podle definovaného rastru, z jednoho bodu bylo akumulováno maximálně 400 laserových pulzů. Každý vzorek byl nanesen na 5 pozic MALDI destičky a z každé pozice byly provedeny tři analýzy. Pro kalibraci hmot 21

bylo použito extraktu z Escherichia coli DH5 alpha připraveného a analyzovaného podle popsaného protokolu. Spektra v oblasti molekulových hmotností do 2000 Da, kde většinou nacházíme ionty pocházející z matrice, nebyla použita k vyhodnocení. Pro vyhodnocení dat bylo použito softwarů FlexControl, FlexAnalysis a BioTyper.

3.4 Metody provedených experimentů 3.4.1 Použitá metoda pro test vlivu intenzity laseru a koncentrace extraktu na kvalitu spekter Pro sledování vlivu intenzity laseru a koncentrace extraktu na výsledné spektrum byla vybrána typová kultura Lactobacillus casei ssp. casei 7088T, která byla sterilizována 1,2 ml 75% etanolu. Pelet byl resuspendován v rozpouštědle (70% FA a ACN v poměru 1:1). Použitá matrice:

byla

použita kyselina α-kyano-4-hydroxyskořicová (HCCA)

připravena dle doporučeného postupu společnosti Bruker (nasycený roztok ve směsi 50 µl H2O, 50 µl 10% TFA, 100 µl ACN). Extrakt vzorku byl nanesen v objemu 0,3 µl na MALDI destičku v pěti opakováních. Po zaschnutí při pokojové teplotě byl vzorek převrstven 0,3 µl roztoku matrice. Vzorky byly tedy naneseny metodou Bottom-layer a data byla sbírána automaticky (akumulace po 1000 střelách z každého terčíku). Intenzita laseru byla použita v 38 %, 40 % a 43 % na arbitrární stupnici. První ředění bylo provedeno 5 µl extraktu + 2,5 µl směsi 70% FA + ACN (1:1), druhé 5 µl extraktu + 5 µl směsi 70% FA + ACN (1:1).

3.4.2 Vliv změny poměrů vody a organické složky v roztoku matrice Použita byla opět typová kultura Lactobacillus casei ssp. casei 7088T, upravená etanolovou sterilizací a extrahovaná směsí 70% FA a ACN v poměru 1:1. Použitá matrice: příprava proběhla dle tabulky 2, kde množství 10% TFA zůstalo zachováno (50 µl) a měnil se použitý objem vody (aq) a acetonitrilu (organická složka, og). HCCA byla přidávána do nasycení roztoku. Pro nanesení vzorku byla použita metoda Bottom-layer po 5 terčících pro každý roztok matrice.

22

Tabulka 2: Složení použité matrice

H2O (µl) 0 16 30 50 70 83 100

ACN (µl) 150 133 120 100 80 66 50

aq : og 1:3 1:2 1:1,5 1:1 1,5:1 2:1 3:1

3.4.3 Změna poměrů vody a acetonitrilu v extrakčním rozpouštědle Sedm vzorků Lactobacillus casei ssp. casei 7088T bylo kultivováno a sterilizováno obvyklým způsobem. Rozpouštědlo pro extrakci vzorků bylo připraveno dle tabulky 3. Použitá matrice: byla použita HCCA připravena dle doporučeného postupu společnosti Bruker (nasycený roztok ve směsi 50 µl H2O, 50 µl 10% TFA, 100 µl ACN). Pro nanesení vzorku byla použita metoda Bottom-layer po 5 terčících na každý pokus matrice. Tabulka 3: Složení rozpouštědla pro extrakci vzorků Lb. casei CCM 7088

Vz. č. 1 2 3 4 5 6 7

H2O(µl) 0 5 10 15 20 30 40

FA 100% (µl) 35 35 35 35 35 35 35

ACN(µl) 65 60 55 50 45 35 25

3.4.4 Testování různých druhů matric pro získání kvalitních signálů s ohledem na detekci látek s vyšší molekulovou hmotností Vzorek byl připraven podle obvyklého postupu a analyzován jako extrakt. Různé typy matric byly zředěny do požadované koncentrace roztokem připraveným z 200 µl destilované vody + 200 µl 10% TFA + 400 µl ACN.

23

Použité matrice: DHB – k. 2,5 - dihydroxylbenzoová (20 mg/ml) FerA – k.ferulová (10 mg/ml) SA – k. sinapová (10 mg/ml) HCCA (nasycená)

Nanesení vzorku: a) Bottom-layer, b) Dried-droplet – 2,4 µl matrice + 0,6 µl vzorku pak 0,6 µl na 5 jamek. 3.4.5 Ověření použitelnosti metod, které dle publikovaných studií vedly detekci látek vyššími molekulovými hmotnostmi Metoda podle Nilssona 1999 K připraveným peletům bylo přidáno 20 µl 0,1% TFA. Byla provedena sonifikace po dobu 20 min. Vzniklý bakteriální lyzát byl odstředěn a supernatant byl odebrán. Zbývající pelet byl extrahován v 20 µl 50% ACN, zamíchán na votexu a odstředěn. Vzniklý extrakt byl odebrán pro analýzu. Pro nanášení vzorků a matrice na MALDI destičku byla použita technika Seed-layer. První vrstva (matrice č. 1) obsahovala FerA o koncentraci 1 mg/ml v ACN. Takto vzniklá matrice byla nanesena v objemu 0,5 µl na MALDI destičku a ponechána zaschnout při laboratorní teplotě. Následně byla převrstvena směsí bakteriálního extraktu a matrice č. 2 v poměru 1:1. Matrice č. 2 vznikla nasycením FerA v roztoku 2-propanol/H2O/FA (2:3:1). Metoda dle Reulle a kol. 2004 Pelet byl smíchán s 0,5 µl 0,1% TFA přímo na MALDI destičce. Po zaschnutí byl převrstven 0,5 µl etanolu, který byl ponechán zaschnout při laboratorní teplotě. Jako třetí a poslední vrstva byla použita matrice z nasycené HCCA v roztoku ACN/isopropanol/0.1% TFA (49:49:2). Po zaschnutí byla provedena analýza. Tato metoda byla testována i bez použití etanolu. Byl použit stejný postup, jen krok převrstvení vzorku etanolem byl vynechán a nanesený vzorek byl po zaschnutí převrstven připravenou matricí.

24

Metoda dle Madonny a kol. 2000 Vzorek byl upraven sterilizací etanolem, pro analýzu byl použit vzorek extrahovaný dle obvyklého postupu v množství 0,3 µl na MALDI destičku a po zaschnutí při pokojové teplotě převrstven 0,3 µl matrice, která byla připravena z FerA o koncentraci 12,5 mg/ml v roztoku FA/ACN/H2O (17:33:50). Po zaschnutí byla provedena analýza.

Metoda dle Meetaniho a kol. 2005 K analýze byly použity celé bakterie sterilizované etanolem. Pro první pokus byla použita jako matrice HCCA, v druhém pokusu FerA. Matrice HCCA byla připravena dle postupu doporučeného společností Bruker. Druhá matrice byla FerA o koncentraci 12,5 mg/ml v roztoku FA/ACN/H2O (17:33:50). Pelet nanesený na destičku byl převrstven 1 µl povrchově aktivní látky N,N-dimethyldodecylamine-N-oxidu (DDA) o koncentraci 1mM. Směs byla ponechána zaschnout při pokojové teplotě a následně byla převrstvena 0,5 µl jednou z matric. Stejný postup byl uplatněn i při použití buněčného extraktu, který jsme nanesli v množství 0,5 µl na MALDI desku.

Metoda dle Chonga et al. 1997 Použitými matricemi byly opět HCCA připravená dle společnosti Bruker a FerA připravená stejným způsobem jako u metody dle Meetaniho. Prvním krokem byla lyze buněk v roztokou 0.5 mM Trispuferu (pH 7.4), 2 M gu-HCl a 2% Tritonu. Buňky s tímto roztokem byly zamíchány na votexu po dobu 30s a centrifugovány (2 min. 13,5 ot. /min.). Vzniklý supernatant byl použit k analýze. Se zbylým peletem byl postup opakován. Oba vzniklé supernatanty byly smíchány a v množství 0,3 µl naneseny na destičku. Po zaschnutí při pokojové teplotě byly vzorky převrstveny jednou z matric.

3.4.6 Modifikace metody dle Madonny a kol. 2000 Protokol přípravy analýzy dle Madonny se ukázal pro naše potřeby nejvhodnějším, nízká homogenita vzorku po zaschnutí na desce však neumožnila automatický sběr dat. Proto byly studovány různé modifikace metody. K analýze bylo vždy použito extraktu ze sterilizovaného vzorku. Jako matrice bylo vždy použito kyseliny ferulové.

25

Na MALDI destičku jsme pokaždé nanesli extrakt i matrici v objemu 0,2 µl na 5 terčíků pro každou koncentraci metodou „bottom-layer“.

Změna koncentrace FerA Základní roztok pro ředění matrice byl připraven: FA/ACN/H2O 17:33:50. Postup přípravy matric je zobrazen v tabulce 4. Tabulka 4: Příprava matric s různými koncentracemi FerA

Vz. č. 1 2 3 4 5

Koncentrace FerA (mg/ml) 5 8,5 12,5 16,5 20 (nasycený roztok)

Navážka FerA (mg) 0,3 0,5 1,2 1,4 2,2

Množství základního roztoku (µl) 60 58 96 85 110

Změna poměru ACN a H2O v základním roztoku pro Madonnu Koncentraci FerA v matrici jsme použili 12,5 mg/ml základního roztoku (ZR). Množství FA bylo neměnné. Postup přípravy ZR lze nalézt v tabulce 5. Tabulka 5: Příprava základních roztoků pro Madonnu

Vz. č. 1 2 3 4 5

FA:ACN:H2O 17:15:68 17:25:58 17:33:50 17:40:43 17:50:33

Naváženo FerA (mg) 1,1 (FerA nerozpuštěn) 0,7 1,2 1,1 1

Množství ZR (µl) 88 56 96 88 80

Změna poměru FA a H2O v základním roztoku Madonny Koncentraci FerA v matrici jsme použili 12,5 mg/ml základního roztoku. Množství ACN bylo konstantní. Postup přípravy základního roztoku lze nalézt v tabulce 6. Tabulka 6: Postup přípravy základního roztoku při změně množství FA a H2O

Vz. č. 1 2 3 4 5 6

FA:ACN:H2O v ZR 1:33:66 5:33:62 12:33:55 17:33:50 25:33:42 40:33:27

Naváženo FerA (mg)

Množství ZR (µl)

1,2 0,9 0,9 1,2 1,0 1,2

96 72 72 96 80 96

26

Sledování vlivu použití FA či TFA v základním roztoku Madonny Základní roztok pro ředění matrice byl připraven: 1) FA:ACN: H2O (17:33:50) 2) TFA:ACN: H2O (17:33:50). Koncentrace FerA byla 12,5 mg/ml. Sledování vlivu analýzy celých buněk a buněčného extraktu Základní roztok byl připraven ve směsi FA:ACN: H2O (17:33:50), koncentrace FerA byla 12,5 mg/ml základního roztoku. Na MALDI desku byly naneseny celé buňky Lb. casei a buněčný extrakt v množství 0,3 µl. Extrakce buněk byla provedena podle postupu uvedeného výše. Po zaschnutí byly vzorky převrstveny připravenou matricí a analyzovány.

3.4.7 Analýza laktobacilů s použitím HCCA a FerA jako matrice Byla porovnána použitelnost dvou matric, HCCA jako zástupce matrice běžně používané a společností Bruker doporučené a matrice z FerA upravené dle Madonny a kol. 2000 pro získání signálů látek s vyšší molekulovou hmotností (do 40 kDa). K analýze bylo vždy použito extraktu ze sterilizovaného vzorku upraveného standardně. Na MALDI destičku jsme pokaždé nanesli extrakt i matrici v objemu 0,2 µl na 5 terčíků pro každou koncentraci metodou „bottom-layer“. Matrice HCCA byla připravena podle návodu společnosti Bruker. Matrice FerA byla použita v koncentraci 12,5 mg/ml základního roztoku FA:ACN:H2O (17:33:50). Analyzovány

byly

Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus,

vzorky: Lactobacillus

Lactobacillus

Lactobacillus paracasei crispatus,

casei ssp.

Lactobacillus

ssp.

casei,

paracasei, amylovorus,

Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii. Porovnávání a analýza píků byly provedeny vizuálně i pomocí programu vytvořeného konkrétně pro rozpoznání stejných píků s možností odchylky určení m/z 0,5 ‰ (program vytvořil Václav Juchelka, student Fakulty informatiky Masarykovy univerzity).

27

4. Výsledky 4.1.1 Vyhodnocení výsledků U souboru výsledků byly Grubbsovým testem vyloučeny odlehlé výsledky. Odchylka m/z pro odpovídající signály je 0,5 ‰. 4.1.2 Výsledky kontroly stability zamražených vzorků Výsledné hmotnostní spektrum půl roku zamražených vzorků vykazuje stejné

Intens. [a.u.]

píky, jako spektrum čerstvě připravených. Přehled spekter je uveden na obrázku 7.

x104 2

2672.1

3852.8

Intens. [a.u.]

Lb. casei CCM 7088

5889.5

4696.6

0 x105

6803.3

7578.4

8412.2

9393.5 7088\0_E18\1\1s lin

5351.0

0.5 0.0 x104 1 Intens. [a.u.]

2672.5

3852.9

Lb. casei CCM 7088

5890.0

4696.8

6804.7

7578.4

8412.6

Lb. paracasei CCM 7275

5889.7 2738.3

Intens. [a.u.]

9394.4

* Lb_paracasei_CCM_7275_MRS_eth_091202\0_B11\1\1s lin

5299.5

0 x104 2 Intens. [a.u.]

Lb_casei_CCM_7088_MRS_eth_091202_40\0_C7\1\1s lin

5350.9

4446.5

6845.2 7478.6

8411.8

9393.6 7275\0_H18\1\1s lin Lb. paracasei CCM 7275

5300.1 5890.2 2738.9

4446.5

0

6846.3 7479.4

Intens. [a.u.]

2672.5

4211.6

Lb. rhamnosus CCM 1825

5889.8

7578.3

8425.6 * 1825\0_M18\1\1slin, "Baseline subt."

5352.0 2673.1

0

2000

3000

4000

Lb. rhamnosus CCM 1825

5891.1

4223.1

5000

9394.7

Lb_rhamnosus_CCM_1825_MRS_eth_091202\0_D11\1\1s lin

5351.2

4000 2000 0 x104 2

8413.3

6000

7579.7

7000

8427.0

8000

9000

10000

11000

m/z

Obrázek 7: Test vlivu zamražení vzorku, použitá matrice HCCA dle společnosti Bruker (modré spektrum-čerstvý extrakt vzorku, červené spektrum-vzorky po půlročním zmražení)

4.1.3 Test vlivu intenzity laseru a koncentrace vzorku na získaná spektra Na obrázku 8, který zobrazuje spektra získaná při použití různých intenzit laseru (38 %, 40 %, 43 %), lze vidět, že intenzita laseru má vliv pouze na intenzitu signálů. Nebyly získány žádné jiné signály v oblasti molekulových hmotností v rozpětí 2 000 10 000 Da ani v oblasti vyšších molekulových hmotností. Počet píků zůstal tedy zachován.

28

Dendrogram na obrázku 9 ukazuje výsledné seskupení vzorků do větví. Lactobacillus

casei

CCM

7089

byl

zařazen

do

podvětve

se

zástupci

Lactobacillus paracasei. Ostatní kmeny byly seskupeny do správných podvětví. Ředěné vzorky i vzorky, na kterých byla testována intenzita laseru, byly blízce seskupeny.

A

B

C

Obrázek 8: Spektrum Lactobacillus casei při změně intenzity laseru Intenzita dusíkového laseru: A: 38 % laseru, B: 40 % laseru, C: 43 % laseru

Obrázek 9: Vliv výkonu laseru a koncentrace extraktů na zařazení zástupců rodu Lactobacillus

29

4.1.4 Vliv změny poměrů vody a organické složky v roztoku matrice Automatickým sběrem dat se nepodařilo získat data ze vzorků s poměrem vody a ACN 1:3, jelikož vzorek zasychal na okrajích terčíku. Bylo tedy nutno použít manuální sběr dat. U poměru 3:1 (aq:org) nebyl dostatek míst ve vzorku poskytujících signál pro vytvoření spektra ani při manuálním sběru. Vyhodnocení signálů ze vzorku Lactobacillus casei CCM 7089 bylo provedeno na základě intenzit signálů získaných akumulací spekter z každé z pěti jamek. Získaná spektra lze vidět na obrázku 10. Srovnání poměrů intenzit tří významných píků v různých oblastech m/z nám umožnilo zjistit vliv změny množství vodné a organické fáze na relativní intenzitu signálů proteinů s vyšší molekulovou hmotností. Vybrali jsme píky o molekulové hmotnosti 9395, 5890 a 3624 Da, výsledky jsou zobrazeny v grafech 1-3. Pro potvrzení vlivu jsme použili test jednofaktorová ANOVA (ANalysis Of VAriance). Z důvodů nízké kvality dat u poměru 3:1 byly výsledky získány s velkou relativní chybou. V případě ani jednoho z testovaných poměrů vodné a organické fáze nebyly pozorovány nové píky v oblasti molekulové hmotnosti nad 10 kDa.

2:1

1,5:1

1:1

1:1,5

1:2

1:3

Graf 1: poměr intenzit píků 9395/5890 osa x: použitý poměr vodné a organické fáze v roztoku matrice osa y: poměr intenzit daných píků

30

2:1

1,5:1

1:1

1:1,5

1:2

1:3


2:1

1,5:1

1:1

1:1,5

1:2

1:3


31

Intens. [a.u.]

x104 2

Intens. [a.u.]

Intens. [a.u.]

0 x104 4 2 0 x104 2

3497 3853 2738 3143

4696

3497 3853 2738 3143

Intens. [a.u.]

8414

9393

1:1

5890 6805

7582

8413

9394 1 2\0_M16\2\1slin

5351

1:2

3497 3853 5890

2738 3143

7583

4447

8415

9395 1 3\0_C16\2\1slin

5351 3497 3853 2738 3143

Intens. [a.u.]

1:3

5890 7578

4447

8414

9394 1,5 1\0_E20\2\1slin

5351 3495 3853

0 x104 2 Intens. [a.u.]

7582

1 1\0_M20\1\1slin

4447

2738 3143

1,5:1

5890 4447

6805

7581

8413

9393 2 1\0_J22\2\1slin

5351 3496 3853 2738 3143

Intens. [a.u.]

2000

6805 5351

0 x104 1

0 6000 4000 2000 0

1:1,5

5890 4203

0 x104 2

1 1,5\0_B20\2\1slin

5351

2:1

5890

4447

6805

7581

8413

9394 3 1\0_D22\1\1SLin

5351 3496 3853 2738 3082

5890 4447

4000

3:1

6804

4992

6000

7581

8413

8000

9391

10000

12000

14000

m/z

Obrázek 10: Změna poměru vodné a organické fáze v roztoku matrice u Lb. casei CCM 7088 (příslušný poměr mezi vodnou a organické fázi vyjádřen čísly vpravo)

32

Intens. [a.u.]

x104 4

Intens. [a.u.]

2 0 x104

2672

3143

3624 3981

4448

5890

4993

6805 7203 7579

8341

9394 L.casei 2\0_J20\1\1slin

Lb. casei 2

2 3625 3981

Intens. [a.u.]

0 x104 2

4448

6805

7582

8412

9395 L.casei 3\0_K20\1\1slin

5351

2739 3144

3625 3982

4448

Intens. [a.u.]

Lb. casei 3

5890 6805

4993

7581

8414

9393 L.casei 4\0_L21\2\1slin

5352 3498 3853

0.5

2739 3144

2739 3144

3625 3982

0 x104 2 Intens. [a.u.]

7583

8413

9395 L.casei 5\0_M20\1\1slin

5352

2

4448

Lb. casei 5

5890

6805

7582

8413

9394 L.casei 6\0_N20\1\1slin

5351

2672

3625

Lb. casei 6

4203 4698

3143

0 x104 2

2000

5890

4696

0.0 x104

1

Lb. casei 4

4203

2281

0

5890

4993

0 x104

Intens. [a.u.]

Lb. casei 1

5351

2738 3082

Intens. [a.u.]

L.casei 1\0_I20\1\1slin

5351

5890

6805 7208 7583

8413

9394 * L.casei 7\0_O20\2\1slin

5348

Lb. casei 7

3622 3979 3080

4000

6000

8000

10000

12000

14000

m/z

Obrázek 11: Změna poměru H2O a ACN v extrakčním rozpouštědle (jednotlivé poměry jsou uvedeny v tabulce 5)

33

4.1.5. Test vlivu změny poměru vody a acetonitrilu v rozpouštědle pro extrakci proteinů Jak lze vidět na obrázku 11, složení rozpouštědla, pokud jde o množství vody a acetonitrilu, nemá na výsledné spektrum příliš jednoznačný vliv, ač na základě testu ANOVA byl tento vliv zhodnocen jako signifikantní. Neobjevují se žádné nové signály v oblasti molekulových hmotností od 2 do 10 kDa ani v oblasti vyšších hmot. Srovnání poměrů intenzit píků o molekulové hmotnosti 9395, 5890 a 3624 Da, jsou zobrazeny v grafech 4-6. Z důvodu absence či nízké kvality signálů v oblasti molekulových hmotností nad 6 kDa nebylo možné u vzorku 7 provést výpočet sledovaných poměrů intenzit.

Graf 4: poměr intenzit píků 9395/5890 osa x: číslo vzorku, složení extrakčního rozpouštědla viz tabulka 3 osa y: poměr intenzit daných píků

34

Graf 5: poměr intenzit píků 9395/3624 osa x: číslo vzorku, složení extrakčního rozpouštědla viz tabulka 3 osa y: poměr intenzit daných píků

Graf 6: poměr intenzit píků 5890/3624 osa x: číslo vzorku, složení rozpouštědla viz tabulka 3 osa y: poměr intenzit daných píků

4.1.6. Testování různých druhů matric pro získání kvalitních signálů s ohledem na detekci látek s vyšší molekulovou hmotností Kvalitní hmotnostní spektrum získané automatickým sběrem dat poskytly pouze vzorky analyzované pomocí matrice HCCA, použití ostatních matric vyžadovalo ruční analýzu. Na získané výsledky měla vliv i metoda nanesení vzorku a matrice. Metoda „Drieddroplet“, která by měla být vhodnější pro získání vysokomolekulárních signálů, obecně vyžadovala vyšší intenzitu laseru pro získání signálu a u matrice SA a DHB se nepodařilo 35

získat dostatek míst poskytujících signál k uskutečnění identifikace. Vzorky nanesené s matricí SA nebylo možno analyzovat ani při použití metody nanesení „Bottom-layer“. Hmotnostní spektra s použitím matrice HCCA při nanesení metodami „Bottom-layer“ i „Dried-droplet“ jsou velmi podobná. Přehled výsledných hmotnostních spekter je na Intens. [a.u.]

obrázku 12. 5352

8000

DHB 1 - 2\0_J3\1\1SLin

DHB „bottom-layer“

6000 4000

3854

2000 Intens. [a.u.]

5891

4204 2739

6951 7578

4992

0

8413

9394

5352

fer 1 - 2\0_K3\4\1SLin

FerA „bottom-layer“

8000 6000 3854

4000 3082

2000

5891

4447

6951

Intens. [a.u.]

0 x104

7590

9394

5351

Hcca1\0_M2\1\1slin

HCCA „bottom-layer“

1.00 0.75 3853

0.50

2672

0.25

4697

5890

3306

Intens. [a.u.]

0.00 x104 1.00

9395

7579 6806

4992

8342

5351

5\0_I7\1\1SLin HCCA „dried-droplet“

4202

0.75

5890

0.50

3852 2738

0.25

9393

7580

4696 6804

4991

8345 10040

0.00 2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

m/z

Obrázek 12: Hmotnostní spektrum Lb. casei CCM 7088 při použití různých typů matrice

4.1.7. Ověření použitelnosti metod, které dle studií vedou detekci látek vyššími molekulovými hmotnostmi Detekce vysokomolekulárních látek v hmotnostním spektru bylo dosaženo pomocí metod dle Nilssona (1999), Madonny (2000) a Meetaniho (2005). Jak lze pozorovat na obrázku 13, u Nilssonovy metody byl nalezen pík látky s molekulovou hmotností 16368 Da. U Madonny a Meetaniho byly nalezeny píky v oblasti až 50 kDa.

36

Matrice HCCA připravená dle Meetaniho poskytla pouze látky nízkomolekulárních látek do 10 kDa. Na obrázku 15 lze vidět spektra získaná analýzou celých buněk a extraktu. U žádné ze zkoumaných metod nebylo možno využít automatické analýzy, všechna data bylo nutno získat ručně. U metod dle Nilssona a Meetaniho byly píky detekovatelné s obtížemi, bylo časově poměrně náročné nalézt místa na terčíku poskytující signály s vhodným poměrem signál/šum. U metody dle Madonny bylo možné sledovat nárůst bílých krystalků po zaschnutí vzorků a matrice. Při zasažení těchto krystalů pulsem laseru bylo vždy získáno mnoho signálů v oblastech nízkých i vysokých molekulových hmotností. U metody dle Chonga (1997) při použití matrice FerA nebylo možno získat žádné signály ani při ručním sběru dat. Vzorek s matricí na MALDI desce velmi špatně zasychal, neobjevovaly se žádné krystaly ani jiné útvary poskytující signály. Vznikla bílá hmota, která se koncentrovala po obvodu jamek na destičce, neposkytovala žádné signály, pouze šum. Při použití matrice HCCA se podařilo získat hmotnostní spektra, ale píky v oblasti vyšších molekulových hmotností neobsahovala. Metoda dle Ruelle s matricí HCCA poskytovala nízkomolekulární signály poměrně dobře, u vzorků převrstvených etanolem byly pozorovány jiné píky než u vzorků bez etanolu, jak lze vidět na obrázku 14. Pro

porovnání

jsme

k metodám

zkoumaným

s ohledem

na

získání

vysokomolekulárních signálů přidali i metodu běžně používanou a doporučovanou společností Bruker s matricí HCCA. Tato metoda poskytuje bohaté spektrum signálů v oblasti nižších molekulových hmotností. Jako jediná je tato metoda vhodná pro automatický sběr dat. Přehled výsledných hmotnostních spekter všech těchto zkoumaných metod je uveden na obrázku 13.

37

Intens. [a.u.]

Chong_HCCA

7202

2000

3274 4550

0 x104

Intens. [a.u.]

l_casei chong hcca 1lyzat\0_F14\1\1SLin

5351

4000

9392 8409

l_casei meetani hcca cele b\0_B14\1\1SLin

5351

2

Meetani_HCCA

7202 9392

3853 Intens. [a.u.]

0 x104

Intens. [a.u.]

2 1 0 x104 2 1

2644

Intens. [a.u.] Intens. [a.u.]

0.0 x104 1.0 0.5

Nilsson_FerA

7224

4217

9282

6144

16370 ruelle lb.c.bez et.\0_N22\1\1SLin

5355

Ruelle_HCCA

3856 9401

6796

2815

0 x104 1.0 0.5

nilsson lb.c.\0_L22\1\1SLin

8433

Hcca1\0_M2\1\1slin

5351

Bruker_HCCA

3853 7579

4203

9395

madonna ext high mass vetsi detekce\1_L17\1\1SLin

7228

Madonna_FerA

8412 10037 3274

5352

12481 11411 14165

16335

18323

21703 23430

25764

35308

43372

46727

49076

0.0 5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

m/z

Obrázek 13: Přehled hmotnostních spekter Lb. casei CCM 7088 při použití metod s ohledem na detekci vysokomolekulárních iontů látek za použití matric HCCA a FerA

38

Intens. [a.u.]

x104

* ruelle lb.c.bez et.\0_N22\1\1SLin, Smoothed, "Baseline subt."

5355

bez etanolu

2.0 1.5

3856

1.0 4206

0.5

5893

9401 6796

2418

7584

2815

Intens. [a.u.]

0.0 x104 1.2

* ruelle lb.c.s et.\0_M23\1\1SLin, Sm oothed, "Baseline subt."

s etanolem

1.0 3485

0.8 3183

0.6 0.4

5392 4330 2942

0.2

9399

11374

12826

0.0 2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

m/z

Intens. [a.u.]

Obrázek 14: Hmotnostní spektrum Lb. casei CCM 7088 dle Ruelle 7386

* l_casei meetani fera cele b\0_C14\1\1SLin, Smoothed, "Baseline subt."

celé buňky

5000 4000 3000 5355

2000

9256 3279

1000 23426

46715

35197

Intens. [a.u.]

0 * l_casei meetani fera roztok b\0_E15\3\1SLin, Smoothed, "Baseline subt."

5354

buněčný extrakt

800 600 3339

400 200

46794

0 -200 10000

20000

30000

40000

50000

60000

m/z

Obrázek 15: Hmotnostní spektra Lb. casei CCM 7088 analyzovaného metodou dle Meetaniho s matricí FerA

39

4.1.8. Modifikace metody dle Madonny a kol. 2000 Výsledky změn koncentrace FerA Matrice byla připravena dle tabulky č. 4. Žádná z použitých koncentrací, včetně nasyceného roztoku k. ferulové, neznemožnila detekci kvalitních signálů širokého spektra molekulových hmotností automatickým sběrem dat (obrázek 17).

Výsledky změn poměru ACN a H2O v základním roztoku pro matrici dle Madonny Matrice byla připravena dle tabulky č. 5. Kvalitní hmotnostní spektra s detekcí vysokomolekulárních látek byla u všech užitých poměrů ACN:H2O (obrázek 18), u poměru 15:68 nebyla FerA zcela rozpuštěna, ale na výsledné spektrum to však nemělo vliv. Pouze u extrémního poměru ACN:H2O (50:33) nebylo možno získat dostatek dat pro zhotovení spektra. Změna poměru FA a H2O v základním roztoku matrice dle Madonny Matrice byla připravena podle tabulky č. 6. Při poměru FA:H2O (1:66) byl po vysušení vzorku a matrice pozorován vznik „bílých keříčků“, které poskytovaly pouze nízkomolekulární signály. Poměr FA:H2O (5:62) přinesl výskyt ojedinělých špičatých krystalků „jehliček“, které vydávaly signál vysokomolekulárních látek. Ve větší míře se vedle „jehliček“ vytvořily útvary podobné trávě, které neposkytovaly žádné signály. Další poměry FA:H2O (12:55) a (17:50) poskytly jehličkovité krystalky téměř po celé ploše terčíku. Získání kvalitních spekter nebylo tedy obtížné. Zbylé dva zkoumané poměry FA:H2O (25:42) a (40:27) nebyly pro získání dat pro vytvoření spektra vhodné. Krystaly se nevytvořily a vyskytující se bílá hmota neposkytovala signály.

Shrnutí výsledných

hmotnostních spekter lze nalézt na obrázku 19.

Sledování vlivu použití FA či TFA v základním roztoku matrice dle Madonny Vliv použití FA či TFA na výsledné hmotnostní spektrum nebyl zaznamenán. Obě metody přípravy roztoku matrice přinesly spektra bohatá na nízkomolekulární i vysokomolekulární píky.

Sledování vlivu analýzy celých buněk a buněčného extraktu Metoda dle Madonny poskytuje stejná hmotnostní spektra při použití celých buněk i buněčných extraktů. Detekce vysokomolekulárních látek tím také není ovlivněna (obrázek 16).

40

Intens. [a.u.]

12478

* madonna bunk high mass vetsi detekce\0_N15\1\1SLin 25757

celé buňky

600

8377 14167

46750

18314

400 4207

35304

23443 16348

200

Intens. [a.u.]

0 7233

* madonna ext high mass vetsi detekce\1_L15\1\1SLin

buněčný extrakt

2000 1500

4204 9398

1000 12487 46776

500

14175

25773

18299

35346

0 5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000 40000

45000

m/z

Intens. [a.u.]

Obrázek 16: Hmotnostní spektrum Lb. casei CCM 7088, metoda dle Madonny, analýza celých buněk a buněčného extraktu

Intens. [a.u.]

1000

12,5 mg/ml

4203 8412 12484

5364

36547

25761

0

16,5 mg/ml

8385

12483

25766

35298

46771

* L.casei 20mg\0_F3\1\1SLin, "Baseline subt.", Smoothed

7229

20 mg/ml (nasycený roztok)

8413 12484 17721

5357

21744

8412

12482

18308

5000

46784

35333

25746

* L.casei 8_5mg\1_B3\1\1SLin, "Bas eline subt.", Smoothed

7233

4204

46755

5 mg/ml

5354

0

43320

* L.casei 5mg\0_B2\1\1SLin, "Baseline subt.", Smoothed

7232 4205

36567

25766

0

4000 2000 0

46746

* L.casei 16.5mg\0_E4\1\1SLin, "Bas eline subt.", Smoothed

4206

2000

43273

4205

2000 Intens. [a.u.]

21720

7235

5354

Intens. [a.u.]

17719

0

2000 Intens. [a.u.]

* L.casei 12.5mg\0_D2\1\1SLin, "Baseline subt.", Smoothed

7228

2000

8,5mg/ml

8410

12481

10000

15000

18311

20000

25755

25000

35325

30000

35000

43336

40000

46777

45000

50000

m/z

Obrázek 17: Hmotnostní spektrum Lb. casei CCM 7088, roztok matrice s různými koncentracemi k. ferulové Použitá koncentrace k. ferulové je uvedena vpravo nad každým spektrem, červeně vyznačen postup dle Madonny

41

Intens. [a.u.]

7228

2000


33:50

4203 8412

1000

12484 17719

Intens. [a.u.]

5364

21720

36547

25761

43273 46746

0 * L.casei 15acn\0_H3\1\1SLin, "Baseline subt.", Smoothed

7233

2000 1000

15:68

8412 4205

9252 12480

17705

5892 Intens. [a.u.]

0 2000

21329

46768

35313

25750

49062

* L.casei 25acn\1_I3\1\1SLin, "Baseline subt.", Smoothed

7228

25:58

4203 8410

1000 Intens. [a.u.]

0 6000 4000 2000

12484

5888

14156

17692

35291

25749

7232

43597

46726

* L.casei 40acn\0_K2\1\1SLin, "Baseline subt.", Smoothed

40:43

8413 4203

9397 12483

5351

17722

25755

35334

43310 46792

0 10000

20000

30000

40000

50000

m/z

Intens. [a.u.]

Obrázek 18: Hmotnostní spektra Lb. casei CCM 7088, matrice FerA, změna poměrů ACN a H2O Vpravo nad spektry vyznačen použitý poměr ACN:H2O, červeně vyznačen postup dle Madonny 7228

2000


17:50

4203 8412

1000

12484 17719

Intens. [a.u.]

5364

36547

25761

43273 46746

0 4204

* L.casei 12FA\0_O2\1\1SLin, "Baseline subt.", Smoothed

12:55

7225 10041

2000

12482

5888

Intens. [a.u.]

21720

14163

17720

35328

25754

43307

46789

0 5365

* L.casei 1FA\0_M2\1\1SLin, "Baseline subt.", Smoothed

1:66

4201

5000

3863

7599 11237

Intens. [a.u.]

0 6000 4000 2000

4204 5354

* L.casei 5FA\1_M2\1\1SLin, "Baseline subt.", Smoothed

5:62

9398 12482

16337

25769

0 10000

20000

30000

40000

50000

m/z

Obrázek 19: Hmotnostní spektrum Lb. casei CCM 7088, matrice FerA, změna poměrů FA a H2O Vpravo nad spektry je uveden poměr FA a H2O, červeně vyznačen postup dle Madonny

42

4.1.9. Analýza laktobacilů s použitím matrice HCCA dle společnosti Bruker a FerA dle Madonny Hmotnostní spektra byla zpracována pomocí softwaru Biotyper, který vytvořil přehledné dendrogramy. Metoda s matricí HCCA nezařadila kmeny Lb. rhamnosus VFU 99 a Lb. rhamnosus VFU 148 k ostatním zástupcům druhu Lb. rhamnosus. Kmen Lb. paracasei VFU 56 byl zařazen do větve se zástupci rodu Lb. rhamnosus. Výsledný dendrogram je uveden na obrázku 20. Metoda dle Madonny seskupila všechny zkoumané vzorky rodu Lb. paracasei do jedné větve a zástupce rodu Lb. rhamnosus do druhé větve, jak lze vidět na obrázku 21. Počet píků opakovaných 100%, 75% a 50% pro každou z matric je uveden v tabulce 7. Metoda s matricí HCCA vykazuje více 100% se opakujících píků, má tedy lepší opakovatelnost. V tabulce 8 je uveden přehled píků konkrétních kmenů. Přehled druhově specifických a druhově společných píků jsou uvedeny v tabulce 9, druhově specifické píky druhu Lb. rhamnosus a druhu Lb. paracasei byly nalezeny vzájemným porovnáním jejich hmotnostních spekter. Na obrázku 22 je pro ilustraci ukázán výsek spektra Lb. paracasei a Lb. rhamnosus.

Obrázek 20: Dendrogram při použití matrice HCCA dle společnosti Bruker

43

Obrázek 21: Dendrogram při použití matrice FerA dle Madonny

Tabulka 7: Přehled opakovatelnosti metod Počet opakovaných píků ve všech měřeních Vzorek s matricí HCCA Celkový počet 100% nad 75% Lb. paracasei VFU 110 94 61 21 Lb. paracasei VFU 111 94 64 19 Lb. paracasei VFU 160 92 61 13 Lb. rhamnosus VFU 148 88 50 19 Lb. rhamnosus VFU 22 92 62 17 Lb. rhamnosus VFU 32 92 67 12 Počet opakovaných píků ve všech měřeních Vzorek s matricí FerA Celkový počet 100% nad 75% Lb. paracasei VFU 110 90 54 22 Lb. paracasei VFU 111 97 58 19 Lb. paracasei VFU 160 97 51 21 Lb. rhamnosus VFU 148 65 24 14 Lb. rhamnosus VFU 22 85 46 15 Lb. rhamnosus VFU 32 97 57 26

nad 50% 12 11 18 19 13 13 nad 50% 14 20 25 27 24 14

44

Tabulka 8: Vlastní a společné píky kmenů rodu Lb. paracasei a Lb. rhamnosus Vzorek

Celkový počet píků

Společné píky

Rozdílové píky 59

Lb. paracasei VFU 110 HCCA

94

Lb. paracasei VFU 110 FerA

90

55


94

59


97


92


97

70

Lb. rhamnosus VFU 148 HCCA

88

74

Lb. rhamnosus VFU 148 FerA

65


92


85

54


92

52


97

35 35

62 65

27 14

51 61

31 40

57

Intens. [a.u.]

Tabulka 9: Přehled druhově specifických a druhově společných píků Druhově specifické píky Druhově společné píky Vzorek HCCA FerA HCCA FerA Lb. rhamnosus 13 12 33 34 Lb. paracasei 27 25 59 56 x104

1.5

1.0 3406.4

2646.7

3480.1

3737.6 2942.2

0.5 3217.6

3306.9

0.0 2600

2800

3000

3200

3400

3600

3800

m/z

Obrázek 22: Výsek hmotnostních spekter Lb. rhamnosus VFU 32 (červené spektrum) a Lb .paracasei VFU 110 (modré spektrum), hvězdičkou označené specifické píky

Pro zjištění kvality signálu a přesnosti pro obě metody byly vybrány 3 píky zastupující molekulové hmotnosti, které se vyskytují při použití obou matric - 5300, 7480 a 9394 Da. Pro metodu s matricí FerA byl přidán pík 12381 Da. Jako modelová byla vybrána spektra Lactobacillus paracasei VFU 111. 45

Kvalita signálu byla zjištěna pomocí hmotnostního rozlišení daných píků. Pro zjištění přesnosti metody bylo využito směrodatné odchylky molekulových hmotností. Všechna data byla získána z 9 opakovaných měření, hodnoty rozlišení i molekulové hmotnosti byly odečteny pomocí softwaru FlexAnalysis. Přehled výsledků pro zjištění přesnosti metody je uveden v tabulce 10. Tabulka 10: Přehled směrodatných odchylek pro zjištění přesnosti a kvality signálu metod (matrice HCCA byla připravena dle návodu firmy Bruker, matrice FerA byla připravena dle metody Madonny a kol. 2000) Přesnost

Směrodatná odchylka určení m/z daných píků [Da] 5300 Da

7480 Da

9394 Da

12381 Da

HCCA

0,07

0,15

0,25

FerA Rozlišení signálu

0,23

0,18

0,32

Směrodatná odchylka určení rozlišení daných píků

HCCA

10.58

15.00

10.21

FerA

33.91

22.65

54.80

1,03

91.55

Velikost rozlišení daných píků HCCA

537.77

657.11

601,00

FerA

827.11

977.67

1069.67

1090.89

Metoda dle Madonny s FerA poskytuje průměrné rozlišení u daných píků hodnotu 999. Metoda s matricí HCCA připravená dle společnosti má průměrnou hodnotu rozlišení 598. Metodu dle Madonny a Brukera jsme testovali i na jiných laktobacilech. Potvrdily se výsledky získané u rodů Lb. rhamnosus a Lb. paracasei. Metoda dle Madonny poskytovala bohatá hmotnostní spektra v oblasti nižších i vysokých molekulových hmotností. Ilustrační spektra lze nalézt na obrázku 23.

46

Intens. [a.u.]

x104 2

6498.1 9187.2

Intens. [a.u.] Intens. [a.u.]

Lb. johnsonii CCM 2935_HCCA

3411.6

0 6000 4000 2000 0 x104

* Lactobacillus johnsonii 2935\0_M3\5\1SLin, "Baseline subt.", Smoothed

5186.2

4075

Lb. johnsonii CCM 4382_FerA

9583

6160

36085

46796 * Lb. amylovorus 4382 hcca\0_N2\5\1SLin, "Baseline subt.", Smoothed

Lb. amylovorus CCM 4382_HCCA

1.0 9333.7

0.5

0.0 x104

* Lactobacillus amylovorus 4382 madonna\0_G10\1\1SLin, "Baseline subt.", Smoothed

8169

6556

Lb. amylovorus CCM 4382_FerA

9309

3797 Intens. [a.u.]

17673

6783.7

0.0 x104

12335

15433

18244

21213

25475

28536

49196

32848

1.0

52048

* Lb. gasseri 7781 hcca\0_M3\1\1SLin, "Baseline subt.", Smoothed

5186.1

Lb. gasseri CCM 7781_HCCA

6799.2

0.5

9172.9

0.0 x104

Intens. [a.u.]

12315

4406.8

0.5 Intens. [a.u.]

* Lactobacillus johnsonii 2935 madonna\0_M8\3\1SLin, "Baseline subt.", Smoothed

7234

* Lactobacillus gasseri 7781 madonna\0_L6\5\1SLin, "Baseline subt.", Smoothed

7292

Lb. gasseri CCM 7781_FerA

0.5 3646

6056

9559

12318

38150

0.0 10000

20000

30000

40000

50000

60000

m/z

Obrázek 23: Přehled hmotnostních spekter různých druhů laktobacilů

47

5. Diskuse MALDI-TOF MS profilování bakterií při standardním protokolu přípravy umožňuje rychlé zařazení většiny vzorků na úrovni druhu a podruhu. Problém nastává při analýze některých blízce příbuzných druhů, které někdy nebývají na základě výstupů správně diferencovány. Proto je rozvoj alternativních protokolů přípravy vzorků, které umožní detekci druhově specifických signálů, nutný. Podle některých studií se předpokládá, že píky z oblastí vyšších molekulových hmotností pomohou lépe rozlišit testované kultury, protože jsou charakteristické pouze pro určitý bakteriální kmen (Lay, 2001). Při optimalizaci metody jsme se zaměřili především na tuto problematiku. Testovali jsme, zda je charakter hmotnostního spektra ovlivněn intenzitou laseru, či koncentrací vzorku. Výsledky potvrdily, že různá koncentrace vzorku ani změna výkonu laseru, kterou jsme testovali u typových kultur, nevedla ke změně pozice vzorku v dendrogramu (obrázek 9), vše se seskupilo v odvětvích na základě příslušnosti ke kmenům. Toto zjištění bylo významné z důvodu srovnávatelnosti dalších výstupů, protože intenzitu laseru ani koncentraci extraktu nebylo možné za daných okolností nastavit vždy na stejnou hodnotu. Ukázalo se však, že typová kultura Lactobacillus casei CCM 7089 se řadí k zástupcům druhu Lactobacillus paracasei. Potvrdilo se tedy, že na základě MALDITOF MS dat při použití obvyklého protokolu, tzn. analýzy pomocí matrice HCCA, nelze tyto druhy spolehlivě rozlišit. Výsledky stability zamražených vzorků testovaných kultur ukázaly, že extrahované buňky je možno uchovávat nejméně půl roku v mrazicím boxu při -20°C bez následků na kvalitu hmotnostního spektra. Analýzu tedy lze provést bez ohledu na datum kultivace vzorků, což poskytuje možnost analýzu opakovat či srovnávat s později izolovanými kmeny. V praxi se však většinou využívá právě možnosti rychlé analýzy čerstvě nakultivovaných vzorků. Při testování vlivu změny poměrů vody a organické složky (ACN) v roztoku matrice se podle výsledků testu ANOVY ukázalo, že změna zastoupení vodné a organické složky hraje roli ve změně relativní intenzity signálů. Jak lze vidět na grafech 1, 2, 3, tento vliv není výrazný či nenaznačuje jednoznačný trend využitelný k modifikaci standardní metody přípravy vzorku, která by usnadnila detekci látek s vyšší molekulovou hmotností. Také změny poměru vody a acetonitrilu v rozpouštědle pro extrakci proteinů nevykázaly jednoznačný vliv. Počet píků zůstal zachován a podle výsledků ANOVY testu 48

má sice změna poměru vody a acetonitrilu signifikantní vliv, ale na grafech 4, 5, 6 nelze pozorovat žádný jednoznačný trend. První sada testovaných pro MALDI-TOF MS analýzu nejčastěji používaných matric DHB, FerA, HCCA, SA potvrdila, že každá matrice poskytuje trochu odlišné hmotnostní spektrum. V tomto testu byl navíc sledován vliv nanesení vzorků na MALDI desku. Jak lze vidět na obrázku 12, žádná ze sledovaných matric nepřinesla nové píky z oblastí vysokých molekulových hmotností. Navíc je zde vidět, že na výsledném spektru s HCCA matricí nelze pozorovat změny v hmotnostním spektru způsobené použitím odlišné metody nanesení vzorku a matrice. U metody s matricí SA se z MALDI MS nepodařilo získat kvalitní hmotnostní spektra. Vzorek sice poskytoval signály, ale s nízkou intenzitou a pouze v omezeném počtu míst na terčíku. Větší pozornost byla věnována především postupům, které by dle některých publikací měly poskytnout hmotnostní spektra s detekcí vysokomolekulárních látek (Nilsson, 1999; Madonna, 2000; Meetani, 2005; Chong, 1997; Ruelle, 2004). V souladu s uvedenými publikacemi bylo ověřeno, že byly nalezeny píky v oblastech vysokých molekulových hmotností u metod dle Nilssona, Madonny a Meetaniho, vždy při použití matrice FerA. V Meetaniho publikaci je sledován především vliv surfaktantu, který přinesl zlepšení detekce vysokomolekulárních hmotností. Dosáhl jich i při použití matrice HCCA, ale nejlepší výsledky zaznamenal při použití matrice FerA. Po přidání surfaktantu vykázal detekci látek s molekulovou hmotností vyšší než 15 kDa. Naše experimenty prokázaly výskyt vysokomolekulárních látek pouze při použití matrice FerA. Signály byly ovšem velmi těžce detekovatelné. Použití matrice HCCA přineslo pouze signály z oblasti hmotností nízkomolekulárních. Je možné, že výsledky ovlivnila odlišná příprava vzorků, použité materiály (dodavatel chemikálií, materiál MALDI desky) či přístroj. Při použití FerA jsme také testovali analýzu celých buněk a extraktu. Srovnání spekter lze vidět na obrázku 15. V Nilssonově studii (1999) je popsán experiment využívající MALDI-TOF MS pro identifikaci druhu Helicobacter pylori. V této studii Nilsson pokládá spektrum v oblastech 15-40 kDa za velmi důležité právě při studiích H. pylori, jelikož předpokládá, že velké množství proteinů a antigenů spojených s virulencí se nalézá právě v této oblasti. Naše výsledky potvrdily přítomnost píku v oblasti 16368 Da, jeho detekce byla ovšem obdobně obtížná jako u metody dle Meetaniho.

49

Chong dokonce zaznamenal detekci signálů v rozsahu 25 až 500 kDa z lyzátu buněk Escherichia coli DH5α. Pomocí guanidin hydrochloridu a Tritonu X-100 narušil a rozpustil vnitřní membránové proteiny. Nejlepší výsledky mu poskytla matrice HCCA. Při testování této metody jsme zopakovali postup s matricí HCCA a navíc jsme přidali pokus s matricí FerA. Naše analýza ukázala, že matrice FerA neumožnila získat žádné analyzovatelné signály. Vzorek velmi špatně zasychal a detekován byl pouze šum. Při použití matrice HCCA se sice podařilo detekovat signály a získat hmotnostní spektrum, ale tyto signály nepocházely z oblasti nad 10 kDa i při opakování pokusu. Srovnávat naše dosažené výsledky s výsledky Chonga je poněkud složité, jelikož v jeho publikaci u dosažených spekter není popsána intenzita signálu, vysokomolekulární signály prezentované v této práci jsou navíc na hranici šumu. V experimentu podle Ruelle byly analyzovány bakterie izolované z odpadních vod. Použitím matrice HCCA a rozpouštědla ACN/isopropanol/0.1% TFA dosáhla autorka zvýšení detekce vysokomolekulárních látek (nad 10 kDa), které při použití rozpouštědla TFA/ACN nalezeny nebyly. Nám se tento postup bohužel nepotvrdil a matrice HCCA poskytovala nízkomolekulární spektrum v případě obou rozpouštědel. Ruelle dále testovala vliv etanolu, který zvýšil extrakci proteinu a podpořil homogenní rozložení směsi na MALDI destičce. V našem experimentu pokus s etanolem nepotvrdil tyto výsledky. Hmotnostní spektrum získané ze vzorku s etanolem vykazovalo odlišné píky než analýza bez etanolu. Etanol ovlivnil spektrum spíše negativním způsobem. Experimenty provedené Madonnou prokazují schopnost matrice FerA detekovat vysokomolekulární látky. Madonna udává, že schopnost FerA ionizovat látky je méně náchylná na poměr směsi rozpouštědla, matrice je tolerantní vůči solím a surfaktantům, a umožňuje analýzu širokého spektra vzorků. Madonna uvádí protokol přípravy pro nalezení vysokomolekulárních hmotnostních signálů (až 75 kDa). Jako nejvhodnější organické rozpouštědlo označil acetonitril, který jednoznačně poskytl vyšší kvalitu spektra než aceton či isopropanol. Převrstvením vzorku 40% etanolem docílil zlepšení homogenity směsi buněk a matrice. Empiricky nastavil jako nejvhodnější koncentraci FerA 12,5 mg/ml základního roztoku FA:ACN:H2O (17:33:50). Matrice po zaschnutí vytvářela krystalky ve tvaru jehliček, na které se analyzované buňky přichytily. Tyto jehličky poskytovaly signály. Protokol přípravy analýzy dle Madonny s matricí FerA se ukázal pro naše potřeby nejvhodnějším. Data bylo možné získat ručně bez větších problémů a detekovány byly

50

vysokomolekulární látky. S cílem zlepšit parametry spekter a dosáhnout možnosti automatizovaného sběru dat byly měněny dílčí parametry metody. Použitá koncentrace FA v základním roztoku matrice měla na výsledné hmotnostní spektrum největší vliv ze všech zkoumaných vlivů. Podle získaných výsledků FA ovlivňuje krystalizaci matrice, jelikož změny v množství FA vedou k tvorbě krystalů různých tvarů a následně i odlišné množství signálů potřebných pro vytvoření hmotnostních spekter. Z experimentu analýzy celých buněk a buněčného extraktu vyplynulo, že spektra obou metod jsou srovnatelná a detekce vysokomolekulárních látek zůstala zachována. Metoda je tedy z hlediska jednoduché a rychlé proveditelnosti vhodná pro použití v klinické

mikrobiologii.

V případě

nejednoznačnosti

identifikace

po

provedení

standardního postupu lze jednoduchou změnou v konečné fázi přípravy vzorku získat výrazně odlišná MALDI-TOF hmotnostní spektra obsahujících celou řadu nových, potenciálně specifických signálů. Porovnání vlivů změn doporučeného složení matrice přineslo poznání, že takto přichystaná matrice je velmi vhodná pro získání kvalitních hmotnostních spekter obsahujících píky v oblastech nižších a vyšších molekulových hmotností (až do 50 kDa). Drobné změny složení však příliš výsledné hmotnostní spektrum nemění. Metoda je tedy robustní a případné drobné odchylky v přípravě matrice nebrání správné analýze vzorku. Větší odchýlení od protokolu přípravy však většinou zcela znemožnilo detekci signálu. Žádný z pokusů nepřinesl možnost automatizace metody, matrice se vzorkem většinou po zaschnutí vytvořila nehomogenní krystalky ve tvaru jehliček, poskytující signály, které bylo nutno vyhledat ručně. V případech většího odchýlení od protokolu nebyly jehlicovité krystalky vytvořeny a místa na terčíku poskytující signál nebylo možno nalézt. Tohoto postup přípravy vzorků a matrice s možností detekce vysokomolekulárních látek, bylo využito v následujícím experimentu sledujícím závislost diskriminačních schopností MALDI-TOF MS na použité metodě přípravy vzorku. Porovnány byly výsledky rozlišení dvou příbuzných bakteriálních druhů s použitím dvou metod. Vedle rutinně používané a výrobci MALDI-TOF hmotnostních spektrometrů doporučované matrice obsahující k. α-kyano-4-hydroxyskořicovou, byla testována matrice připravená dle Madonny a kol. 2000. Získaná hmotnostní spektra byla analyzována a upravena do formy dendrogramu pomocí softwaru BioTyper, který porovnává spektra klastrovou analýzou a na základě jejich podobnosti je seřazuje do podvětví. Blízké kmeny by tedy měly být seřazeny ve stejné větvi. Z dendrogramů na obrázku 20 a 21 lze vidět, že 51

metoda dle Madonny lépe seskupuje Lactobacillus paracasei a Lactobacillus rhamnosus do větví a vykazuje tedy lepší identifikační a klasifikační vlastnosti. Z výsledků vyplývá, že obě metody vykazují velmi podobný počet druhově specifických i druhově společných píků. Přesto software Biotyper dokáže lépe identifikovat bakterie při použití metody dle Madonny s matricí FerA. Nedá se však jednoznačně říci, že je tato schopnost podmíněna detekcí vysokomolekulárních hmotností. Obě metody disponují také přibližně stejným počtem píků opakujících se ve více jak 50 % měření, v případě píků opakovatelných ve všech analýzách však lepší výsledky poskytuje metoda doporučená společností Bruker. Lepší rozlišení signálu však vykazuje metoda dle Madonny s FerA, dává užší píky, ale s horší přesností stanovení molekulové hmotnosti v porovnání s metodou dle společnosti Bruker.

52

6. Závěr Podařilo se nám nalézt metodu spolehlivě rozlišující vybrané skupiny blízce příbuzných bakterií na druhové úrovni. Ze studovaných vlivů měl významný vliv na kvalitu a reprodukovatelnost MALDI MS profilů především výběr a složení matrice. Při sledování vlivů působících na změnu hmotnostního spektra, získaného pomocí matrice HCCA připravené dle návodu doporučeného společnosti Bruker, byla zjištěna stabilita uchovávaných vzorků v mrazicím boxu po dobu nejméně půl roku. Změna intenzity laseru měla vliv pouze na výslednou intenzitu signálu, počet detekovaných píků jí nebyl ovlivněn. Koncentrace extraktu vzorku rovněž neměla vliv na kvalitu jejich spekter a tudíž i jejich řazení v dendrogramu. Změny v poměru vody a organické složky roztoku matrice ani změna poměru vody a acetonitrilu v rozpouštědle pro extrakci proteinů nepřinesly žádné změny v hmotnostních spektrech, které by zásadním způsobem ovlivnily výsledná hmotnostní spektra. Tato metoda jako jediná poskytla dostatečně homogenní vrstvu vzorku a matrice, která umožnila bezproblémové automatické sbírání dat. Metoda dle společnosti Bruker i jiné metody přípravy využívající tuto matrici poskytly nízkomolekulární signály (do 11 kDa) s vysokou reprodukovatelností. Vysokomolekulární signály (až 50 kDa) byly detekovány především při použití matrice FerA. Při modifikaci metody využívající matrici FerA byl zaznamenán významný vliv pouze u poměru FA a vody v základním roztoku matrice. FA ovlivnil krystalizaci směsi matrice se vzorkem a následné získávání dat. Pouze větší odchýlení od protokolu přípravy znemožnilo analýzu. Na základě modifikace protokolu přípravy se nám podařilo s použitím matrice FerA o koncentraci 12,5 mg/ml v roztoku FA/ACN/H2O (17:33:50) zkoumané druhy laktobacilů,

včetně

blízce

příbuzných

druhů

Lactobacillus

paracasei,

Lactobacillus rhamnosus, spolehlivě rozlišit na druhové úrovni.

53

Použitá literatura: Anhalt, J. P., Fenselau C. (1975): Identification of bacteria using mass spectrometry. Anal. Chem. 47: 219–225.

Bizzini A., Durussel C., Bille J., Greub G., Prod’hom G. (2010): Performance of MatrixAssisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry for Identification of Bacterial Strains Routinely Isolated in a Clinical Microbiology Laboratory. J. Clin. Microbiol., 48: 1549–1554.

Blaiotta G., Fusco V., Ercolini D., Aponte M., Pepe O., Villani F. (2008): Lactobacillus Strain Diversity Based on Partial hsp60 Gene Sequences and Design of PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism Assays for Species Identification and Differentiation. Appl. Environ. Microbiol. 74(1): 208–215.

Blondiaux N., Gaillot O., Courcol R.J. (2009): MALDI-TOF mass spectrometry to identify clinical bacterial isolates: Evaluation in a teaching hospital. Pathol. Biol. 58(1):55-7. . Boyle R. J., Robins-Browne R. M., Tang M. L. K. (2006): Probiotic use in clinical practice: what are the risks? Am. J. Clin. Nutr. 83: 1256–64.

Cain T.C., Lubman D.M., Weber W.J. Jr. (1994): Differentiation of bacteria using protein profiles from matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid. Commun. Mass Spectrom. 8: 1026-1030.

Canchaya, C., M. J. Claesson, G. F. Fitzgerald, D. van Sinderen, and P. W. O'Toole. (2006): Diversity of the genus Lactobacillus revealed by comparative genomics of five species. Microbiology 152:3185-3196.

Carbonnelle E., Mesquita C., Bille E., Day N., Dauphin B., Beretti J., Ferroni A., Gutmann L., Nassif X. (2011): MALDI-TOF mass spectrometry tools for bacterial identification in clinical microbiology laboratory. Clin. Biochem. 44: 104–109.

54

Chen H., Lim C.K., Lee Y.K., Chan, Y.N. (2000): Comparative analysis of the genes encoding 23S-5S rRNA intergenic spacer regions of Lactobacillus casei-related strains. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50: 471-478.

Chong B.E., Wall D.B., Lubman D.M., Flynn S.J. (1997): Rapid profiling of E. coli proteins up to 500 kDa from whole cell lysates using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 11: 1900-1908. Christner M., Rohde H., Wolters M., Sobottka I., Wegscheider K., Aepfelbacher M. (2010):Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrixassisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J. Clin. Microbiol. 48(5): 1584–91.

Collins M.D., Phillips B.A., Zanoni P. (1989): Deoxyribonucleic-acid homology studies of Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei sp. nov., subsp. paracasei and subsp. tolerans, and Lactobacillus rhamnosus sp. nov., comb. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 39: 105108.

Degand N., Carbonnelle E., Dauphin B., Beretti J.L., Le Bourgeois M., Sermet-Gaudelus I., Segonds C., Berche P., Nassif X., Ferroni A. (2008): Matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry for identification of nonfermenting gramnegative bacilli isolated from cystic fibrosis patients. J. Clin. Microbiol. 46: 3361-3367.

Dellaglio F., Dicks L.M.T., Du Toit M., Torriani S. (1991): Designation of ATCC 334 in place of ATCC 393 (NCDO 161) as the neotype strain of Lactobacillus casei subsp. casei and rejection of name Lactobacillus paracasei (Collins et al., 1989). Int. J. Syst. Bacteriol. 41: 340-342.

Dellaglio, F., Bottazzi, V., Vescovo, M. (1975): Deoxyribonucleic acid homology among Lactobacillus species of the subgenus Streptobacterium Orla-Jensen. Int. J. Syst. Bacteriol. 25: 160-172.

Desai A.R., Shah N.P., Powell I.B. (2006): Discrimination of dairy industry isolates of the Lactobacillus casei group. J. Dairy Sci. 89: 3345-3351. 55

Dicks L.M.T., Du Plessis E.M., Dellaglio F., Lauer E. (1996): Reclassification of Lactobacillus casei subsp. casei ATCC 393 and Lactobacillus rhamnosus ATCC 15820 as Lactobacillus zeae nom. rev., designation of ATCC 334 as the neotype of L. casei subsp. casei, and rejection of the name Lactobacillus paracasei. Int. J. Syst. Bacteriol. 46: 337340.

Dieckmann R., Helmuth R., Erhard M., Malorny B. (2008): Rapid classification and identification of salmonellae at the species and subspecies levels by whole-cell matrixassisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry. Appl. Environ. Microbiol. 74: 7767-7778.

Eigner U., Holfelder M., Oberdorfer K., Betz-Wild U., Bertsch D., Fahr A.M. (2009): Performance of a Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time-of-Flight Mass Spectrometry System for the Identification of Bacterial Isolates in the Clinical Routine Laboratory. Clin. Lab. 55: 289-296.

Elhanany E., Barak R., Fisher M., Kobiler D., Altboum Z. (2001): Detection of specific Bacillus anthracis spore biomarkers by matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 15: 2110-2116.

Felis, G.E., Dellaglio, F., Mizzi, L., Torriani, S. (2001): Comparative sequence analysis of a recA gene fragment brings new evidence for a change in the taxonomy of the Lactobacillus casei-group. Int. J. Sys. Evol. Microbiol.51: 2113-2117.

Fenselau C, Demirev P. (2001): Characterization of intact microorganism by MALDI mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 20: 157–171.

Ferreira L., Sanchez-Juanes F., Gonzalez-Avila M. (2010b): Direct identification of urinary tract pathogens from urine samples by matrix-assisted laser desorption ionizationtime of flight mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 48(6): 2110–5.

56

Ferreira L., Sanchez-Juanes F., Guerra I.P., (2010a): Microorganisms direct identification from blood culture by MALDI-TOF mass spectrometry. Clin Microbiol Infect. 17: 546– 551.

Ferroni A., Suarez S., Beretti J.L. (2010): Real-time identification of bacteria and Candida species in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 48(5): 1542–8.

Hansen, P. A., Lessel, E. F. (1971): Lactobacillus casei (Orla-Jensen) comb. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 21, 69–71.

Holland R. D., Rafii F., Heinze T. M., Sutherland J. B., Voorhees K. J., Lay J. O., Jr. (2000): Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass Spectrometric detection of bacterial biomarker proteins isolated from contaminated water, lettuce and cotton cloth. Rapid. Commun. Mass Spectrom. 14: 911-917.

Holland R.D., Wilkes J.G., Rafii .F, Sutherland J.B., Persons C.C., Voorhees K.J., Lay J.O. (1996): Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry. Rapid. Commun. Mass Spectrom. 10: 1227 1232.

Ishida Y., Madonna A. J., Rees J. C., Meetani M. A., Voorhees K. (2002): Rapid analysis of

intact

phospholipids

from

whole

bacterial

cells

by

matrix-assisted

laser

desorption/ionization mass spectrometry combined with on-probe sample pretreatment. Rapid. Commun. Mass Spectrom. 16: 1877-1882.

Jackson K.A, Edwards-Jones V., Sutton C.W., Fox A.J. (2005): Optimisation of intact cell MALDI method for fingerprinting of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Microbiol. Methods. 62(3):273–84.

Judicial Commission of the International Committee on Systematics of Bacteria (2008): The type strain of Lactobacillus casei is ATCC 393, ATCC 334 cannot serve as the type because it represents a different taxon, the name Lactobacillus paracasei and its subspecies names are not rejected and the revival of the name ‘Lactobacillus zeae’ contravenes Rules 57

51b (1) and (2) of the International Code of Nomenclature of Bacteria. Opinion 82, Int J Syst. Evol. Microbiol. 58: 1764-1765.

Karas M., Bachman D., Bahr U., Hillenkamp F. (1987): Matrix-Assisted Ultraviolet Laser Desorption of Non-Volatile Compounds. Int. J. Mass Spectrom. Ion. Proc. 78: 53–68. -Karas, M.; Bachmann, D.; Hillenkamp, F. (1985): Influence of the Wavelength in HighIrradiance Ultraviolet Laser Desorption Mass Spectrometry of Organic Molecules. Anal. Chem. 57: 2935-2939.

Keysa C., Dareb D. J., Suttonb H., Wellsc G., Luntc M., McKennac T., McDowallc M., Shah H. N. (2004): Compilation of a MALDI-TOF mass spectral database for the rapid screening and characterisation of bacteria implicated in human infectious diseases. Infect. Genet. Evol. 4: 221–242

Klaenhammer T. R., Barrangou R., Buck B. L, Azcarate-Peril M. A., Altermann E. (2005): Genomic features of lactic acid bacteria effecting bioprocessing and health. FEMS Microbiol. Rev. 29: 393–409.

Krader P., Emerson D. (2004): Identification of archaea and some extremophilic bacteria using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. Extremophiles. 8: 259-268.

Krishnamurthy T, Ross PL, Rajamani U. (1996): Detection of pathogenic and nonpathogenic bacteria by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid. Commun. Mass Spectrom. 10 :883-888.

Kullen, M. J., R. B. Sanozky-Dawes, D. C. Crowell, and T. R. Klaenhammer. (2000): Use of the DNA sequence of variable regions of the 16S rRNA gene for rapid and accurate identification of bacteria in the Lactobacillus acidophilus complex. J. Appl. Microbiol. 89:511-516.

La Scola B, Raoult D. (2009): Direct identification of bacteria in positive blood culture bottles by matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry. PLoS ONE. 4(11):e8041. 58

Lay J.O. Jr. (2001): MALDI-TOF mass spectrometry of bacteria. Mass Spectrom. Rev. 20: 172– 194.

Madonna A., Basile F, Ferrer I., Meetani M., Rees J., Voorhees K. (2000): On-probe sample pretreatment for the detection of proteins above 15 KDa from whole cell bacteria by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 14, 2220–2229.

Marinach C., Alanio A., Palous M., Kwasek S., Fekkar A., Brossas J., Brun S., Snounou G., Hennequin Ch., Sanglard D., Datry A., Golmard J., Mazier D., (2009): MALDI-TOF MS-based drug susceptibility testing of pathogens: The example of Candida albicans and fluconazole. Proteomics. 9: 4627–4631.

Meetani M.A., Voorhees K.J. (2005): MALDI mass spectrometry analysis of high molecular weight proteins from whole bacterial cells: pretreatment of samples with surfactants, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16: 1422-1426.

Mori K., Yamazaki K., Ishiyama T., Katsumata M., Kobayashi K., Kawai Y., Inoue N., Shinano H. (1997): Comparative sequence analyses of the genes coding for 16S rRNA of Lactobacillus casei-related taxa. Int. J. Syst. Bacteriol. 47: 54-57.

Moura H., Woolfitt A.R., Carvalho M.G., Pavlopoulos A., Teixeria L.M., Satten G.A., Barr J.R. (2008): MALDI-TOF mass spectrometry as a tool for differentiation of invasive and noninvasive Streptococcus pyogenes isolates. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 53: 333-342.

Nelson Ch. P., White E. V (2005): Bacterial Analysis by MALDI-TOF Mass Spectrometry: An Inter-Laboratory Comparison. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16: 456-462.

Nilsson C.L. (1999): Fingerprinting of Helicobacter pylori strains by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analysis. Rapid. Commun. Mass Spectrom. 13: 1067-1071.

59

Orla-Jensen S., (1919): The Lactic Acid Bacteria.Host, Copenhagen. 1-196.

Pot B., Tsakalidou E. (2009): Taxonomy and metabolism of Lactobacillus. In: Ljungh Ä., Wadström T. (eds.), Lactobacillus molecular biology: From genomics to probiotics, 3-58. Caister Academic Press, Hethersett.

Prod'hom G., Bizzini A., Durussel C., Bille J., Greub G. (2010): MALDI-TOF mass spectrometry for direct bacterial identification from positive blood culture pellets. J. Clin. Microbiol. 48(4): 1481-3.

Ruelle V., El Moualij B., Zorzi W., Ledent P., De Pauw E. (2004): Rapid identification of environmental bacterial strains by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid. Commun. Mass Spectrom. 18: 2013-2019.

Ryzhov V., Fenselau C. (2001): Characterization of the protein subset desorbed by MALDI from whole bacterial cells. Anal. Chem. 73: 746-750.

Sedláček I. (2007): Taxonomie prokaryot. Masarykova univerzita v Brně 2007, 270s.

Seng P., Drancourt M., Gouriet F., La Scola B., Fournier P.E., Rolain J.M., Raoult D. (2009): Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrixassisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin. Infect. Dis. 49: 543-551.

Stevenson L.G., Drake S.K., Murray P.R. (2009): Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by MALDI-TOF mass spectrometry. J. Clin. Microbiol.48: 444-447.

Shaw E.I., Moura H., Woolfitt A.R., Ospina M., Thompson H.A., Barr J.R. (2004): Identification of biomarkers of whole Coxiella burnetii phase I by MALDI-TOF mass spectrometry. Anal. Chem. 76: 4017-4022.

Šedo O. (2002): Analýza peptidů hmotnostní spektrometrií MALDI – TOF. Diplomová práce, Masarykova univerzita, Brno, 110s. 60

Šedo O. (2008): Nové perspektivy MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie. Disertační práce, Masarykova univerzita, Brno, 84s.

Tanaka K., Waki H., Ido Y., Akita S., Yoshida Y., Yoshida T. (1988): Protein and polymer analysis up to m/z 100,000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry Rapid Commun. Mass Spectrom., 2(8): 151.

Teshim A. (2007): MALDI – MS typizace γ-proteobakterií, Diplomová práce, Masarykova univerzita, Brno, 115s. Tannock G.W. (2005): Probiotics & Prebiotics: Scientific Aspects. Norfolk, England: Caister Academic Press, 238s. ISBN: 1-904455-01-8.

Vaidyanathan S., Winder C.L., Wade S.C., Kell D.B., Goodacre R. (2002): Sample preparation in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of whole bacterial cells and the detection of high mass (>20 kDa) proteins. Rapid. Commun. Mass Spectrom. 16: 1276-1286.

Valentine N., Wunschel S., Wunschel D., Petersen C., Wahl K. (2005): Effect of Culture Conditions on Microorganism Identification by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Appl. Environ. Microbiol. 71(1): 58–64.

Veen S., Claas E. C. J., Kuijper Ed. J. (2010): High-Throughput Identification of Bacteria and Yeast by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry in Conventional Medical Microbiology Laboratories. J. Clin. Microbiol. 48(3): 900–907.

Wayne L.G. (1994): Actions of the Judicial Commission of the International Committee on Systematic Bacteriology on Requests for Opinions published between January 1985 and July 1993. Int. J. Syst. Bacteriol. 44: 177-178.

Williams T.L., Andrzejewski D., Lay Jr. J.O., Musser S.M. (2003): Experimental factors affecting the quality and reproducibility of MALDI TOF mass spectra obtained from whole bacteria cells. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14 :342-351. 61

Seznam zkratek: 5-MS

kyselina 5-metoxysalicylová

ACN

acetonitril

CCM

Česká sbírka mikroorganismů

Da

dalton

DDA

N,N-dimethyldodecylamine-N-oxid

DDW

deionizovaná voda

DHB

kyselina 2,5 – dihydroxybenzoová

DNA

deoxyribonukleová kyselina

FA

kyselina mravenčí

G+

gram-pozitivní bakterie

G-

gram-negativní bakterie

HABA

kyselina 2-(4´hydroxyfenylazo)benzoová

HCCA

kyselina α-kyano-4-hydroxyskořicová

MALDI-TOF MS

Hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací za účasti matrice s analyzátorem doby letu („Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Timeof-Flight Mass Spectrometry“)

FerA

4-hydroxy-3-metoxyskořicová

kyselina

(kyselina

ferulová) MS

hmotnostní spektrometrie („Mass Spectrometry“)

PCR

polymerázová řetězová reakce

TFA

kyselina trifluoroctová

TOF

analyzátor doby letu („Timeo=f-Flight“)

UV SA sinapová) ZR

ultrafialové záření kyselina 3,5-dimetoxy-4-hydroxyskořicová (kyselina základní roztok

62

Optimalizace podmínek přípravy vzorků pro MALDI-MS profilování bakterií. Diplomová práce

Recommend Documents