MALDI-MS proteinů. jednonásobně nabité ionty, také 2 +,3 +, záleží na matrici a hmotnostním rozsahu

intenzita

MALDI-MS proteinů BSA

[M+H]+ [M+2H]2+

BSA dvojnásobně nabitý

[2M+H]+ BSA dimer

m/z

jednonásobně nabité ionty, také 2+,3+, záleží na matrici a hmotnostním rozsahu artefakty: dimery, trimery; adukty (s matricí, rozpouštědlem); fragmenty

MALDI-MS proteinů, Příklad č.2 2+

rel. intenzita

1+

3+

m/z

Určení MW – ESI

jak vzniká vícenásobný náboj – ESI

výpočet MW proteinu z m/z sousedních píků M – MW proteinu z – nábojový stav

intenzita

X = (M+z)/z Y = (M+z+1)/(z+1) nábojový stav (z) píku X: zx= (Y-1)/(X-Y)

X

MW: M = (X*zx)-zx = (Y*zy)-zy

Y

m/z

myoglobin: ukázkový výpočet MW X = (M+z)/z Y = (M+z+1)/(z+1) nábojový stav (z) píku X: zx= (Y-1)/(X-Y); X = 998.25 Y = 942.82 zx = (942.82-1)/(998.25-942.82) ≈ 17 zx = 17, zy = 18 M = (X*zx) – zx = 998.25*17-17 = 16952.91 teoretická MW = 16951.52 M = (Y*zy) – zy = 942.82*18-18 = 16952.76 teoretická MW = 16951.76

Unknown

X = 1101.8 Y = 1057.8 zx = (Y-1)/(X-Y) = (1057.8-1)/(1101.8-1057.8) ≈ 24 zx = 24, zy = 25 M = (X*zx) – zx = 1101.8*24-24 = 26419.2 M = (Y*zy) – zy = 1057.8*25-25 = 26420

M = (662.1*34) - 34 = 22477.4 M = (1762.1*9) - 9 = 15849.9

Příklad č.4 – určete nábojové stavy jednotlivých píků a přibližnou MW zx= (Y-1)/(X-Y); X = 952.1772 Y = 912.5492 zx = (912.5492-1)/(952.1772-912.5492) ≈ 23 zx = 23, zy = 24 952.1772*23-23*1 = 21877.07 atd. 21877.1

Programy pro dekonvoluci - SpectraPhile http://home.iprimus.com.au/pakholt/lcms/spectraPhile.html

Programy pro dekonvoluci - MagTran Zhongqi Zhang and A. G. Marshall.J. Am. Soc. Mass Spectrom. (1998), 9, 225-233. http://www.geocities.com/SiliconValley/Hills/2679/magtran.html

Klasické problémy při interpretaci - ADP/ATP transporter

problémový membránový protein -soli, pufry, detergent, lipidy -> ESI?  -precipitace, omytí, rozpuštění…. SDQALSFLKDFLAGGVAAAISKTAVAPIERVKLLLQVQHASKQISAEK QYKGIIDCVVRIPKEQGFLSFWRGNLANVIRYFPTQALNFAFKDKYK QIFLGGVDRHKQFWRYFAGNLASGGAAGATSLCFVYPLDFARTRLA ADVGKGAAQREFTGLGNCITKIFKSDGLRGLYQGFNVSVQGIIIYRAA YFGVYDTAKGMLPDPKNVHIIVSWMIAQTVTAVAGLVSYPFDTVRRR MMMQSGRKGADIMYTGTVDCWRKIAKDEGPKAFFKGAWSNVLRG MGGAFVLVLYDEIKKFV

Klasické problémy při interpretaci - ADP/ATP transporter 28 1176.90 -precipitace, omytí, redukce/alkylace, 29 1136.35 10% FA  30 1098.51

MW = 32925

31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46

1063.10 1029.91 998.73 969.39 941.72 915.59 890.87 867.45 845.24 824.13 804.06 784.94 766.70 749.30 732.67 716.77

Příklad č.6 – určete co je problémem ve ESI-MS spektru následujícího proteinu a navrhněte řešení SEKVENCE:

MRELPVSYDSTSTESLYPRSILIKPPQITVPRTP AVSYPLVTSFPPLRQPDLLPIPRSPQPLGGSHRM PSSQQNSDDANSVASYENQEPACKNVDADED EDDYPNGYLVVLPDSSPAAVPVVSSAPVPSNPDL GDSAFSVESCEDYVNVPESEESAEASLDGSREY VNVSPEQQPVTRAELASVNSQEVEDEGEEEGV DGEEAPDYENLQELNLEHHHHHH Pufr: 20mM HEPES, 50mM NaCl, 1mM 2-ME, 1mM EDTA

Příklad č.6 – určete co je problémem ve ESI-MS spektru následujícího proteinu a navrhněte řešení SPEKTRUM:

Příklad č.6 – tvoří se kovalentní multimery (snadno odhalitelný je di a trimer) a adukty s 2-ME 24272.5 48390.8 72507 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

1936.64 1862.19 1793.26 1729.25 1669.66 1614.03 1562.00 1513.22 1467.40 1424.27 1383.60 1345.20 1308.87 1274.45 1241.80 1210.78 1181.27 1153.17 1126.37 1100.80 1076.36 1052.98 1030.60 1009.15 988.57 968.82

37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56

1960.66 1909.09 1860.16 1813.68 1769.47 1727.36 1687.22 1648.89 1612.27 1577.25 1543.71 1511.57 1480.74 1451.15 1422.71 1395.37 1369.06 1343.73 1319.32 1295.78

Příklad č.6 – po redukci TCEP a přečistění

24120.4 HS

SH

Příklad č.6 – tvoří se kovalentní multimery (snadno odhalitelný je di a trimer) a adukty s 2-ME 24272.5 48390.8 72507

24120.4 + 2*76

25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

S-2ME

2ME-S

2*24120.4 + 2*76 - 2 2ME-S

S S

2ME-S

HS

SH

S-2ME

S S

S S

3*24120.4 + 2*76 - 4

S-2ME

1936.64 1862.19 1793.26 1729.25 1669.66 1614.03 1562.00 1513.22 1467.40 1424.27 1383.60 1345.20 1308.87 1274.45 1241.80 1210.78 1181.27 1153.17 1126.37 1100.80 1076.36 1052.98 1030.60 1009.15 988.57 968.82

37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56

1960.66 1909.09 1860.16 1813.68 1769.47 1727.36 1687.22 1648.89 1612.27 1577.25 1543.71 1511.57 1480.74 1451.15 1422.71 1395.37 1369.06 1343.73 1319.32 1295.78

Určení náboje z jednoho píku • Nutné dostatečné rozlišení • Rozdíly mezi izotopickými píky v izotopovém vzoru 1+: Δ m/z = 1 Da, 2+: Δ m/z = 0.5 Da, 3+: Δ m/z = 0.33 Da ...

• Rozdíly mezi adukty

1375.9650

1375.9650*4 – 4*1.00728 = 5499.8309

1375.7153

1 Z= A-B

1376.2140

1375.9650

3 4 5 6

1834.28 1375.97 1100.97 917.65

B

1376.4635 1375.4653

A

1376.7128

1376.713 1376.464 1376.214 1375.965 1375.715 1375.465

4.0 4.0 4.0

1376.9613

1100.9760

1375.2151 1377.2118

1375.2

1375.6

1376.0

1376.4

1376.8

1377.2

1377.6

917.6493 1834.2813

Určení náboje z jednoho píku • Počet izotopických píků do 1 amu od daného izotopu…

1188.2596

1188.1758

12+ 1188.0923

1188.0085

1187.9251

1187.8415

1187.7581

1187.6746

1187.4241

1187.3400

1187.2557

1295.72

1187.5078

1187.82

14241.80 m/z 1583.43 1425.19 1295.72 1187.82 1096.53 1018.28

1096.53

MW CS 9 10 11 12 13 14

1187.5910

12*1187.82 – 12*1.00728 = 14241.8

1583.43

1018.28

1425.19

1187.3 1187.4 1187.5 1187.6 1187.7 1187.8 1187.9 1188.0 1188.1 1188.2 m/z

1000

1100

1200

1300

1400

1500

m/z

900 950 1000 1050 1301.0

1100 1301.5

1150 1302.0 1302.5

1200

1042.5

1303.0

1301.5244

1042.0

1303.0274

1302.0248

1301.7748

1301.5244

1301.2739

1042.2212

1042.8223

1042.6216

1041.8204

1041.6200

1041.4196

1041.2194

1041.4196

1041.0190

1042.0206

1040.8186

868.1845

868.0176

867.8506

1042.4214

868.3516

867.6835

1041.5

1302.7760

1302.5254

867.6 867.8 868.0 868.2 868.4 868.6 868.8 869.0 869.2 869.4

1301.0233

869.1866

869.0183

868.8518

868.6854

868.5181

867.5161

1041.0

1302.2751

1300.7725

868.0176

Příklad č.7 – z izotopových obálek jednotlivých píků určete Mmono a nábojový stav všech tří píků

1043.0

m/z

1250 1300

900 950 1000 1050 1301.0

1100 1301.5

1150

1042.0

1302.0 1302.5

1200

1042.5

1303.0

1301.5244

1041.5

1303.0274

1301.5244 1301.7748 1302.0248

5199.0568 1301.2739

1042.2212

1042.8223

1042.6216

1041.8204

1041.6200

1041.4196

1041.2194

1041.4196

1041.0190

1042.0206

1040.8186

868.1845

868.0176

867.8506

1042.4214

868.3516

867.6835

1041.0

1302.7760

1302.5254

867.6 867.8 868.0 868.2 868.4 868.6 868.8 869.0 869.2 869.4

1301.0233

869.1866

869.0183

868.8518

868.6854

868.5181

867.5161

6+ (6*867.5161) - 6*1.00728 5199.0529

1302.2751

1300.7725

868.0176

Příklad č.7 - řešení 5+ (5*1040.8186) - 5*1.00728 5199.0566

1043.0

4+ (4*1300.7725) - 4*1.00728 5199.0609

m/z

1250 1300

800

900

1100

1200

1300

1400

1500

36245.30 m/z 1813.27 1726.97 1648.52 1576.89 1511.23 1450.82 1395.06 1343.43 1295.48 1250.85 1209.18 1170.21 1133.67 1099.35 1067.05 1036.59 1007.82 980.61 954.83 930.37 907.14 885.04 863.99 843.92 824.76 806.46

1600

1727.03294

1648.54925

1576.89786

1511.27150

1450.82931

1395.05604

1343.45012

1250.83461

1209.17181

1295.50636 1000

MW CS 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

1170.20543

1133.67556

1099.32219

1036.56681

1007.81287

954.81691

930.35939

824.36523 843.91262 863.95838 885.05225 907.10386

980.61272

1067.03671

Určení nábojového stavu u velkých molekul

1700

m/z

1169.6 1169.8 1170.0 1170.2 1170.4

1170.42571

1170.39192

1169.94088 1169.97348 1170.00605 1170.03851 1170.07119

1170.6 1170.8

1171.00609

1170.87858 1170.90967 1170.94223 1170.97161

1170.78092 1170.81205 1170.84461

1170.71535 1170.74729

1170.58883 1170.61952 1170.65150 1170.68208

1170.45993 1170.49076 1170.52271 1170.55331

1169.87867 1169.90721

1169.84535

1169.81088

1169.77748

1169.71912 1169.74322

1169.68301

1169.64771

1170.29687 1170.32885 1170.36101

1170.26276

1170.13509 1170.16711 1170.23236

1170.10264

1170.19872

m/z 1/(m/z(n+1) - m/z(n) 1170.23236 29.7 1170.19872 1170.36101 31.1 1170.32885 1170.42571 29.6 1170.39192 1170.16711 31.2 1170.13509 1169.97348 30.7 1169.94088

m/z

AVG 30.5

1170.0 1170.1 1170.2 1170.3 1170.4 1170.5

1170.5533

1170.5227

20

1170.6

1170.6821

1170.6515

1170.5888

25

1170.7 1170.8

31

1170.9

1170.9422

1170.8786

1170.8446

1170.8120

1170.7809

1170.7473

15 1170.4257

1170.2628

1170.1671

1170.1351

1170.3610

1170.3289

1170.2969

10

1170.4908

1170.4599

1170.3919

1170.0712

1170.0385

1170.0060

1

1169.9735

1169.9409

1170.2324

1170.1026

1170.1987

5

Dekonvoluce, určení náboje a monoizotopické M •

Výpočet z různě nabitých stavů - Covey TR. Rapid Commun Mass Spectrom 1988, 2: 249.

•

Odhaz ze vzdáleností mezi izotop. píky – Henry

•

Mannův algoritmus – odhad náboje podle vzdálenosti aduktu, metoda nejmenších čtverců - Mann M. Anal Chem 1989, 61: 1702. - náchylné k artefaktům…

•

„3D“ dekonvoluce – podobné jako Mann ale využívá více aduktů - Labowsky M. Rapid

•

Multiplikativní korelační analýza – Hagen JJ. Anal. Chem. 1994, 66:1877.

•

Maximum Entropy – dobrá ale výpočetně extrémně náročná metoda.

KD. Org. Mass Spectrom. 1990, 25: 490.

Commun Mass Spectrom 1993, 7: 71.

Reinhold BB. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1992, 3:207. Ferrige AG. Rapid Commun. Mass Spectrom. 1991, 5:374. Ferrige AG. Rapid Commun. Mass Spectrom. 1992, 6:707.

Dekonvoluce, určení náboje a monoizotopické M •

Pattern recognition – určení náboje. Patterson vs. Fourier, resp. jejich kombinace - Senko MW. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1995, 6:52.

•

Zscore – Zhang Z. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1998, 9:225

•

Vypočtení Mmono – najdeme monoizotopický pík, z pozic izotopů n=2-4 počítáme Mmono jako Mi-i*1.0028 – průměrujeme přes jednotlivé izotopy a pak i spektra

•

Proč určovat Mmono? - není zatížena variabilitou C12/C13

•

U velkých molekul monoizotopický pík mizí, je potřeba správně určit jeho pozici.

Ubiquitin: 8,57kDa (10+) Intens.

C378H629N105O118S1, M+nH ,8569.69 857.3701

857.4704

857.5706 857.2698 1500

857.6709

1000 857.1695

500

Mono

857.7712

857.8715 857.0692

857.9718

858.0720 856.9689 0 857.0

857.2

857.4

857.6

857.8

858.0

858.2

m/z

Myoglobin: 16,96kDa (20+) Intens.

C769H1212N210O218S2, M+nH ,16961.12 848.5569 848.5068

1000

848.6070

848.4566

848.6572 800

848.4065 848.7073

600

848.3564

848.7574

400 848.8075 848.3062

848.8577 200

Mono

848.2561

848.9078

848.9579 848.2060

849.0080 849.0582

0 848.2

848.4

848.6

848.8

849.0

849.2

m/z

Pepsin: 41,40kDa (50+) Intens.

C1851H2835N451O599S12, M+nH ,41399.58 828.4924

1000

800

600

400

Mono

200

0 828.0

828.1

828.2

828.3

828.4

828.5

828.6

828.7

828.8

828.9

m/z

BSA: 69,33kDa (80+) Intens.

C3071H4826N816O927S40, M+nH ,69329.07 867.1641

1000

800

600

400

Mono

200

0 866.7

866.8

866.9

867.0

867.1

867.2

867.3

867.4

m/z

Fibronectin: 262,56kDa (100+) Intens.

C11485H17824N3208O3681S90, M+nH ,262560.88 2627.2224

1000

800

600

400

Mono

200

0 2625.8

2626.0

2626.2

2626.4

2626.6

2626.8

2627.0

2627.2

2627.4

2627.6

m/z

Určení Mmono proteinu – dle Mavg Roman Zubarev – Mmono se od Mavg oddaluje o cca 1Da na každých 1500Da. Přepočítávací faktory pro proteiny i oligonukleotidy (ty dávají lepší výsledek – uniformní složení).

Zubarev R at al Rapid Commun Mass Spectrom 1991, 5, 276.

Určení Mmono proteinu – dle Mavg Jaká je průměrná hmotnost uhlíku? 12,0011 +/- 0,001 nebo 12,0109 +/- 0,0002 nebo…? Zastoupení izotopů kazí přesnost výpočtu…

Beavis RC Anal Chem 1993, 65, 496.

Určení Mmono proteinu – averagine Zubarev – Mavg -> Mmono Spočteno na základě rovnoměrného zastoupení aminokyselin (každé je 5%). Realita je jiná, např. Cys 1,9%, Met 2% Michael Senko – koncept averagine – průměrná AK, spočtená na základě reálné distribuce aminokyselin v proteinové databázi

C4.9384H7.7583N1.3577O1.4773S0.0417

Mavg = 111.1254

1.Dekonvoluce + určení Mavg 2.Určení kolik averagine jednotek se vejde do Mavg 3.Spočtení přibližného teoretického složení + zaokrouhlení na nejbližší celočíselnou hodnotu 4.Dopočtení množství vodíků – příklad 5.Modelová izotopová obálka 6.Fitování obálek a odečtení Mmono

Ad bod 4. 20kDa protein = 179.98 averagine = 7.5 S – rozdíl v intenzitách izotopů, pokud uděláme S=7 (+16H) nebo S=8 (-16H) je méně než 1% - tedy pod variabilitou sken-sken Ad bod 6. Píky na krajích obálek nejsou vhodné – m.j. mohou být ovlivněny tvorbou aduktů s kationty a solventy – je lepší ořezat vše pod 20% THRASH – Thorough high resolution analysis of spectra by Horn – Horn DM. J. Am. Soc. Mass Spectrom 2000, 11:320. Senko MW et al J Am Soc Mass Spectrom 1995, 6, 229. Horn DM et al J Am Soc Mass Spectrom 2000, 11,320.

Určení Mmono proteinu – averagine - myoglobin Intens. x108

+MS 1060.45448

998.19367 1131.08475

1.0

942.73570

0.8 1211.80784

893.22571 1413.68197

0.6

1304.95351

848.56454

0.4

808.20423

0.2 1696.26594

1542.12638 1884.40957

616.18202

0.0 600

800

1000

1200

1400

1600

1800

m/z

Určení Mmono proteinu – averagine - myoglobin Intens. x108

16+ 1060.37885

16+ 1060.44089

+MS 16+ 1060.50289

16+

1.0 16+ 1060.56505

16+ 1060.31712

Mavg = 16951,272

0.8

16+ 1060.62774

16+ 1060.25537

0.6

16+ 1060.69050

0.4

16+ 1060.19396 16+ 1060.75387

0.2 16+ 1060.81702 16+ 1060.13281

16+ 1060.88109 16+ 1060.06935 16+ 1060.94116

0.0 1060.0

1060.2

1060.4

1060.6

1060.8

1061.0

1061.2

m/z

Určení Mmono proteinu – averagine - myoglobin Mavg 16951,272 Averagine = 111,12540 / (C4,9384H7,7583N1,3577O1,4773S0,0417) Mavg / averagine = 152,5418 ×

C753,31258H1183,46529N207,10604O225,35005S6,36099 C753H1183+XN207O225S6 C0,31258H0,46529N0,10604O0,35005S0,36099 = X ~ 23

C753H1206N207O225S6 (teor. složení – C769H1212N210O218S2)

Určení Mmono proteinu – averagine - myoglobin Model podle averagine kalkulace C753H1206N207O225S6 Nábojový stav 16+

Model podle reálného složení C769H1212N210O218S2 Odečtená Mmono = 16940,9375 Teoretická Mmono = 16940,9650 1,6ppm

1060.0

1060.2

1060.4

1060.6

1060.8

1061.0

1061.2

Dekonvoluce, určení náboje a monoizotopické M averagine

1169.4879

Mmono = 36223.9135

1169.6

1169.8

1170.0

1170.2

1170.4

1170.6

1170.8

1171.0

m/z

Identifikace jednoho proteinu

Intensity

ADSMK ADSMKEETSLINVCPWKVNMGGHDSIYTLREEIYTLK EETSLINVCPWK VNMGGHDSIYTLR EEIYTLK MLIILLR MLIILLRTYSHEEDKEWQIDSLAEIRIQPLPMNVSA TYSHEEDK EWQIDSLAEIR IQPLPMNVSA

m/z

Proteinové štěpení • • • • • • •

Trypsin AspN GluC ArgC LysC CNBr Chymotrypsin

K/R-D E-, E/DRKMY/W/K/F-

\-P \-P \-P \-P

\-P

Identifikace proteinu - princip

Přesnost – správnost měření • Da – Dalton - 0.1 – 0.0001 • Th – Thompson – 0.1 – 0.0001 • ppm – parts per million – 100 – 0.1 ppm chyba = 1e6x(naměřená M-teoretická M)/teoretická M

• % 1000.0000 Iontová past 100-1000 ppm

TOF FT-MS 10-100 ppm 0.1 – 1 ppm

Důležitá je přesnost… Čím vyšší přesnost měření, tím méně peptidů potřebujeme pro bezchybnou identifikaci Unikátnost peptidu jako funkce jeho MW

Počet unikátních peptidů jako funkce velikosti proteinu Conrads TP et al . Anal Chem 2002, 72: 3349.

Peptidové mapování MASCOT – Matrix Science - http://www.matrixscience.com/cgi/search_form.pl?FORMVER=2&SEARCH=PMF MS-Fit – Protein Prospector,UCSF - http://prospector.ucsf.edu/cgi-bin/msform.cgi?form=msfitstandard

Pro-Found – Rockefeller University

http://prowl.rockefeller.edu/prowl-cgi/profound.exe http://hs2.proteome.ca/prowl/profound/control.html

Older engines, not available or unstable today PepIdent – SWISS-PROT PepSEARCH – EMBL ~ PepSea – Protana pepMAPPER – UMIST MOWSE – MRC/HGMP

Identifikace proteinů peptidovým mapováním •

Než začneme posbíráme maximum informací - zdroj vzorku (u tkáňových kultur zjistíme zda nebyly modifikovány virem) - postup zpracování, složení pufrů – vliv na modifikace proteinu - fyzikálně chemické informace – MW, pI - potenciální modifikace - typ štěpení, kvalita a čistota enzymu, čistota a stáří chemikálií….

•

Důkladně prohlédneme spektrum, odstraníme známé kontaminace a adukty (pozor na odstranění píků ze vzorku – důležitou roli hraje přesnost a rozlišení) Keller BO. Anal Chim Acta 2008, 627:71.

•

První nástřel provádíme s volnějšími parametry (zkrácené nebo modifikované proteiny mají jiné MW a pI než ty v databázi, organismus není zcela osekvenovaný, atd.) pak upřesňujeme (užší taxonomie, MW a pI interval, přesnost, modifikace, atd.) a sledujeme jak se vyvíjí skóre a počet přiřazených peptidů

•

Zvolíme jeden z prohledávacích programů ProFound – http://prowl.rockefeller.edu/prowl-cgi/profound.exe MASCOT – http://www.matrixscience.com/cgi/search_form.pl?FORMVER=2&SEARCH=PMF MsFit – http://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msfitstandard

•

Nepřiřazené píky buď dále prohledáváme (směs proteinů) nebo se je snažíme přiřadit (nespecifické štěpení, procesing proteinu). Sledujeme i spektrum – je nepřiřazený signál intenzivní nebo ne?

Peptidové mapování – vliv parametrů 784.3656 842.5097 869.3889 870.5407 936.4567 938.4214 941.6030 952.4515 1002.5619 1016.5771 1024.5436 1037.4020 1075.5534 1081.5163 1089.5689 1097.5338 1120.5630 1128.5281 1138.5850 1174.6306 1188.6459 1297.6743 1308.6543 1331.7240 1453.7759 1961.0208 1971.0781

Peptidové mapování – vliv parametrů


Database TaxonomyAll taxa Missed Cleavages Fixed Mods Variable Mods Peptide tol

NCBI 0 0 0 1000



SwissProt 0 0 0 1000









SwissProt 1 C-Cam 0 1000



SwissProt 1 C-Cam M-ox Prot N-ter Ac 1000



SwissProt 1 C-Cam M-ox Prot N-ter Ac 100


Database SwissProt TaxonomyFirmicutes Missed Cleavages 1 Fixed Mods C-Cam Variable Mods M-ox Prot N-ter Ac Peptide tol 100






Database SwissProt TaxonomyS. penumoniae Missed Cleavages 1 Fixed Mods C-Cam Variable Mods M-ox Prot N-ter Ac Peptide tol 1


Unmatched masses: 842.50 – Trypsin 870.54 – very tiny peak 1016.57 - methylation of 1002.56 1024.54 – sodium adduct of 1002.56 1089.57 - methylation of 1075.55 1097.53 - sodium adduct of 1075.55 1128.53 – very tiny peak 1188.65 – methylation of 1174.63 1308.65 - very tiny peak

Peptidové mapování – prezentace výsledků Nutno uvést • instrument a jeho nastavení, typ kalibrace (interní, externí, post-kalibrace) • program/algoritmus použitý pro označení píků, dekonvoluci, vyhlazení/korekce • program a všechny parametry použité pro identifikaci • Skóre (+limit), pokrytí sekvence, počet použitých/přiřazených píků

MALDI FT-ICR (Apollo II Dual source Apex Qe 9.4T) externí kalibrace na Bruker Peptide Mix DataAnalysis 4.0, unprocessed, SNAP v 2.0 MASCOT v 2.2 – Swiss-Prot (verze/datum), S. pneumoniae, Trypsin, m.c. - 1, f.m. - C-Cam, v.m. – Prot N-term acetylated + M-ox, p.t. 1ppm Skóre 249 (48 limit), pokrytí sekvence 53%, 23/26 píků přiřazeno

http://www.mcponline.org/site/misc/PhialdelphiaGuidelinesFINALDRAFT.pdf

Co nám vysoké rozlišení přináší Lepší a rychlejší identifikace proteinů – peptidové mapování Plektin – obrovský protein z cytoskeletu (530kDa, 4900 AK, několik sestřihových variant) MVAGMLMPRDQLRAIYEVLFREGVMVAKKDRRPRSLHPHVPGVTNLQVMRAMASLRARGLVRETFAWCHFYWYLTNEGIAHLRQ YLHLPPEIVPASLQRVRRPVAMVMPARRTPHVQAVQGPLGSPPKRGPLPTEEQRVYRRKELEEVSPETPVVPATTQRTLARPGPE PAPATDERDRVQKKTFTKWVNKHLIKAQRHISDLYEDLRDGHNLISLLEVLSGDSLPREKGRMRFHKLQNVQIALDYLRHRQVKLV NIRNDDIADGNPKLTLGLIWTIILHFQISDIQVSGQSEDMTAKEKLLLWSQRMVEGYQGLRCDNFTSSWRDGRLFNAIIHRHKPLLIDM NKVYRQTNLENLDQAFSVAERDLGVTRLLDPEDVDVPQPDEKSIITYVSSLYDAMPRVPDVQDGVRANELQLRWQEYRELVLLLLQ WMRHHTAAFEERRFPSSFEEIEILWSQFLKFKEMELPAKEADKNRSKGIYQSLEGAVQAGQLKVPPGYHPLDVEKEWGKLHVAILE REKQLRSEFERLECLQRIVTKLQMEAGLCEEQLNQADALLQSDVRLLAAGKVPQRAGEVERDLDKADSMIRLLFNDVQTLKDGRH PQGEQMYRRVYRLHERLVAIRTEYNLRLKAGVAAPATQVAQVTLQSVQRRPELEDSTLRYLQDLLAWVEENQHRVDGAEWGVDL PSVEAQLGSHRGLHQSIEEFRAKIERARSDEGQLSPATRGAYRDCLGRLDLQYAKLLNSSKARLRSLESLHSFVAAATKELMWLN EKEEEEVGFDWSDRNTNMTAKKESYSALMRELELKEKKIKELQNAGDRLLREDHPARPTVESFQAALQTQWSWMLQLCCCIEAH LKENAAYFQFFSDVREAEGQLQKLQEALRRKYSCDRSATVTRLEDLLQDAQDEKEQLNEYKGHLSGLAKRAKAVVQLKPRHPAH PMRGRLPLLAVCDYKQVEVTVHKGDECQLVGPAQPSHWKVLSSSGSEAAVPSVCFLVPPPNQEAQEAVTRLEAQHQALVTLWH QLHVDMKSLLAWQSLRRDVQLIRSWSLATFRTLKPEEQRQALHSLELHYQAFLRDSQDAGGFGPEDRLMAEREYGSCSHHYQQL LQSLEQGAQEESRCQRCISELKDIRLQLEACETRTVHRLRLPLDKEPARECAQRIAEQQKAQAEVEGLGKGVARLSAEAEKVLALP EPSPAAPTLRSELELTLGKLEQVRSLSAIYLEKLKTISLVIRGTQGAEEVLRAHEEQLKEAQAVPATLPELEATKASLKKLRAQAEA QQPTFDALRDELRGAQEVGERLQQRHGERDVEVERWRERVAQLLERWQAVLAQTDVRQRELEQLGRQLRYYRESADPLGAWL QDARRRQEQIQAMPLADSQAVREQLRQEQALLEEIERHGEKVEECQRFAKQYINAIKDYELQLVTYKAQLEPVASPAKKPKVQSG SESVIQEYVDLRTHYSELTTLTSQYIKFISETLRRMEEEERLAEQQRAEERERLAEVEAALEKQRQLAEAHAQAKAQAEREAKELQ QRMQEEVVRREEAAVDAQQQKRSIQEELQQLRQSSEAEIQAKARQAEAAERSRLRIEEEIRVVRLQLEATERQRGGAEGELQALR ARAEEAEAQKRQAQEEAERLRRQVQDESQRKRQAEVELASRVKAEAEAAREKQRALQALEELRLQAEEAERRLRQAEVERARQ VQVALETAQRSAEAELQSKRASFAEKTAQLERSLQEEHVAVAQLREEAERRAQQQAEAERAREEAERELERWQLKANEALRLRL QAEEVAQQKSLAQAEAEKQKEEAEREARRRGKAEEQAVRQRELAEQELEKQRQLAEGTAQQRLAAEQELIRLRAETEQGEQQR QLLEEELARLQREAAAATQKRQELEAELAKVRAEMEVLLASKARAEEESRSTSEKSKQRLEAEAGRFRELAEEAARLRALAEEAK RQRQLAEEDAARQRAEAERVLAEKLAAIGEATRLKTEAEIALKEKEAENERLRRLAEDEAFQRRRLEEQAAQHKADIEERLAQLR KASDSELERQKGLVEDTLRQRRQVEEEILALKASFEKAAAGKAELELELGRIRSNAEDTLRSKEQAELEAARQRQLAAEEERRRR EAEERVQKSLAAEEEAARQRKAALEEVERLKAKVEEARRLRERAEQESARQLQLAQEAAQKRLQAEEKAHAFAVQQKEQELQQ TLQQEQSVLDQLRGEAEAARRAAEEAEEARVQAEREAAQSRRQVEEAERLKQSAEEQAQARAQAQAAAEKLRKEAEQEAARR AQAEQAALRQKQAADAEMEKHKKFAEQTLRQKAQVEQELTTLRLQLEETDHQKNLLDEELQRLKAEATEAARQRSQVEEELFSV RVQMEELSKLKARIEAENRALILRDKDNTQRFLQEEAEKMKQVAEEAARLSVAAQEAARLRQLAEEDLAQQRALAEKMLKEKMQ AVQEATRLKAEAELLQQQKELAQEQARRLQEDKEQMAQQLAEETQGFQRTLEAERQRQLEMSAEAERLKLRVAEMSRAQARAE EDAQRFRKQAEEIGEKLHRTELATQEKVTLVQTLEIQRQQSDHDAERLREAIAELEREKEKLQQEAKLLQLKSEEMQTVQQEQLLQ ETQALQQSFLSEKDSLLQRERFIEQEKAKLEQLFQDEVAKAQQLREEQQRQQQQMEQERQRLVASMEEARRRQHEAEEGVRRK QEELQQLEQQRRQQEELLAEENQRLREQLQLLEEQHRAALAHSEEVTASQVAATKTLPNGRDALDGPAAEAEPEHSFDGLRRKV SAQRLQEAGILSAEELQRLAQGHTTVDELARREDVRHYLQGRSSIAGLLLKATNEKLSVYAALQRQLLSPGTALILLEAQAASGFLL DPVRNRRLTVNEAVKEGVVGPELHHKLLSAERAVTGYKDPYTGQQISLFQAMQKGLIVREHGIRLLEAQIATGGVIDPVHSHRVPVD VAYRRGYFDEEMNRVLADPSDDTKGFFDPNTHENLTYLQLLERCVEDPETGLCLLPLTDKAAKGGELVYTDSEARDVFEKATVSAP FGKFQGKTVTIWEIINSEYFTAEQRRDLLRQFRTGRITVEKIIKIIITVVEEQEQKGRLCFEGLRSLVPAAELLESRVIDRELYQQLQRGE RSVRDVAEVDTVRRALRGANVIAGVWLEEAGQKLSIYNALKKDLLPSDMAVALLEAQAGTGHIIDPATSARLTVDEAVRAGLVGPE FHEKLLSAEKAVTGYRDPYTGQSVSLFQALKKGLIPREQGLRLLDAQLSTGGIVDPSKSHRVPLDVACARGCLDEETSRALSAPRA DAKAYSDPSTGEPATYGELQQRCRPDQLTGLSLLPLSEKAARARQEELYSELQARETFEKTPVEVPVGGFKGRTVTVWELISSEYF TAEQRQELLRQFRTGKVTVEKVIKILITIVEEVETLRQERLSFSGLRAPVPASELLASGVLSRAQFEQLKDGKTTVKDLSELGSVRTLL QGSGCLAGIYLEDTKEKVSIYEAMRRGLLRATTAALLLEAQAATGFLVDPVRNQRLYVHEAVKAGVVGPELHEQLLSAEKAVTGYR DPYSGSTISLFQAMQKGLVLRQHGIRLLEAQIATGGIIDPVHSHRVPVDVAYQRGYFSEEMNRVLADPSDDTKGFFDPNTHENLTYR QLLERCVEDPETGLRLLPLKGAEKAEVVETTQVYTEEETRRAFEETQIDIPGGGSHGGSTMSLWEVMQSDLIPEEQRAQLMADFQA GRVTKERMIIIIIEIIEKTEIIRQQGLASYDYVRRRLTAEDLFEARIISLETYNLLREGTRSLREALEAESAWCYLYGTGSVAGVYLPGSR QTLSIYQALKKGLLSAEVARLLLEAQAATGFLLDPVKGERLTVDEAVRKGLVGPELHDRLLSAERAVTGYRDPYTEQTISLFQAMKK ELIPTEEALRLLDAQLATGGIVDPRLGFHLPLEVAYQRGYLNKDTHDQLSEPSEVRSYVDPSTDERLSYTQLLRRCRRDDGTGQLLL PLSDARKLTFRGLRKQITMEELVRSQVMDEATALQLREGLTSIEEVTKNLQKFLEGTSCIAGVFVDATKERLSVYQAMKKGIIRPGTA FELLEAQAATGYVIDPIKGLKLTVEEAVRMGIVGPEFKDKLLSAERAVTGYKDPYSGKLISLFQAMKKGLILKDHGIRLLEAQIATGGII DPEESHRLPVEVAYKRGLFDEEMNEILTDPSDDTKGFFDPNTEENLTYLQLMERCITDPQTGLCLLPLKEKKRERKTSSKSSVRKRR VVIVDPETGKEMSVYEAYRKGLIDHQTYLELSEQECEWEEITISSSDGVVKSMIIDRRSGRQYDIDDAIAKNLIDRSALDQYRAGTLSIT EFADMLSGNAGGFRSRSSSVGSSSSYPISPAVSRTQLASWSDPTEETGPVAGILDTETLEKVSITEAMHRNLVDNITGQRLLEAQAC TGGIIDPSTGERFPVTDAVNKGLVDKIMVDRINLAQKAFCGFEDPRTKTKMSAAQALKKGWLYYEAGQRFLEVQYLTGGLIEPDTPG RVPLDEALQRGTVDARTAQKLRDVGAYSKYLTCPKTKLKISYKDALDRSMVEEGTGLRLLEAAAQSTKGYYSPYSVSGSGSTAGS RTGSRTGSRAGSRRGSFDATGSGFSMTFSSSSYSSSGYGRRYASGSSASLGGPESAVA

http://xtal.cicancer.org/research.html

Co nám vysoké rozlišení přináší Lepší a rychlejší identifikace proteinů – peptidové mapování MALDI-TOF vs MALDI-FT-ICR

Co nám vysoké rozlišení přináší

TOF

Lepší a rychlejší identifikace proteinů – peptidové mapování

Přiřazeno 384 peptidů Pokrytí 67%

ICR

Proč nedosahujeme 100% pokrytí

Optimální případ (při měření v rozsahu 600-3500 Da) = 88% K-VFGR-CELAAAMK-R-HGLDNYR-GYSLGNWVCAAK-FESNFNTQATNRNTDGSTDYGILQINSR-WWCNDGR-TPGSR-LCNIPCSALLSSDITASVNCAKK-IVSDGNGMNAWVAWR-NR-CK-GTDVQAWIR-GCR-L Bez alkylace = 49% K-VFGR-CELAAAMK-R-HGLDNYR-GYSLGNWVCAAK-FESNFNTQATNRNTDGSTDYGILQINSR-WWCNDGR-TPGSR-LCNIPCSALLSSDITASVNCAKK-IVSDGNGMNAWVAWR-NR-CK-GTDVQAWIR-GCR-L S alkylací, ale limitace množstvím vzorku-reálný stav = 59% K-VFGR-CELAAAMK-R-HGLDNYR-GYSLGNWVCAAK-FESNFNTQATNRNTDGSTDYGILQINSR-WWCNDGR-TPGSR-LCNIPCSALLSSDITASVNCAKK-IVSDGNGMNAWVAWR-NR-CK-GTDVQAWIR-GCR-L Ani nejlepší proteáza není dokonalá K-VFGR-CELAAAMKR-HGLDNYR-GYSLGNWVCAAK-FESNFNTQATNRNTDGSTDYGILQINSR-WWCNDGR-TPGSR-LCNIPCSALLSSDITASVNCAK K-IVSDGNGMNAWVAWRNR-CKGTDVQAWIR-GCR-L

Jak dosahujeme 100% pokrytí Trypsin K-VFGR-CELAAAMK-R-HGLDNYR-GYSLGNWVCAAK-FESNFNTQATNRNTDGSTDYGILQINSR-WWCNDGR-TPGSR-LCNIPCSALLSSDITASVNCAKK-IVSDGNGMNAWVAWR-NR-CK-GTDVQAWIR-GCR-L AspN KVFGRCELAAAMKRHGL-DNYRGYSLGNWVCAAKFESNFNTQATNR NT-DGST-DYGILQINSRWWCN-DGRTPGSRLCNIPCSALLSS-DITASVNCAK KIVS-DGNGMNAWVAWRNRCKGT-DVQAWIRGCRL Chymotrypsin KVF-GRCELAAAMKRHGLDNY-RGY-SLGNW-VCAAKF-ESNF-NTQATNR NTDGSTDY-GILQINSRW-W-CNDGRTPGSRLCNIPCSALLSSDITASVNCAK KIVSDGNGMNAW-VAW-RNRCKGTDVQAW-IRGCRL

Proč věřit identifikaci i když nedosahujeme 100% pokrytí Jsou-li peptidy rovnoměrně rozprostřeny po sekvenci, je to dobré znamení K-VFGR-CELAAAMK-R-HGLDNYR-GYSLGNWVCAAK-FESNFNTQATNRNTDGSTDYGILQINSR-WWCNDGR-TPGSR-LCNIPCSALLSSDITASVNCAKK-IVSDGNGMNAWVAWR-NR-CK-GTDVQAWIR-GCR-L Pokud tomu tak není, podíváme se blíže na sekvenci abychom zjistili, proč nám kus proteinu chybí. Nejčastější příčiny: Chybí zásahové místo pro proteázu V sekvenci je hodně cysteinů a vzorek nebyl alkylován V sekvenci nalezneme potenciální N-glykosylační místa, u sekvencí bohatých na Ser a Thr může jít i o O-glykosylaci Výskyt jiných posttranslačních modifikací (methylace, acylace, fosforylace, GPI kotva, flavinylace, atd.) Pokud máme perfektně pokrytý C-konec, ale chybí kus od N-konce – procesing?

Prediction programs O-glycosylation DictyOGlyc - http://www.cbs.dtu.dk/services/DictyOGlyc/ GlcNAc O-glycosylation sites in Dictyostelium discoideum proteins Example of O-glycosylated propetide from A. oryzae VGVNPLPAPREISWGSSGPKSIAGELQLRTDSDSADGIVADAWNRAWETIVALRWVPAATEAPISSFEPFPTPTAGAS ................................................................................................................................................................................G...........G...............

NetOGlyc - mucin type GalNAc O-glycosylation sites in mammalian proteins http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/ N-glycosylation http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ finds NXS-T sequons and tries to predict which one will be modified

Prediction programs N-glycosylation http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ finds NXS-T sequons and tries to predict which one will be modified Hexosaminidase

GPI anchor http://mendel.imp.ac.at/sat/gpi/gpi_server.html If run on CD73 (GPI on 549) - P21589 The S549 is identified !!!!

Prediction programs Acylation Myristoylator - predicts N-terminal myristoylation of proteins by neural network. Only N-terminal glycines are myristoylated (leading methionines are cleaved prior to myristoylation). http://us.expasy.org/tools/myristoylator/

The entered sequence is: VP2 MGAALTILVD LIEGLAEVST LTGLSAEAIL SGEALAALDG EITALTLEGV MSSETALATM GISEEVYGFV STVPVFVSRT AGAIWLMQTV QGASTISLGI QRYLHNEEVP TVNRNMALIP WRDPALLDIY FPGVNQFAHA LNVVHDWGHG LLHSVGRYVW QMVVQETQHR LEGAVRELTV RQTHTFLDGL ARLLENTRWV VSNAPQSAID AINRGASSAS SGYSSLSDYY RQLGLNPPQR RALFNRIEGS MGNGGPTPAA HIQDESGEVI KFYQAQVVSH QRVTPDWMLP LILGLYGDIT PTWATVIEED GPQKKKRRL This protein is predicted as myristoylated!

Palmitoylation (on Cys residue) http://csspalm.biocuckoo.org/online.php Tested with Lck – P06239 Online version has limitations (<1000AA, etc.) Freely downloadable has no limits

Prediction programs Phosphorylation NetPhos2.0 - produces neural network predictions for serine, threonine and tyrosine phosphorylation sites in eukaryotic proteins http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/

Kinase targets NetPhosK - http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhosK/ Site Kinase Score --------------------S-7 CKII 0.66 S-42 RSK 0.50 S-59 p38MAPK 0.54 S-71 PKC 0.58 S-102 PKA 0.61 T-104 PKC 0.63 S-121 DNAPK 0.50 S-133 PKC 0.59 S-162 PKC 0.53 S-166 PKC 0.77 Y-192 EGFR 0.54 S-194 p38MAPK 0.51

Intensity

Identifikace proteinů ve směsi ADSMKEETSLINVCPWKVNMGGHDSIYTLREEIYTLK ADSMK / EETSLINVCPWK / VNMGGHDSIYTLR / EEIYTLK MLIILLRTYSHEEDKEWQIDSLAEIRIQPLPMNVSA / MLIILLR / TYSHEEDK / EWQIDSLAEIR / IQPLPMNVSA – každý peptid z jiného proteinu!!!

m/z

Identifikace proteinů ve směsi - separace a MS/MS Separace – LC+schopnosti MS

MS

Intensity

MS/MS (CID)

MS MS

time MS/MS (CID)

MS/MS (CID) MS MS/MS (CID)

Peptidové sekvenování

Fragmentace peptidu b1

b2

b3

R1

R3 R4 R2 NH2-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO2H N-konec

C-konec

y3

y2

y1

Přehled aminokyselin v číslech AK G A S P V T C L I N D Q K E M H F R Y W

Gly Ala Ser Pro Val Thr Cys Leu Ile Asn Asp Gln Lys Glu Met His Phe Arg Tyr Trp

Hmotnost 57.02 71.08 87.03 97.05 99.07 101.05 103.01 113.08 113.08 114.04 115.03 128.06 128.09 129.04 131.04 137.06 147.07 156.10 163.06 186.08

Boční řetězec 1 15 31 41 43 45 47 57 57 58 59 72 72 73 75 81 91 100 107 130

Immoniové ionty 30 44 60 70 72 74 76 86(72) 86(72) 87(70) 88 101(84, 129) 101(129, 112, 84, 70) 102 104(61) 110(166, 138, 123, 121, 82) 120(91) 129(112, 100, 87, 73, 70, 59) 136 159

Fragmentace peptidu S-P-A-F-D-S-I-M-A-E-T-L-K MH+ = 1410.6 b-ions+ 88.1 185.2 256.3 403.5 518.5 605.6 718.8 850.0 921.1 1050.2 1151.3 1264.4

y-ions+ S PAFDSIMAETLK SP AFDSIMAETLK SPA FDSIMAETLK SPAF DSIMAETLK SPAFD SIMAETLK SPAFDS IMAETLK SPAFDSI MAETLK SPAFDSIM AETLK SPAFDSIMA ETLK SPAFDSIMAE TLK SPAFDSIMAET LK SPAFDSIMAETL K

1323.6 1226.4 1155.4 1008.2 893.1 806.0 692.3 561.7 490.6 361.5 260.4 147.2

Specific Cleavage at Proline y7

HYPERCLEAVAGE

b11

y2

b16

[M+2H]2+

y8

SSLPPLPGPDK

2+

y8 y7

y5

y8

y5

y7

y3

GTPGELTYSVTYTPGASTNKHPDWWNEK y15

y26

y7

y263+

[M+3H]3+

y182+

y16

y202+

2+

y7 y152+

y212+ y222+ y232+

y172+

y192+

y252+

y262+

Interpretace MS/MS Spekter MASCOT MS/MS SEARCH - Matrix Science http://www.matrixscience.com/cgi/search_form.pl?FORMVER=2&SEARCH=MIS

MS/MS SONAR - Rockefeller University http://hs2.proteome.ca/prowl/sonar/sonar_cntrl.html

MyriMatch

http://fenchurch.mc.vanderbilt.edu/software.php

OMSSA

http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/omssa/omssacgi.cgi?searchsettings=iontrap.xml

!XTANDEM - Rockefeller University http://www.thegpm.org/

PepFrag –Rockefeller University http://prowl.rockefeller.edu/prowl/pepfrag.html

Protein Guru

http://www.proteinguru.com/MassSpec/OLMAT/login

MS Seq, MS Tag - Protein Prospector,UCSF http://prospector.ucsf.edu/cgi-bin/msform.cgi?form=msseq http://prospector.ucsf.edu/cgi-bin/msform.cgi?form=mstagstandard

SEQUEST – Scripps, ThermoFisher Protein Pilot – ABI Sciex Protein Lynx - Waters

MASCOT – MS/MS

MASCOT – MS/MS

MASCOT – MS/MS

MASCOT – MS/MS

MASCOT – MS/MS výsledek Skóre

Report

„Error tolerant search“ report

Jak ověřovat MS a MS/MS data? • Nezávislý experiment – biologický • Manuální procházení MSMS spekter a kontrola přiřazení – expert mode, časově náročné, nemusí být 100%ní • Statistické ověření pomocí tzv. nesmyslných/maskovacích databází – decoy search

Jak ověřovat MS a MS/MS data? Decoy – dvě strategie - invertovaná databáze - zpřeházené sekvence Kolik procent dobrých identifikací získám v „nesmyslné“ databázi – FDR (False Discovery Rate) FDR = FP / (FP + TP) FP – false positive, TP – true postive http://www.mcponline.org/site/misc/PhialdelphiaGuidelinesFINALDRAFT.pdf

False Discovery Rates at Peptide and Protein levels : For large scale experiments, the results of any additional statistical analyses that estimate a measure of identification certainty for the dataset, or allow a determination of the false discovery rate, e.g., the results of decoy searches or other computational approaches.

Jak spočítat hmotnost iontu? • b-ionty 1 + B1 + B2 + B3 + B4 + . . . . • y-ionty 1 + 18 + Y1 + Y2 + Y3 + Y4 + . . . . • a-ionty b – 28 (CO) • immoniové ionty AK zbytek – 27 • MW Σ(AK zbytek) + 18

Pravidla pro čtení sekvence 1.

? Nábojový stav, hmotnost prekurzoru

2.

? C- nebo N-koncová AK – na základě štěpení

3.

? Komplementární ionty – nikdy nekombinovat různé série !!! y + b – 1 = [M+H]+

4.

? a- / b-iontové páry (dif. 28Da)

5.

? Ztráty H2O/ NH3 (dif. 18 / 17Da)

6.

? Vícenásobně nabité ionty + následné neutrální ztráty

7.

? Prolin

m/z 699.62 tryptic digest (-K/-R)

[M+H]+ = 1398.24

ends with -K

AAAAAAAAAAAAAAGAAGK

A

A

A A

A A

A

A

A

A G KG

A

A

G

A

6A

A

A

A G

A A

K

A

A

A

2A

A 2A

MALDI-MS proteinů. jednonásobně nabité ionty, také 2 +,3 +, záleží na matrici a hmotnostním rozsahu

Recommend Documents