Bab I
Pendahuluan
I.1 Deskripsi Topik dan Latar Belakang Penelitian Selama ini informasi sejumlah unsur runut dalam jaringan mahluk hidup dinyatakan dalam bentuk jumlah total unsur tersebut. Informasi ini tidak cukup dan memungkinkan kesalahan interpretasi dalam menjelaskan proses penyerapan, peranan, metabolisme, ketersediaan, akumulasi, defisiensi dan sifat toksisitas suatu unsur. Ada kemungkinan suatu unsur dalam organisme hidup terdiri dari beberapa spesi dengan sifat yang berbeda. Selain itu, evolusi suatu unsur runut dalam suatu organisme hidup terjadi akibat interaksinya dengan lingkungan pengkoordinasian yang sangat kompleks. Interaksi tersebut secara kimiawi dapat digambarkan sebagai ion yang dikelilingi oleh pasangan elektron donor dari ligan biologis. Contoh yang sangat populer adalah spesi Fe dalam hemoglobin, Co dalam vitamin B12, Mg dalam klorofil, dan Zn dalam insulin.
Sekelompok logam lain seperti Cd, Hg, Pb dan metaloid As bersifat toksik. Tingkat toksisitasnya sangat bergantung pada bentuk spesinya dan bukan hanya berdasarkan jumlah totalnya. Misalnya, logam merkuri dalam bentuk metil merkuri (Me2Hg) efek toksisitasnya jauh lebih besar dibandingkan dengan bentuk kation Hg2+ (Cornelis dkk., 2003). Suatu sampel dengan jumlah total merkuri sangat kecil dapat berefek sangat mematikan, sebaliknya pada sampel lain dapat bersifat kurang toksik walaupun kadar totalnya lebih tinggi. Pada beberapa kasus, evolusi unsur runut diikuti dengan sintesis ligan spesifik seperti metallotionein (Lobinski dkk., 1998) atau pembentukan ikatan metalloid-karbon seperti dalam kasus seleno asam amino atau senyawa organoarsen (Szpunar dan Lobinski, 2002).
Berdasarkan permasalahan di atas, pengetahuan tentang spesi unsur sangat penting untuk lebih memahami proses transformasi kimia dan biokimia unsur, peranan dan ketersediaannya serta untuk memperoleh informasi yang lebih lengkap tentang esensial dan toksisitasnya.
Spesi kimia didefinisikan sebagai bentuk spesifik suatu unsur dengan struktur molekular atau kompleks tertentu maupun isotop atau tingkat oksidasi tertentu (Templeton dkk., 2000). Dengan demikian, spesiasi unsur merupakan distribusi spesi kimia unsur tersebut dalam suatu sistem.
Elusidasi proses spesiasi memerlukan analisis spesiasi yang didefinisikan sebagai aktivitas analitik yang mengidentifikasi dan mengukur suatu spesi. Analisis ini meliputi juga proses pengambilan sampel (sampling), kuantifikasi, dan kontrol kualitas metode analitik yang digunakan. Analisis ini dibedakan atas karakterisasi secara operasional dan secara fungsional. Karakterisasi operasional menetapkan prosedur karakterisasi spesi yang tergantung pada metode analitik yang dipilih, dalam hal ini identitas spesi tidak dibahas, sedangkan karakterisasi fungsional memberikan informasi tentang fungsi suatu spesi dalam proses biokimia (Caruso dkk., 2003).
Analisis spesiasi dapat dilakukan dengan menggunakan metode langsung (direct speciation methods) (Ortner, 2003) maupun dengan metode gabungan dan kombinasi (combined and coupled techniques) (Needham dkk., 2005; Caruso dkk, 2003). Beberapa metode spesiasi langsung yang telah digunakan adalah metode isotop, elektrokimia, difraksi dan absorpsi sinar-X, UV-Vis, Infra Red (IR) dan Nuclear Magnetic Resonance (NMR). Metode gabungan dan kombinasi menggabungkan dan mengkombinasikan dua atau lebih metode analisis untuk elusidasi suatu spesi kimia. Spesi yang diinginkan terlebih dahulu dipisahkan dengan menggunakan teknik pemisahan tertentu, kemudian dideteksi secara selektif. Kombinasi teknik yang umum digunakan adalah kromatografi cair (liquid chromatography, LC), elektroforesis kapiler (capillary electrophoresis, CE), dan kromatografi gas (gas chromatography, GC) untuk proses pemisahan spesi serta spektrometri serapan atom (atomic absorption spectrometry, AAS), inductively coupled plasma atomic emission spectrometry (ICP AES), inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) atau electrospray ionisation mass spectrometry (ESI MS) untuk pendeteksian selektif unsur dan molekul. Metode
2
gabungan merupakan metode yang paling umum digunakan dalam analisis spesiasi (Michalke, 2002; 2003b; Caruso dkk., 2003).
Seludang pembuluh (sieve tube) merupakan jalur transport jarak jauh nutrisi dan sinyal antara organ sumber dan organ penyimpanan dalam tanaman. Komposisi cairan floem yang ditransportasikan dalam unsur tapis (sieve element) sangat kompleks dan merupakan spesi yang sangat spesifik (Kehr dkk., 1999). Dalam unsur tapis, karbohidrat dan senyawaan nitrogen dipindahkan dari organ sumber ke organ penimbunan seperti pada bagian pucuk pertumbuhan, kuncup, ujung akar, dan jaringan penyimpanan. Pada tempat terjadinya pertumbuhan tersebut dibutuhkan sejumlah mineral melalui floem. Hal ini dicapai melalui proses transport dari xilem ke floem pada batang dan daun.
Beberapa hasil penelitian menunjukkan unsur-unsur nutrien minor seperti Mn dan Zn ditransportasikan dalam bentuk kompleks khelat dengan senyawa organik (Schmidke dan Stephan, 1995). Sayangnya pengetahuan tentang ligan tersebut masih sangat terbatas. Cairan floem diketahui mengandung sejumlah komponen pembentuk khelat seperti senyawaan asam organik, asam amino, maupun peptida, namun belum ada yang teridentifikasi sebagai ligan transport kation tersebut.
Mullins dkk. (1986) telah membuat analisis komputasi berdasarkan konsentrasi kation dan senyawa organik dalam cairan floem untuk menentukan ligan mana yang sesuai untuk unsur hara tertentu. Penelitian ini sangat informatif namun secara eksperimen sulit dilakukan. Hal ini disebabkan karena kesulitan memperoleh sampel cairan floem dalam jumlah relatif besar untuk proses analisis, konsentrasi unsur tersebut dalam cairan floem sangat kecil sehingga sulit untuk mendeteksinya, dan tingginya kompleksitas matriks cairan floem.
Tanaman jarak (Ricinus communis L.) merupakan salah satu dari sejumlah kecil tanaman model untuk penelitian cairan floem. Cairan floem dapat diperoleh dari tanaman ini dalam jumlah volume yang relatif besar (Milburn, 1970), yaitu sekitar 20 – 80 µL/2 jam sampling/tanaman. Cairan floem dari tanaman ini juga telah
3
diteliti untuk menentukan spesi kimia mangan dan seng (Van Goor dan Wiersma, 1976), nikel dan kobalt (Wiersma dan Van Goor, 1979), konsentrasi ion kalsium (Wiersum, 1979; Brauer dkk., 1998), ion Mg (Zhong dkk., 1993), translokasi unsur Cu, Mn, Zn dan Fe (Stephan dkk., 1994; Schmidke dan Stephan, 1995), karakteristik transport besi (Schmidke dkk., 1999) maupun identifikasi protein pengikat besi (Krüger dkk., 2002). Beberapa penelitian ini dilakukan dengan menggunakan kecambah tanaman jarak (Kallarackal dkk., 1989; Geigenberger dkk., 1993; Sakuth, 1993; Zhong dkk., 1993; Stephan dkk., 1994; Schmidke dan Stephan, 1995; Brauer dkk., 1998; Verscht dkk., 1998; Kalusche dkk., 1999; Schmidke dkk., 1999; Schobert dkk., 2000; Krüger dkk., 2002) dan hanya sedikit yang menggunakan tanaman jarak dewasa. I.2
Masalah Penelitian
Diferensiasi dan distribusi spesi Mg, Ca, Mn, Zn, Mo dan Cd dalam cairan floem tanaman jarak belum terungkap sepenuhnya walaupun fungsi, peranan, defisiensi dan toksisitasnya telah banyak dibahas. Hal ini disebabkan kompleksitas matriks cairan floem yang menyulitkan analisis unsur-unsur runut tersebut. Selain itu, juga disebabkan rendahnya kadar beberapa unsur runut yang membutuhkan teknik analisis dengan kepekaan tinggi. Permasalahan lain adalah menjaga spesi agar tidak terdekstruksi atau mengalami perubahan struktur molekul atau perubahan bilangan oksidasi selama proses analisis. Dengan demikian pemilihan metode analisis yang tepat dan optimasinya sangat diperlukan untuk elusidasi spesi kimia unsur tersebut dalam cairan floem tanaman jarak.
Berdasarkan deskripsi di atas, permasalahan utama penelitian ini adalah: Bagaimana mendiferensiasikan spesi unsur Mg, Ca, Mn, Zn, Mo, dan Cd dengan konsentrasi sampai orde pg/mL dalam cairan floem tanaman jarak?
Dalam penelitian ini, permasalahan difokuskan pada: -
Metode apa yang tepat digunakan untuk memisahkan spesi Mg, Ca, Mn, Zn, Mo, dan Cd dalam cairan floem tanaman jarak (Ricinus communis L.)?
4
-
Bagaimana kondisi optimal untuk memisahkan spesi Mg, Ca, Mn, Zn, Mo, dan Cd dalam cairan floem tanaman jarak (Ricinus communis L.)?
-
Bagaimana metode yang tepat untuk mendeteksi spesi tersebut yang konsentrasinya dalam kisaran pg/mL – µg/mL?
-
Bagaimana distribusi berat molekul spesi Mg, Ca, Mn, Zn, Mo, dan Cd dalam cairan floem tanaman jarak (Ricinus communis L.)?
I.3
Asumsi-asumsi
Teknik Kromatografi eksklusi ukuran (Size Exclusion Chromatography, SEC) dan Quantitative Preparative Native Continuous Polyacrylamide Gel Electrophoresis (QPNC PAGE), merupakan suatu metode pemisahan spesiasi unsur yang telah teruji handal dan banyak digunakan dalam analisis spesiasi. Pemisahan spesiasi bidimensional dapat dilakukan dengan kedua teknik tersebut atau dengan elektroforesis kapiler (Capillary Elektrophoresis, CE). Pemilihan metode pemisahan bidimensional disesuaikan dengan karakter dan distribusi spesi pada pemisahan sebelumnya.
Kandungan unsur-unsur dalam fraksi SEC dan PAGE dideteksi dengan menggunakan ICP-MS. Metode deteksi unsur ini telah terbukti banyak digunakan dalam analisis spesiasi multiunsur karena kemampuan analisis multiunsur pada saat bersamaan, batas deteksi yang rendah hingga tingkat orde pg/mL, akurasi dan presisi tinggi, instrument yang serba guna, serta dapat digunakan untuk analisis hampir semua unsur dalam sistem periodik dan isotop unsur. I.4
Hipotesis Penelitian
Berdasarkan permasalahan penelitian dan kajian pustaka yang dilakukan, maka diajukan beberapa hipotesis sebagai berikut: 1.
Pemisahan tahap I unsur Mg, Ca, Mn, Zn, Mo, dan Cd dalam cairan floem tanaman jarak dapat dilakukan dengan menggunakan SEC dan QPNC PAGE.
2.
Kondisi optimal untuk memisahkan spesi unsur Mg, Ca, Mn, Zn, Mo, dan Cd dalam cairan floem tanaman jarak (Ricinus communis L.) dapat
5
ditentukan dengan melakukan variasi buffer, komposisi buffer, pH, kolom, dan parameter lain yang terkait dengan metode yang digunakan. 3.
Pemisahan spesi unsur yang diduga berikatan dengan protein/polipeptida dapat dipisahkan dengan baik menggunakan teknik bidimensional SEC dan QPNC PAGE.
4.
Pemisahan spesi unsur dengan berat molekul rendah dapat dipisahkan dengan teknik bidimensional SEC dan CE.
5.
Pendeteksian unsur Mg, Ca, Mn, Zn, Mo, dan Cd dalam fraksi SEC dan QPNC PAGE dapat dilakukan menggunakan ICP-MS hingga pada tingkat orde pg/mL.
6.
Spesi dengan kelimpahan relatif kecil dengan berat molekul besar diduga berikatan dengan protein/polipeptida.
I.5
Tujuan Penelitian
Berdasarkan permasalahan di atas, tujuan penelitian dirumuskan sebagai berikut: 1.
Menentukan metode analisis spesiasi yang tepat untuk analisis spesi nutrisi utama Mg dan Ca, spesi kimia nutrisi minor Mn, Zn, dan Mo serta spesi kimia logam berat (Cd) dalam cairan floem tanaman jarak (Ricinus communis L.).
2.
Menentukan kondisi optimal pemisahan spesi unsur Mg, Ca, Mn, Zn, Mo, dan Cd dalam cairan floem tanaman jarak.
3.
Menentukan distribusi berat molekul spesi kimia unsur Mg, Ca, Mn, Zn, Mo, dan Cd dalam cairan floem tanaman jarak.
4.
Memisahkan lebih lanjut spesi kimia unsur Ca dan Mo dalam cairan floem tanaman jarak.
Kontribusi ilmiah yang ingin dicapai dalam penelitian ini adalah mengetahui diferensiasi dan distribusi spesi kimia unsur hara pokok Mg dan Ca, spesi kimia unsur esensial runut Mn, Zn, dan Mo serta spesi kimia logam berat Cd dalam cairan floem tanaman jarak. Diharapkan informasi tersebut dapat bermanfaat untuk mengetahui mekanisme proses transformasi dan transport Mg, Ca, Mn, Zn, Mo, dan Cd dalam cairan floem tanaman jarak. 6
I.6
Ruang Lingkup dan Batasan Penelitian
Masalah utama analisis spesiasi terutama spesiasi unsur runut dalam cairan floem tanaman jarak dewasa adalah sulitnya memperoleh cairan floem dalam jumlah besar, kompleksnya matriks sampel, dan kecilnya konsentrasi unsur tersebut. Oleh karena itu diperlukan metode analisis yang tepat dan optimal untuk mengatasi permasalahan ini.
Penelitian ini difokuskan pada analisis spesiasi operasional, yaitu karakterisasi spesi yang tergantung pada metode analitik yang dipilih. Metode pemisahan primer dilakukan dengan menggunakan SEC sedangkan pemisahan sekunder menggunakan QPNC PAGE dan CE. Pendeteksian selektif unsur dilakukan dengan menggunakan ICP-QMS. I.7
Pelaksanaan Penelitian Secara Garis Besar
Pelaksanaan penelitian mulai dari tahap awal yaitu kultur tanaman sampai pada tahap analisis di laboratorium dilakukan pada Institute of Chemistry and Dynamics of the Geosphere: ICG-III Phytosphere, FZ-Jülich, Jerman pada kurun waktu Oktober 2002 – September 2005.
Penelitian ini terdiri dari 6 tahap, meliputi: (1) Kultur tanaman jarak Kultur tanaman jarak dilakukan di dalam rumah kaca, dimana untuk satu periode tanam berlangsung selama 7-8 pekan. Kultur tanaman dilakukan kontinyu pada kurun waktu April 2003 – Juni 2005 karena kebutuhan sampel yang besar.
(2) Sampling cairan floem. Sampling tanaman jarak yang juga dilakukan di dalam rumah kaca pada masa transpirasi tanaman. Umumnya untuk sekali panen 30 – 40 tanaman berlangsung sepekan. Cairan floem langsung dibekukan dalam tabung berisi nitrogen cair (sekitar -80 °C) sebelum digunakan. Lama penyimpanan maksimal dalam tabung tersebut umumnya 2-3 bulan tergantung kebutuhan.
7
(3) Penentuan kadar total unsur Cairan floem tanaman jarak didestruksi dengan menggunakan metode microwave tertutup untuk penentuan kadar total unsur dan kedapat-ulang unsur setelah proses pemisahan SEC dan QPNC PAGE.
(4) Pemisahan Pemisahan cairan floem tanaman jarak menggunakan berbagai metode pemisahan seperti SEC, QPNC PAGE, dan CE. Pemisahan primer dilakukan dengan metode SEC. Dua kolom SEC digunakan yaitu kolom sephadex G-25 M dan kolom sephadex G-50 SF. Beberapa eluen diaplikasikan pada proses pemisahan ini, yaitu Tris-HCl, MES, dan NaCl. Pemisahan sekunder dilakukan dengan metode QPNC PAGE dan CE. Optimasi metode CE dilakukan cukup intensif dengan menggunakan beberapa eluen, yaitu Tris-HCl, Na2HPO4/NaH2PO4/CTAB, dan H3BO3/CTAB.
(5) Pendeteksian unsur Pendeteksian selektif unsur setelah destruksi dan setelah proses pemisahan SEC dan QPNC PAGE dilakukan dengan menggunakan metode ICP-QMS.
(6) Analisis dan interpretasi data penelitian. Data hasil pemisahan dan analisis pendeteksian unsur ICP-QMS diolah dengan menggunakan program Excel versi 2003 dan untuk memudahkan mengolah puluhan ribu data hasil analisis dibuat program sederhana menggunakan program Visual Basic for Application (VBA) versi 2003.
I.8
Sistematika Disertasi
Disertasi ini terdiri dari 5 bab dengan rincian sebagai berikut: Bab I merupakan pendahuluan yang menguraikan deskripsi topik dan latar belakang penelitian, masalah, tujuan, ruang lingkup dan batasan penelitian, pelaksanaan penelitian secara garis besar dan sistematika disertasi. Bab II menguraikan kajian pusataka yang berkaitan dengan penelitian ini. Bab III berisikan metodologi penelitian yang 8
digunakan untuk menyelesaikan permasalahan penelitian. Bab IV menyajikan data hasil penelitian dan pembahasannya. Terakhir Bab V merumuskan kesimpulan hasil penelitian dan saran-saran tindak lanjut penelitian ini.
I.9
Keaslian Penelitian
Berdasarkan studi literatur yang telah dilakukan, belum ada penelitian tentang diferensiasi dan distribusi spesi Mg, Ca, Mn, Zn, Mo, dan Cd dalam cairan floem tanaman jarak yang dilakukan secara komprehensif menggunakan metoda pemisahan SEC, QPNC PAGE, dan CE dan metoda pendeteksian ICP QMS hingga batas deteksi orde pg/mL serta pemisahan dua tahap spesi Mo dan spesi Ca dengan menggunakan metoda-metoda tersebut di atas. Dengan demikian, penelitian disertasi ini dapat dijamin keasliannya.
9
