Fluorescenční Fluores cenční a radioizotopové metody v mikrobiální ekologii I. Blok - fluorescenční metody 1.
P: Fluorescenční mikroskopie, její použití v limnologii, pojem primární a sekundární fluorescence, specifická vazba fluorochromů C: Příprava preparátů s nízkou fluorescencí pozadí, rozlišení chlorofylu v buňkách mikroorganismů.
2.
P: Barvení fluorochromy, které se vážou na DNA, rozlišení mikroorganismů na prokaryota a eukaryota. C: Barvení DAPI (zvýraznění DNA a jader mikroorganismů)
3.
P: Využití vícenásobného diferenciálního barvení fluorochromy v mikrobiální ekologii, modelový systém predátor-kořist. C: Barvení bakterií DTAF, dobarvení prvoků DAPI, stanovení rychlostí vyžírání bakterií prvoky.
Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
Fluorochromy Akridinová oranž (AO) - váže se na bílkoviny, RNA, DNA - excitační vlnová délka kolem 470 nm - emitované paprsky ve vlnová délce 530-650 nm, žlutozelená až červená
DTAF [ 55-(4, 66-dichlorotriazin dichlorotriazin--2-yl) yl)--aminofluorescein] aminofluorescein] - váže se především na bílkoviny - excitační a emisní parametry velmi podobné AO - používáno pro fluorescenční značení bakteriální kořisti pohlcované fagotrofními prvoky
DAPI (4,6(4,6-diamidino diamidino--2-phenyl indole indole)) - excitační vlnová délka 360 nm - emitované paprsky kolem 490-500 nm, emitované světlo je modré - váže se především na DNA, barví jádra
Primulin - excitační a emisní parametry podobné DAPI, emitované světlo v rozmezí od bílé přes žlutou a zelenou k modré - používán k počítání prvoků a ke zvýraznění jejich povrchových struktur
Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
Fluorescenční mikroskopie - lokalizace fluoreskujících látek nebo objektů v biologických preparátech
PRINCIP - při osvětlení preparátu ultrafialovým nebo modrofialovým světlem (obecně světlem s převahou krátkých vlnových délek )
a) PRIMÁRNÍ = přirozená fluorescence, autofluorescence příklad: chlorofyl a
b) SEKUNDÁRNÍ fluorescence, vyvolaná zabarvením speciálními barvivy tzv. fluorochromy - jestliže na ně posvítíme urč. vlnovou délkou, začnou fluoreskovat, váží se specificky na různé buněčné komponenty Světlo, kterým působíme - excitační vlnová délka, délka, vyvolaná fluorescence - emisní vlnová délka (nebo spektrum)
Podle směru excitačního světla 1. v procházejícím světle 2. EPIFLUORESCENCE - dopadající excitační paprsek shora, odražený (emisní) již s jinou vlnovou délkou
Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
Odražené světlo
Procházející světlo
Epifluorescence
Epifluorescence
Epifluorescence Viry Bakterie Prvoci - řasy Vířníci
(0,1 – 100 µm)
Bacteria
Detritus
Microbial loop Bacteria
Microbial food webs
Phototrophic bacteria 0-106 cells ml -1 Viruses 104-109 ml-1
Mikrobes in 1 ml of lake water
Cyanobacteria 0-105 cells ml -1 Algae 102-104 cells ml -1 Heterotrophic bacteria 105-108 cells ml -1
1 ml ~ 1 cm 3 Hetero- and mixotrophic flagellates 102-104 cells ml -1
Hetero- and mixotrophic ciliates 0-104 cells ml -1
Bakterie
Heterotrofní bičíkovci
“Pikosinice”
Zelení bičíkovci
DAPI
Zelené řasy a sinice
Heterotrofní nálevníci Mixotrofní nálevníci
„normální“ bakterioplankton (Římov)
10 µm 1999 © J. Nedoma
Roklanské j. (Rachelsee, 7.9.99)
20 µm 1999 © J. Nedoma
Plešné j. (6.9.99)
1999 © J. Nedoma
20 µm
Prášilské j. (9.9.99)
20 µm 1999 © J. Nedoma
Fluorescently labeled bacteria - FLB
Dinobryon sp.
Tracer - 5-15% of total bacteria
Pelagostrombidium falax
Ochromonas
Taxon-specific uptake rates Colonial HNF
Halteria sp. Pelogohalteria viridis
Attached flagellates
Stylonichia sp.
Přehrada Římov, Římov, 14.6. 2000
Tracer = 14.6 % Time = 30 min
5 µm
10 µm
Salpingoeca sp.
Attached choanoflagellates - Salpingoeca
10 µm
Halteria sp.
Halteria sp.
Pelogohalteria viridis Pelagotrombidium falax Cyclidium glaucoma
Rimostrombidium brachykinetum
Cinetochylum
Uptake of Synechococcus
Coleps sp.
Rozvoj vláken odolných vůči predaci prvoků
0h
24 h
48 h
LOW
FISHSTOCK
i i ii i i
i i ii
i i i i i ii i ii i i
HIGH
i i i i
Bacteria
i
i i
Characteristické rysy predace prvoků na bakteriích 1. Selekce větších bakteriálních buněk - přednostně pohlcují větší, dělící se buňky SELEKCE
2. Rozvoj populací bakterií odolných vůči predaci i ii i i ii i i i i i i i ii i ii i i i
i i i
3. Predace prvoků na bakteriích a bakt. produkce positivně korelovány - vysoká růstová rychlost nebo aktivita vztažená na buňku za situace intenzivního žíru bakterií prvoky
Substrá Substr át
Neaktivní buňky
Velká biomasa Nízká aktivita !
Malá biomas biomasa a Vysoká aktivit tivita a!
1. Laboratorní Laboratorní studie Kontinuální kultivace bakterií s prvoky s různou potravní specializací
2. Terénní pokusy Pokusy in situ v dialyzačních pytlích - různě manipulovaná planktonní společenstva pomocí velikostní frakcionace vzorků (nádrž Římov)
Continuous flow system Stage - I Light
Rhodomonas sp.
Inorganic P-limited medium
exudates + accompanying bacteria
II / Control
II / Bodo
Bacterivory
II / Urotricha Algivory
9
0.6
6
0.4
3
0.2
0
0.0 1.2
15
II / Control
12
1.0 0.8
9
0.6
6
0.4
3
0.2
0
0.0
II / Bodo
15 12 9
2.1 1.8 1.5
Bodo
1.2 0.9
6
0.6 3
0.3
0
0.0 1.2
15 4
12
3
9 6
2
3
1
0
0
102 Urotricha ml-1
5
106 bacteria ml-1
0.8
II / Urotricha
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
0 2 4 6 8 10 12
0 2 4 6 8 10 12
days
days
Bact. cell volume (µm3)
Bact. cell vol. Bodo - TGR
1.0
Bact. cell volume (µm3)
Bacteria
12
Bact. cell vol. (µm3) TGR (106 bact. ml-1 h-1)
Stage-I
Bact. cell volume (µm3)
106 bacteria ml-1 104 Bodo ml-1
106 bacteria ml-1
106 bacteria ml-1
1.2 15
Large filaments BET-proteobact.
Epifluorescence a analýza obrazu
Vlákna (objemy a biomasy)
Ribozómy
70 S
(2 podjednotky)
30 S Molekuly RNA
16 S
50 S 23 S
5S
Oligonukleotidové Sondy / Próby Úseky konzervativní Úseky specifické pro skupiny nebo druhy bakterií Funkce - závisí na počtu ribozómů
Fluorochrom
C G A T C A A T T G C G A C A
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
G C T A G T T A A C G C T G T
DAPI
Betaproteobacteria
Overlay
Bacterioplankton at the beginning of the experiment
Alpha-Proteobacteria Beta-Proteobacteria Gamma-Proteobacteria
% of DAPI-stained bacteria
100 80
Inoculation
Stage-I
II / Bodo
60 40 20 0 100 80
II / Urotricha
II / Control
60 40 20 0 1 2 3 4 5 6
Days
8
10
12
1 2 3 4 5 6
8
Days
10
12
Hybridized in food vacuoles Bodo abundance [*105 ml-1]
2.0 with ingested Alpha-Proteobacteria with ingested Beta-Proteobacteria
1.6 1.2 0.8 0.4 0.0
1 2 3 4 5 6
Days
8
10
12
Low quality food
????
BET
Cell--wall properties Cell
ALF
Growth rate ≥ Predation
Filament formation BET
“Top-down” manipulační pokus “Topv dialyzačních pytlích, Římov
Velikostní frakcionace (triplikáty)
< 0.8 µm Bakterie & viry
< 5 µm Bakterie, viry a bičíkovci
Inkubace: 4 dny Vzorkování: 0, 24, 48, 72, a 96 hodin
Nefiltrov. Nefiltrovaná kontrola
Nejnápadnější dopady pokusných manipulací: manipulací: < 5 µm varianta = „zvýšená predace prvoků prvoků“, “, ZOOPLANKTON
PREDACE
Bakteriá teriální produkce a změny mor morfologie fologie
Složení ba bak kter teriálního iálního společenstva
< 5 µm
< 0.8 µm
Reservoir
12 10 8 6 4
0.3 0.2 0.1
2
0.0 50
0
0
12
24
48
72
96
10
40
8
30
6
20
4 2
10
0
0 0
24
48
72
Time [hours]
96
0
24
48
72
Time [hours] HNF Ciliates
96
0
24
48
72
96
Time [hours] Bacterial production HNF - total grazing Ciliates - total grazing
Ciliates ml-1 103 HNF ml-1
106 bacteria ml-1 Bacterial production Total grazing rate [106 bacteria ml-1d-1]
Bacterial abundance Bact. cell volume
Mean cell volume [µm3]
0.4
14
< 0.8 µm
< 5 µm
Reservoir
BET42a R-BT065 CF319a
50 40
% DAPI stained cells
30 20 10 0 5 4 3 2 1
GAM42a
90
EUB338
80 70 0
24
48
72
Time (hours)
96
0
24
48
72
Time (hours)
96
0
24
48
72
Time (hours)
96
DAPI
Beta-Proteobacteria
Overlay
Ba Bak kterioplankton na začátku pokusu T=0h
DAPI
Beta-Proteobacteria
96 hodin
Typická struktura vloček ve variantě < 5 µm
Overlay
DAPI R-FL615
10 µm
72 hodin Vlákna odolná vůči predaci prvoků (< 5 µm varianta)
Flectobacillus cluster
Overlay
DAPI
72 hours Morphotypes of CF in grazing-resistant flocs (< 5 µm treatment)
CF
Overlay
Bacteriální buňky hybridizované přímo v potrav. Vakuolách prvoků
Cyclidium glaucoma
Beta-proteobacteria
Bodo saltans Bodo saltans
Bakteriální buňky hybridizované přímo v potravních vakuolách bičíkovců (CARD-FISH protokol) Příklad – buňky hybridizované se sondou R-BT065 častou kořistí bičíkovců v nádrži
R-BT065
Naopak GRAM GRAM+ + Actinobacteria 5 µm
negativně negativ ně sele selektovány ktovány bičíkovci
Přehrada Římov - vliv bakteriofágů SYBRGreen barvení
TEM
VIRY VIRY hostitelsky hos titelsky specifické specifické
Vysoce pravděpodobný vliv na složení společenstev bakterií
Virové částice
Podíl viditelně infikovaných bakteriálních buňek - možnost stanovit mortalitu bakterií způsobenou viry
24 24--36 h
Selektivní predace
Host-specifické viry
“Killing the winner” (Thingstad and Lignell 1997)
Mikroautoradiografie
3H-substrát
Filtrace Fotoemulze
Expozice ve tmě Vyvolání
Bakterie
Mikroautoradiografie
Jednotlivé buňky nebo shluky bakterií
Autoradiografické stopy
Bakterie přisedlé na řasách
“Spirilum”
The composed image of microautoradiography and CARDFISH created by image analysis (top panel). The composition consists of three images, which are shown bellow. The DAPI- and probe-images (GAM) were used to determine the relative abundance of different bacterial groups, while the proportion of bacteria taking up leucine were determined as the % of bacteria connected with black spots formed by silver grains.
DAPI
probe
% of probe-defined groups of bacteria
grains
% of bacteria taking up leucine
R-BT065
Mikroautoradiografie & CARD-FISH - příjem leucinu ve variantě se zvýšenou predací prvoků na bakteriích (<5 µm)
T=0h
T = 72 h Buňky hybridizované se sondou R-BT065 - vzestup jejich relativního podílu ve společenstvu
Velký růstový potenc potenciál ! - nárůst % aktivních buněk (R-BT065), > 95% aktivních při intenzivní predaci prvoky
Velmi aktivní skupina !
Metody analýzy analýzy obrazu - rychl ychlé é kvantitativní stanovení organismů - rychlé proměření vybraných parametrů populace - délka, šířka, objem - stanovení obsahu určitých látek DNA – vztah k rychlosti růstu RNA - vztah k proteosyntéze - kvantifikace síly fluorescenčního signálu - třídění populace podle “aktivitního parametru”
Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
Další využití fluorescenční mikroskopie - v kombinaci s analýzou obrazu – přesné stanovení biomasy mikroorganismů < 1µm
- imunofluorescence
- “genetické próby” – část molekuly RNA komplementární s určitým úsekem RNA na ribosomu bakterií. - enzymatické aktivity individuální buněk (řas a bakterií)
Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
Plešné j. (8.6.99)
P limitace (Al) aktivní extracelulární fosfatázy (ELF®97 fosfát)
10 µm 1999 © J. Nedoma
Plešné jezero (9.10.00)
50µm 2000 © A. Štrojsová
Autofluorescence fytoplanktonu, aktivní extracel. fosfatázy
ELF®97 phosphate ~ detects active phosphatase sites & phytoplankton autofluorescence @LUCIA at a species-specific level
Cryptomonas
Peridinium
Bacterial filaments
Gymnodinium
Ceratium Elakatothrix Pediastrum
Chlorogonium
Fragillaria Cosmarium Staurastrum
ELF®97 phosphate ~ detects active phosphatase sites & phytoplankton autofluorescence @LUCIA at a population level
Elakatothrix
Eudorina
Cell-specific phosphatase activity measurement Brightness of ELF precipitates
with the image analysis system LUCIA 4
3 Chlorogonium fusiforme 25 Jun 2001 736 fmol cell-1 h-1
2
Peridinium umbonatum 1 Nov 2000 72 fmol cell-1 h-1
1
0 0
5
10
15
min
20
25
30
