Hydrochip: de toekomst van monitoring, de monitoring van de toekomst

Hydrochip: de toekomst van monitoring, de monitoring van de toekomst

Frank Schuren, Holger Cremer, Bendert de Graaf, Adrie Atsma, Gert van Ee, Ron van der Oost, Theo Janse, Tessa van der Wijngaart, Marco Jaspers Uitvoerend consortium: STOWA, TNO, Vitens, Waternet & Hoogheemraadschap Hollands Noorderkwartier

INHOUD

INLEIDING KRW-Monitoring: NU KRW-Monitoring: DNA een Alternatief? KRW Monitoring: Fluorescentie een Alternatief? Referenties ACHTERGROND Hoe werkt de Hydrochip? Fluorescentiemetingen

4 4 4 6 6 7 7 14

Principe van de fluorescentie-analyse Uitvoering van de fluorescentie-analyse Referenties

14 14 15

ONTWIKKELING HYDROCHIP Achtergrond Selectie DNA Beschikbaarheid 18s rRNA gen DNA volgordes Gesloten benadering Open benadering

16 16 16 18 18 20

RESULTATEN Vergelijking resultaten microscopische kiezelalgentellingen en Hydrochip

23 23

Soortlijsten Habitattypering Referenties Ervaringen met de praktijkchip Statistische relaties tussen fluorescentie- en fytoplanktonanalyses Gegevensverzameling en –ordening Relatie fluorescentiemeting – fytoplanktontelling Relatie met biodiversiteit Conclusies Referentie Slotopmerking

23 25 26 27 28 28 28 33 34 34 35

2

SAMENVATTING De Hydrochip, een chip waarmee snel en betrouwbaar de kwaliteit van het oppervlaktewater kan worden vastgesteld, is de afgelopen twee jaar binnen het STOWA/Watermozaïekprogramma ontwikkeld door een consortium van STOWA, Vitens, Waternet, Hoogheemraadschap Hollands Noorderkwartier en TNO. Het project beoogt om bij te dragen aan een kosteneffectieve en efficiente monitoring van de waterkwaliteit. Waterschappen werken hard aan het bereiken van een goede chemische en ecologische waterkwaliteit. Een goede kwaliteit van het oppervlaktewater heeft belangrijke waarde op zichzelf en is ook essentieel voor drinkwaterproductie, visserij en recreatie. De kwaliteit van oppervlaktewater staat op veel plaatsen onder druk door de emissies van bijvoorbeeld zware metalen, meststoffen en bestrijdingsmiddelen, maar ook door aanpassingen aan de watersystemen. Het kunnen volgen van de kwaliteit van het oppervlaktewater is van belang om de ontwikkeling te volgen en ook om effecten van maatregelen te kunnen evalueren. Kiezelalgen of diatomeeën komen in bijna alle wateren voor en de aan- of afwezigheid van bepaalde soorten van deze algen is een goede indicator voor de kwaliteit van water. Zoeken in watermonsters naar kiezelalgen met behulp van een microscoop is de huidige manier van monitoren. Dit is een tijdrovende en dure klus. De Hydrochip wil een alternatief bieden voor deze werkwijze. Hydrochip De Hydrochip kan snel detecteren welke levensvormen er aanwezig zijn in water. Door DNA van veel voorkomende algen en bacteriën (bijvoorbeeld blauwalg) te gebruiken kan je met behulp van de Hydrochip snel ‘lezen’ welke levensvormen er wel of niet aanwezig zijn in het water. De Hydrochip kan zo makkelijk testen welke soorten kiezelalg aanwezig zijn in het water en dit vertalen naar de kwaliteit van het water. Om de Hydrochip in praktijk te gebruiken is nog wel verdere ontwikkeling nodig. De Hydrochip kan nu nog maar enkele waterorganismen detecteren. Door gebruik te maken van generieke DNA technologie zal de Hydrochip in de toekomst ook andere relevante waterorganismen zoals blauwalg kunnen opsporen. Op deze manier is in dit project de basis gelegd voor kostenefficiënte en effectieve monitoring ten behoeve van waterbeheer in het kader van de Europese Kaderrichtlijn Water (KRW) en de Zwemwaterrichtlijn.

3

INLEIDING KRW-Monitoring: NU Een goede kwaliteit van het oppervlaktewater is van essentieel belang voor gezonde aquatische ecosystemen. Maar ook voor allerlei andere functies van het water, zoals visserij, recreatie en drinkwaterproductie. De kwaliteit van het oppervlaktewater in Nederland staat op veel plaatsen echter onder druk, vooral door eutrofiëring (overmatige belasting met voedingsstoffen), strakke waterpeilen en harde oeverbeschoeiingen. Waterbeheerders houden de ecologische kwaliteit van de Nederlandse oppervlaktewateren nauwlettend in de gaten. Deze monitoring vormt de basis voor effectief en doelmatig beheer en onderhoud, en voor het nemen van de juiste herstelmaatregelen, in het kader van de Europese Kaderrichtlijn Water (KRW) en de Zwemwaterrichtlijn. In het waterbeheer is, door de komst van de KRW, bij het onderzoek naar de kwaliteit van oppervlaktewater de nadruk komen te liggen op ecologie. Schoon en gezond water herbergt allerlei soorten dieren en planten in de goede aantallen en verhoudingen. Met behulp van KRW-maatlatten wordt aan de hand van de aanwezige soorten en hun aantallen afgelezen in hoeverre de referentie of het doel wordt bereikt. Ook de chemische kwaliteit wordt meegenomen in de beoordeling. Essentieel is dat de soorten dieren en planten goed worden onderzocht: met reproduceerbare en representatieve meetmethoden en correcte namen van de aangetroffen soorten. De ecologische monitoring bestaat nu uit het bemonsteren en analyseren van veldmonsters door gespecialiseerde medewerkers, die hiervoor naast de protocollen vooral afgaan op hun ervaring en (veld)kennis. Omdat de resultaten vergelijkbaar moeten zijn met die van hun collega’s in binnen- en buitenland zijn er handboeken en voorschriften. Het Handboek Hydrobiologie [1] en de NEN en CEN voorschriften zijn hiervan voorbeelden. Een van de belangrijkste wettelijk verplichte onderdelen bij het onderzoek naar de waterkwaliteit is het vaststellen welke soorten planten en dieren zijn aangetroffen. De KRW vraagt om onderzoek naar hogere planten (water- en oeverplanten, macrofyten), algen (kiezelalgen of fytobenthos, fytoplankton), macrofauna (kleine waterdieren) en vissen. Dit vereist specialisten in iedere groep die de verschillende soorten in hun verschillende stadia (larven, volwassen dieren) op naam kunnen brengen: het determineren tot op de soort. Het belang hiervan is dat iedere type water en iedere waterkwaliteit zijn eigen combinatie kent van aantallen van verschillende soorten: in vervuild water komen andere soorten en aantallen voor dan in schoon, onverstoord water. Voor een aantal groepen van organismen is de huidige werkwijze voor KRW-monitoring arbeidsintensief en vereist specialistische kennis. Deze handelingen zijn relatief duur en kosten veel tijd. Ook zijn er voor een aantal groepen (te) weinig specialisten om al die honderden soorten vakkundig te determineren. Een goedkope, snelle en betrouwbare methode om deze organismen te determineren zou een goede aanvulling zijn op de huidige methoden.

KRW-Monitoring: DNA een Alternatief? DNA is ‘hot’. Op tv en in de pers zien we regelmatig ‘DNA’ opduiken, bij de opheldering van misdrijven (‘cold cases’) , of bijvoorbeeld bij het bepalen van de herkomst van voedselbedervers (‘EHEC’). Deze voorbeelden geven aan dat de DNA-technologie de afgelopen tijd een enorme vlucht

4

heeft genomen. Dat blijkt ook uit het feit dat belangrijke DNA milestones elkaar steeds sneller volgen: • • • • • • • •

1869: Ontdekking DNA door Miescher 1944 Avery beschrijft DNA als drager erfelijke informatie 1953: Watson en Crick beschrijven DNA structuur 1975: Sanger beschrijft methode voor bepalen samenstelling DNA (sequencing) 1983: Mullis beschrijft methode voor vermeerderen DNA (PCR) 1995: Eerste bacteriële genoomsequentie beschikbaar 2001: Humane genoomsequentie beschikbaar 2006: Nieuwe generatie DNA sequencing technieken beschikbaar (ook gebruikt voor het Hydrochip project)

Die snelle ontwikkeling geldt ook voor de toepassing van DNA-technologie voor het vaststellen van soorten in de biologie. Wereldwijd zijn initiatieven ontstaan voor DNA-barcoding: een methode in de taxonomie waarbij een stukje DNA wordt gebruikt om vast te stellen tot welke soort deze behoort. Ook in Nederland wordt aan dit programma deelgenomen, namelijk bij Naturalis Biodiversity Centre in Leiden. Met behulp van deze DNA-barcodes is het dus mogelijk om op een heel andere en veel snellere manier te kijken naar de soortenrijkdom. Deze technologie kan ook worden ingezet voor KRWmonitoring. Er wordt dan niet meer gekeken naar de uiterlijke verschijningsvorm om een (soort)label te kunnen toekennen aan een organisme. In plaats daarvan wordt gekeken naar de DNA-barcode. In het Hydrochip project is een chip gemaakt waardoor relatief snel de belangrijkste soorten kiezelalgen in een watermonster kunnen worden bepaald. Hiertoe wordt gebruik gemaakt van specifieke stukjes DNA die overeenkomen met bepaalde indicatorsoorten. Hiermee is een snelle analyse te maken van de afgeleide waterkwaliteit. Naast kiezelalgen wordt in het project Hydrochip ook al gekeken naar de mogelijkheden voor blauwalgen, die vooral voor de monitoring van zwemwateren van belang zijn. Doel is om met een goede, eenvoudige, generieke technologie een snelle en routinematige beoordeling te kunnen uitvoeren. Daardoor komen sneller resultaten beschikbaar en kan beter worden gestuurd op maatregelen voor het verbeteren van de waterkwaliteit en ecologie in het oppervlaktewater. Hoewel een goed werkende Hydrochip een snelle en goede methode moet opleveren voor routinematige analyse van de biologische waterkwaliteit is het geen simpele vervanging van de huidige meetmethodiek. Het onderzoek naar DNA bij soortherkenning wordt wereldwijd uitgevoerd en gezien als belangrijke toevoeging aan de taxonomie [2]. De Hydrochip zal ook belangrijk zijn om meer aandacht te krijgen voor kennis over soorten planten en dieren. Immers, een lijst met soorten is de start om informatie te krijgen over de biologische waterkwaliteit. Routinematig werk wordt hiermee eenvoudiger, maar er zal meer vraag komen naar specialisten die kennis hebben over aangetroffen soorten. Daarnaast kunnen andere belangrijke thema’s meer aandacht krijgen: biodiversiteit, ecologie van soorten, kennis over zeldzame en kenmerkende soorten.

5

KRW Monitoring: Fluorescentie een Alternatief? Binnen het Hydrochip project is ook onderzocht wat de waarde is van fluorescentie spectrometrie, de simpelste en goedkoopste methode voor het volgen van fytoplanktonpopulaties in oppervlaktewater. Deze methode is gebaseerd op het feit dat verschillende typen algen door hun specifieke kleurstoffen een ander fluorescentiepatroon vertonen. Door het fluorescentiesignaal te meten kunnen semi-kwantitatieve uitspraken worden gedaan over de aanwezigheid van groepen algen in het oppervlaktewater.

Referenties [1] Bijkerk R (red) (2010) Handboek Hydrobiologie. Biologisch onderzoek voor de ecologische beoordeling van Nederlandse zoete en brakke oppervlaktewateren. Rapport 2010 - 28, Stichting Toegepast Onderzoek Waterbeheer, Amersfoort. [2] Moritz, C., C. Cicero, 2004. DNA barcoding: Promise and pitfalls. PLoS Biol 2(10): e354.

6

ACHTERGROND Hoe werkt de Hydrochip? Door toepassing van de Hydrochip krijgen waterbeheerders een betrouwbaar beeld van de soortsamenstelling van de kiezelalgenflora in het water en daarmee van de nutriëntenbelasting of trofische status. De chip wordt gemaakt door specifieke stukjes DNA (DNA barcodes/probes/targets) van gekozen algensoorten te ‘plakken’ op een glasplaatje. Hierdoor ontstaat een patroon van DNA ‘spots’ op de chip. Het analyseren van oppervlaktewatermonsters met behulp van de Hydrochip kan worden opgedeeld in een aantal afzonderlijke stappen. De eerste stap is het nemen van het oppervlaktewatermonster. Dit monster wordt vervolgens gefiltreerd waardoor alle (eventueel) aanwezige kiezelalgen worden opgevangen. Door vervolgens het filter in behandeling te nemen, is het mogelijk het DNA afkomstig van kiezelalgen te isoleren. Het geïsoleerde DNA wordt daarna vermeerderd (‘geamplificeerd’) in een zogenaamde PCR stap (polymerase chain reaction). Dit houdt in dat het DNA van de algen vermeerderd wordt (figuur 1).

Figuur 1.: Principe van de PCR stap om grote hoeveelheden DNA te vermeerderen.

Na deze vermeerderingsstap wordt het DNA voorzien van een fluorescente chemische groep (voor latere detectie) en vervolgens in contact gebracht met de Hydrochip, waarna de hybridisatiestap plaatsvindt: de soortspecifieke stukjes DNA van diatomeeën binden zich dan aan het target-DNA van de Hydrochip. (figuur 2).

7

Figuur 2. Binding van gelabeld DNA aan target-DNA op de Hydrochip.

DNA van soort A zal binden aan het spotje waarop zich het target-DNA van soort A bevindt, DNA van soort B zal binden aan target DNA van B, etc. Op deze manier ontstaat een patroon van spotjes die ‘aan’ (binding: soort aanwezig) en ‘uit’ staan (geen binding: soort afwezig). Om dit patroon waar te kunnen nemen, wordt met een chipreader een foto van de Hydrochip gegenereerd. Dit resultaat geeft dus aan welke diatomeeën aanwezig zijn in het onderzochte oppervlaktewatermonster. Het analyseren van oppervlaktewatermonsters met behulp van de Hydrochip kan worden opgedeeld in een aantal afzonderlijke stappen. De eerste stap is het nemen van het oppervlaktewatermonster. Dit monster wordt vervolgens gefiltreerd waardoor alle (eventueel) aanwezige algen worden opgevangen. Door vervolgens het filter in behandeling te nemen, is het mogelijk het DNA afkomstig van algen te isoleren. Het geïsoleerde DNA wordt daarna vermeerderd. Na deze vermeerderingsstap wordt het DNA aangebracht op de Hydrochip, waarna de hybridisatiestap plaatsvindt: het DNA van kiezelalgen bindt zich hierbij aan het target-DNA van de Hydrochip. Er ontstaat een patroon van spotjes dat aangeeft welke kiezelalgen aanwezig zijn in het onderzochte oppervlaktewatermonster.

8

De verschillende stappen zijn weergegeven in onderstaande figuren.

Figuur 3A. Monstername (in dit geval een rietstengel voor fytobenthos analyse).

Figuur 3B. Kiezelalgenconcentratie door middel van filtratie.

9

Figuur 3C. Extractie van DNA door het openbreken van kiezelalgen gevolgd door zuivering van het DNA.

Figuur 3D. Labelling van het DNA door markermoleculen (bijvoorbeeld fluorescentie).

10

Figuur 3E. Schema van de Hydrochip die zich bevindt op de bodem van een reactievaatje (hoogte ca. 4 cm).

Figuur 3F. Binding (hybridisatie) van gelabeld monster-DNA aan overeenkomstig target-DNA aan het oppervlak van de Hydrochip.

11

Figuur 3G. DNA-spots die een signaal geven met DNA dat geïsoleerd is uit een water- of rietstengelmonster (dit duidt op aanwezigheid van de betreffende soorten in het monster!).

Figuur 3H. Chip reader voor het uitlezen van de Hydrochip.

Het principe van de Hydrochip is visueel weergegeven in een film: http://www.youtube.com/watch?v=8ui4bx0L9-o

12

De volgende stap is om het patroon te vertalen in een telling. Een telling die nu gebaseerd is op soortenidentificatie op basis van DNA in plaats van microscopische verschijningsvormen. Deze telling wordt vervolgens vertaald in een eutrofiegraad met behulp van de methodieken zoals die beschreven zijn in de KRW-maatlatten (figuur 4).

Figuur 4. Van kiezelalg (diatomee) naar ecologische kwaliteit.

13

Fluorescentiemetingen Principe van de fluorescentie-analyse Chlorofyl-a is een universeel fotosynthesepigment dat voorkomt in alle fytoplanktonsoorten en kan daarom gebruikt worden als indicator voor de biomassa. Fluorescentie spectroscopie is een van de methoden waarmee chlorofyl-a kan worden geanalyseerd. Met fluorescentie spectroscopie kunnen de verschillende soorten algen niet worden onderscheiden, maar het is wel mogelijk om onderscheid te maken tussen verschillende groepen fytoplankton. Al deze groepen hebben namelijk specifieke kleurstoffen: fycocyanine is karakteristiek voor blauwalgen, chlorofyl-b voor groenalgen, chlorofyl-c en fucoxantine voor kiezelalgen en fucoerytricine en peridynine voor overige genera, zoals dinoflagellaten en cryptofyten (Beutler et al, 2002). Het principe van de fluorescentie analyse bij fytoplankton is schematisch weergegeven in figuur 5. Ingestraald licht, met een voor de kleurstof specifieke golflengte, wordt geabsorbeerd door deze voor de groep karakteristieke kleurstof. De verhoogde energie door deze lichtabsorptie wordt door het fotosyntheseapparaat zeer efficiënt aan chlorofyl-a overgedragen. De opgenomen energie wordt door chlorofyl-a omgezet in lichtuitstraling (fluorescentie), die gevoelig kan worden gedetecteerd. Door de fluorescentie te meten, na instraling van verschillende golflengen, kan onderscheid worden gemaakt tussen de relatieve bijdragen van verschillende fytoplanktongroepen aan het gedetecteerde signaal. De fluorescentie signalen zijn evenredig met de chlorofyl-a concentraties van de algen (lineair verband tot 500µg chlorofyl/l).

Figuur 5. Schema van het principe van de fluorescentie-analyse van fytoplankton. Lichtinstraling (respectievelijk 610, 450, 525 en 570 nm voor blauwalgen, groenalgen, kiezelalgen en cryptofyten/ flagellaten) leidt tot een hoger energieniveau van de specifieke kleurstoffen in deze groepen fytoplankton. De energie wordt van de kleurstoffen overgedragen aan chlorofyl dat hierdoor gaat fluoresceren (lichtuitstraling van 685 nm), hetgeen wordt gedetecteerd door de fluorometer. Uitvoering van de fluorescentie-analyse De fluorescentie-analyses binnen dit project zijn uitgevoerd met de laboratoriumuitvoering van de Fluoroprobe II van bbe Moldaenke (figuur 6), volgens een gecertificeerd protocol van Waterproef (laboratorium van Waternet en HHNK in Edam). De Fluoroprobe is door de fabrikant gekalibreerd op 14

chlorofylgehalten. Bij elke meting worden de instellingen van het apparaat gecontroleerd met een nulmeting met afgeschermde lichtbron en een blanco meting met gedemineraliseerd water. Als de instellingen afwijken wordt het apparaat opnieuw gekalibreerd. Aan de hand van het meetsignaal na instraling met 4 LED’s (verschillende specifieke golflengten), wordt met behulp van een ingevoerde constante een beste fit berekend, waarbij een schatting van het aandeel van de vier algengroepen wordt gemaakt. Het meetsignaal wordt omgerekend naar µg chlorofyl-a/l. De monsters worden voor de analyses gekoeld en in het donker bewaard. De metingen worden uitgevoerd door 25 ml monster in een kwarts meetcuvet te brengen en hiervan 12 maal de fluorescentie te meten bij 4 golflengten. De fluorescentiewaarden worden omgerekend naar chlorofylgehalten en opgeslagen in de computer, waarna de gemiddelde waarden worden berekend met een Excel dataverwerking programma.

4

1 2

5

3

7 8

6

9 10

Figuur 6. De bbe Moldaenke Fluoroprobe II; 1. voeding; 2. aan/uit schakelaar; 3. regelaar roersnelheid; 4. cuvetkamer met meetgedeelte voor 25 ml cuvet; 5. kalibratiecuvet (alleen gebruikt bij Rijnland) 6. transmissie venster; 7. LED venster; 8. detector venster; 9. cuvethouder; 10. afschermkap.

Referenties Beutler M, Wiltshire KH, Meyer B, Moldaenke C, Lüring C, Meyerhöfer M, Hansen UP, Dau H, 2002. A fluorometric method for the differentiation of algal populations in vivo and in situ. Photosynth Res. 72: 39-53.

15

ONTWIKKELING HYDROCHIP Achtergrond De oorsprong van de biologie ligt in het observeren van levende cellen. Ook de huidige beoordeling van de ecologische kwaliteit van oppervlaktewater is gebaseerd op het voorkomen en aantallen van soortgroepen. De verschillende soorten, waaronder kiezelalgen, worden gebruikt als indicatororganismen voor (veranderingen in) de kwaliteit van het water. De microscopische analyses waarmee kiezelalgenpopulaties worden bepaald hebben een aantal beperkingen. Zo is er veel ervaring nodig om goed onderscheid te kunnen maken tussen verschillende soorten, kosten deze analyses veel tijd en is de variatie in analyseresultaten van verschillende experts in sommige gevallen een punt van discussie. Door technische ontwikkelingen van de afgelopen jaren zijn er ook alternatieve analysemethoden binnen handbereik gekomen. Zo heeft een enorme ontwikkeling plaatsgevonden op het gebied van DNA-gebaseerde analyses (zie toelichting). DNA is de drager van erfelijke informatie en is aanwezig in alle levende cellen. De samenstelling van DNA is verschillend per soort, maar omdat een groot aantal onderdelen in alle levende cellen voorkomen, zijn de DNA volgordes (genen) die de informatie bevatten voor deze onderdelen ook aanwezig in alle soorten organismen. Omdat de nu voorkomende soorten als gevolg van evolutionaire processen deels uit elkaar en deels uit nu niet meer voorkomende voorlopersoorten zijn ontstaan, zijn er sterke overeenkomsten tussen nauwverwante soorten, die niet alleen in uiterlijk maar ook op DNA-niveau zijn terug te vinden. Dit maakt het mogelijk verwantschap op DNA-niveau in kaart te brengen, maar ook om op een veel bredere schaal biodiversiteit in kaart te brengen. Het grote voordeel van DNAgebaseerde analyses boven morfologische analyses is dat parallelle analyse van veel DNA-monsters heel goed mogelijk is terwijl morfologische analyses per definitie opeenvolgend (dus 1 voor 1) moeten plaatsvinden. Dit betekent dat er met DNA-gebaseerde analyses een geweldige efficiëntieslag gemaakt kan worden, zowel in kosten als qua tijd.

Selectie DNA DNA gebaseerde analyses van biodiversiteit richten zich niet op de volledige analyse van het DNA (dat zou veel te kostbaar en tijdrovend zijn), maar op één specifiek gebied uit het DNA. Voor de keuze van het specifieke stuk DNA is een aantal factoren van belang: • • • • •

Het betreffende stuk DNA moet in alle soorten die aangetoond moeten kunnen worden aanwezig zijn (dit is niet altijd het geval: genen die bijvoorbeeld betrokken zijn bij de vorming van toxines zijn soms wel en soms niet aanwezig); Het betreffende stuk DNA moet in soorten die sterk van elkaar afwijken toch nog redelijk op elkaar lijken om onderlinge vergelijking mogelijk te maken (ook dit is niet vanzelfsprekend: sommige stukken DNA verschillen al sterk tussen nauwverwante soorten); Het betreffende stuk DNA moet daarnaast in soorten die nauw verwant zijn toch nog voldoende verschillen vertonen om onderscheid mogelijk te maken; Van het betreffende stuk DNA is bij voorkeur al behoorlijk wat informatie beschikbaar in vrij toegankelijke databases; Het betreffende stuk DNA moet niet alleen in geïsoleerde cellen van 1 soort kunnen worden aangetoond, maar ook in natuurlijk voorkomende populaties van tientallen verschillende soorten;

Voor elk van deze criteria afzonderlijk is het niet zo moeilijk om een stuk DNA te vinden, maar de combinatie van deze criteria maakt het wel lastig. Voor de Hydrochip ontwikkeling is de keus 16

gevallen op het 18s rRNA gen, omdat dat gen als één van de weinige aan alle criteria voldoet. Andere wetenschappelijke ontwikkelingen richten zich deels op andere genen die echter allemaal beperkingen vertonen voor één of meer van bovenstaande criteria. Om informatie over dit 18s rRNA gen te kunnen verkrijgen, wordt gebruik gemaakt van een techniek die het mogelijk maakt van een kleine hoeveelheid DNA heel veel kopieën te maken, zodat vervolganalyse veel eenvoudiger wordt. Deze zogenaamde PCR techniek maakt gebruik van twee kleine stukjes DNA die, als ze kunnen aanhechten aan een groter stuk DNA, er voor zorgen dat het gebied tussen de twee kleine stukjes heel snel en efficiënt vermeerderd wordt. Het is dan wel belangrijk dat die kleine stukjes DNA precies passen bij het grotere stuk DNA. Anders vindt er geen vermeerdering plaats. Voor de Hydrochip doelstelling is het daarnaast belangrijk dat die stukjes precies passen bij heel veel verschillende soorten (waaronder in ieder geval bij alle soorten kiezelalgen). Daarnaast moet het zo zijn dat in het gebied tussen de twee kleine stukjes DNA voldoende verschillen aanwezig zijn om verschillende soorten van elkaar te kunnen onderscheiden. Voor het 18s rRNA gen is het mogelijk gebleken aan al deze eisen te voldoen. Dit gen en deze techniek wordt dan ook gebruikt voor alle DNA-gebaseerde experimenten die hierna worden beschreven.

Figuur. 7. Principe Hydrochip.

De gedachte achter de Hydrochip (figuur 7) is om in één keer een groot aantal verschillende soorten kiezelalgen te kunnen aantonen. Voor de DNA-stukken die verschillen tussen de verschillende soorten worden synthetische stukjes DNA gemaakt (target DNA) die elk afzonderlijk als een spot op een oppervlak (bijvoorbeeld een microscoopglaasje) worden aangebracht. Uit praktijkmonsters (rietstengels of watermonsters) wordt DNA geïsoleerd (wordt tegenwoordig ook wel environmental DNA genoemd) en dit DNA wordt gebruikt als startmateriaal voor het vermeerderen van het stukje DNA dat hoort bij het 18s rRNA gen. Op deze manier wordt van dit specifieke gen heel veel DNA gemaakt. Door bij het vermeerderen een label ter herkenning mee te nemen (bijvoorbeeld een 17

fluorescerende stof) wordt verdere herkenning mogelijk gemaakt. Het vermeerderde DNA van het 18s rRNA gen wordt daarna op het microscoopglaasje met de verschillende synthetische stukjes DNA gebracht. Als DNA-volgordes identiek zijn in het vermeerderde en het synthetische materiaal kunnen ze aan elkaar gaan binden. Hierdoor ontstaan er fluorescerende signalen voor die stukjes DNA die horen bij de soorten die in het betreffende monster aanwezig zijn. Op die manier ontstaat er een patroon van spots dat laat zien welke soorten wel en welke niet aanwezig zijn in een monster. Essentieel voor het kunnen uitvoeren van de hier beschreven aanpak is wel dat de DNA-volgordes voor de verschillende soorten bekend zijn, omdat zonder die informatie geen synthetisch DNA kan worden gemaakt. Een groot deel van de ontwikkelingen binnen het Hydrochip project stonden in het teken van het beschikbaar krijgen van deze DNA-volgordes. De gevolgde stappen worden verder beschreven.

Beschikbaarheid 18s rRNA gen DNA volgordes Bij de start van het Hydrochip project is geïnventariseerd hoeveel en welke 18s RNA gen DNA volgordes beschikbaar waren voor kiezelalgen. Hoewel dat op het eerste oog leek mee te vallen, bleek bij nadere beschouwing dat het aantal beschikbare DNA-volgordes voor zoetwatersoorten heel erg beperkt was. Het was dan ook al snel duidelijk dat zelf actie ondernomen moest worden om de hoeveelheid DNA-volgordes uit te breiden. Er zijn twee verschillende routes gevolgd, een gerichte (gesloten) benadering en een bredere (open) benadering. Voor de gesloten benadering wordt geprobeerd specifieke DNA-volgordes te vinden voor specifieke soorten. Bij de open benadering wordt een grote hoeveelheid DNA-volgordes verzameld, waaruit DNA-volgordes, die horen bij kiezelalgen, kunnen worden geselecteerd. Beide benaderingen zullen hierna in meer detail worden beschreven.

Gesloten benadering De gedachte achter de gesloten benadering is dat, uitgaande van specifieke soorten, de bijbehorende 18s rRNA gen DNA volgordes kunnen worden bepaald. Op papier klinkt dit heel rechttoe rechtaan: Als specifieke kiezelalgensoorten rein voorhanden zijn (dat betekent dat er slechts cellen van één specifieke soort in een monster zitten, zonder verontreiniging van andere soorten) dan is het technisch geen probleem om daar DNA-informatie bij te verzamelen. Het grote probleem van die benadering is echter dat levende kiezelalgen niet in zuivere vorm beschikbaar zijn. Alle monsters die al tientallen jaren voor de ecologische monitoring worden verzameld, worden meteen na monstername opgewerkt op een zodanige wijze dat DNA niet intact blijft. Bovendien betreft dit ook altijd mengsels van diverse soorten. Deze monsters zijn daarmee niet geschikt voor de gesloten benadering. Een andere route die bijvoorbeeld voor veel groepen planten en insecten wordt gevolgd, is het gebruikmaken van materiaal dat door hobbyisten wordt verzameld. Helaas bestaat een dergelijk netwerk niet voor kiezelalgen. Een derde meer wetenschappelijke route is het gebruikmaken van zogenaamde stammencollecties waarin wetenschappers hun verzamelde materialen opslaan en dit toegankelijk maken voor collega’s. Hoewel deze route voor sommige groepen algen wel wordt gebruikt, is deze route voor kiezelalgen niet in gebruik omdat er geen goede methoden bestaan om levende kiezelalgen langere tijd te bewaren en daarna weer verder te laten groeien. Uiteindelijk bleven er nog twee mogelijkheden over die we verder hebben onderzocht, namelijk zelf kweken en zogenaamde “single-cell analysis”. Het in het laboratorium kweken van kiezelalgen is iets waar maar relatief weinig ervaring mee is opgedaan buiten dit project. De beschikbare kennis is grotendeels gebaseerd op specifieke groepen 18

kiezelalgen in het kader van wetenschappelijk onderzoek. In samenwerking met de groep van prof. Vijverman van de Universiteit Gent in België is een kweeksysteem opgezet, waarmee specifieke soorten efficiënt konden worden gekweekt. Dit systeem is ook gebruikt voor het kweken van kiezelalgen uit natuurlijke monsters waarin diverse soorten kiezelalgen voorkomen. Hoewel dit in principe wel werkte, viel het aantal verkregen kolonies (verzameling van cellen die uit één cel zijn voortgekomen) tegen, zeker gezien de hoeveelheid werk die nodig was om deze kolonies te verkrijgen. Toen bij nadere analyse ook nog bleek dat bijna alle kolonies behoorden tot dezelfde soort en er op deze manier dus nauwelijks nieuwe informatie werd verkregen, is besloten deze route, om nieuwe sequenties van het 18s rRNA gen in handen te krijgen, stop te zetten.

Figuur. 8. Micromanipulator voor “single-cell analysis” De tweede route die is gevolgd binnen de gesloten benadering is de “single-cell analysis”, waarbij losse kiezelalgencellen worden geïsoleerd met een speciale microscoop (figuur 8). Hierna wordt DNA uit deze cellen gebruikt voor PCR-vermeerdering van het 18s rRNA gen. Omdat er in dit geval heel weinig DNA beschikbaar is als startmateriaal, is de eerste ronde van vermeerdering niet voldoende en wordt dit materiaal gebruikt voor een tweede PCR-ronde van vermeerdering (met iets andere condities). Op deze manier lukt het wel om voldoende materiaal van het 18s rRNA gen in handen te krijgen voor verdere analyse. Bij deze manier van analyseren is het ook noodzakelijk om een soortnaam te koppelen aan de DNA-volgorde. Hiertoe worden de twee schaaltjes, die afkomstig zijn van de losse kiezelalgcel, na de vermeerderingsreacties weer uit het monster gehaald en klaargemaakt voor determinatie door een kiezelalgenexpert. Alles bij elkaar is dit een technisch zeer uitdagende route die wonder boven wonder toch behoorlijk goed bleek te werken. Wel viel de efficiëntie van deze route tegen, omdat er bij elke stap sprake was van een percentage uitvallers, waardoor er aan het einde van de streep, door het grote aantal stappen, in relatief weinig gevallen een volledig resultaat werd verkregen. De belangrijkste oorzaak voor uitval was het feit dat veel van de verkregen DNA-volgordes niet hoorden bij kiezelalgen maar bij andere organismen, met name schimmels. Hoewel het uitgangsmateriaal in alle gevallen losse kiezelalgcellen leken te zijn, doen deze resultaten vermoeden dat in veel gevallen schimmels (waarschijnlijk schimmelsporen) aan of in 19

kiezelalgen aanwezig waren en dat hun DNA efficiënter vermeerderd werd dan het kiezelalgen-DNA. Hoewel deze route een aantal bruikbare DNA-volgordes heeft opgeleverd, die uiteindelijk ook gebruikt zijn voor de Hydrochip, staat de hoeveelheid werk die hiervoor verricht moet worden niet in verhouding tot het resultaat.

Open benadering In tegenstelling tot de gesloten benadering richt de open benadering zich niet specifiek op kiezelalgen, maar veel meer op de in de geselecteerde monsters aanwezige biodiversiteit in bredere zin. Het 18s rRNA gen is niet alleen aanwezig in kiezelalgen, maar in alle organismen die een celkern bevatten (met een wetenschappelijk woord eukaryoten genoemd). Voor de open benadering hebben we gebruik gemaakt van nieuwe technologische ontwikkelingen voor het bepalen van DNAvolgordes, die een uitvloeisel zijn van de wedloop om de samenstelling van het volledige menselijke DNA zo snel en efficiënt mogelijk te bepalen. Deze zogenaamde nieuwe generatie technieken voor het bepalen van DNA-volgordes maakt het mogelijk zeer grote aantallen volgordes ineens te bepalen. Het gaat hierbij bijvoorbeeld om 1 miljoen volgordes die niet perse bij 1 monster hoeven te behoren, maar ook over een groot aantal verschillende monsters kunnen worden verdeeld, bijvoorbeeld 100 monsters met elk 10.000 volgordes. Deze ‘mass sequencing’ techniek is gebruikt om een deel van de monsters, die in het kader van het Hydrochip project zijn verzameld, te analyseren. De resultaten van deze analyses zijn op twee verschillende manieren verder uitgewerkt: 1. Specifieke uitwerking bij kiezelalgen behorende DNA-volgordes; 2. Generieke uitwerking alle volgordes. De resultaten van de specifieke, op kiezelalgen gerichte uitwerking, zijn gebruikt voor het toevoegen van herkenningsvolgordes/probes op de Hydrochip. De generieke uitwerking is gericht op een bredere ecologische analyse van praktijkmonsters en enkele voorbeelden hiervan zullen nader worden uitgewerkt. In dit geval zijn alle verkregen DNA-volgordes vergeleken met een databank waarin wetenschappers van over de hele wereld hun verkregen DNA-informatie opslaan. Door vergelijking met deze DNA-volgordes en hun bijbehorende informatie is het mogelijk om ook onze nieuwe DNA-volgordes te groeperen en in te delen in zogenaamde taxonomische groepen. Zo zijn in figuur 9A de resultaten weergegeven van de fytoplanktontellingen zoals die door Waternet zijn uitgevoerd voor een specifieke locatie. Hetzelfde monster is samen met een aantal andere monsters ook op DNA niveau geanalyseerd en de resultaten van die analyse zijn weergegeven in figuur 9B. Wat opvalt in figuur 9B is dat er naast de bekende groepen algen, die zijn geteld door Waternet, nog een groot aantal groepen organismen aangetoond kan worden in deze monsters op basis van DNAgebaseerde analyse. Als alle DNA-resultaten van de Waternet monsters bij elkaar worden genomen (figuur 9C) blijkt slechts 30% van de DNA volgordes te behoren tot deze groepen algen. Het is via de open benadering dus mogelijk om veel meer informatie uit deze monsters te halen.

20

Figuur. 9A. Klassieke fytoplanktontellingen uitgevoerd voor locatie hap048.

Fytoplanktonsamenstelling Holland Ankeveense Plassen, petgat , 2010

Figuur. 9B. DNA-analyse voor fytoplankton, waaronder locatie hap048.

21

Figuur. 9C. Open benadering met daarop de klassieke benadering geprojecteerd (in kleur). Een vergelijkbare analyse is ook uitgevoerd met een deel van de monsters die in het kader van het Hydrochip project zijn verzameld. Uit al deze monsters is DNA geisoleerd, de DNA-volgordes van de aanwezige 18s rRNA genen zijn bepaald en de verkregen resultaten zijn ingedeeld in taxonomische groepen. Als alle informatie van alle monsters op een hoop wordt gegooid, wordt een vergelijkbaar taartdiagram verkregen als in figuur 9C, waarbij alleen de grootte van de taartpunten varieert, aangezien hier andere praktijk monsters zijn geanalyseerd (figuur 9D).

Figuur. 9D. @

22

RESULTATEN Vergelijking resultaten microscopische kiezelalgentellingen en Hydrochip Om de toegevoegde waarde van de Hydrochip beter te kunnen beoordelen, is het belangrijk om een vergelijking te maken tussen analyseresultaten van de conventionele microscopische tellingen en de Hydrochipresultaten voor dezelfde praktijkmonsters. Hierbij moet wel meteen worden opgemerkt dat dit een beetje het karakter heeft van appels met peren vergelijken, omdat de beide analysemethoden verschillende onderdelen van kiezelalgen bekijken. Voor microscopische tellingen worden de schaaltjes van de kiezelalgen nauwkeurig bekeken en wordt door een expert een naam toegekend aan het schaaltje. Er zijn soortenlijsten waarop duizenden namen voorkomen die hiervoor gebruikt worden. De Hydrochipanalyse is gebaseerd op specifiek stukjes DNA die per soort verschillend zijn. Zoals in het hoofdstuk over de ontwikkeling van de Hydrochip al is beschreven, is slechts voor een beperkt aantal kiezelalgen dergelijke DNA-informatie beschikbaar. Ook is er veel discussie over naamgeving, die regelmatig verandert en over kiezelalgen die er qua schaaltje hetzelfde uitzien, maar op DNA-niveau toch duidelijk verschillend zijn (en waarbij het dus waarschijnlijk verschillende soorten betreft) of andersom: kiezelalgen die er qua schaaltje verschillend uitzien, maar die op DNA-niveau identiek zijn. Het is duidelijk dat de namenlijst volgens de microscopische methode en de Hydrochipmethode niet direct met elkaar te vergelijken zijn. We hebben daarom ook gekozen voor een vergelijking van resultaten op een hoger niveau, namelijk habitat of ecosysteem. Hieronder worden de resultaten van de gemaakte vergelijkingen stap voor stap besproken. In een eerste serie tests zijn in totaal 188 water- en substraatmonsters (rietstengels of andere waterplanten) geanalyseerd op de samenstelling van de kiezelalgen met behulp van 1) microscopie en 2) de Hydrochip. Hiervoor is gebruik gemaakt van protocollen die gedurende het project door Vitens zijn geoptimaliseerd om een betere signaal-ruis verhouding te krijgen. Van elk monster zijn er via beide methoden soortenlijsten van de aangetroffen kiezelalgen gegenereerd. Op basis van deze soortenlijsten werd vervolgens een typering van het habitatkenmerk trofiegraad uitgevoerd om de kwaliteit van de Hydrochip te toetsen. In de volgende paragraaf wordt een vergelijking gemaakt tussen de resultaten van de microscopische analyse en de Hydrochip. Vergeleken worden allereerst de soortenlijsten, en ten tweede de resultaten van de typering van het habitatkenmerk trofiegraad. Soortlijsten Figuur 10 en 11 geven de soortenlijsten weer, die opgesteld zijn op basis van de microscopische kiezelalgenanalyse en de Hydrochipanalyse van een draadwiermonster uit de Tetwijkse Wetering. Meteen valt op dat de microscopische analyse veel meer soorten oplevert dan de Hydrochipanalyse. Oorzaak hiervoor is dat de genetische fingerprint van de ca. 2500 in Nederland voorkomende kiezelalgensoorten (van Dam, 2010) nog lang niet ontcijferd is. Hierdoor zal een deel van in de microscopische analyse aangetroffen kiezelalgensoorten door de Hydrochip (nog) niet herkend worden. Sommige frequent voorkomende soorten in het onderzochte monster zoals Achnanthidium minutissimum en Nitzschia acicularis worden echter wel door de Hydrochip zowel kwalitatief als kwantitatief goed waargenomen. Verder toont een vergelijking van beide lijsten aan dat de Hydrochip soorten waarneemt die in de microscopische analyse niet geïdentificeerd worden. In het genoemde voorbeeld zijn dit bijvoorbeeld Achnanthes brevipes en Pinnularia microstauron. 23

Achnanthes brevipes is een brak- en zoutwatersoort die in het onderzochte monster eigenlijk niet aangetroffen kan worden. De reden dat deze soort met de Hydrochip toch wordt waargenomen is, komt door de methodische aanpak van de gensequentie analyse. Voor een in het monster aangetroffen gensequentie wordt de meest vergelijkbare sequentie in een bestaande database geïdentificeerd en de hierbij horende soortnaam aangegeven. Deze verschillen tonen aan dat op dit moment de Hydrochip resultaten getoetst moeten worden door vergelijking met de uitkomsten van de klassieke microscopische analyse.

Figuur. 10. Typering van de trofiegraad op basis van een draadwiermonster uit de Tetwijkse Wetering verzameld op 27 april 2010. In totaal 200 kiezelalgenschaaltjes werden door middel van een microscopische analyse geteld en geclassificeerd. De berekende indicatiewaarde van 5,1 betekent een eutrofe kiezelalgengemeenschap en een eutroof habitat (zie Bijkerk, 2010 voor de klasse-indeling van trofiegraad). T = ecologische indicatiewaarde voor trofiegraad uit van Dam et al. (1994). N.b. = voor deze taxa zijn geen indicatiewaarden beschikbaar. Indifferente soorten (T = 7) tellen niet mee in de berekening.

24

Figuur. 11. Typering van de trofiegraad op basis van een draadwiermonster uit de Tetwijkse Wetering verzameld op 27 april 2010. De kiezelalgensoorten werden door middel van een Hydrochip analyse bepaald. De berekende indicatiewaarde van 4,8 betekent een eutrofe kiezelalgengemeenschap en een eutroof habitat (zie Bijkerk, 2010 voor de klasse-indeling van trofiegraad). T = ecologische indicatiewaarde voor trofiegraad uit van Dam et al. (1994). N.b. = voor deze taxa zijn geen indicatiewaarden beschikbaar. Indifferente soorten (T = 7) tellen niet mee in de berekening.

Habitattypering De typering van habitatkenmerken als zuurgraad en trofiegraad is een belangrijke methode in het waterbeheer. Hierdoor kan op basis van de de kiezelalgengemeenschap in water- en substraatmonsters een uitspraak gedaan worden over de kwaliteit van de herkomstwateren. De kiezelalgengemeenschap kan bijvoorbeeld aantonen of het herkomstwater van het betreffende monster in oligotrofe, mesotrofe of eutrofe toestand verkeerd. De methode van habitattypering is gedetailleerd beschreven in Bijkerk (2010). In het Hydrochip project zijn typeringen gedaan voor het habitatkenmerk trofiegraad. Hiervoor krijgt elk kiezelalgensoort een ecologisch indicatiegetal (een getal tussen 1 en 7) voor trofiegraad die afgeleid is uit literatuuropgaven en deskundigenoordelen (Bijkerk, 2010). In Nederland wordt de lijst van indicatiegetallen in Van Dam et al. (1994) het meest toegepast. Figuren 10 en 11 geven een voorbeeld van de typering van de trofiegraad van het eerder genoemd draadwiermonster. Hoewel er duidelijke verschillen zijn in zowel het aantal geïdentificeerde soorten als de soortsamenstelling tussen beide analysemethodes , wijst de berekende typering van de trofiegraad op een eutrofe kiezelalgengemeenschap en een eutroof habitat. In het kader van dit project zijn tot nu toe 188 monsters zowel microscopisch als met de Hydrochip op kiezelalgen geanalyseerd, en is voor alle monsters een typering van de trofiegraad uitgevoerd. Figuur 12 toont een vergelijking van de indicatiewaarden voor trofiegraad van de microscopische en Hydrochip analyse voor elk monster. De vergelijking geeft dus aan in hoeverre de berekende trofiegraden door middel van microscopische en Hydrochip analyse overeenkomen. Het wordt duidelijk dat de Hydrochip in het mesotrofe en eutrofe bereik resultaten levert (licht rode veld in afbeelding 12) die min of meer goed door de microscopische analyse bevestigd worden. Anderzijds is het ook duidelijk dat vooral in het oligotrofe en oligo-mesotrofe spectrum weinig

25

overeenstemming is tussen beide methoden. Dit ligt zeker aan het feit dat er tot nu toe nauwelijks oligotrofe indicatorsoorten op de Hydrochip geplaatst zijn, puur omdat oligotrofe soorten niet verzameld en gesequenced zijn en de genetische fingerprints van deze soorten niet bekend zijn. De resultaten voor het (meso)eutrofe bereik laten dus zien dat Hydrochip en microscopische analyses op habitatniveau vergelijkbare uitkomsten laten zien. Het ligt dus ook in de lijn der verwachting dat dit gaat gelden voor het oligotrofe en oligo-mesotrofe bereik, als de moleculaire informatie, voor de voor deze habitats representatieve soorten, aan de Hydrochip analyses kan worden toegevoegd.

Figuur. 12. Typering van de trofiegraad van herkomstwateren op basis van kiezelalgenanalyses van 188 onderzochte water- en substraatmonsters. De kiezelalgen in alle monsters werden met zowel een microscopische analyse als de Hydrochip onderzocht.

Referenties Bijkerk, R. (2010) Handboek Hydrobiologie. Biologisch onderzoek voor de biologische beoordeling van Nederlandse zoete en brakke oppervlaktewateren. Rapport 2010-28, STOWA Stichting Toegepast Onderzoek Waterbeheer, Amersfoort. Van Dam, H. (2010) Kiezelalgen. In: J. Noordijk, R.M.J.C. Kleukers, E.J. van Nieukerken, A.J. van Loon (red.) De Nederlandse biodiversiteit. Nederlandse Fauna 10, Nederlands Centrum voor Biodiversiteit Naturalis & European Invertebrate Survey, Leiden, blz. 131-133. Van Dam, H., Mertens, A., Sinkeldam, J. (1994) A coded checklist and ecological indicator values of freshwater diatoms from The Netherlands. Netherlands Journal of Aquatic Ecology 28: 117-131.

26

Ervaringen met de praktijkchip De praktijkchip is ontwikkeld op basis van een Alere chip platform. De Hydrochip is een platform met unieke DNA-markers waarmee verschillende soorten d kiezelalgen en enkele cyanobacteriën kunnen worden aangetoond. Door Vitens is gewerkt aan de ontwikkeling van een protocol waarmee het mogelijk is om m.b.v. de Hydrochip op een relatief eenvoudige wijze een beeld te verkrijgen van de kiezelalgen in oppervlaktewater en rietstengels. Het creëren van het analyseprotocol voor de Hydrochip is in twee verschillende fasen uitgevoerd. In de eerste fase is een set van DNA-markers gebruikt waarmee de werking van de Hydrochip is getest. Deze fase kan worden beschouwd als een verkennende fase. Uit dit onderzoek is het protocol op hoofdlijnen gedefinieerd. In de tweede fase van dit onderzoek zijn door TNO nieuwe DNA-biomarkers ontwikkeld welke specifieker zijn voor het aantonen van kiezelalgen populaties. Het ging hierbij om in totaal 150 verschillende biomarkers: 135 voor het aantonen van verschillende kiezelalgen , 11 voor het aantonen van Cyanobacteriën (blauwalgen), en 4 controle spots (voor de controle op de werking van de Hydrochip). . Alle biomarkers zijn op een chipplatform gespot, welke resulteerde in een praktijk Hydrochip. Een eerste stap in de protocolontwikkleing richtte zich op het optimaliseren van de isolatie van DNA uit kiezelalgen uit oppervlaktewater. Voor de isolatie van DNA is een kit geselecteerd die binnen de waterleidingsector gebruikt wordt voor het isoleren van DNA vanuit lastige watermonsters. Daarna zijn deze monsters getest op de Hydrochip., Dit resulteerde in een nieuw protocol voor isolatie en verdere opwerking van DNA voor gebruik op de Hydrochip. In de tweede fase is tevens de software ontwikkeld waarmee de resultaten van de Hydrochip via IconoClust software (van Alere) kunnen worden uitgelezen. Via deze software wordt inzichtelijk gemaakt welk type diatomee of cyanobacterie op de chip een positieve en/of negatieve reactie geeft in het geteste oppervlaktewater/rietstengel. Hierna is een validatiestudie opgezet waarbij verschillende watermonsters zijn getest. Van eerdere analyses (met de uitgebreidere research Hydrochip door TNO) was bekend dat deze monsters het grootste deel van de kiezelalgen markers op de Hydrochip zouden bestrijken. Uit vergelijking van de research Hydrochip met de praktijk Hydrochip (die dus een subgroep van het totaal aantal markers bevatte) kwam naar voren dat de performance voor beide typen chips hetzelfde was voor 49 biomarkers. In een vervolgproject zal verdere optimalisatie van de protocollen plaatsvinden. Parallel hieraan zal er onderzoek gedaan worden naar de andere markers.

27

Statistische relaties tussen fluorescentie- en fytoplanktonanalyses Omdat een fluorescentie-analyse van fytoplankton zeer snel en goedkoop is, werd een aanvullend onderzoek uitgevoerd naar de bruikbaarheid van deze methode bij het voorspellen van de ecologische kwaliteit van een locatie. Als de fluorescentie-analyse kan worden ingezet om een voorselectie te maken van locaties waarvoor een microscopisch onderzoek of een analyse met de Hydrochip waardevol is kan dat een kostenbesparing opleveren. Omdat de fluorescentietechniek geen onderscheid maakt tussen soorten, maar alleen hoofdgroepen fytoplankton kan onderscheiden, is een gedetailleerde analyse niet mogelijk. Het is daardoor niet mogelijk om, zoals met determinaties van verschillende soorten kiezelalgen, de trofiegraad van een water te bepalen. Door een dataset van 67 monsters statistisch te onderzoeken is getracht twee vragen te beantwoorden: • •

Komt de met fluorescentie bepaalde samenstelling van de fytoplanktongemeenschap overeen met de samenstelling die is aangetoond met microscopische determinaties? Kan de fluorescentie-analyse worden gebruikt als indicator van de biodiversiteit van het fytoplankton?

Gegevensverzameling en –ordening Zowel de fluorescentiemetingen als de fytoplanktontellingen zijn in monsters van het beheergebied van Waternet uitgevoerd door het laboratorium Waterproef. Alleen monsters met zowel volledige fluorescentie- als fytoplanktondata zijn meegenomen in deze statistische analyse. Voor deze statistische analyse zijn 67 metingen met vier fluorescentie-signalen en een totaal van 412 waargenomen fytoplanktonsoorten gebruikt. De fytoplanktonsoorten zijn verenigd tot de vier hoofdgroepen groenalg, blauwalg, kiezelalgen en overig. Een visuele indruk van deze dataset is gegeven in figuur 13. In bijlage 1 is een overzicht gegeven van alle aangetroffen soorten fytoplankton. Deels is de statistische analyse uitgevoerd met het pakket STATGRAPHICS.

Relatie fluorescentiemeting – fytoplanktontelling In eerste instantie is de relatie tussen de fluorescentiesignalen en de fytoplanktontellingen geanalyseerd, rekening houdend met de verdeling over de vier hoofdgroepen. Een berekening van M-fytoplankton (microscopisch bepaald aantal cellen per hoofdgroep) met de vier F-signalen (fluorescentie) is weergegeven in tabel 1. De berekening is uitgevoerd met de formule: M-i = C-i + ∑ (B i,j * F-j )met i,j = 1-4 (groenalg/blauwalg/kiezelalg/overig) C-i, B i,j : regressieparameters Uit de tabel blijkt dat de kalibratie van de fluorescentiesignalen voor de vier hoofdgroepen goed in overeenstemming is voor de hoofdgroepen groenalg, blauwalg en diatomeeën, maar dat de groep ‘overig’ meer gerelateerd is aan het ‘groenalg’ fluorescentie-signaal dan het ‘overig-signaal’. De relatie naar de vier excitatiegolflengten (lichtinstraling) verdient daarom nadere aandacht.

28

Tabel 1: Weergave van multiple regressie tussen aantal fytoplankton (M=microscopie) en fluorescentiemeting (F) per hoofdgroep. Cursief, dikgedrukt is significant.

3,3

0,1

0,4

1,6

1,6

1,1

1

6,5

10,4

7

0,1

2,4

4,2

3,6

5

5,3

1,7

2,8

19,4

7,1

9,7

6,1

6,2

39,5

10

0,6

19,5

1,7

1,2

6,9

16,4

4,5

1,3

0,4

21,3

7,6

60,4

16,7

3

52,4

20,9

42,7

11,1

13,1

15,5

8,2

150

12

73,1

15,1

11,1

120,4

55,2

10,4

86,3

5,2

5,5

17,2

74,5

12,2

4,5

14

69,7

35,2

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1083 319 0 0 319 0 574 0 0 255 0 0 0 0 0 255 3760 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 64 0 64 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 255 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 64 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 127 64 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 127 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 382 0 0 0 0 0 64 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 191 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 574 0 0 0 0 0 0 191 0 0 0 64 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 191 127 0 0 0 255 0 0 127 0 0 0 0 0 0 0 64 0 0 0 0 0 0 0 0 0 127 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 64 64 0 0 127 0 0 0 64 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 64 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 72 29 14 43 0 14 101 0 14 0 0 14 159 87 0 0 14 0 14 87 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 29 0 0 0 0 0 0 0 14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 58 0 0 0 0 0 0 0 58 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 29 0 0 0 0 0 0 14 0 0 0 0 0 0 14 0 0 43 43 0 0 0 14 0 0 0 0 0 0 0 14 0 14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 29 0 0 0 0 0 0 0 0 29 0 0 0 0 58 14 0 0 0 0 0 0 0 0 29 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 14 0 0 14 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 57 0 11 11 0 68 0 0 0 0 79 0 0 0 192 34 23 23 0 0 0 11 0 0 0 0 34 11 0 0 34 0 0 0 0 0 0 0 11 0 0 0 0 11 11 0 0 0 0 11 11 0 0 0 57 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11 0 0 0 0 45 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 23 0 0 0 0 0 0 0 0 0 102 11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 23 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 45 0 0 23 0 0 0 0 0 45 57 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11 0 0 0 0 0 0 0 11 0 0 0 0 0 0 11

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 23 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 12 0 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 23 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 23 58 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 351 0 0 0 0 0 0 819 59 0 0 0 0 234 0 0 234 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 59 0 0 936 234 234 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 702 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1404 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1287 0 0 0 117 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 585 0 117 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 59 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 117 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 117 0

0 0 0 131 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 263 0 1971 0 0 6964 0 0 0 0 0 526 0 0 131 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 131 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 131 788 0 0 526 0 0 0 263 0 0 788 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 263 0 0 131 131 263 0 0 0 920 0 0 0 0 0 0 526 0 0 0 0 0 2759 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 131 0 0 0 0 263 0 0 0 0 131 263 0 0 0 0 0 0 0 0 0 131 33 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 131 0 0 0 0 263 0 263 0 1051 0 0 0 920 0 0 0 263 131 131 131 0 0 131 0 0 0 0 0 0 0 0 0 131 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 657 0 0 0 0 0 0 0 0 263 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 263 0 0 0 0 0 0 131

0 0 0 0 0 0 0 0 28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 193 0 0 0 0 138 0 0 0 0 28 28 0 0 0 0 0 55 0 0 0 0 0 28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 83 0 0 0 0 0 55 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 110 0 0 0 110 330 0 0 0 0 220 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 330 83 28 0 0 0 0 0 0 28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 55 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 110 275 28 28 0 0 0 0 0 110 83 0 0 0 0 0 28 0 0 0 83 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 248 0 0 0 0 0 0 0 28 0 0 0 9443 4130 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 165 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 66 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 394 0 131 131 0 197 0 0 460 0 0 0 0 0 1117 0 0 66 0 0 0 131 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 66 66 0 0 0 66 0 0 66 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 66 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 263 0 0 0 263 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 66 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 66 0 0 0 131 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 263 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 66 0 0 0 131 131 0 66 0 0 0 0 0 0 0 66 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 66 0 0 0 197 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 66 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 66 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 289 0 0 0 0 0 289 0 578 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 289 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1156 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 289 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 578 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 289 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 289 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 289

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 19 0 0 0 0 0 0 0 0 19 39 0 0 0 0 0 39 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 39 0 116 0 0 77 0 0 0 0 0 0 0 0 77 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 39 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 19 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 19 0 0 0 0 0 19 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 19 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 77 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 58 0 0 0 0 0 116 231 0 0 0 0 0 0 0 0 0 19 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 19 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 17 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 35 104 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 29 121 81 0 12 6 0 12 6 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 12

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 120 0 241 0 0 0 0 1686 0 120 0 0 0 0 3613 0 0 0 120 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 120 0 482 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 482 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4095 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 120 0 482 0 0 0 602 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 120 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 241 0 120 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 241 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 120 120 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 120 0 0 0 120 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 361 361 0 602 0 0 2289 0 0 0 0 0 241 0 241 120 0 0 0 120 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 120 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 120 0 0 0 0 120 241 0 0 0 241 0 0 0 0 0 1204 0 0 0 0 0 0 482 482 0 241 0 0 241 0 0 0 0 0 361 0 0 0 120 0 0 0 0 0 0 120 0 0 0 0 0 843 0 0 120 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 241 0 0 120 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 120 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 482 0 482 241 120 120 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 120 0 120 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 120 0 0 0 0 0 0 0 0 120 0 0 120 0 0 0 0 120 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15 0 0 0 0 0 3 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 28 0 0 0 0 5 0 0 8 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 21 0 0 0 0 0 0 0 28 15 0 64 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 1928 0 0 0 0 836 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 64 0 0 0 0 0 321 0 0 0 0 1286 0 0 64 129 64 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 64 0 0 0 0 0 321 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 514 257 0 0 0 0 257 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2443 0 0 0 0 0 0 0 0 64 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 64 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 64 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 64 0 0 0 64 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 193 64 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 64 0 0 0 0 321 0 0 3214 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 46 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15 0 0 46 0 0 0 0 0 107 306 0 15 0 0 31 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 64 0 0 0 0 0 0 0 0 64 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 31 0 0 31 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15 15 0 15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15 0 0 0 0 0 0 31 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 413 1208 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 508 0 4576 0 0 3559 0 0 0 0 0 57456 25423 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15 0 0 0 0 0 0 0 15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 508 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 508 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 508 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 508 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 508

0 0 0 0 0 0 0 111 1440 1662 0 0 111 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 111 443 0 886 0 0 2437 2105 0 222 0 0 1994 222 0 0 0 0 332 0 0 0 111 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 222 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 886 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 443 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 111 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 111 0 0 0 0 0 0 0 0 0 222 111 0 0 0 0 0 0 0 222 332 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 443 0 0 0 0 222 0 0 0 0 0 0 0 0 0 111 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 111 0 111 0 0 0 0 0 0 0 0 0 289 0 0 0 193 0 0 0 0 0 0 193 0 0 0 0 0 96 0 0 0 0 0 0 386 386 0 0 0 386 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 386 0 0 0 0 193 0 0 0 0 96 0 96 0 0 0 0 96 0 0 96 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 96 0 289 0 0 0 0 0 0 0 96 0 96 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 386 0 0 0 0 0 0 386 0 0 0 96 0 0 0 0 0 96 1157 193 0 0 0 0 0 0 0 0 96 0 0 193 0 0 0 0 0 0 0 96 0 0 0 0 0 0 96 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 96 0 0 0 0 386 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 825 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1649 0 0 412 0 0 0 0 825 1237 0 0 0 0 2680 3092 0 0 0 0 0 206 0 0 1649 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 206 0 0 0 0 0 1237 0 0 825 0 0 0 0 0 0 1649 0 0 0 0 0 0 0 825 0 825 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 206 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 206 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 412 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1443 0 0 0 0 0 618 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 206 0 0 2268 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 412 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 28 0 0 0 0 0 85 57 113 0 85 0 0 199 142 0 0 0 0 596 57 0 0 0 0 0 28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 28 0 0 0 0 0 113 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 28 0 0 0 0 113 0 0 0 0 113 0 0 0 0 0 0 0 0 113 0 0 0 0 0 0 340 0 0 0 0 0 0 0 0 28 0 0 0 0 0 28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 28 28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 57 0 57 0 0 0 0 227 0 0 0 0 0 0 0 0 85 0 0 0 0 28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 57 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 28 0 0 0 0 57 0 28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 57 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 75 0 0 0 0 0 301 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 301 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 75 0 0 1431 0 75 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 75 301 0 0 0 0 0 0 0 0 0 75 0 0 75 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 602 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 151 0 0 0 0 0 0 75 0 0 0 0 0 0 0 0 0 75 0 0 0 0 0 0 75 0 0 75 0 75 0 0 0 0 0 0 0 4217 0 0 0 3615 0 0 75 0 0 0 0 0 0 75 226 0 0 0 0 0 0 0 0 75 0 0 0 0 75 0 0 75 0 0 75 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 44 0 0 22 0 0 0 0 0 0 0 0 11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 22 0 0 44 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11 0 0 0 0 0 0 0 0 11 0 0 11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11 11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11 0 11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11 0 0 0 11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 22 0 11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 1205 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 151 0 0 0 0 0 0 151 151 0 151 0 0 0 0 0 0 151 0 0 151 0 0 0 0 0 0 0 0 602 0 0 0 602 0 0 0 0 0 0 0 0 0 602 0 0 0 602 0 602 0 0 0 0 151 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 301 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 151 0 0 0 0 0 151 151 301 301 0 0 0 0 0 0 1506 1205 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 151 0 0 0 0 0 0 0 151 0 0 0 0 0 0 0 0 151 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 301 0 0 0 0 0 0 151 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7230 1205 1205 602 0 602 0 0 0 151 0 0 0 0 0 0 0 1657 3765 1054 0 2109 0 0 151 0 0 0 0 0 0 0 0 151 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 151 0 151 0 0 151 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 206 0 0 0 1031 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 206 0 0 0 0 20 0 0 0 0 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 0 0 40 0 0 0 0 0 80 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2149 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 0 0 0 80 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40 0 0 0 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 0 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 0 0 0 0 0 0 0 0

1446 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 723 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 241 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 241 0 241 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 241 0 0 0 241 0 482 0 0 1928 964 964 2892 0 0 964 964 0 0 0 964 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1446 0 0 0 0 0 0 0 0 241 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1205 0 0 241 0 0 0 0 0 0 0 0 241 0 4820 3374 0 0 0 0 0 0 0 241 0 0 241 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 482 0 0 0 0 0 1928 0 0 0 0 0 0 0 241 0 241 723 0 0 0 0 0 0 241 0 0 0 0 0 0 0 0 1446 0 0 0 0 4820 0 0 0 241 0 0 241 0 1205 0 0 0 1205 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1205 0 241 0 0 0 964 0 723 0 0 5543 0 0 0 0 241 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 60 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 75 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 60 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 346 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15 15 0 0 0 0 0 0 0 0 15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 60 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 201 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 161 0 0 0 0 0 161 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 161 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 120 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40 0 0 0 0 361 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40 0 0 0 0 281 80 0 0 0 0 0 0 0 0 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2410 0 1205 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 301 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 151 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 301 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1205 0 0 0 0 0 0 0 0 0 602 0 0 0 0 0 0 1205 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 301 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 301 0 0 0 0 0 602 0 0 0 0 0 1205 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 301 0 0 0 0 0 0 301 0 0 0 0 0 0 0 301 904 0 13254 0 0 0 602 0 0 0 0 0 0 0 2410 0 0 602 3314 1506 0 0 0 4820 0 0 0 0 0 0 301 0 0 0 0 0 0 0 904 0 0 2109 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 145 0 0 0 0 0 579 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 72 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 72 0 0 0 72 0 0 0 0 72 0 0 0 0 0 217 0 0 0 0 0 579 0 0 0 0 145 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 289 0 0 0 289 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 72 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 145 0 0 0 0 0 145 0 0 0 0 0 0 0 145 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 579 145 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 217 72 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 507 0 3474 0 0 145 362 0 72 145 0 0 72 0 0 72 0 0 434 0 0 72 0 0 0 0 0 0 0 217 0 0 0 0 0 0 0 0 362 0 0 217 0 0 0 0 0 0 0 0 0 72 0 0 0 0

60 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 166 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1205 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15 0 0 0 0 15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 60 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 60 0 0 0 0 0 0 15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15 0 0 0 15 0 0 45 0 0 0 0 0 0 15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15 0 0 30 0 0 0 0 0 241 0 0 0 15 0 30 467 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 30 0 0 0 136 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2481 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1241 0 0 0 2481 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 155 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 620 0 0 0 1241 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 620 0 0 0 0 620 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1241 0 0 0 2481 0 0 0 0 0 620 0 0 0 0 0 620 620 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9305 0 0 0 0 0 0 0 0 1241 0 0 0 0 0 0 0 620 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8064 0 0 620 0 0 0 0 1241 0 0 4963 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 12 0 60 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40 0 0 0 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 6 0 0 6 0 0 0 0 0 0 24 0 0 0 24 24 96 0 0 84 24 12 0 0 0 0 0 0 0 24 0 0 48 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 12 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 169 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 6 0 0 0 0 0 0 12 0 0 6 0 0 0 0 0 6 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 23 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 34 0 23 0 0 45 45 0 0 0 0 113 0 0 0 0 0 0 0 0 23 34 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 301 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 23 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 23 0 23 0 0 90 68 135 0 0 0 0 0 0 0 0 0 23 0 45 0 0 0 0 45 23 90 0 0 0 0 0 0 0 0 45 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 45 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 23 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 90 0 45 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 34 79 11 0 0 0 0 0 0 0 11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 23 0 0 0 0 11 0 0 79 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 160 107 0 0 0 0 213 0 0 0 0 0 0 0 0 53 160 0 107 0 0 0 267 0 0 107 0 586 0 0 0 0 0 0 53 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 213 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 53 0 0 0 0 0 426 640 107 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1173 0 0 0 0 0 0 0 0 53 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 107 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 53 0 0 0 0 0 53 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 107 0 0 0 107 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 320 160 53 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 107 160 0 0 0 0 0 0 0 53 426 0 0 0 0 0 0 0 53 0 0 0 160 0 0 0 0 107 0 0 6237 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 53 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 321 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 161 0 0 0 0 0 161 0 0 0 0 0 0 0 0 0 643 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 643 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 161 161 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 161 0 0 0 0 0 0 0 161 161 161 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 643 0 0 0 161 0 0 0 161 0 161 1607 161 0 0 0 161 0 0 0 0 0 0 0 161 0 0 0 0 0 161 964 0 0 0 0 0 0 0 482 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 161 0 0 0 0 964 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 284 0 0 0 0 155 0 0 0 0 0 0 0 0 0 103 0 0 0 0 0 78 26 0 0 0 0 155 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 26 0 0 0 0 0 129 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 103 0 207 0 0 0 0 52 103 0 0 0 0 0 0 0 0 103 0 0 0 52 0 0 0 0 0 0 52 0 26 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 26 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 52 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 181 310 26 26 0 0 0 0 0 0 52 0 0 0 0 0 0 0 0 52 155 0 0 0 0 0 0 0 0 52 0 0 0 0 0 0 0 0 0 26 0 103 0 0 0 0 0 0 0 17033 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 155 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 0 40 0 0 20 40 0 79 0 0 0 576 0 0 20 0 20 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 0 0 20 0 0 0 0 99 79 0 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 0 0 0 20 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1707 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 128 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 0 0 15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 38 0 8 0 8 0 0 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

301 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 151 0 0 0 3012 0 1205 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 620 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 151 0 0 151 0 0 0 0 301 0 0 0 0 602 602 0 0 0 602 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 602 1205 0 0 0 602 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 301 904 0 0 0 0 0 0 0 0 0 301 0 0 0 0 0 0 301 0 0 151 0 0 151 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 151 0 0 0 0 0 301 151 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 753 0 5573 0 0 0 301 0 0 0 0 0 0 0 602 2410 0 0 1807 1054 0 0 0 0 0 151 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 301 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1265 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 181 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 60 0 0 0 0 0 0 0 0 60 0 0 241 0 0 0 0 0 120 0 0 482 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 241 0 0 0 0 843 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 60 0 0 0 0 0 181 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 60 60 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 60 0 0 0 0 0 0 0 120 0 60 0 0 0 241 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 241 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 60 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 60 0 0 241 0 1687 0 0 1687 60 0 0 120 0 0 0 60 60 120 0 0 181 0 0 0 0 60 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 181 0 0 120 0 0 0 60 0 0 0 60 0 0 0 0 0 60

2,8 6,6

8,5

2,4

1

6,4

0,6

0,7

3,2 0 9,1

23 0 5,1

23

34,8

0,9

10,8

15

5,9

6,1 1,9

2,2

12,5

8,7 2,4 5,5

33,9 2,9 2,3

4,9 0,5 0,7

6,9 0,5 0,3

9,3 3,3

4,2

38,3

0

92,4

3,7

34,7

0

27,1 1,5

6,7 0 2,2

3,2 1 0,7

17,2

22,4

51,7

18,4

12

4,4

5,8

32,9

3,2

0

30,3

0,2

3,9 0

5,8

33

3

23,4

2,6

2,1

4

0,2

7,1

14,5

0

23,5

14

11,1

32

6,5

3,9

0

31,4

0

0,1

0

2,9

0,3

1

0

2,6

0,1

9,4

6,9

2,8

VEC011

3,6

8,8

82,9

3

VEC008

2,7 4,6

GRV001

4

44

58,1

6,1

4,6

32,4

9

0

13,5

4,6

2,2

5,6

13

3

11,9

0

12,6

9,8

63,5

24,1

76,1

BIN002

1,2

30

12,3

PKH011

6,1 4,6

NTV002

0

0

5,1

6

MBP037

1,2

0,1

8

PKH010

0,8 2,5

PKH020

1,2

0,9

27,4

PKH016

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 435 0 0 38 0 19 0 0 114 0 0 0 0 0 19 757 0 0 0 57 0 38 0 0 0 0 19 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 19 0 0 0 19 0 0 0 0 0 0 19 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 19 0 38 0 151 0 76 76 0 0 0 0 38 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 189 19 19 0 0 0 19 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 151 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 95 0 0 0 0 0 0 19 0 0 0 38 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 19 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 19 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 19 0 0 0 0 0 0 0 0 0 76 38 0 0 0 0 0 0 0 19 0 19 0 0 0 19 0 0 0 38 0 0 0 0 19 0 0 38 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 378 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 19 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

37,5

7,1

16,3

VEC011

0 0 0 0 0 0 25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 50 0 0 25 0 628 0 0 25 0 126 0 0 0 50 101 0 75 0 0 0 25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 25 0 0 0 0 0 101 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 50 101 0 0 0 0 25 75 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 25 25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 25 0 0 25 0 0 0 101 25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 50 0 0 0 50 0 0 0 0 0 0 0 0 0 25 0 0 0 25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 25

0,7

3,6

12,2

VEC008

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 36 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 265 0 0 0 0 0 0 0

1,8

1,9

17,1

BIN002

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

3,3

0,3

11,2

NTV002

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 23 0 0 0 0 46 0 0 69 694 46 0 46 0 0 0 46 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 93 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 23 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 23 0 0 0 0 0 0 0 23 0 0 46 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 23 46 0 0 0 0 116 69 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 116

4,1

1,9

3,5

GRV001

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 87 29 58 0 58 29 0 0 29 0 0 0 0 29 0 58 29 0 0 0 43 0 0 0 0 0 0 0 0 14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 173 87 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 14

0

5,4

0,2

3

KMS002

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5575 413 103 0 103 0 0 0 0 0 0 0 0 826 10634 0 206 0 0 0 103 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 103 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 103 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 103 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0

2,1

0,5

3,9

MBP037

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 105 0 0 315 0 0 315 0 420 0 0 0 3259 10512 0 210 0 105 0 315 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 210 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 105 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 420 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 210 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 105 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 1,2

1,3

0,3

PKH020

0 0 0 0 0 0 0 0 438 0 0 0 0 438 0 0 0 0 0 0 0 0 44 131 0 0 0 0 0 219 569 0 0 0 0 175 613 131 0 88 0 0 44 0 0 0 0 44 44 0 0 0 44 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 44 0 0 0 0 0 88 0 0 0 0 0 0 0 0 0 88 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 175 0 0 0 350 0 0 0 0 0 175 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 44 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 44 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 88 438 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 88 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 219 0 0 0 0 0 0 0 0 44 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 1,2

2,2

0,6

PKH011

0 0 40 0 0 0 0 0 80 0 0 0 0 80 0 0 0 0 0 0 0 0 120 0 40 0 40 0 0 40 201 0 0 0 0 0 562 0 40 0 0 0 80 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40 0 0 0 0 0 0 0 40 0 0 0 0 0 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 80 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 80 0 0 0 321 321 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 361 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40 0 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 80 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 80 0 40 0 0 0 201 0 0 0 0 0 0 0 120 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 80 0 0 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 1,4

7,1

PKH010

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 482 0 0 0 0 0 0 0 1927 0 0 1927 0 0 0 0 0 0 0 0 482 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1927 0 0 0 1927 0 0 0 0 0 1927 0 0 0 0 0 0 0 1927 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 41434 482 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 482 0 0 0 0 0 0 964 482 482 482 0 0 0 0 0 482 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1927 0 0 0 0 1927 0 0 0 0 964 0 0 0 0 0 482 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1,3 3,1

12,1

PKH050

0

PKH016

0

HAP010

0

HAP048

0,5

NAP020

6,6

2,2 6,7

NAP040

VP2VA2

0,2

NAP010

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 96 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 96 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 193 0 0 0 193 0 0 0 0 0 771 0 0 0 0 0 385 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 193 96 0 0 0 0 0 0 0 0 0 96 0 0 0 0 0 2987 0 0 96 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 96 0 385 289 0 0 2602 0 0 0 0 1638 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 193 0 0 385 0 578 0 0 0 0 0 0 0 289 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 96 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 96 0

0

GRV001

0,4

7,2

0 0 0 165 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1652 2808 165 165 165 0 0 165 0 826 0 0 0 0 0 330 1156 0 0 330 2147 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 165 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 165 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 330 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 496 0 0 0 0 0 496 496 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 330 0

1,7

KMS002

0,2

5,4

13

BIN002

1,9

10,1

1,1

NTV002

3,6

10,5

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 80 0 0 40 0 0 40 0 0 0 0 439 957 120 80 0 0 0 40 0 80 0 0 239 0 0 80 40 120 0 40 199 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40 0 0 0 0 0 0 0 120 40 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 199 0 0 0 0 0 80 439 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 159 0 0 0 80 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40

3,4

VEC014

4,3

1,4

3

5

VEC011

1,9

4,7

0,5

13,4

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 413 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1032 1308 69 0 138 0 0 69 0 138 0 0 0 0 0 0 275 413 0 275 3235 69 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 275 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 69 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 619 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 69 69

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 28 0 28 0 0 0 0 57 0 0 340 0 0 0 0 0 0 0 113 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 28 170 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 57 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 28 0 0 0 0 0 340 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 113 0 0 28 0 28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 57

3 1,5

VEC008

2,3

1,4

2,4

19,1

0 0 533 76 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 76 228 76 0 152 0 0 304 0 0 0 0 0 0 0 0 152 0 0 76 1826 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 76 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 152 0 0 76 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 913 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 76 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 76 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 152 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 228 0

0 0 0 0 0 0 0 0 222 0 0 0 0 0 0 0 0 222 0 0 0 0 445 0 222 0 445 0 0 0 0 222 0 0 0 0 0 222 1334 0 0 222 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1334 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 445 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 22904 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 222 222 0 0 889 0 0 0 0 667 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 222 0 445 0 0 0 0 222 889 0 0 0 0 0 0 0 0 222 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 222 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 667 0

2,1

MBP037

7,5

AP2AA2

2,1

4,6

1,6

10,8

VP2VA2

9

AP1AA1

1,4

1,4

1,3

8

VP1VA1

0

40,6

VP6VA6

1,1

8,5

0,8

AP2AA2

10

8,1

VP5VA5

0,8

2,5

0

AP1AA1

1,1

VP4VA4

2,6

0 6,2

VP6VA6

4,7

3 18

28,4

VP6VA6

6,2

5,8

VP5VA5

12

8,3

9,2

VP5VA5

0

1,5

21

VP4VA4

0,8

3,3

VP4VA4

0,2

0,6

VP3VA3

0,7

VP2VA2

2,2

1 15

1,6

VP1VA1

4,1

3,9

3

VP3VA3

1,3

9,7 30,6

VP1VA1

mpunt

DIATOMEEEN GROENALGEN BLAUWALGEN

ASRIFORM CERACLOS DIATTENU FRAGNANA FRAGRUMP FRIO FRLA MARTATOM OPEPGUGR OPEPKRUM PSROELLP STSI STSICOCS STSIPUNC STURPIPI SYDR TABU TABUFASC ULNAACUS AUSE AUSEAMBI AUSEGRAN COCA CYCL CYCLDUBI CYCO CYTEAT OM CYTEDIUN CYTEGLOM CYTEMENE CYTEOCEL CYTEPSED DILLPSEU MELOVARI MELS SKELPOTA SKELSUBS STDI STDIHANT STDIMINU STDINEOA STDIPARV STDITENU THSI THSILACU THSIPSEU UROSLONG ACNAMINU AMRACOPU BAAR COON COONPLEU COONPLLI EOLIMINI FRUSVULG GONE GONECLAV HALAVENE NACU NAVIANTO NAVIGREG NAVIRADO NITZ NITZACIU NITZAMPH NITZFONT NITZFRUS NITZFRUT NITZGRAC NITZGRFO NITZPACE NITZPAEA NITZPLIO NITZRECT NITZSUAC PLNOFREQ SURI SURIMINU TRYBHUNG ACTIHANZ AMKRMINU AMKRNANS ANKI ANKY BOOCBRAN CAENVIRI CART CHDO CHGO CHOTINCU CHREMINT COCSPOLY COEN CORU CORUASTR CORUMIPO CORUPSEU COUMELLI CRGEAPIC CRGEPULC CRGERECT CRUCFENE CRUCTETR DASPJURS DEOD DEODARAR DEODARBI DEODARLO DEODARMA DEODARSU DEODBRBR DEODCOCO DEODCOMM DEODCOSA DEODCOST DEODDELI DEODDENT DEODDISP DEODFLAV DEODINAC DEODININ DEODINTE DEODMAXI DEODOPCA DEODOPOL DEODOPOP DEODSERR DEODSPIN DEODSUBS DICOCURV DICYINER DICYPLAN DIGEPALA DIOS DIOSPULC DIOSSUSO DIOSTETA DIPL DYSMVARI ECCOELEG FRANOVAL FUSOVIRI GLTIPELA GLTISPRA GOOPPARU GRNUCORO HAEM HARIPOLY HARIRETI HEGEPARV HORTVERU JURAJAVO KICH KICHCONT KICHIRRE KICHOBEA KICHOBES KICHPSEU KOLI KOLILONG KOLISETI KOLISTAG LARH LARHCILI LARHGENE LARHLONG LARHSUSA LARHWRAT LOMOVERR MARVGEMI MITI MORA MORAARCU MORACARI MORACIRC MORACONT MORAGRIF MORAIRRE MORAKOMA MORAMINU MORATORT NECH NECHSUSO NECHWILL NECYOVAL NEODDANU OOCY OOCYLACU OOCYPARV PANDMORU PEASBIBR PEASBIRA PEASBORY PEASDUDP PEASDUPL PEASSIMP PEASTETR PLNELAUE PLSP PSICJURI PSIDFINA PSIDPLAN PSLLKAME PSTRPUNC PTERANGL PTERANGO PTERVARI PYMI QUCOELLI RACESIGM SCEE SCHRSETI SCNEECOR SCNEELTI SCNEGRAN SCNEGUTW SCNEMAGN SCNEOBLI SCNEOBSU SCNEPECT SCNEVERR SCOU SICE SICEKOLK SICEORNA SICEPSBL SILOKOLK SPRM SPRMEXSU SPRMSIMI TEONCAUD TEONMINI TEONTRIA TERE TEREALTE TERUHETE TERUKOMA TERUPUNC TERUSTAU TERUTRAN TREUSCHM TREUTRIA VITR VOVO ANNA ANNACIRC ANNO APCA APCADELI APNI APNIAPHA APNIFLAQ APNIGRAC APTH APTHSUAN CHCC CHCCLIMN CHCCMINM CHCCMINU CUSPISSA CYGR CYGRFERR CYGRIRRE CYGRLIBE CYLIRACI CYNAIMPE CYNUCALY CYTYFILI CYTYINTE CYTYPLAN LIMNREDE LYNG MEPE MEPEHYAL MEPEMINU MEPEPUNC MEPETENU MICY MICYVIRI MICYWESE MYXO OSCI PANN PLANAGAR PLLYCONT PLLYLIMN PSDA PSDACATE PSDALIMN PSDAMUCI RHABLINE ROME SNOWLACU SNOWLITO SPRU SYEC WOROOBTU CERI CERIBRUN CERIELLI CHCL CHCS CHCSBIPO

0,7

AP2AA2

16 1,9

AP1AA1

F-goenalg F-blauwalg F-diatom F-overig F-totaal

VP3VA3

0,62

VP2VA2

0,48

VP1VA1

0,71

AP2AA2

0,59

Correlatie

AP1AA1

M-Overigen 2454 879 -23 27 446

VP6VA6

M-Kiezelalgen 921 -37 10 424 1

VP5VA5

M-Blauwalgen 1033 0 276 -81 174

VP4VA4

M-Groenalgen 1012 344 -3 0 -32

VP3VA3

Constante F-groenalg F-blauwalg F-diatom F-overig

96 0 0 0 0 0 84 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 217 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 60 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 48 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 36 0 12 0 12 0 0 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 709 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 354 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 354 0 0 354 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 709 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 354 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 354 354 0 0 0 0 1418 0 1418 0 1418 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2836 0 0 1418 0 0 0 0 0 0 354 0 354 0 0 354 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 354 0 0 0 709 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1418 354 354 0 0 354 0 0 0 0 0 354 0 0 0 0 0 354 0 709 0 354 0 0 0 0 354 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2127 0 709 0 0 0 0 2836 0 0 0 0 0 0 0 0 354 0 354 354 0 0 0 0 0 0 0 0 354 354 0 0 0 0 0 0 0 2836 0 0 0 0 354 0 0 354 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15951 0 0 0 0 0 0 0 1772 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 276 0 0 0 138 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 138 138 0 69 0 0 276 0 0 0 0 0 69 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 69 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 276 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 69 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 207 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 138 0 0 0 138 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 69 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 301 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 301 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 18 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 301 0 0 0 0 0 0 0 0 301 0 0 301 0 0 301 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2410 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1205 0 0 0 1205 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 301 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 301 0 0 0 0 301 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 301 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1205 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1205 301 0 0 0 0 0 0 0 0 0 301 0 0 0 0 0 0 602 0 602 301 0 0 0 0 0 0 301 0 0 0 0 301 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1,7

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 13 26 0 0 0 0 26 7 0 7 0 0 26 0 0 0 0 0 13 13 0 0 7 0 0 0 0 0 0 11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11 0 0 0 0 11 0 0 56 0 0 11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 13 0 0 0 0 0 0 7 7 0 0 13 0 0 0 33 0 0 0 0 0 26 26 0 0 0 0 0 26 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 26 0 0 0 0 0 0 13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 13 0 0 0 7 46 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 0 0 0 0 26 0 13 0 13 0 0 0 52 0 0 0 0 0 0 0 0 0 26 20 0 7 0 0 0 0 0 0 13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 129 0 0 0 0 55 0 0 0 0 0 0 0 0 0 18 184 0 0 0 0 18 37 0 0 0 0 55 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 37 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 74 0 0 0 0 0 74 0 74 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 551 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 18 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 18 0 0 0 0 18 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 37 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 18 0 0 0 0 0 0 18 349 0 0 0 0 0 0 0 0 37 0 0 0 0 0 0 0 0 0 74 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 18 0 0 18 0 0 0 74 0 0 0 0 0 0 0 13160 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 37 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 161 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 101 682 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 0 31 0 0 0 0 0 0 0

0

Figuur 13: Een impressie van de dataset waarop het statistische onderzoek is uitgevoerd: horizontaal 67 monstercodes, fluorescentie signalen op de eerste vier regels. Per regel zijn de 412 fytoplanktonspecies verdeeld over de vier hoofdgroepen: iedere oranje/rode cel is een telresultaat (de groep ‘overig’ is niet volledig getoond).

29

De correlaties in Tabel 1 geven al aan dat de overeenkomst tussen fluorescentiebepaling en de aantallen fytoplanktoncellen niet goed is, zoals ook te zien in de regressieplaatjes in Figuur 14 en de vergelijking van de signalen en tellingen in Figuur 15. M-groenalgen uit FB-signalen

M-diatomeeen uit FB-signalen 20000

30000

18000 16000

20000

measured

measured

25000

15000 10000

14000 12000 10000 8000 6000 4000

5000

2000

0

0

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

0

5000

predicted

10000

15000

20000

predicted

M-blauwalgen uit FB-signalen

M-overig uit FB-signalen 120000

40000 35000

100000

measured

measured

30000 25000 20000 15000

80000 60000 40000

10000 20000

5000 0

0

0

5000

10000

15000

20000

predicted

25000

30000

35000

0

20000

40000

60000

80000

100000 120000

predicted

Figuur 14: Weergave van de multiple regressie tussen fytoplanktontellingen en de fluorescentiesignalen (geteld fytoplankton op y-as en met fluorescentie voorspelde waarde op x-as).

De beperkte correlatie tussen fluorescentie en fytoplanktonaantal is uiteraard te verklaren uit de grote diversiteit in afmetingen van de fytoplanktonsoorten. Helaas zijn geen biovolume of biomassabepalingen verricht, die in de regressie zouden kunnen worden meegenomen. Er kan wel een indicatie worden verkregen door –binnen bepaalde restricties- een gewogen regressie analyse uit te voeren op bovenstaande gegevens: per fytoplanktonspecies wordt een gewicht toegekend (minimum 0,1 en maximum 10) als virtuele transformatie naar biovolume, waarbij het verschil tussen de fluorescentiemeting en de ‘gewogen telling’ wordt geminimaliseerd. Statistisch gezien is het toekennen van gewichten een manipulatie voor het verkrijgen van een betere correlatie. Het toekennen van gewichten moet op basis van biovolume en/of biomassa van de afzonderlijke soorten gebeuren. Daarom is met literatuurgegevens (“Mendota phyto database”) een controle uitgevoerd met gewogen data van 48 van de 412 soorten, verdeeld over de vier hoofdgroepen. Met deze ‘steekproef’ is het effect op de correlatie tussen fluorescentie en algenaantallen onderzocht. De conclusie is dat de relatie tussen de fluorescentiesignalen en de individuele soorten fytoplankton aanzienlijk verbetert als rekening wordt gehouden met (een indicatie voor) het biovolume. Bij een vervolgstudie wordt daarom aanbevolen om, bijvoorbeeld op grond van literatuurwaarden en/of

30

meetbestanden, een analyse van het biovolume of de biomassa uit te voeren. Een weergave van de gevolgen voor de fytoplanktonaantallen is weergegeven in figuur 15. Fytoplankton-aantallen, zonder gewicht 180000 160000 140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0

1

3

5

7

9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63 65 67 Fytoplankton-aantallen, met gewicht

60000 50000 40000 30000 20000 10000 0

1

3

5

7

9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63 65 67

groenalg_pred

blauwalg_pred

diatom_pred

overig_pred

Fluorescentiesignalen 160 140 120 100 80 60 40 20 0 1

3

5

7

9

11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63 65 67

F-goenalg

F-blauwalg

F-diatom

F-overig

Figuur 15: Vergelijking tussen het fluorescentiesignaal en de microscopische tellingen van de verschillende groepen fytoplankton in 67 onderzochte monsters (fytoplankton aantallen of met fluorescentie bepaald chlorofyl-a [onder] op y-as en monsternummer op x-as).

31

Het resultaat van de gewogen regressieberekening wordt vermeld in tabel 2: Tabel 2: Resultaat regressie met optimalisatie door gewichten.

Constante F-groenalg F-blauwalg F-diatom F-overig

M-Groenalgen 985 172 3 -74 -64

M-Blauwalgen 1018 -76 234 -89 85

M-Diatomeeën -57 -52 81 833 -188

M-Overigen 2443 712 -200 31 374

Correlatie

0,97

0,97

0,90

0,94

Tabel 2 verschilt in structuur niet veel van Tabel 1: het grote verschil zit in de correlatiecoëfficiënten, wat ook zichtbaar is in de regressiefiguren: zie figuur 16.

M-diatomeeen uit FB-signalen

10000

20000

measured (met gewicht)

measured (met gewicht)

M-groenalgen uit FB-signalen

8000 6000 4000 2000

15000 10000 5000

0

0

0

2000

4000

6000

8000

10000

-5000

0

5000

predicted M-blauwalgen uit FB-signalen

15000

20000

M-overig uit FB-signalen measured (met gewicht)

30000

measured (met gewicht)

10000

predicted

25000 20000 15000 10000 5000

50000 40000 30000 20000 10000 0

0 0

5000

10000

15000

predicted

20000

25000

0

10000

20000

30000

40000

predicted

Figuur 16: Weergave multiple regressie, waarbij de sommatie van de vier hoofdgroepen is gebaseerd op gewogen tellingen (‘statistisch gewogen’ fytoplankton op y-as en met fluorescentie voorspelde waarde op x-as).

32

Relatie met biodiversiteit Als mogelijke indicator vooor de biodiversiteit is de zogenaamde Shannon-Weaver index bepaald. Deze index is berekend met de volgende formule:

H = - ∑ i (pi ld pi )

met

i =1 tot S

S = totaal aantal soorten Pi = Ni / N Ni = aantal individuen van soort i N = totaal aantal individuen

Zowel met regressietechnieken als met patroonherkenning technieken bleek het niet mogelijk een relatie tussen de fluorescentie en de biodiversiteit te leggen. Voor een vervolgstudie wordt geadviseerd meerdere kwaliteitindices te berekenen of te meten.

In figuur 17 wordt de Shannon-Weaver index weergegeven, in samenhang met de fluorescentiemetingen.

160

6,00

140 5,00 120 4,00 100

F-overig F-diatom

80

3,00

F-blauwalg F-goenalg

60 2,00

Shannon

40 1,00 20 0

0,00 1

3

5

7

9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63 65 67

Figuur 17 Shannon-Weaver diversiteitsindex (rechter-as) en fluorescentieresultaten (µg chlorofyl/L) per monster.

33

Conclusies De fluorescentie-analyse wordt in Nederland al toegepast om een indicatie van de risico’s van blauwalgen te verkrijgen (Werkgroep Cyanobacteriën, 2011). Omdat met fluorescentie geen individuele soorten worden bepaald maar alleen onderscheid op hoofdgroepen wordt gemaakt, is het onmogelijk om hiermee een eerste indruk van de trofiegraad te geven. De met fluorescentie bepaalde samenstelling van de fytoplanktongemeenschap komt niet goed overeen met de samenstelling die is aangetoond met microscopische celtellingen, maar geeft wel een redelijk goede voorspelling van de microscopisch bepaalde biomassa (of biovolume) van het fytoplankton. De fluorescentie-analyse kan niet worden gebruikt als indicator van de biodiversiteit van het fytoplankton omdat daarvoor meer informatie over individuele soorten nodig is. Met fluorescentieanalyse kan dus wel snel en goedkoop een eerste indruk worden verkregen over de globale samenstelling van het fytoplankton, maar het lijkt niet mogelijk om er de KRW-maatlat fytoplankton mee te toetsen.

Referentie Mendota phyto database: http://lakebase.gleon.org/download/files.path.95aef113df758631.4d656e646f746120506879746f20 4469762046756e6320446174615f394d6172636831312e786c7378.xlsx Werkgroep cyanobacteriën, Blauwalgenprotocol 2011, Vastgesteld door het DWO met NWO status op 10 februari 2011

34

Slotopmerking De Hydrochip is een instrument dat de waterbeheerder in staat stelt om op basis van DNA vingerafdrukken een goed beeld te verkrijgen van de samenstelling van (kiezel)algen in oppervlaktewater. Hiermee biedt het een toekomstig alternatief voor het bepalen van de ecologische kwaliteit met behulp van microscopische analyses. De Hydrochip die binnen dit project is ontwikkeld is in staat een goede voorspelling te doen over de trofiegraad voor het (meso)eutrofe bereik. In de nabije toekomst zal bij de verdere ontwikkeling de nadruk gelegd worden op een uitbreiding van de chip met markers voor algensoorten die representatief zijn voor het oligotrofe en oligo-mesotrofe bereik. De inzetbaarheid van de chip kan daarnaast nog vergroot worden door een uitbreiding richting blauwalgen, waarmee in dit project al een begin is gemaakt. Op deze manier is in dit project de basis gelegd voor een goedkope en snelle monitoring ten behoeve van effectief beheer in het kader van de Europese Kaderrichtlijn Water (KRW) en de Zwemwaterrichtlijn. Het consortium zal binnen een EU LIFE project (start november 2012) over een periode van 4 jaar de Hydrochip verder ontwikkelen totdat deze in routinematig watercontrolewerkzaamheden gebruikt kan worden.

35