HŐSOKKFEHÉRJE AUTOANTITEST VIZSGÁLATOK CARDIOVASCULARIS ÉS AZ IMMUNRENDSZERT ÉRINTŐ KRÓNIKUS BETEGSÉGEKBEN

HŐSOKKFEHÉRJE AUTOANTITEST VIZSGÁLATOK CARDIOVASCULARIS ÉS AZ IMMUNRENDSZERT ÉRINTŐ KRÓNIKUS BETEGSÉGEKBEN

Doktori értekezés Dr. Kocsis Judit Témavezető: Dr. Prohászka Zoltán Semmelweis Egyetem, Budapest Tudományági Doktori Iskola: Molekuláris Orvostudományok Elméleti és klinikai immunológia program 2005

A bírálóbizottság tagjai: Elnök: Prof. Kalabay László Titkár: dr László Zoltán Opponensek: dr Búzás Edit dr Horváth Ildikó 1. Tag: dr Somoskövi Ákos A szigorlati bizottság tagjai: Elnök: Tagok:

Prof. Falus András Prof. Pálóczi Katalin Dr. Dérfalvi Beáta

1

TARTALOMJEGYZÉK

2.

1. ÖSSZEFOGLALÁS

4.

2. SUMMARY

5.

3. BEVEZETÉS

6.

4. IRODALMI HÁTTÉR

7.

4.1. A hősokkfehérjék általános leírása

7.

4.2. A 70 kDa-os hősokkfehérjék leírása

11.

4.3. A 70 kDa-os hősokkfehérje expressziójának szabályozása

13.

4.4. A természetes autoantitestek

17.

4.5. A hősokkfehérje-ellenes antitestek

18.

4.6. A Hsp70-ellenes antitestek vizsgálata egyes betegségekben

20.

4.6.1.Hsp-70 elleni antitestek autoimmun betegségekben

20.

4.6.2.Hsp70-ellenes antitestek neuropszihiátriai kórképekben

21.

4.6.3.Hsp70-ellenes antitestek egyéb krónikus betegségekben

22.

4.7. A Hsp70 és a cardiovascularis betegségek kapcsolata

26.

4.7.1.Hsp70-ellenes antitestek cardiovascularis betegségekben

27.

4.8. A Hsp70 szerepe a HIV fertőzésben

29.

4.9 A csontvelőátültetés (periériás őssejt transzplantáció) és a hősokkfehérjék kapcsolata

29.

4.10. A Hsp70 szerepe a tumorellenes immunitásban

31.

5. CÉLKITŰZÉSEK

32.

6. MÓDSZEREK

33.

6.1. Betegek és kontrollok

33.

6.2. A hősokkfehérjék elleni antitestek titerének meghatározása

36.

6.3. Egyéb klinikai és laborparaméterek meghatározása

38.

6.4. Statisztikai módszerek

38.

7. EREDMÉNYEK

40.

7.1. Az anti-Hsp70 elleni antitestek szintjének mérésére szolgáló ELISA beállítása 40. 7.2 Az anti-Hsp70 IgG antitestek szintje súlyos coronaria-betegekben és egészségesekben

42.

7.3. Az anti-Hsp70, Hsp60 és 65 IgG antitestek szintének összehasonlítása súlyos coronaria-betegekben és kontroll egyénekben

2

45.

7.4. Az anti-Hsp70 antitestek szintje HIV szeropozitív egyénekben

46.

7.5. Az anti-Hsp70 antitestek változása aktív antiretroviralis terápia során

47.

7.6. Az anti-Hsp70 és anti-Hsp60 antitest szintek összehasonlítása HIV pozitív egyének és HIV szeronegatív kontroll egyének között

47.

7.7. Az anti-Hsp60/65 elleni IgA antitestek szintje malignus hematológiai betegségekben

48.

7.8. A Hsp60/65 elleni IgA szintek alakulása hemopoetikus őssejttranszplantációt követően

50.

7.9. Az anti-Hsp60/65 és anti-Hsp70 antitestek összehasonlítása hisztidin dekarboxiláz knock-out és vad-típusú egerekben

52.

8. MEGBESZÉLÉS

54.

8.1. A Hsp70 elleni IgG antitest szintek egészséges egyénekben

54.

8.2. A Hsp70 elleni IgG antitest szintek koszorúér-betegségben

54.

8.3.A Hsp-elleni IgG szintek alakulása HIV pozitív egyénekben

56.

8.4. A 60 kDa-os hősokkfehérjék elleni IgA szint hematológiai malignus betegségekben és perifériás őssejttranszplantációt követően

58.

8.5. A hősokkfehérje elleni IgG antitestek szintje hisztamin hiányos egerekben

60.

8.6. A hősokkfehérjék elleni antitest szint szabályozása eredményeim tükrében

60.

8.7 Az értekezésben leírt legfontosabb eredmények összefoglalása

62.

9. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

63.

10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

65.

11. IRODALOMJEGYZÉK

67.

12. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE

84.

3

1. ÖSSZEFOGLALÁS HŐSOKKFEHÉRJE AUTOANTITEST VIZSGÁLATOK CARDIOVASCULARIS ÉS AZ IMMUNRENDSZERT ÉRINTŐ KRÓNIKUS BETEGSÉGEKBEN Dr. Kocsis Judit Témavezető: dr. Prohászka Zoltán Semmelweis Egyetem III.sz. Belgyógyászati Klinika 2005 Jelen dolgozatban a 70 és 60 kDa-os hősokkfehérjék (Hsp) elleni antitest szintek vizsgálatának eredményeit foglalom össze. A hősokkfehérék elleni antitestek létezése már hosszú évek óta bizonyított, de ezek keletkezése, szintjük szabályozása és klinikai jelentősége még korántsem tisztázott. A 70 kDa-os hősokkfehérje elleni antitestek mérésére egy szilárd fázisú ELISA módszert állítottam be. Ezt követően három nagy betegségcsoportban elemeztem a 70 kDa-os, illetve a 60 kDa-os hősokkfehérje szinteket, választ keresve arra, hogy a hősokkfehérjék elleni immunitás összefüggésbe hozható-e ezen betegségek patomechanizmusával, vagy klinikai lefolyásával. A hősokkfehérje elleni immunitás szabályozásának jobb megértése érdekében hisztamin dekarboxiláz knock out (HDC-KO) egértörzsben is elemeztük a fenti antitestek előfordulását. Súlyos koszorúér-betegségben szenvedő egyének csoportjában azt találtam, hogy a 70 kDa-os hősokkfehérje elleni antitest szint –a 60/65 kDa-os Hsp elleni antitest szintekkel ellentétbennem függ össze a betegséggel. Ugyanakkor HIV fertőzött egyéneknél, azaz egy olyan betegségben, ahol bizonyított az immunrendszer krónikus Hsp70 expozíciója, szignifikánsan emelkedettnek találtam az antiHsp70 antitest szintet, ami a hatékony antiretroviralis terápiát követően lecsökkent. A malignus hematológiai megbetegedésben szenvedő egyéneknél a 60/65 kDa-os Hsp elleni IgA szint alacsonyabbnak bizonyult az egészséges kontroll egyénekhez képest, s ez szignifikáns volt a lymphoproliferatív betegségben szenvedők csoportjában. Perifériás őssejttranszplantációt követően a vizsgálatok alapján úgy tűnik, hogy a természetes autoantitestek szintje hamarabb rendeződik, mint az össz IgA szint. A hisztamin hiányos egerekben tett megfigyelés alapján az derült ki, hogy az endogén histamin befolyásolja a természetes autoantitestek, így a hősokkfehérje elleni antitestek termelődését. Eredményeim alapján úgy tűnik, a 60- és 70 kDa-os hősokkfehérjék elleni antitestek termelődése különböző szabályozás alatt áll és hogy ezen antitestek élettani és kórélettani szerepe eltérő.

4

2. SUMMARY Heat shoch protein antibody evaluation in cardiovascular disease and in chronic conditions involving the immune system Kocsis Judit MD Mentor: Zoltán Prohászka MD, PhD MD Semmelweis University, Budapest, 2005 In this work I summarize the results of antibody detection against 60- and 70 kDa heat shock proteins (Hsps) in some chronic human diseases. The existence of anti-heat shock protein antibodies is proved for a long time, however there is still lack of satisfactory data about regulation of the production and clinical role of these antibodies. For detecting antibodies against the 70 kDa heat shock protein I set up a solid phase ELISA assay. Then I evaluated the anti-Hsp70 and anti-Hsp60 antibody levels in certain human diseases. My aim was to find association between the humoral immunity against these hsps and the pathomechanism and clinical course of the disease. For better understanding of the regulation of anti-Hsp antibody formation, we evaluated these antibody levels in histamin deficinent mice also. In a group of patients with severe coronary artery disease I found that anti-Hsp70 antibody level doesn’t associate with the disease, unlike anti-Hsp60 and anti-Hsp65 antibodies. The opposite result was found among patinets with HIV infection, another disease, where the immune system is proved to be exposed chronically to Hsp70. In this patient population antiHsp70 IgG level was significantly higher compared to healthy controls, and this level decreased markedly with highly active antiretroviral treatment. In patients with hematologic malignancies, anti-Hsp60 and anti-Hsp65 antibody levels were lower, compared to healthy subjects and this difference was significant in the subgroup of patients with lymphoprolipherative disease. Long after hemopoietic bone marrow transplantation there was a trend toward faster reconstitution of natural autoantibody levels compared to total IgA levels. Detecting anti-Hsp70 and anti-Hsp60/65 antibody levels in histamine deficient mice we came to the conclusion that endogenous histamin plays a role in the regulation of natural autoantibody production, including anti-Hsp antibodies. My results support, that the regulation of anti-Hsp60 and anti-Hsp70 antibody production is different, and these antibodies have different physiologic and pathophysiologic roles in humans.

5

3. BEVEZETÉS A hősokkválaszt az 1970-es években fedezték fel, amikor a hőhatásnak kitett Drosophila melanogaster sejtekben a fehérjék egy adott csoportjának gyors szintézisét észlelték. Akkor még nem ismerték funkciójukat, így hősokkfehérjéknek nevezték el ezeket a proteineket (1). Kiderült, hogy ezek a fehérjék rendkívül konzervatív szerkezetűek, és a prokariótáktól az eukariótákig valamennyi sejt nélkülözhetetlen alkotói. A kezdeti kutatások alapján fény derült a hősokkfehérjék sejt életében betöltött esszenciális szerepére (chaperon funkció), ez alapján kapták egyes képviselőik a chaperonin elnevezést. A sejt életében emellett számos más fontos funkciót is betöltenek a hősokkfehérjék, pl. transzportfolyamatokat irányítanak, különféle stresszhatások miatt károsodott fehérjéket állítanak helyre stb. A hősokk-, vagy stresszválasz a természetben előforduló egyik legkonzervatívabb adaptív válasz (2-3). A későbbi széleskörű kutatásoknak köszönhetően kiderült, hogy a hősokkfehérjék nem csak intracelluláris funkciót töltenek be, hanem fontos szabályozó szerepet töltenek be a természetes és az adaptív immunrendszer működésében. A hősokkfehérjék elleni immunválasz egyre alaposabb megismerése vezetett például ahhoz a fontos új klinikai következtetéshez, miszerint a 60 kDa-os hősokkfehérjék elleni antitestek a koszorúérbetegség és az atherosclerosis független rizikó faktorai (4-5). Doktori munkám során elsősorban a 70kDa-os hősokkfehérje elleni humorális immunválasz összefüggését vizsgáltam egyes humán betegségekkel (koszorúérbetegség, HIV fertőzés, malignus hematológiai betegség miatt csontvelőtranszplantációban részesülő betegek), remélve, hogy ezáltal további releváns adatokat kapunk a hősokkfehérjék elleni immunitás jelentőségéről és esetleg új, hatékony predikciós klinikai tényezők birtokába jutunk.

6

4. IRODALMI HÁTTÉR 4.1. A hősokkfehérjék általános leírása A hagyományos elképzelés szerint a hősokkfehérjék (Hsp) intracelluláris fehérjék, melyek az alapvető sejtfolyamatokban és azok szabályozásában vesznek részt. Elnevezésüket

onnan

kapták,

hogy

először

Drosophilában

figyelték

meg

hőmérsékletemelkedés hatására ezen fehérjék fokozott szintézisét (6). Filogenetikailag, funkcionális és immunológiai szempontból rendkívül konzervált molekulák, melyek nélkülözhetetlenek a sejtek életműködéséhez. Az élővilágban a baktériumoktól a növényi és állati sejteken át az emberig minden lényben kimutathatók, funkciójuk az egyes

fajokban

igen

hasonló.

Aminosav

sorrendjük

az

élővilág

egyik

legváltozatlanabbul továbböröklődő struktúrája, egyes tagjai több mint 50%-os aminosav szekvencia homológiát mutatnak a különböző fajok között. A hősokkfehérjék konstitutív módon expresszálódó formái (egy normál sejt összes fehérjemennyiségének 5-10%-át teszik ki) fiziológiás körülmények között vesznek részt a sejt működésében, az indukálható formák pedig a különböző külső és belső stresszhatások (pl. hipertermia, hypoxia-reoxigenizáció,

reaktív

oxigén

gyökök

akkumulációja,

gyógyszerek,

nehézfémek, etanol, vírus- és baktériumfertőzések, citokinek) ellen védik a sejtet illetve a sejt fehérjéit, segítve ezzel a sejt túlélését (7-8) (1.táblázat). A hősokkfehérjék három fő biokémiai szereppel rendelkeznek. Dajkafehérje aktivitásuk révén meggátolják a denaturálódott fehérjék összetapadását, és segítik visszanyerni a denaturált fehérjék natív

konformációját.

Néhány

dajkafehérje

funkciójú

hősokkfehérje

nem

stresszhelyzetben is részt vesz a naszcens polipeptidek natív konformációjának kialakításában a fehérjeszintézis során. Továbbá annak köszönhetően, hogy a fehérjéket speciális konformációban képesek tartani, számos sejtregulációs folyamatban, mint például a sejtciklus kontrollban, a szteroid és D-vitamin-receptor feldolgozásban, és az antigén prezentációban vesznek részt. A legjobban ismert, dajkafehérje aktivitással rendelkező hősokkfehérjék a Hsp70, Hsp90 és a Hsp60 családba tartoznak. A hősokkfehérjék második szerepe a sejt redox állapotának szabályozása, melynek legjobb példáját a Hsp32, ismertebb nevén a hemoxigenáz-1 nyújtja. A harmadik alapvető biokémiai szerep a fehérje turnover szabályozása. Példaként az ubiquitin említhető, mely nyugalmi körülmények között is expresszálódik a sejtben, hősokk

7

hatására

nagyobb

mennyiségben

termelődik,

és

molekuláris

toldalékként

a

proteoszómában lebontásra kerülő fehérjék kijelölésére szolgál. A hősokfehérjék működésükhöz ATP-ből nyerik az energiát, az ATP hidrolízisét pedig maga a hősokkfehérje katalizálja. 1. Táblázat. A hősokkfehérjék fokozott expressziójához vezető állapotok Élettani

Kóros

Környezeti hatás

Sejtosztódási ciklus

Vírusfertőzés

Hőmérsékletváltozás (hő- és hidegsokk)

Növekedési faktorok

Bakteriális fertőzés

Nehézfémek

Sejtdifferenciálódás

Parazita fertőzés

Alkohol

Szöveti fejlődés

Láz

Antibiotikumok

Hormonális stimuláció

Gyulladás

Sugárzás

Ischaemia Hipertrófia Oxidatív károsodás Malignitás Autoimmunitás Toxinok, lipopoliszacharid

A hősokkfehérjéket hagyományosan molekulatömegük alapján osztjuk családokba. Ezek a családok funkcionális és legtöbbször strukturális értelemben az evolúció minden fejlettségi szintjén megtalálhatók (9). A legjobban ismert hősokkfehérjék a 110, 90, 70, és 60 kDa molekulatömegű hősokkfehérjék családjába tartoznak (2. táblázat). Ezek a hősokkfehérjék hősokk hiányában, 37oC-on is expresszálódnak. Külön csoportot képeznek a minor hősokkfehérjék, idetartoznak a 34, 47, 56, 75, 78, 94, és 174 kDa molekulatömegű glukózregulált fehérjék (glucose regulated proteins (grp)), melyek glukóz megvonás hatására termelődnek. A hősokkfehérjék egy harmadik csoportját a kisméretű, mintegy 20 kDa molekulatömegű hősokkfehérjék alkotják.

8

2. Táblázat. A hősokkfehérjék legjobban ismert családjai Eukarióta (prokarióta) család HSP110 (C1P)

A gén

A gén neve

jelölése HSP105A

110-kDa

HSP105B

hősokkfehérje

APG-1

110-kDa

A gén

A HSP

lokalizációja

lokalizációja

13q12.3

Citoszol/mag

4q28

Citoszol/mag

5q31.1-q31.2

Citoszol/mag

14q32.3 (4q3.5,

Citoszol/mag

hősokkfehérje, ozmotikus stresszfehérje 94 APG-

70-kDa

2/HSPA4

hősokkfehérje 4 (HSP apg-2)

HSP90 (HtpG)

HSPCA

90 kDa

hősokkfehérje 1, alfa 11p14.1-14.2, 1q212-q22, pseudogének) HSPCB

TRAP1 HSP70 (DnaK) HSPA1A

90 kDa

6p12 (4q21-q25, Citoszol/mag

hősokkfehérje 1,

15pter-q21,

beta

pseudogének)

hősokkfehérje 75

16p13.3

Mitokondrium

70 kDa

6p21.3

Citoszol/mag

6p21.3

Citoszol/mag

6p21.3

Citoszol/mag

14q24.1

Citoszol/mag

21

Citoszol/mag

9q33-q34.1

Endoplazmás

hősokkfehérje 1A HSPA1B

70 kDa hősokkfehérje 1B

HSPA1L

70 kDa hősokkfehérje-szerű 1

HSPA2

70 kDa hősokkfehérje 2

HSPA3

70 kDa hősokkfehérje 3

HSPA5

70 kDa

9

hősokkfehérje 5

retikulum

(glukóz regulált fehérje, 78 kDa, grp78, BiP HSPA6

70 kDa

1cen-qter

Citoszol/mag

1q23.1

Citoszol/mag

11q23.3-q25

Citoszol/mag

70 kDa

Emberben nem

Citoszol/mag

hősokkfehérje 9A

ismert, egérben

(mortalin 1)

18-as

hősokkfehérje 6 (HSP70B’) HSPA7

70 kDa hősokkfehérje 7 (HSP70B)

HSPA8

70 kDa hősokkfehérje (HSC70)

HSPA9A

kromoszóma HSPA9B

70 kDa

5q31.1

Citoszol/mag

12q12-13.2

Mitokondrium,

hősokkfehérje 9B (mortalin-2) HSP60 (GroEL)

HSPD1

60 kDa hősokkfehérje

Citoszol?

(chaperonin) HSP40

Hsp32, HO-1,

Citoszol, mag

Hsp40, Hsp47 Kisméretű hősokkfehérjék

Hsp22, αAkrisztallin Hsp23, αBkrisztallin Hsp27, Hsp28

Mitokondrium

HSP10

Hsp10, Hsp17

TCP-1 komplex

10

4.2. A 70kDa-os hősokkfehérjék leírása A 70 kDa-os hősokkfehérje családba tartozó fehérjék szerkezete igen konzervatív, eukarióta sejteken belül 60-78%-ban mutatnak azonos szerkezetet és az eukarióta Hsp70 valamint az E.coliból származó DnaK (a Hsp70-nek megfelelő fehérje) közötti azonosság 40-60%-os (2). Valamennyi Hsp70 képes ATP kötésére. A humán Hsp70 molekula konstitutív (Hsc70) és indukálható (Hsp72) formájának szerkezete gyakorlatilag megegyezik, különbség a C-terminális végen lévő 6 aminosav, mely a Hsp70-ből hiányzik. A 72 kDa-os fehérje három fő doménre osztható. Az N-terminális végen található egy 44 kDa-os domén (1-386 aminosavak), ez felelős az ATP kötésért. Ez a rész négy alegységet tartalmaz, melyek két lebenyt képezve egy bemélyedést vesznek körül. A középső 18 kDa-os domén (384-543) a peptid kötő rész, mely 4 standard antiparalell ß-redőből és egy α-hélixből áll, utóbbi képes a peptidek megkötésére. A 10 kDa-os C-terminális domén (542-646 a Hsc, illetve 542-640 a Hsp72 esetében) egy konzervatív EEVD terminális szekvenciával zárul, utóbbi valamennyi eukarióta Hsp70 ésHsp90 molekulán megtalálható (10) (1. Ábra). A Hsp70 család tagjai intracellulárisan chaperon funkciót töltenek be, s ennek révén fejtik ki citoprotektív

hatásukat.

A

Hsp70

család

konstitutív

formái,

így

a

nucleusban/citoplazmában lévő Hsc70, a mitokondriális Grp-75 (mt-Hsp70), valamint az endoplazmás retikulumban lévő Grp-78 alapvetően két fő chaperon funkciót látnak el a sejt normál, stresszmentes állapotában. A sejtben újonnan szintetizálódott és még be nem tekeredett naszcens fehérjéket

a Hsp60 család tagjaihoz kísérik, ahol aztán

megtörténik ezen fehérjék „hajtogatása”. A másik fő feladatuk az, hogy a sejtfehérjéket a sejt különböző kompartmentjeibe szállítják. Továbbá a Hsc70 és a Hsp70 más fehérjék, pl. a gliális-axon transzfer proteinek „cohort” proteinjeiként szolgálhatnak (10).

11

1/A Ábra. A Hsp70 N-terminális, ATP-áz doménje. (Forrás: Pubmed/structure/193X)

1/B Ábra. A Hsp70 C-terminális, szubsztrát kötő doménje. (Forrás: Pubmed/structure/ 1DKY)

12

4.3.A 70 kDa-os hősokkfehérje expressziójának szabályozása A hősokkfehérjék, így a Hsp70 nyugalmi intracelluláris szintje közel állandó, mint már fent említésre került részben a konstitutív forma a Hsc70, részben a különféle stresszhatásokra indukálódó forma a Hsp70 (Hsp72) alkotja. A hősokkfehérjék, így a Hsp70 expressziójának fokozódását leginkább a hősokk, illetve egyéb sejtkárosító folyamatok hatására aktiválódó hősokktranszkripciós faktorok (HSF: heat shock transcription factor) szabályozzák, melyek gyors ütemben kötődnek a fehérjét kódoló gén promóterének úgynevezett hősokkeleméhez (HSE: heat shock element). Gerincesekben eddig négy ilyen faktort írtak le, ezek a HSF-1, -2, -3 és 4 (11), legjobban a HSF-1 funkciója ismert. Nyugalmi állapotban a HSF-1 monomer formában található a citoplazmában, nagyrészt komplexet képezve a Hsp70 és Hsp90 molekulákkal, emellett könnyen kötődnek a denaturálódott fehérjékhez is. Ha hősokk, vagy egyéb stressz hatására fokozódik a denaturálódott fehérjék intracelluláris koncentrációja, akkor a HSF-1 valószínűleg nagyobb arányban kötődik ezekhez és ilyen módon a károsodott fehérjék hidrofób felszínein aktiválódik. Az aktiválódott HSF-1 trimer formában található meg, így kötődik a hősokkelemhez, transzkripciót indukálva. Ugyanakkor a bekötődő a HSF-1 foszforiláltsági állapota is meghatározó szerepet tölt be abban, hogy bekövetkezik-e transzkripció. Negatív szabályozó útvonalról is tudunk, egerekben kimutattak egy úgynevezett hősokk-elemhez kötődő faktort (HSE-BF, HSE binding factor), mely a hősokkelemhez kötődve gátolja a transzkripciót. A Hsp70 konstitutív formájának, a Hsc70 szintézisének a szabályozása kevésbé ismert, valószínű, hogy a hősokktranszkripciós faktorok nem vesznek részt benne. A hősokkfehérje szintézis a hősokkot követően általában 3-5 órával éri el tetőpontját, majd nyoc óra múlva befejeződik. A Hsp70 szint a stresszhatást követően jóval nagyobb mértékben emelkedik, mint például a Hsp90 szintje, ez részben abból adódhat, hogy a Hsp90 nyugalmi szintje magasabb, illetve a Hsp90 kevésbé vesz részt a sejt védőmechanizmusaiban. A hősokkfehérjék, így a Hsp70 szintje a stresszhatás utáni napokban, hetekben tartósan magasabb marad. A hősokkválasz mértékét in vivo körülmények között számos egyéni tényező is befolyásolja, ilyen például a hsp gének polimorfizmusa (12), a hősokkfehérjék eltérő nyugalmi szintje, például a Hsp70/Hsc70 arány (13).

13

A hősokkfehérjék alapvetően nem polimorf fehérjék, ez alól vannak kivételek. Legnagyobb arányban a HLA-kapcsolt hsp70 gének polimorfizmusait vizsgálták (3. táblázat). A humán hsp70-1 gén cisz regulációs szekvenciájában a biallélikus polimorfizmus a hősokk elemen belül található. Végeztek olyan kísérleteket, melyekben a fenti régióban történt nukleotid szubsztitúció hatását vizsgálták a promóter erősségére és a transzkripciós aktivitásra (14-15). Favatier és munkatársainak eredményei azonban azt mutatták, hogy a hsp70-1 promóter polimorfizmus nem befolyásolja a hősokk transzkripciós faktorok kötődését, a Hsp70 mRNS akkumulációját vagy szintézisét az EBV-vel transzformált humán sejtvonalakban. Hasonló eredményt kaptak Schroederék, akik a hsp70-2 gén polimorfizmus és a Hsp70 messenger RNS expresszió közötti kapcsolatot elemezték, és azt találták, hogy a gén PstI polimorfizmusa nem befolyásolja ex vivo a mRNA expressziót (16).

14

3. Táblázat. A Hsp70 gének polimorfizmusainak összefüggései egyes emberi betegségekkel Gén

Polimorfizmus

Populáció

Betegség/állapot

Hsp70-1

-110 A/C

indiai

tuberculoid lepra

francia

allergiás asztma

spanyol

cöliákia

egyesült királyságbeli (Northwick Park Heart Study II) spanyol

Hsp70-2

PstI

A vizsgált Eredmény betegek/kontrollok száma ? HSP70-1A szignifikáns emelkedése TL-ben 48/31 Nincs összefüggés

miokardiális infarktus

128/94 19 család 578/698

Nincs független összefüggés Nincs erős összefüggés

SLE

90/117

mexikói mesztic

SLE

107/158

afro-amerikai

SLE

46/42

Szignifikánsan gyakoribb a betegek között Nincs független kapcsolat Szignifikáns, független kapcsolat

mexikói

spondylarthropathia

150/158

spanyol egyesült királyságbeli

rheumatoid arthritis Graves-Basedow kór

? 90/92

német francia

IBD-t kísérő csontveszteség allergiás asztma

83/86 48/31

német

súlyos szepszis

87

japán

Crohn betegség

108/108

15

Szignifikánsan gyakoribb a betegek között Nincs összefüggés Szignifikánsan gyakoribb a betegek között Nincs összefüggés Nincs összefüggés Nincs összefüggés a kimenetellel Az A-allél szignifikánsan gyakoribb a nem

Megjegyzés

Referencia

-

17

DR4 és DR7 kiterjesztett haplotípusa lehet Kapcsolat rizikó haplotípusokkal Nincs kapcsolatban a testtömeg-indexszel

14

Kapcsoltság HLADR3-al

21

Kapcsoltság HLADR3-al C4A vagy DR3-tól független összefüggés HLA-B27-től független kapcsolat

22

Szoros összefüggés a C4A gén deléciójával DR4 és DR7 kiterjesztett haplotípusa lehet -

25 26

Nincs különbség a betegek és a kontrollok között

29

18 19 20

23 24

27 14 28

P2/P2

Hsp70-HOM NcoI

amerikai egyesült államokbeli

I-es típusú diabetes mellitus

29 család

japán dán

I-es típusú diabetes mellitus I-es típusú diabetes mellitus

32/31 114/110

taivani

I-es típusú diabetes mellitus

59/83

tunéziai

obezitás

343/174

tunéziai

emlőrák

243/174

finn

egészséges populáció,

spanyol

spondylarthropathia, reaktív arthritis rheumatoid arthritis

18 család (n=56) 31 38 ?

mexikói

spondylarthropathia

150/158

német

IBD-t kísérő csontveszteség

francia

súlyos, nem perforáló esetekben Nincs független kapcsolat

Rögzülés bizonyos rizikóhaplotípusokban

30

Nincs kapcsolat Nincs független Kapcsolat DR kapcsolat allélokkal Szignifikáns kapcsolat HLA-t nem vizsgáltak Szignifikánsan Nincs kapcsolat a gyakoribb a betegek TNF -308 között polimorfizmussal Szignifikánsan emelkedett rizikó Rögződés bizonyos HLA-B27/DR Nincs kapcsolat allélikus Nincs kapcsolat kombinációkban Nincs kapcsolat

31 32

HLA-B27-től független összefüggés -

24

83/86

Szignifikánsan gyakoribb a betegek között Nincs kapcsolat

allergiás asztma

48/31

Nincs kapcsolat

14

német

súlyos szepszis

87

DR4 és DR7 kiterjesztett haplotípusa lehet -

dán

I-es típusú diabetes mellitus

114/110

Nincs összefüggésben a kimenetellel HOM-2 allél TNF, HLA-B és szignifikánsan HLA-A allélekkel gyakoribb a kontrollok erős összefüggés között

16

33 34 35 36

25

27

28 32

Bár klinikai tanulmányokban eddig még nem sikerült alátámasztani a hsp70 polimorfizmus intracelluláris Hsp70 szintre kifejtett közvetlen szabályozó szerepét, az állatkísérletek egyértelműen arra utalnak, hogy a hősokkfehérjék emelkedett szintje előnyös hatással van bizonyos kórfolyamatok megelőzésére. A patkány indukálható hsp70 génjét hordozó transzgenikus egerekről szóló korábbi beszámolók szerint ezen állatok szíve kevésbé érzékeny az ischaemiás károsodással szemben (37). Később ezen eredmények megerősítéseképpen a humán hsp70 géneket hordozó transzgenikus egerek egészséges szívében gyorsabb gyógyulást írtak le ischaemiát követően az azonos alomból

származó,

nem

transzgenikus

egerekhez

képest.

A

hősokkfehérjék

kardioprotektív szerepét nemrégiben foglalták össze (38). Számos in vitro és in vivo állatkísérlet (39) támasztja alá a magas Hsp70 szint védő szerepét a kísérletesen kiváltott szepszis jobb prognózisában és kimenetelében. Egy korábban lezajlott hősokk súlyos szepszisben például csökkenti a mortalitást és a szervi károsodást, mely a fokozott Hsp70 expresszióval magyarázható. Úgy tűnik még számos alap- és klinikai jellegű kutatást kell még végezni ahhoz, hogy a hősokk válasz pontos összetevőit és szabályozását emberben megismerjük. 4.4. A természetes autoantitestek Egészséges emberek szérumában egyaránt kimutathatóak autoreaktív T- és B-sejtek (40-41). A természetes autoantitestek egészséges személyek szérumában található, nyilvánvaló specifikus antigén stimuláció nélkül keletkező ellenanyagok (42), melyek többsége legalább egy vagy több saját antigénnel reagál, ezért azokat természetes autoantitesteknek nevezzük (41). A természetes antitestek IgM, IgG és IgA izotípusúak, általában polireaktívak szemben a „nem saját” antigének ellen termelődő antitestekkel, melyek monoreaktívak. A természetes antitesteket nagyfokú konnektivitás jellemzi. A természetes antitest repertoár viszonylag szűk spektrumú, a korai életévek során alakul ki és az élet során nem változik, szemben a „nem saját” antigének ellen termelődő antitestekkel. T sejtektől független módon termelődnek a CD5+B1 sejtek által. Szigorú szelekcióra utal, hogy a természetes autoantitestek által felismert antigének elsősorban az evolúció során megőrzött (auto) antigének, mint például acetilkolin receptor, inzulin, hsp60, hsp70, hsp90, β2-mikroglobulin, IL-1, IL-6, aktin, tubulin. A természetes

17

autoantitestek hozzájárulhatnak az antigének T-sejtek felé történő prezentációjához (43), opszoninként a természetes védekezőmechanizmusokat támogathatják, továbbá fontos szerepet tölthetnek be az immunregulációban, mivel nagyfokú konnektivitásuk révén hálózati rendszerben a keringő immunkomplexek méretét, clearance-ét, és gyulladáskeltő potenciálját képesek befolyásolni. Ezen kívül, az immunhomeosztázis egyik általános mechanizmusaként a természetes IgG típusú antitestek a csontvelői preB- és B-sejtek számát befolyásolják. Cohen (44-45) egy új elméletet alkotott a természetes autoantitestek szerveződéséről illetve funkciójáról. Az „immunológiai homunculus” néven ismert elmélete szerint az összes saját struktúra egy bizonyos része képeződik le egy arányaiban torzított antigén tulajdonságú sajátban. Az elképzelés szerint a domináns autoantigének kódoltak az immunrendszer szervezeti felépítésében, többek között serkentő és gátló limfociták révén. A hálózaton belül a különböző, egymással kölcsönhatásban lévő limfociták között a kölcsönös interakciónak köszönhetően néhány limfocita még anélkül is aktiválódik, hogy a specifikus antigénnel immunogén formában kapcsolatot teremtett volna. Az egymással összekapcsolt limfociták egy mintázata által meghatározott autonóm aktivitási állapot alkotja egy adott saját antigén funkcionális leképezését, mely köré a hálózat szerveződik. A domináns saját antigének és az egymással kölcsönhatásban álló saját antigénnel reagáló T- és B-sejt populáció alkotja ezt a hálózatot. Cohen (44-45) szerint a homunculus lehet felelős az immuntolerancia fenntartásáért, illetve károsodása autoimmun betegségeket válthat ki. A hősokkfehérjék immundomináns tulajdonságán, és a patogének elleni természetes védekezésen túl, a fentiek alapján valószínű, hogy bizonyos hősokkfehérjék és specifikus antitestjeik az immunológiai homunculus részét képezik (44). 4.5. A hősokkfehérje-ellenes antitestek A hősokkfehérjék elleni antitestek szérumban való jelenlétét az elmúlt két évtizedben már számos vizsgálatban kimutatták. Ezek az antitestek mind egészséges humán szérumban, mind különféle kóros állapotokban megtalálhatók különböző mennyiségben (46). Eddig legtöbbet a 60 kDa-os hősokkfehérje család tagjai ellen termelődő antitestek előfordulását és szintjét elemezték, különösen miután kiderült, hogy ezen antitestek

18

szintje szoros összefüggést mutat a koszorúér-betegséggel és a carotis stenosissal. A hősokkfehérje elleni antitestek termelődését magyarázó elméletek közül korábban Wick és munkacsoportjának elmélete (47-50) volt az egyik legszélesebb körben elfogadott. Eszerint, az egészségesekben és különböző betegségekben detektálható hősokkfehérje elleni antitestek különböző mikroorganizmusokkal történő fertőzések immunválaszt indukáló hatásának tulajdoníthatóak. Az elmélet többek között azokra a kísérletes adatokra támaszkodik, miszerint pozitív korreláció áll fenn a szérumban mérhető Chlamydia pneumoniae elleni IgA és a H pylori elleni IgG, valamint a mycobacterialis hsp65-elleni antitest szintek között az átlag népességben, továbbá a mycobacterialis hsp65-elleni antitestek keresztreakciót adnak a hsp60 molekula E. coliban (GroEL) és Chlamydia baktériumban (chsp60) kimutatható formájával (51). Ezen elmélet szerint a saját hsp-elleni antitest válasz passzív módon, különböző baktériumokkal való fertőződés „melléktermékeként” jöhet létre. Az is ismert, hogy a hősokkfehérjék különféle fertőzések esetén immundomináns antigént jelentenek a gazdaszervezet számára. Az alábbi bakteriális és parazita fertőzések során például a Hsp70 immundomináns antigénként szerepel: Borrelia burgdorferi, Chlamydia trachomatis, Leishmania donovani, Leishmania major, Mycobacterium tuberculosis et leprae, Plasmodium falciparum, Schistosoma mansoni, Trypanosoma cruzi (10), ami szintén alátámasztja a hősokkfehérje ellenes antitestek fertőzés által indukált jelenlétét. Ma úgy gondoljuk, hogy a Hsp60 és Hsp70 ellenes antitestek valódi természetes autoantitestek (lásd 4.4. Fejezet). Ezt támasztja alá a fenti eredmények mellett az is, hogy Pockley és munkatársai (52-53) ELISA technikával valamennyi egyén szérumában tudtak Hsp60 és Hsp70 ellenes antitesteket detektálni, akárcsak munkacsoportunk az IgG típusú anti-Hsp60 antitestek esetében (54-56). Azt is kimutattuk, hogy az anti-Hsp60 elleni antitestek szintje középkorú férfiakban 5 éves periódust tekintve konstans (Bíró és munkatársai, közlés alatt). Itt jegyezném meg, hogy a legtöbb vizsgálat elsősorban a 60 kDa-os hősokkfehérje család elleni antitestekre vonatkozik. A Hsp70 elleni antitestek termelődéséről jóval kevesebbet tudunk, az eddig leközölt eredményeket a következő fejezetben foglalom össze.

19

4.6. A Hsp70-ellenes antitestek vizsgálata egyes betegségekben A Hsp70-ellenes antitestek előfordulását egészséges egyénekben és különféle kóros állapotokban több munkacsoport is vizsgálta (4. Táblázat). Egészséges humán szérumból az alkalmazott metodikától függően különböző arányban lehet kimutatni Hsp60, Hsp70 és Hsp90-elleni antitestek jelenlétét, melyek szerepe még nem kellően tisztázott. A vizsgálatok eredményei közül néhány arra utal, hogy a Hsp70 ellenes antitestek esetleg specifikus kóroki szerepet töltenek be bizonyos betegségek kialakulásában. 4.6.1.Hsp-70 elleni antitestek autoimmun betegségekben A krónikus betegségek közül leginkább az autoimmun betegségekben, ezek közül is elsősorban SLE-ben vizsgálták a Hsp70-ellenes antitestek szintjét (4. Táblázat). Az SLE-s betegek szérumának vizsgálata ellentmondásos eredményt adott, két vizsgálatban emelkedettnek találták a Hsp70-ellenes antitestek szintjét (57-58), míg két másik vizsgálatban nem találtak szignifikáns különbséget a kontroll egyénekhez képest (5960), megjegyzendő, hogy ezek a vizsgálatok viszonylag kis számú mintából történtek. Hayem és munkatársai emellett reumatoid arthritisben és kevert kötőszöveti betegségben is emelkedettnek találták a Hsp70-elleni antitestek szintjét egészséges kontroll egyénekéhez viszonyítva (58). Prummelék (61) Graves-Basedow kórban vizsgálták a Hsp70-ellenes antitesteket és azt találták, hogy a Western blot módszerrel mért antitest szint szignifikáns mértékben magasabb, mint egészséges egyénekben, s ez a szint a kezelés során az euthyreoid állapot elérésekor sem normalizálódik. Autoimmun májbetegségekben (autoimmun hepatitis és primer biliáris cirrózis) Shingai és munkatársai (62) mutattak ki immunoblot módszerrel emelkedett Hsc70 (a Hsp70 konstitutív formája) elleni antitest szintet. Autoimmun eredetű uveitisben is leírták a Hsp70 ellenes antitestek emelkedett szintjét (63). A fenti eredmények alapján lehetséges, hogy a Hsp70-ellenes antitesteknek patogenetikai szerepük lehet egyes autoimmun betegségek kialakulásában, ugyanakkor az emelkedett antitest szint a poliklonális B sejt aktivációval is magyarázható.

20

4.6.2.Hsp70-ellenes antitestek neuropszihiátriai kórképekben Schizophréniás betegekben Schwarz és munkatársai (64) ELISA módszerrel detektálták az antitest szinteket, melyek szignifikánsan nagyobb arányban fordultak elő a betegek szérumában (legnagyobb arányban a még teljesen kezeletlen betegek körében), mint egészséges egyénekben. Mivel a hősokkfehérjéknek neuroprotektív szerepük is van, felmerül, hogy a Hsp70 ellen termelődő antitestek gátolnák a Hsp70 illetve ahhoz hasonló antigénszerkezetű fehérjék protektív szerepét, s ily módon járulnának hozzá a betegség kialakulásához. Schwarzék eredményét támasztotta alá egy másik munkacsoport, akik szintén szignifikánsan magasabbnak találták a Hsp70 és Hsp90 elleni antitest szinteket akut schizophreniában, egy nagy esetszámú (n=90) vizsgálatban (65). A hsp70-ellenei antitestek szintje összefüggésben volt a betegség tüneteinek súlyosságával, amit a BPRS skála (Brief Psychiatric Rating Scale) segítségével mértek, korrelált az anti-Hsp90 antitest szinttel és nőkben magasabb volt, mint férfiakban. 6 hetes kezelést követően a betegek állapotának javulásával párhuzamosan az antitest szint csökkenését figyelték meg. Kimék vizsgálatában azoknál a betegeknél javultak a tünetek legnagyobb mértékben a 6 hetes kezelési periódus alatt, akiknél a kiindulási anti-Hsp70 antitest titer a magas tartományban volt. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az anti-Hsp70 antitesteknek speciális szerepük lehet a betegségben. A szerzők többféle lehetséges mechanizmust is említenek. A schizophrenia kialakulásának idegfejlődéstani hipotézise szerint a fetális korban fellépő környezeti tényezők (pl. fertőzés, perinatalis szövődmény, egyéb stresszhatások) a központi idegrendszer abnormalitásait okozhatják, ami később schizophréniára hajlamosít (66), amiben a Hsp70 fokozott expressziója is szerepet játszhat. Egy korábbi vizsgálatban Olney és munkatársai (67) a Hsp70 fokozott expresszióját

észlelték

a

corticolimbicus

idegsejteken

NMDA

(N-methyl-D-

aszpartámsav) receptor antagonista adását követően, ezzel a szerrel a schizophrenia tüneteit lehet előidézni. Antipszichoticus terápiát követően ugyanakkor elmaradt a fokozott Hsp70 expresszió, s ez a tény a Hsp70 schizophrenia patogenezisében betöltött lehetséges szerepére irányítja a figyelmet. Meniére betegségben és az úgynevezett immun-mediált akut sensoneurinalis hallásvesztésben is felmerül a Hsp70-ellenes antitestek lehetséges etiológiai szerepe

21

(68-69). Munari és munkatársai nemrég megjelent közleményükben (69) megerősítik azt, hogy az akut nem vezetéses hallásvesztés egyik formájának –melyet újabban immun-mediált sensoneurinalis hallásvesztének, vagy immun-mediált belső-fül betegségnek (70) is neveznek—a kialakulásában szerepe lehet a Hsp70 ellenes antitesteknek. Ez a betegség máig ismeretlen etiológiájú, a szerzők közleményükben egy olyan Hsp70 antitest kimutatására szolgáló ELISA tesztet mutatnak be, mely 84%os szenzitivitással és 93%-os specificitással különítette el az immun-mediált hallásvesztésben szenvedő betegeket az egyéb sensoneurinalis hallásvesztéstől, illetve az egészséges kontroll egyénektől. Az irodalomban eddig ez az első olyan közlemény, mely a humán Hsp70 elleni autoantitestek diagnosztikus értékét igazolja. 4.6.3.Hsp70-ellenes antitestek egyéb krónikus betegségekben Pulmonalis sarcoidosisban (mely ismeretlen eredetű betegség, etiológiájában infekció is felmerül) egy 37 beteg bevonásával végzett vizsgálat során szintén magasabbnak találták a Hsp70-elleni IgG antitest szinteket az egészséges kontrollokéhoz képest (71). Ebben a vizsgálatban korrelációt lehetett kimutatni a Hsp70-ellenes IgG antitest szint, valamint a szérum angiotenzin konvertáló enzim szint (emelkedett szintje a betegség egyik aspecifikus markere) és a szolubilis IL-2R szint között, továbbá a CRP szint között. A szerzők a magasabb anti-Hsp70 szintet a fokozott immunaktivációval, illetve a fertőzéses állapottal magyarázták. Gyulladásos bélbetegségben (Crohn betegség, colitis ulcerosa) is vizsgálták ezen antitestek lehetséges etiológiai szerepét, mivel ebben a betegségcsoportban is fokozott Hsp70, valamint Hsp60 expressziót lehet kimutatni a gyulladásos bélszakasz epithelialis sejtjeiben, valamint a mucosában és submucosábna lévő mononuclearis sejtekben (72). A munkacsoport a gyulladásos bélszakaszból vett biopsziás mintákból ki tudott mutatni Hsp70 ellenes IgA és IgM antitesteket, de ezek az egészséges kontrol mintákban is jelen voltak, emellett a komplement aktiváló IgG antitestek hiányoztak, ez alapján nem tűnik valószínűnek, hogy a Hsp70-ellenes antitesteknek szerepük lenne a gyulladásos bélbetegség immunpatológiájában.

22

II-es típusú diabetesben a Hsp70-ellenes IgG és IgM szitek nem voltak magasabbak, ugyanakkor az IgA szinteket szignifikánsan magasabbnak találták a kontrollokhoz képest (73), s ez összefüggésbe volt hozható a diabeteses makroangiopathia jelenlétével is. A Hsp70-ellenes antitestek malignus betegségekben való előfordulását eddig még nem igen vizsgálták. Egy munkacsoport elemezte nem kissejtes tüdőrákban szenvedő betegek körében (n=49) a Hsp70 és a Hsp90-ellenes antitest szinteket és azt találták, hogy a Hsp70 ellenes antitest szint szignifikánsan magasabb volt a betegek szérumában, mint egészséges kontrollok szérumában, ugyanakkor ez a Hsp90 ellenei antitest szintek esetében az emelkedés kevésbé volt kifejezett. Az allogén csontvelőtranszplantációt, valamint a szervtranszplantációt követő akut és krónikus graft-versus-host betegséggel kapcsolatban több munkacsoport is kimutatott fokozott Hsp70 elleni immunitást, ezt részletesen a 4.7. fejezetben tárgyalom. Cardiovascularis betegségben több munkacsoport is elemezte az anti-Hsp70 antitest szinteket, erről részletesen a következő fejezetben írok.

23

Vizsgált

Betegek száma

Anti-hsp70 szint

beteganyag Borderline

Beteg: 72

hipertónia

Kontroll: 75

Nincs különbség

Milyen paraméterrel Vizsgálati

Referen

találtak összefüggést

cia

Nincs

módszer

összefüggés ELISA

dohányzással,

43

lipid

paraméterekkel,

Hsp70

szinttel Hipertónia

Hipertóniás:111

Hipertónia,

Emelkedett

Dohányzással

Kontroll: 75

össze

Beteg: 218

Carotis

carotis

függ ELISA

52

intima-media ELISA

83

vastagság változással nem

atherosclerosis Erős

nem

volt összefüggés

fizikai 764 acélipari munkás

Zaj, por és hőhatásnak Hipertóniával

munka

Immunoblot

74

Nem emelkedett

ELISA

75

Emelkedett

ELISA

76

Western blot

77

kitett

munkásokban

magasabb szint Perifériás

Beteg:33

érszűkület

és Kontroll: 33

renovascularis betegség Perifériás

Perif. érbeteg: 41

érbetegség

Hasi aorta aneurizma: 20; Kontroll: 21

Dilatatív

DCM: 86; CAD: 80

DCM-ben

emelkedett,

cardiomyopathia Kontroll: 96

CAD-ban nem

Koszorúér-

CAD: 258

Nem különbözött

betegség

Non-CAD: 163

Nincs összefüggés a CAD

78

rizikófaktorokkal

Idős vs. fiatal 60

Életkorral emelkedett

ELISA

78

Western blot

61

egészségesek Graves-

GD: 45; Kontroll: 38

Emelkedett

Dohányzással összefügg

SLE

SLE: 73; Kontroll: 28

Nem emelkedett

ELISA

59

SLE

SLE: 34; Kontroll: 10

Emelkedett

Immunoblot

57

SLE

SLE:26; Kontroll: 20

Nem emelkedett

Autoimmun

Reumatoid arthritis:120; Mindhárom

betegségek

MCTD: 10;

Uveitis

Bechcet

Basedow kór

Sarcoidosis

ELISA

60

kórképben

ELISA

58

képest

ELISA

63

Szérum ACE szint, CRP és ELISA

71

SLE: 10; emelkedett kór:

18; Kontrollhoz

Sarcoidosis: 15

magasabb szint

Beteg: 37

Emelkedett

Kontroll: 44

sIL-2R

24

Vizsgált

Betegek

Anti-hsp70

Milyen

Vizsgálati

beteganyag

száma

szint

paraméterrel

módszer

Referencia

találtak összefüggést Schizophrenia

Beteg: 31

Emelkedett

Kezeléssel

Emelkedett

Anti-Hsp90

ELISA

64

antitest ELISA

65

Kontroll: 30 Schizophrenia (akut)

Beteg: 90 Egészséges: 83

szint, BPRS

pontszám,

Kezelés, Női nem Meniere betegség

Beteg: 134

Nem emelkedett

Western blot

68

ELISA

69

Immunoblot

62

ELISA

73

Izoelektromos

72

Kontroll: 124 Immun-mediált sensoros

IMIED: 41

Emelkedett,

hallásvesztés (IMIED)

Egyéb

diagnosztikus

hallásvesztés:

29;

Kontroll: 30 Autoimmun

PBC: 35; AIH: 17 Emelkedett

májbetegségek

Kontroll: 20

2-es

típusú

diabetes DM: 67

Emelkedett

anti- Macrovascularis

mellitus

Kontroll: 38

hsp70 IgA

szövődményekkel

Gyulladásos bélbetegség

IBD: 33

Nem emelkedett

Kontroll: 14 GVHD (PBSCT )

fókuszálás

Transzplantált: 29

GVHD-ben

Donor: 29

magasabb

GVHD

súlyosságával ELISA

80

anti- nem;

Hsp70 és 90 IgM G-CSF adása után nem szint Vesetranszplantáció

emelkedett

Transzplantált: 20

Nem különbözött

Kontroll: 27

a allograft

ELISA

81

Dohányzással nem függ ELISA

82

kontrolltól rejectio

esetén Tüdőrák (NSCLC)

Beteg: 49

Emelkedett szint

Kontroll: 40

össze

4. Táblázat. Hsp70 ellenes antitestek előfordulásának vizsgálata egyes kórállapotokban CAD: koszorúér-betegség, MCTD: kevert kötőszöveti betegség, PBC: primer biliáris cirrózis, AIH: autoimmun hepatitis, SLE: Szisztémás lupus erythematosus, DM: diabetes mellitus, IMIED: immun-mediált belső-fül betegség (immune-mediated inner-ear disease). GVHD: graft-versus-host disease, PBSCT: perifériás őssejtátültetés (peripheral blood stem cell transplantation), NSCLC: nem kissejtes tüdőrák, BPRS: Brief Psychiatric Rating Scale, ACE: angiotenzin-konvertáló enzim, CRP: C-reaktív protein, sIL-2R: solubilis interleukin-2 receptor.

25

4.7. A Hsp70 és a cardiovascularis betegségek kapcsolata A hősokkfehérjék közül a Hsp70-nek kitüntetett szerepe van a cardiovascularis rendszerben, elsősorban feltételezett cardioprotektív szerepe miatt. Számos állat és humán vizsgálat igazolta, hogy a Hsp70 indukálható formájának, a Hsp72-nek fokozott expressziója védi a myocardium sejteket az akut myocardialis stresszhatásokkal (például acut ischaemia, ischaemiás reperfúzió) szemben (84-85). Dillmann és munkatársai

egy

korábbi

vizsgálatban

izolált

állatszíveket

hőhatásnak

vagy

ishcaemiának kitéve fokozott Hsp70 expressziót észleltek (86). Az ezt követő állatvizsgálatokban más munkacsoportok azt találták, hogy az előzetes teljes test melegítés emelkedett Hsp70 szinthez vezet és ez által javult a szívizomzat funkciójának ischaemiás károsodást követő regenerálódása (87-88). Később Marber és munkatársai transzgenikus egerek esetében mutatták ki, hogy a Hsp70 overexpresszió fokozza a szív ischameiás károsodással szembeni rezisztenciáját (89). Érdekes módon más hősokkfehérjék, így a Hsp56 és a Hsp60 overexpressziója a vizsgálatok szerint nem bizonyult protektív hatásúnak, szemben a Hsp70-nel (90-91). Suzuki és munkatársai (84) nemrég kimutatták, hogy az intracelluláris Hsp72 fokozza a manganáz szuperoxid dizmutáz aktivitást. Ez az enzim segíti megőrizni a mitokondriális funkciókat és gátolja a mitokondriumhoz-kapcsolódó apoptózist a myocardialis ischaemia-reperfúzió okozta károsodást. Szintén a Hsp70 hagyományos chaperon funkciójától eltérő protektív mechanizmusra utal az a megfigyelés, miszerint patkányban a Hsp70 komplexet képezve a gátló IκBα szinttel csökkkenti az NF-κB aktivációt (92). Mivel az NF-κB a proinflammatórikus citokinek expresszióját szabályozó egyik kulcsfontosságú transzkripciós faktor, úgy tűnik a Hsp70 gyulladás ellenes hatást is képes kifejteni. Egy a közelmúltban megjelent közleményben Zhu és munkatársai (78) nagy esetszámú humán szérum vizsgálata kapcsán arról számoltak be, hogy a Hsp70 a vizsgált populáció 70%-ban volt kimutatható a keringésből, és a Hsp70 szintje szignifikánsan magasabb volt azon egyéneknél, akik nem szenvedtek koszorúér-betegségben, szemben a coronaria-betegekkel. Az alacsony Hsp70 szint (mint a koszorúér-betegség újabb esetleges kockázati tényezője) független volt a hagyományos rizikófaktoroktól, ráadásul a coronaria-betegség súlyossága –az érintett erek száma alapján- szintén fordított

26

összefüggést mutatott a keringő Hsp70 szinttel. A szerzők úgy gondolják, hogy a szérumban mért Hsp70 szint részben az intracelluláris Hsp70 szinteket tükrözi és a magasabb Hsp70 szintek a nagyobb intracelluláris protektív hatással függenének össze. 4.7.1.Hsp70-ellenes antitestek cardiovascularis betegségekben Cardiovascularis betegségekben elsőként Pockley és munkatársai elemzték az antiHsp70 antitest szintek alakulását. Először borderline hipertóniában szenvedő egyének szérumában vizsgálták az antitest szinteket és 72 beteg, illetve 75 egészséges, normotenzív egyén eredményeit összehasonlítva nem találtak szignifikáns különbséget az anti-Hsp70 antitest szint között (93) és az antitest szintek nem korrleáltak sem a dohányzással, em a lipid paraméterekkel, sem a Hsp70 szérum szinttel. Egy viszonylag nagy esetszámú későbbi vizsgálatban ugyanakkor azt találták, hogy stabil hipertóniás betegek szérumában emelkedett a Hsp70, valamint a Hsp65 ellenes-ellenes antitestek szintje (52). A hipertenzív csoportban (n=111) az anti-Hsp70 antitest szint mediánja (25.-75. percentilis) 55 (37-83) AU/ml volt, míg normotenzív egyénekben (n=75) ez 29 (29-44) AU/ml volt, az anti-Hsp65 esetében 76 (50-143) versus 38 (38-76) AU/ml-t mértek. A vizsgálatot ELISA módszerrel végezték, melynek során az IgA, IgG és IgM antitesteket együttesen mérték. A humán Hsp60 elleni antitestek esetében nem volt szignifikáns különbség a két csoport között (121 versus 129). A fenti különbségek az életkortól, a dohányzási szokástól és a lipid szintektől függetlenül kimutathatók voltak. A vizsgálat során az anti-Hsp70, illetve anti-65 szint és a carotis intima-media (I-M) vastagság közötti kapcsolatot is elemezték, de nem találtak összefüggést és ez összhangban van egy későbbi közleményükkel (83), ahol azt találták, hogy hipertóniás betegeknél a carotis I-M vastagság változása (progressziója) sem hozható kapcsolatba az anti-Hsp70 illetve anti-Hsp65 antitest szintekkel. A fenti eredmények a hipertóniában jelenlévő cardiovascularis stressz állapotot tükrözhetik. A szerzők szerint a fenti antitest emelkedés aspecifikus módon részjelensége lehet a hipertóniában észlelt magasabb szérum össz-immunoglobulin szinteknek, de a Hsp-ellenes antitestek képződését indukálhatják a stressznek kitett erek falában fokozottan kifejeződő hősokkfehérjék is. Egy kínai munkacsoport szintén összefüggést talált az anti-Hsp70 antitest szint és a hipertónia jelenléte között (74). Fizikai munkát végző emberek körében azt találták, hogy a nehéz, illetve stresszes munkakörülmények között (magas zajszint, por, hőség)

27

dolgozók körében magasabb az antitest szint és ez összefügg a magas vérnyomás jelenlétével. Szintén Pockley munkacsoportja elemezte perifériás érbetegségben és renovascularis betegségben a Hsp70 szintet, illetve a Hsp70-ellenes antitest szinteket és azt találták, hogy míg a szérumból magasabb Hsp70 szintek mérhetők a fenti két vascularis betegségben egészséges kontrollokhéz viszonyítva, addig a Hsp70-ellenes antitestek szintje nem különbözött a két csoport között (75). Ezzel szemben Chan és munkatársai (76) 41 perifériás verőérbetegségben illetve 20 aorta aneurizmában szenvedő egyén szérumából szignifikánsan magasabb anti-Hsp70 szinteket detektált. Ez egy meglehetősen kis esetszámú vizsgálat volt és a szerzők nem írták le, hogy pontosan hogyan állították be a mérés során alkalmazott ELISA technikát. Dilatatív cardiomyopathiában is vizsgálták a stressz proteinek elleni antitest szinteket. A munkacsoport Western blot módszert alkalmazott (77) és a cardiomyopathiában szenvedő betegek (n=87) szérumából szignifikánsan nagyobb arányban tudtak Hsp70ellenes antitesteket kimutatni, mint egészséges kontroll egyénekben. Koszorúérbetegségben szenvedők között a Hsp-ellenes (Hsp60, Hsp70, Hsp90) antitest szintek ugyanolyan alacsony arányban voltak detektálhatók, mint a kontroll egyének szérumában. Itt kell megjegyezni, hogy a dohányzás –ami a cardiovascularis betegségek egyik fő rizikótényezője- az eddigi vizsgálatok alapján szintén befolyásolja a Hsp70 expresszióját, valamint a Hsp70-ellenes antitestek szintjét. In vitro vizsgálatok alapján a dohányfüst fokozza a monociták és az endothel sejtek Hsp70 expresszióját (93), emellett dohányzó emberekben magasabb antitest szinteket mértek (61). Ugyanakkor mások eredményei ezt nem támasztják alá, Pockley-ék munkacsoportja egyik vizsgálatukban sem talált összefüggést a dohányzás és az anti-Hsp70 antitest szintek között, továbbá Zhong és munkatársai (82) sem találtak összefüggést a dohányzás és az antitest szintek között tüdőtumoros betegek körében.

28

4.8. A Hsp70 szerepe a HIV fertőzésben A különböző RNS és DNS vírusok életciklusában számos stresszfehérje vesz részt (94) és egyre több adat támasztja alá azt, hogy ezen fehérjék egy része a HIV-1 vírus replikációjában is fontos szerepet tölt be. HIV-1 fertőzést követően a Hsp70 és a Hsp27 fokozott,

szelektív

expresszió-fokozódását

lehetett

kimutatni

(95).

Agostini

munkacsoportja azt mutatta ki, hogy a Hsp70 részt vesz a HIV-1 preintegrációs komplexek nucleáris importjában (96), továbbá az is ismert, hogy a HIV-1 kapszidok összeállása in vitro és in vivo egy ATP-dependens folyamat (97) ami összefügg a hősokkfehérjék ATP-áz aktivitásával. Nemrégiben Gurerék (98) a különféle hősokkfehérjék HIV virionba való beépülését tanulmányozták, és azt találták, hogy a Hsp27, Hsp40, Hsp60, hsp70, Hsc70 és Hsp90 közül legnagyobb mennyiségben a Hsp70 mutatható ki a burokban, míg kisebb mennyiségben a Hsp60 és a Hsc70 is kimutatható volt. Ezt azzal magyarázták, hogy a Hsp70-nek kitüntetett szerepe van a HIV vírus szaporodásában, újabb sejtbe történő bejutásában. 4.9 A csontvelőátültetés (periériás őssejt transzplantáció) és a hősokkfehérjék kapcsolata A szervtranszplantációt követő immunológiai folyamatokban is szerepet játszanak a hősokkfehérjék. A kísérletes adatok szerint vese- vagy szívátültetés esetén például az allograftot infiltráló T sejtek számára erőteljes stimulust jelent a Hsp60, Hsp70 (99). Szívátültetést követően összefüggést lehetett kimutatni a Hsp60-ellenes antitestek jelenléte és az „anti-kardiális” antitestek magas titere között (100). Ismert, hogy az allogén csontvelőátültetést követő szakban gyakoriak az autooimmun jelenségek, számos autoantitest mutatható ki a transzplantáción átesett betegek szérumából, így pl. antinukleáris, anti-simaizom, anti-neutrophil citoplazmatikus antitestek, anti-reticulin antitest és reuma faktor (101), ugyanakkor ezen autoantitestek pontos eredete és klinikai jelentősége nem teljesen ismert. Goral és munkacsoportja állatmodellben és humán vizsgálatokban is tanulmányozták a Hsp70 szerepét a csontvelőtranszplantációt követő immunológiai folyamatokban.

29

Patkánymodellben azt találták, hogy a Hsp70-ellenes antitest szint emelkedése már igen korán, a 7. naptól megjelent a szérumban és összefüggésben volt az akut graft-versushost reakció (GVHD) tüneteivel, kialakulásával. A humán vizsgálatba 29 allogén csontvelőtranszplantáción (perifériás őssejttranszplantáción, PBST) átesett beteg vett részt, továbbá elemezték a donorok és egészséges kontroll egyének Hsp60, hsp70 és hsp90 elleni antitest szintjét is, ELISA módszerrel. Az egészséges kontroll egyének, valamint a perifériás őssejt donorok szérumában alacsony antitest szinteket tudtak kimutatni. A perifériás őssejtmobilizálás céljából adott G-CSF (granulocyta-colonia stimuláló faktor) adása után a donor egyének szérumában nem változott ezen antitestek szintje. Ugyanakkor azon recipiens egyének szérumában, akiknél akut graft-versus–host reakció alakult ki, szignifikánsan emelkedettnek találták az anti-Hsp70 és/vagy antiHsp90 antitest szintet a transzplantációt követő 30. és 90. nap között (80), míg az antiHsp60 antitest szint a kontroll egyénekben mért tartományban volt. Az antitest szint emelkedés és a GVHD súlyossága között nem volt összefüggés. A PBSCT-t követő krónikus GVHD megjelenése/kialakulása is összefüggésbe volt hozható az anti-hsp70 és anti-Hsp90 antitestek magasabb szintjével. A betegek követése során azt találták, hogy a transzplantációtól eltelt idő függvényében egyre csökkent az emelkedett antitest titer, 120 nap elteltével a transzplantált csoportban mért átlagos anti-Hsp70 ás antiHsp90 szint már nem különbözött szignifikáns mértékben a kontroll szinttől és ez párhuzamos volt a GVHD terápiára bekövetkező oldódásával. Az immunoglobulin izotípus elemzés során azt találták, hogy csak az IgM típusú antitestek szintje volt magasabb, az IgA és IgG antitestek szintje végig megegyezett a kontroll egyénekben mért szintekkel.

30

4.10. A Hsp70 szerepe a tumorellenes immunitásban

A hősokkfehérjék immunogén sajátosságaira először az hívta fel a figyelmet, hogy kiderült, képesek tumor-ellenes immunitás kiváltására (102). Az eddigi vizsgálatok bebizonyították, hogy a hősokkfehérjék, köztük a Hsp70 kulcsfontosságú szerepet játszanak a tumorellenes immunválaszban. Srivastava munkacsoportja korábban kimutatta, hogy vírussal fertőzött, illetve tumoros sejtekből származó Hsp90 és Hsp70 specifikus immunitást tud kiváltani az ellen a sejt ellen, amelyből a hősokkfehérje származik (103). Ez a válasz csak abban az esetben következett be, ha a Hsp70-hez egy, a tumorból származó peptidelegy is kötődik, ez a komplex képes aktiválni a specifikus immunválaszt. A Hsp70-peptid komplex feltehetően a fent leírt Toll-szerű receptorain illetve a CD91 receptoron keresztül kerül be az antigénprezentáló sejtekbe (104), ezt követi ezen sejtek érése, aktivációja, nyirokcsomóba kerülése, majd a CD8+ T-limfocita aktiváció. Mivel a hősokkfehérjék egyéb immunológiai stimulus nélkül képesek immunizálni, célsejteket aktiválni, ezért úgynevezett természetes adjuvánsoknak is nevezik őket (105). Számos vizsgálat eredménye bizonyítja, hogy a normális szövetekkel ellentétben a különféle tumorok felszínén fokozott a Hsp70 expresszió (106). Multhoff és munkatársai azt találták, hogy a Hsp70 sejtmembránban való fokozott megjelenése korrelált a NK-sejtek citotoxikus hatásával szembeni fokozott érzékenységgel, ami még tovább fokozódott, ha az NK-sejteket IL-2-vel és rekombináns Hsp70-nel inkubálták (107). Ménoret és munkacsoportja primer tumorokból származó klónok esetében azt találták, hogy csak azon klónok esetében történt tumor rejekció, amelyek indukálható Hsp70-et tudtak szintetizálni, ezzel szemben a progresszíven növekvő daganatoknál nem tudtak Hsp70 szintézist kimutatni (108). Ugyanez a munkacsoport mutatta ki, hogy a nem letális hőstressznek kitett tumor immunogenitása fokozódik, és a specifikus T-sejt mediált citotoxicitás korrelál a hőstressz hatására indukálódott Hsp70 expresszióval (108). A hősokkfehérjék elsődleges intracelluláris szerepe a sejt védelme a különféle külső behatásokkal szemben. A Hsp70 expresszió fokozódása ily módon védelmet is jelenthet a daganatsejtek számára, így például védheti a tumorsejteket a citisztatikus kezeléssel, vagy az irradiációval szemben (109). A tumorsejt fokozott Hsp70-expressziója a hőterápiával szemben is rezisztenssé teheti a daganatot. Wang és munkatársai kimutatták például, hogy a termorezisztens tumorok a HSF-1 transzkripciós faktor gátlásával termoszenzitívvé tehetők (110). Egy másik munkacsoport a Hsp70-expresszió és a tumorsejtek TNF-szenzitivitása közötti kapcsolatot elemezve azt találta, hogy a fokozott Hsp70 expresszió védi a daganatsejtet a TNF és a monocyták okozta citotoxikus károsodással szemben (111). A Hsp70 tehát egyfelől védi és rezisztenssé teheti a daganatsejteket a külső behatásokkal szemben, másfelől a Hsp70-tumorfehérje komplex aktiválja a természetes és az adaptív immunitást, specifikus immunválaszt váltva ki.

31

5. CÉLKITŰZÉSEK 1. Célul tűztük ki egy olyan ELISA módszer beállítását, amellyel megbízhatóan tudjuk detektálni a humán, indukálható Hsp70 (Hsp72) ellen termelődő antitestek szintjét különböző betegcsoportokban és egészséges kontroll egyénekben. 2. Következő célkitűzésünk az volt, hogy megvizsgáljuk, vajon a Hsp70 elleni antitestek szintje összefügg-e a súlyos coronaria-betegséggel, mint azt korábban munkacsoportunk és több más munkacsoport is kimutatta a 60kDa-os hősokkfehérjék esetében. Kíváncsiak voltunk arra is, hogy van-e korreláció a Hsp70 elleni antitestek szintje és a koszorúér-betegség ismert rizikófaktorai között. 3. Ismerve, hogy a Hsp70 fokozottan expresszálódik a HIV-fertőzött sejtek felszínén és nagy mennyiségben beépül a HIV virionok membránjába, azt elemeztük, hogy a HIV fertőzött egyéneknél kivált-e fokozott humorális immunválaszt a krónikus Hsp70 stimulus. Továbbá, befolyásolja-e HIV pozitív betegeknél a hatékony antiretroviralis kezelés ezen antitestek szintjét. 4. A továbbiakban olyan hematológiai malignus betegségben szenvedő egyének csoportjában elemeztük a 60 kDa-os hősokkfehérje család elleni antitestek alakulását, akik hemopoetikus őssejt transzplantáción estek át. Vizsgálatunk során arra kerestük a választ, hogy a hematológiai malignus betegség fennállása befolyásolja-e a Hsp60/65 ellen termelődő antitestek szintjét, továbbá, hogy az autológ illetve allogén őssejt transzplantáció után 2 évvel hogyan alakul ezen antitestek szintje, a teljes immunglobulin szinthez viszonyítva. 5. A természetes antitestek termelődésének szabályozása még nem tisztázott, az eddigi vizsgálatok eredményei alapján úgy tűnik, részben genetikai tényezők befolyásolják ezen antitestek termelődését. Ismert, hogy a hisztamin sokrétű szerepet játszik az immunválaszban, így az immunizációt követő antitest termelésben is (Jutel 2002, 2001, Schneider 2002, Wiener 2001). Eddig nem volt arra vonatkozó adat, hogy van-e szerepe a hisztaminnak a természetes antitestek képződésében. Ezért hisztidin dekarboxiláz knock-out (HDC-KO) egerekben vizsgáltuk az ún. természetes antitest szintek –köztük a humán Hsp70 és a hsp60 elleni antitestek–alakulását egy kollaborációs munka keretein belül. 6. Végül a természetes autoantitest termelődés szabályozásának jobb megértése érdekében célul tűztük ki a Hsp70 és a Hsp60 elleni antitest szintek alakulásának összehasonlítását az egyes betegcsoportokban.

32

6. MÓDSZEREK 6.1. Betegek és kontrollok 1. Súlyos coronaria-betegek és egészséges kontrollok csoportja A súlyos koszorúér-betegségben szenvedő egyének csoportját 99 fő alkotta. Ezek olyan betegek voltak, akik 1995 és 1996 között stabil vagy instabil angina pectoris, valamint típusos EKG elváltozások miatt koszorúér-angiográfián estek át az Országos Kardiológiai Intézetben, melynek során szignifikáns koszorúér-szűkület igazolódott. A koszorúér-festés valamennyi betegnél Judkins módszere szerint történt (112). Ezt követően valamennyi betegnél coronariabypass műtét történt. A betegek főbb demográfiai és klinikai jellemzői az 5. táblázatban láthatók. A betegek 47.5%-a (n=47) már átesett korábban myocardialis infarktuson. A vérminták 6 hónappal a coronarográfiát és bypass műtétet követően kerültek levételre, a szérumokat –70 ºC illetve –20 ºC-on tároltuk. A kontroll csoportot 99 olyan egészséges felnőtt alkotta, akik rutinszerű szűrővizsgálat kapcsán jelentkeztek vérvételre és az anamnézis, a fizikális vizsgálat alapján egészségesnek bizonyultak, anamnézisük nem utalt koszorúérbetegségre. Kikérdezés alapján rögzítettük a betegek és kontroll egyének dohányzási szokásait. 5. Táblázat. A coronaria-betegek és a kontroll egyének klinikai adatai! Változó

Betegek†

Kontroll csoport‡

p-érték* betegek

versus

kontroll csoport Életkor (év)

57 (51-63)

52 (47-54)

p<0,0001

Nem (férfi/nő)

77/23

61/39

p=0,03

BMI (kg/m2)

28,65 (25,95-30,91) 27,29 (24,06-29,69) p=0,0146

Szérum koleszterin 6,4 (5,8-7,5) szint (mmol/l)

5,3 (4,75-6,1)

p<0,0001

Szérum triglicerid 2,3 (1,5-2,9) szint (mmol/l)

1,4 (0,99-2,17)

p<0,0001

†Coronaria bypass műtéten átesett, súlyos koszorúér-betegségben szenvedő egyének. ‡Egészséges kontroll felnőttek. *A p-értéket Mann-Whitney teszttel számoltuk ki. BMI: testtömeg index (Body Mass Index).

33

2. HIV szeropozitív egyének csoportja Negyvenhét HIV fertőzött beteget vontunk be vizsgálatunkba, akik a Fővárosi Szt. László Kórház Immunológiai Osztályán álltak gondozás alatt. A betegek klinikai jellemzői a következők voltak: 34 férfi, 13 nő; életkor (Median (25.-75. percentilis)): 35 (13-78) év; CD4+ limfocita szám: 338 (25-878) sejt/ml; vírus szám: 8000 (0-39000) kópia/ml. Kontrollként ugyanazon egészséges, HIV szeronegatív véradók szérumából válogattunk (n=65), akik az előző vizsgálat kontroll-csoportját alkották. A kontroll egyének klinikai adatai a következők voltak: 27 férfi, 38 nő; életkor: 47 (24-72) év. Tizenkilenc HIV szeropozitív beteg esetében longitudinális vizsgálatra alkalmas savópárokat tudtunk gyűjteni, ahol az első minta az antiretroviralis kezelés (HAART; highly active antiretroviral therapy) megkezdése előtt került levételre, a második minta pedig 11-41 (medián: 24) hónappal a HAART bevezetését követően. A HAART kezelés során kettős (n=2), hármas (n=14), illetve négyes (n=3) gyógyszer-kombinációt kaptak a betegek, a 19 betegből 14 esetében a kombináció proteáz gátló készítményt is tartalmazott. 3. Hematológiai malignus betegségben szenvedő egyének csoportja Ötvenkét hematológiai malignus betegségben szenvedő egyént vontunk be az első (transzplantáció előtti) vizsgálatba, és 33 beteg alkotta a post-transzplantációs csoportot. Valamennyi betegnél hemopoetikus őssejttranszplantációra (HSCT; hemopoietic stem cell transplantation) került sor az Országos Hematológiai és Immunológiai Intézetben 1994 november és 2001 január között. A méréseket –70 C°-on tárolt szérumokból végeztük, melyek a kondicionáló kezelést megelőzően, illetve 25,5 (12,25-45,5) hónappal a sikeres allogén vagy autológ transzplantációt követően kerültek elvételre. A kontroll csoportot 91 olyan egészséges felnőtt alkotta, akik rutinszerű szűrővizsgálat kapcsán jelentkeztek vérvételre és az anamnézis, a fizikális vizsgálat alapján egészségesnek bizonyultak. A betegek és a kontroll egynek klinikai jellemzőit a 6. Táblázat mutatja. Mivel a poszttranszplantációs periódusban a CMV fertőzés megelőzése céljából valamennyi beteg kapott tisztított, polispecifikus intravénás immunglobulint (IVIG), ami nagy mennyiségben tartalmaz IgG-t, ezért ebben a vizsgálatban csak IgA antitest szinteket mértünk.

34

6. Táblázat. A betegek és a kontroll egyének klinikai jellemzői A HSCT előtt

A HSCT után

Egészséges kontroll

vizsgált

vizsgált

csoport (n=91)

betegcsoport (n=52)

betegcsoport (n=33)

34 (25-48)

35 (27.5-44)

34 (25-41)

27/25

20/13

52/39

3

2

-

CML

21

26

NHL

13

3

HD

3

1

ALL

3

0

SAA

5

0

MM

4

1

autológ

22

8

allogén

30

25

Életkor, medián (25.-75. percentilis) Férfi/nő arány Betegség AML

Az őssejt eredete

4. Az anti-Hsp60/65 és anti-Hsp70 antitestek vizsgálata hisztidin dekarboxiláz knockout egerekben A vizsgálatokhoz három-négy hónapos hím és nőstény HDC-KO (hisztamin dekarboxiláz knock-out) egereket, illetve vad típusú egereket használtunk. A HDC-KO egértörzs előállításával kapcsolatban korábbi közleményre utalok (113). A HDC deficiens (HDC-/-) és a vad típusú (HDC+/+) egerek egyebekben azonos genetikai háttérrel rendelkeztek. Az egerek a vizsgálatig hisztamin-mentes étrendet kaptak. Mindkét csoportból 5-5- állattól történt vérvétel a retrobulbaris vénás plexusból, a vérmintákat a vizsgálatig -20C-on tároltuk. A hősokkfehérje elleni IgG és IgM típusú antitest szintek meghatározása ugyanúgy történt, mint a humán szérumok esetében. A kollaborációban készült vizsgálatsorozatban még számos más autoantigénként szóba jövő protein illetve proteoglikán, illetve DNS elleni antitestek is meghatározásra kerültek, ezek részletes leírása máshol olvasható (114).

35

6.2. A hősokkfehérjék elleni antitestek titerének meghatározása A 70kDa-os hősokkfehérje elleni IgG antitest titer meghatározása A Hsp70-elleni antitestek meghatározásához rekombináns humán Hsp70 antigént (StressGen

SPP-755,

Canada)

használtunk.

Az

antitest

titer

meghatározását

laboratóriumunkban kifejlesztett szilárd fázisú ELISA technikával végeztük (a beállítás lépéseit lásd alább). A 96 lyukú mikrotiter lemezeket (Greiner, Németország) 0,1 µg/well Hsp70 antigénnel fedtük (100 μl), amit bikarbonát pufferben oldottuk (pH=9,4). Ezt követően a lemezeket egy éjszakán át inkubáltuk 4ºC-on. Mosást követően (PBSTween20 0,05%) a nem specifikus kötőhelyek blokkolására PBS-zselatin (0,5%) (pH=7,2; 200 μl) oldattal inkubáltuk a lemezeket 1 órán át, szobahőmérsékleten. Ezt követően egyszeri mosás után mértük be a szérum mintákat a lemezekre (100μl/well, 1:100-as higítás PBS-zselatin (0,5%)-Tween (0,05%) oldatban, 1 óra inkubálás szobahőmérsékleten). Ötszöri mosást követően gamma lánc specifikus, peroxidázzal jelölt, nyúlban termelt anti-humán IgG antitestekkel (DAKO, Glostrup, Dánia) jelöltük az anti-Hsp70 antitestek kötődését (100 μl, 1:6000 higítás PBS-zselatin-Tween-ben, 1 óra inkubálás szobahőmérsékleten), majd mosást követően (5x) a jelölés felerősítése érdekében egy ún. második konjugátumot alkalmaztunk (100 μl, 1:3000 higítás PBSzselatin-Tween-ben, 1 óra inkubálás szobahőmérsékleten), ami kecskében termeltetett, peroxidázzal jelölt nyúl immunoglobulin elleni IgG antitest volt (DAKO, Glostrup, Dánia ). A szubsztrát reakció (5x-i mosás után) ortophenilene diamine (OPD, SigmaAldrich St. Louis, Mo, USA)-vel történt citrát pufferben H2O2 jelenlétében. A reakciót kénsavval állítottuk le, az optikai denzitásokat (OD) 490 nm-n (referencia: 620nm) olvastuk le microplate ELISA leolvasó (Metertech S960 ELISA Reader) segítségével. Az OD-értékeket ugyanazon lemez fedetlen részén mért OD-k kivonásával korrigáltuk, az egyes savókat duplikátként mértük. Az antitest koncentrációt önkényes egység/mlben (Arbitrary Unit – AU/ml) adtuk meg, melyet anti-Hsp70 antitesteket magas koncentrációban tartalmazó humán szérum higítási sorából készített standard görbe alapján számoltunk ki.

36

A 60 és 65 kDa-os hősokkfehérjék elleni IgG antitestek titerének meghatározása A humán hsp60-elleni antitestek méréséhez humán rekombináns hsp60 (SPP-740, StressGen Biotechnologies cég (Victoria, Canada)) molekulával fedtük a lemezeket. A mycobacterialis hsp65-elleni antitestek méréséhez rekombináns Mycobacterium bovis hsp65 antigént használtunk (batch: MA14, Lionex, Braunschweig, Németország). A hősokkfehérjék elleni antitestek szintjének meghatározására laboratóriumunkban bevezetett szilárd fázisú ELISA módszert használtuk (115). A lemezeket (Enzy-Plate, Propilen Kft., Pécs, Magyarország) human rekombináns hsp60 és mycobacterialis hsp65 antigénekkel fedtük 1μg/well koncentrációban bikarbonát pufferben (pH 9.6, 100ul/well, 4°C-n egy éjszakán át). Egyszeri mosás után (PBS-Tween20 0.05%) 1 órán át blokkoltuk a lemezeket szobahőmérsékeleten PBS-zselatin (0,5%) oldattal (pH=7,2). Ismételt mosás után mértük be a szérum mintákat (50μl/well PBS-zselatin (0,5%)Tween (0,05%) oldatban, 1:100 higításban, 1 óra inkubálás szobahőmérsékleten). Ezután a lemezeket 5x mostuk, majd nyúlban termelt peroxidázzal konjugált γ-lánc specifikus anti-humán IgG-t (DAKO, Glostrup, Dánia) adtunk hozzá (1 óra inkubálás szobahőmérsékleten.). A lemezek előhívása, leolvasása és az antitestkoncentrációkat tükröző optikai denzitások önkényes egység/ml-be történő átszámolása ugyanazzal a módszerrel történt, mint a Hsp70 ellenes antitestek mérésénél. A 60 és 65 kDa-os hősokkfehérjék elleni IgA antitestek titerének meghatározása A 60 és 65 kDa-os hősokkfehérjék elleni IgA antitestek meghatározása ugyanazzal az ELISA módszerrel történt, mint az IgG antitest meghatározás, de a specifikus kötődés kimutatására nyúlban termelt, alfa-lánc specifikus, peroxidázzal jelölt anti-human IgA antitesttel (Sigma, ST. Louis, USA) történt, amit 1:2000-es hígításban adtunk a lemezekhez.

37

6.3. Egyéb klinikai és laborparaméterek meghatározása Testtömeg index (BMI) A testtömeg indexet a kilogrammokban megadott testtömeg és a méterben mért testmagasság négyzetének hányadosaként számoltuk. CD4+ limfocita alosztály meghatározása A CD4+ limfocita szám meghatározás flow citometriával (FACScan) történt, IMK Lymphocyte kit (Beckton Dickinson, Mountain View, CA, USA) segítségével. HIV kópiaszám meghatározás A HIV-1 RNS szintet NASBA (Organon Teknika, Turnhout, Belgium) teszttel határoztuk meg a HIV pozitív betegek plazma mintáiból. Lipid szint meghatározás A szérum koleszterin és triglicerid koncentrációk meghatározása enzimatikus kolorimetriás módszerrel történt Enzachol-F és ENZGlycide reagensek segítségével. IgA szint meghatározás A csontvelőtranszplantáción átesett hematológiai betegeknél és a kontroll egyéneknél nefelometriával határoztuk meg az össz IgA szintet (Beckmann array laeser nephelometry; Beckmann, USA). 6.4. Statisztikai módszerek A statisztikai analízist a GraphPad Prism3 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, Egyesült Államok) számítógépes program segítségével végeztük. A vizsgálatban résztvevő személyek jellemzőit leíró folyamatos változóknál nem normál eloszlás esetén a mediánt (interkvartilis tartomány), normál eloszlás esetén átlag+szórást, diszkrét változók esetén pedig a változó gyakoriságát tüntettük fel. Mivel a Hsp elleni antitestek szérum titere nem mutatott normál eloszlást, nem paraméteres teszteket (Mann-Whitney, illetve Wilcoxon rangösszeg-próba, ANOVA) használtunk a vizsgált csoportok összehasonlításakor. Valamennyi teszt kétoldalú volt.

38

Az antitestszintek és az egyéb változók közötti összefüggés vizsgálatakor a Spearman rank korrelációt alkalmaztunk. A pozitívnak definiált antitestszintek gyakoriságát Fisher exact teszttel hasonlítottuk össze a csoportok között. A szignifikancia szint határának valamennyi teszt esetében a p<0,05 értéket vettük figyelembe. Mivel a koszorúér-betegségben szenvedők csoportjában egyes kiindulási változók szignifikáns különbséget mutattak a kontroll csoporthoz képest, többszörös logisztikus regressziós analízist alkalmaztunk a Hsp70-elleni antitest szintek összehasonlítására.

39

7. EREDMÉNYEK 7.1. Az anti-Hsp70 elleni antitestek szintjének mérésére szolgáló ELISA beállítása Az anti-Hsp70 ellenes antitest szint szilárd fázisú ELISA módszerrel történő meghatározását egy több lépcsős folyamatban sikerült beállítani. Az anti-Hsp60/65 elleni antitest szint mérés már korábban beállított módszerét tekintettem kiindulási alapnak. A beállítás folyamán több lépésnél kellett az egyes paraméterek változtatásának hatását elemezni, így pl. a fedés koncentrációját (1 versus 2 μg/ml rekombináns Hsp70), a fedés mennyiségét (50 versus 100 μl/well), a bemért minták (szérumok) koncentrációját, az anti-humán IgG antitest koncentrációját, valamint az ELISA lemez fajtáját. A kezdeti mérések során az 1 μg/ml koncentrációjú fedés bizonyult eredményesnek, 100 μl/well mennyiségben, a szérumok higítása esetében az 1:100-es higítás, míg a konjugátum esetében az 1:6000 higítás eredményezte a legerősebb jelet, de nem a legkedvezőbb jel/zaj arányt. Ugyanis a fedetlen lemezeken nyert háttér OD értékek a lemez fedett részén mért értékekhez képest továbbra is magasak voltak, számos minta esetében kaptunk emiatt 0 Au/ml antitest szintet. A specifikus antitest kötődés további felerősítése érdekében ekkor egy ún. második konjugátumot adtunk a rendszerhez, ez egy kecskében termelt, nyúl immunoglobulin ellenes, peroxidázzal jelölt antitest volt, amit 1:3000-es higításban alkalmaztunk. Így a háttér levonása után is kellően magas OD értékeket kaptunk. A módszer specificitását gátlásos kísérletekkel igazoltuk, a vizsgálandó mintákat rekombináns Hsp70-nel előinkubálva dózisfüggő módon csökkentek az OD értékek. A standard görbe előállításához egy magas antitest titerű szérumot kerestem és a továbbiakban valamennyi mérés esetében ennek a szérumnak a felező lépésekben történt hígítási sorát alkalmaztam. Az így nyert OD értékekből lineáris regressziós módszerrel történt a standard görbe illesztése (2. Ábra), az adott savó 1:100 hígítását tűztük ki 6400 AU/ml (arbitrális egység/ml) értéknek Pozitív és negatív kontrollként 1-1 magas illetve alacsony antitest titerű szérum mintát alkalmaztam valamennyi lemezen.

40

OD 490-620 nm

1.00

0.75

0.50

0.25

0.00 0

1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000

AU/ml

2. Ábra. Egy jellegzetes standard görbe az anti-Hsp70 IgG mérési rendszerben. Az X tengelyen az önkényesen definiált (arbitrális egység/ml=Au/ml) értékek szerepelnek, a standard szérum 1:100-as higítását tekintettük 6400 Au/ml-nek. Az Y tengelyen a 490-620 nm-en mért OD értékek láthatók. A fent részletesen leírt szilárd fázisú ELISA módszer beállításával lehetőségünk nyílt a humán Hsp70 elleni IgG antitestek titerének megbízható, reprodukálható mérésére. Vizsgálatai módszerünkkel csaknem valamennyi egészséges kontroll, illetve beteg szérumából detektálni tudtuk a Hsp70 elleni IgG antitestek jelenlétét. Az antitestszintek log-normál eloszlást követnek (3. Ábra).

41

A szérum anti-Hsp70 IgG szint (Au/ml), logaritmikus skála

100000

10000

1000

100

10

1

3. Ábra. Az anti Hsp70 antitestek log-normál eloszlást követnek. Az egyes pontok egyegy egészséges kontroll egyén mintáját jelentik. Az Y tengelyen az anti-Hsp70 antitest szintek vannak feltüntetve arbitrális egység/ml értékben, n=65. 7.2 Az anti-Hsp70 IgG antitestek szintje súlyos coronaria-betegekben és egészségesekben Elsőként koszorúér-betegségben szenvedő egyének csoportjában mértük a Hsp70 elleni antitestek szintjét. A vizsgált csoportokban mért anti-Hsp70 antitest szintek eloszlását a 4. Ábra mutatja. Látható, hogy az antitest szintek log-normális eloszlást követnek mind a beteg, mind a kontroll csoportban. A Hsp70 elleni IgG antitestek szérum koncentrációjának medián értéke (25.-75. percentilis) 653 (400-1141) AU/ml volt koszorúér-betegségben szenvedő egyéneknél, ez az érték az egészsées felnőttel csoportjában 630 (326-1152) AU/ml volt. Mann-Whitney teszttel nem találtunk statisztikailag szignifikáns különbséget a két csoport között.

42

A szérum anti-Hsp70 IgG szintek (Au/ml), logaritmikus skála

10000

1000

100

10 Betegek

Kontroll egyének

4. Ábra. Az anti-Hsp70 IgG antitestek szintje súlyos koszorúér-betegségben szenvedő, valamint egészséges felnőtt egyénekben. Az egyes pontok 1-1 beteget jelölnek. Nincs statisztikailag szignifikáns különbség (p=0,337) a két csoport között a Hsp70 elleni antitestek medián értékét tekintve (Mann-Whitney teszt). Mivel a két csoport között szignifikáns különbség volt mind az életkor (medián 57 versus 52; p<0,0001), mind a férfi/nő arány (3,34 versus 1,56; p=0,03), mind a koleszterin (6,4 versus 5,33; p<0,0001) illetve triglicerid (2,3 versus 1,4; p<0,0001) szintek, továbbá a BMI (28,65 versus 27,29; p=0,0146) tekintetében (5. Táblázat), többszörös logisztikus regressziós analízisben illesztettük az anti-Hsp70 antitestek szintjét a fenti különbségekhez (7.Táblázat). A Hsp70 ellenes antitestek szintje az életkor, nem, BMI, szérum koleszterin és triglicerid szint való illesztés után sem mutatott statisztikailag szignifikáns eltérést a csoportok között, a pérték 0,9844-nek adódott. A Hsp70 elleni antitest szintet definíciónk szerint akkor tekintettük pozitívnak, ha az meghaladta az egészséges kontroll egyénekben mért értékek 75. percentilisét (cut off érték =1152 AU/ml). A pozitív antitest szinttel rendelkező egyének aránya között nem volt statisztikailag szignifikáns különbség a betegek és a kontroll egyének között a Fisher exact teszt alapján (23/99 és 24/99 pozitív eset).

43

Ezt követően elemeztük, hogy az anti-Hsp70 antitest szint mutat-e összefüggést a koszorúér-betegség egyes ismert kockázati tényezőivel. Korrelációs analízist végeztünk, Spearman teszt segítségével. Nem találtunk összefüggést az anti-Hsp70 antitestek szintje és az életkor (r=0,121, illetve 0,194 a betegek, illetve kontroll egyének esetében), a BMI (r=0,087 és –0,163), a szérum koleszterin szint (-0,187 és 0,194), a szérum triglicerid szint (r=-0,034 és –0,005), valamint a C-reaktív protein szint (r=0,039 és – 0,144) között. A Hsp70 ellenes antitestek szintje és a nem, dohányzási habitus, valamint a coronaria-betegek körében előforduló diabetes között sem találtunk összefüggést (Mann-Whitney teszt). Összehasonlítottuk az antitest szinteket azon coronaria-betegek között, akiknél már korábban kialakult myocardialis infarktus (MI, n=47), illetve nem történt MI (n=52). A Hsp70 elleni antitest szint medián értéke 639 (407-1219) volt a MI-n átesett betegek csoportjában és 627 (362-1107) az infarktus szempontjából negatív anamnézisű betegeknél. Ez az érték statisztikailag nem volt szignifikáns (Mann-Whitney teszt).

7. Táblázat A súlyos koszorúér-betegség, valamint az anti-Hsp70 antitest szint közötti összefüggés többszörös logisztikus regressziós elemzése az életkor, nem, BMI, valamint a szérum koleszterin és triglicerid szint szerint illesztve.

Változó

A regressziós koefficiens p-értéke

Életkor

0,1020

Nem

0,0707

BMI

0,1184

Szérum koleszterin

0,0000

Szérum triglicerid

0,4937

Anti-Hsp70

0,9844

44

7.3. Az anti-Hsp70, Hsp60 és 65 IgG antitestek szintének összehasonlítása súlyos coronaria-betegekben és kontroll egyénekben Összehasonlítottuk a Hsp70, 60 és 65 elleni IgG antitestek szintjét koszorúérbetegségben szenvedő (n=99) egyének és azon egészséges egyének között (n=49), akiknél korábban megtörtént a Hsp60/65 elleni antitestek meghatározása. Az antitest szintek medián (25.-75. percentilis) értékeit a 8. Táblázatban tüntetem fel. Az antiHsp70 antitestek medián értéke hasonló a két csoportban (653 (347-1189) illetve 653 (400-1141), p=0,723), ugyanakkor az anti-hsp60/65 antitestek szintje szignifikánsan magasabbnak adódik súlyos koszorúér-betegségben szenvedő egyéneknél (Hsp60 esetében: 131 (50-271) versus 43 (26-111) AU/ml; p<0,0001; Hsp65 esetében: 17 (9,334 versus 8,9 (4,9-12,9) AU/ml, p<0,0001). A Hsp70 elleni antitestek szintje sem a coronaria-betegekben, sem az egészséges kontroll egyénekben nem mutatott korrelációt az anti-Hsp60 (r=0,014, p=0,182) illetve az anti-Hsp65 (r=0,008, p=0,185) antitest szintekkel. 8. Táblázat A Hsp70, valamint a 60 kDa-os Hsp család elleni IgG antitestek szintje súlyos koszorúér-betegségben szenvedő, valamint egészséges kontroll felnőttekben Betegek (n=99)†

Kontroll

csoport p-érték

(n=49)‡ Anti-Hsp70 antitest 653 (347-1189)

653 (400-1141)

p=0.7230

43 (26-111)

p<0,0001

8,9 (4,9-12,9)

p<0,0001

koncentráció (AU/ml) Anti-humán

Hsp60 131 (50-271)

antitest koncentráció (AU/ml) Anti-M.bovis Hsp65 17 (9,3-37) antitest koncentráció (AU/ml) †Coronaria bypass műtéten átesett, súlyos koszorúér-betegségben szenvedő egyének. ‡Egészséges kontroll felnőttek. Az értékek medián (25.-75. percentilis) értékeket jelentenek.

45

7.4. Az anti-Hsp70 antitestek szintje HIV szeropozitív egyénekben 47 HIV-fertőzött beteg és 65 egészséges, HIV szeronegatív egyén szérumában mértük párhuzamosan a Hsp70 elleni IgG antitestek szintjét. HIV pozitív betegek szérumában szignifikánsan magasabb koncentrációt találtunk az egészséges kontrollokéval szemben (medián: 1409 [1031-2214] AU/ml versus 626 [419-970] AU/ml, p<0,0001 (5.Ábra). Definíciónk szerint a magas antitest titert az 1500 AU/ml feletti érték jelentette, ez az érték az egészséges kontrollokban mérté értékek közel 90-es percentilisének felet meg. HIV pozitív egyéneknél a magas titer előfordulási aránya 20/47 volt, míg HIV szeronegatív egyéneknél ez az arány 7/63 volt (p=0,0002, Fisher exact teszt). Ebben a vizsgálatban a pozitív antitest titer definiálásához magasabb cut-off értéket tudtunk meghatározni, mint az előző, coronaria-betegeket elemző vizsgálatban, mivel a HIV pozitív betegek titerének mediánja több mint kétszerese volt a koszorúér-betegekének, illetve kontroll egyénekének. Az anti-Hsp70 antitest szint a HIV szeropozitív egyénekben nem korrelált a CD4+ sejt számmal (r=0,294, p=0,121), illetve a vírus kópia számmal (r=-0,1164, p=0,718).

A szérum anti-Hsp70 IgG szintek (AU/ml),logaritmikus skála

10000

1000

100

10 HIV pozitív (n=47)

HIV negatív (n=65)

5. Ábra. Az anti-Hsp70 IgG szintek 47 HIV pozitív és 65 HIV szeronegatív egyén szérumában. A HIV pozitív egyének a mintavételt megelőzően nem részesültek HAART kezelésben. P<0,0001 (Mann-Whitney teszt).

46

7.5. Az anti-Hsp70 antitestek változása aktív antiretroviralis terápia során 19 HIV szeropozitív beteg esetében kezelés előtt és hatékony, aktív antiretroviralis terápia (HAART) bevezetése után 11-41 (tartomány, medián: 24) hónappal vizsgáltuk, és hasonlítottuk össze az anti-Hsp70 IgG antitestek szintjét. A longitudinalis vizsgálat során azt találtuk, hogy a Hsp70 elleni antitestek szintje szignifikáns mértékben lecsökkent a HAART alkalmazása során (1309 [887-2213] AU/ml versus 640 [386-959] AU/ml; p<0,001, 6. Ábra). Ezzel párhuzamosan a vírus kópiaszám is jelentősen lezuhant (12 000 [3082-59850] versus 0 [0-1205] kópia/ml; p=0,003), a CD4+ limfocita szám pedig emelkedett (180 [151-434] versus 404 [278-690] sejt/ml; p<0,01).

A szérum anti-Hsp70 IgG szintek (AU/ml), logaritmikus skála

10000

1000

100

10 HAART elõtt

HAART alatt

6. Ábra. A szérum anti-Hsp70 antitest szintek a longitudinális vizsgálatban HAART kezelés előtt és hatékony HAART kezelés mellett (p<0,001, Wilcoxon teszt).

7.6. Az anti-Hsp70 és anti-Hsp60 antitest szintek összehasonlítása HIV pozitív egyének és HIV szeronegatív kontroll egyének között Munkacsportunk korábbi mérési eredményeit is figyelembe véve (126, 133) összehasonlítottunk az anti-Hsp60 és anit-Hsp70 szinteket HIV pozitív egyénekben (9. Táblázat). Míg a fent bemutatottak alapján az anti-Hsp70 szint szignifikáns mértékben magasabb a fertőzött egyéenkben az egészséges kontroll egyénekéhez képest, addig az anti-Hsp60 antitest szintek esetében ez nem volt igaz, a két csoport antitest szintje csaknem azonosnak bizonyult.

47

HIV

pozitív HIV

egyének

szeronegatív P-érték

egyének

(Mann-

Whitney teszt)

Medián (25.-75. percentilis) Anti-Hsp60, Au/ml Anti-Hsp70, Au/ml

35,8 (23,8-49,8)

36,0 (24,4-50,6)

n=74

n=63

1409 (1031-2214)

626 (429-970)

n=47

n=63

0,1429 P<0,0001

9. Táblázat. A humán anti-Hsp60 és anti-Hsp70 IgG antitest szintek összehasonlítása HIV-fertőzött egyének és egészséges, HIV szeronegatív kontrollok között.

7.7. Az anti-Hsp60/65 elleni IgA antitestek szintje malignus hematológiai betegségekben A vizsgálat első része egy keresztmetszeti elemzés volt, 52 hematológiai malignus betegségben szenvedő egyén szérumából határoztuk meg a Hsp60 és a Hsp65 elleni IgA típusú antitest szintet, valamint az össz IgA szintet, amit egészséges kontroll egyének antitest szintjeivel hasonlítottunk össze. A vizsgálat második része egy követéses vizsgálat volt, ebben 33 hemaopoetikus őssejttranszplantáción átesett betegnél határoztuk meg a fenti antitest szinteket, arra keresve választ, hogy a transzplantáció utáni késői periódusban (25,5 hónappal a HSCT után) hogyan alakul a hősokkfehérje ellenes antitest szintek rekonstitúcója a teljes IgA szinthez, valamint a transzplantáció előtti szinthez viszonyítva. A vizsgálat első, keresztmetszeti ágán azt találtuk, hogy a humán Hsp60 és mycobacterialis Hsp65 elleni IgA antitestek szintje, valamint az össz IgA szint alacsonyabbnak bizonyult a hematológiai malignus betegségben szenvedők körében az egészséges kontrollokban mért értékekhez képest (7. Ábra). A különbség szignifikánsnak bizonyult a 60 és 65 kDa-os hősokkfehérjék elleni antitest szintek esetében (Mann-Whitney teszt, p=0,0186 és p=0,0265), míg az össz IgA szintek közötti különbség nem volt statisztikailag szignifikáns (p=0,1315).

48

B

A

10

1 Betegek

Kontroll egyének

C 5

A szérum össz IgA szintek (mg/dl)

A szérum anti-Hsp65 IgA szintek, Au/ml (logaritmikus skála)

A szérum anti-Hsp60 IgA szintek, Au/ml (logaritmuikus skála)

100

1000

100

10

4

3

2

1

0

1 Betegek

Kontroll egyének

Betegek

Kontroll egyének

7.Ábra. Az anti-humán Hsp60 (A), anti-mycobacterialis Hsp65 (B) antitestek, valamint az össz IgA koncentráció (C) a hematológiai malignus betegségben szenvedő egyéneknél HSCT-t megelőzően, valamint egészséges kontroll egyénekben. A Mann-Whitney teszttel számított p-értékek a következők voltak: p=0,0186; p=0,0265 illetve p=0,1315. Az alcsoport elemzés során azt találtuk, hogy a fenti különbség a limfoproliferatív betegségben (Hodgkin kór, non Hodgkin limfóma, akut limfoid leukémia és myeloma multiplex) szenvedők szignifikánsan alacsonyabb antitest szintjeiből ered. Ez utóbbi csoportban szignifikánsan alacsonyabb volt az anti-Hsp60 és anti-Hsp65 antitestek szintje a kontrollokéhoz képest (10.Táblázat), ezzel szemben a myeloproliferatív betegségben szenvedők csoportjában (krónikus myeloid leukémia, akut myeloid leukémia) az antitest szintek nem különböztek a kontrollokétól. Az antitest szintek, valamint a betegek életkora között nem találtunk korrelációt.

49

10. Táblázat Az anti-Hsp antitestek és az össz IgA szint összehasonlítása a csontvelőtranszplantációt megelőzően a myeloproliferatív (CML és AML) vagy lymphoproliferatív (NHL, HD, ALL, myeloma multiplex) betegségben szenvedők, valamint az egészséges kontroll egyének között. Myeloproliferatív

Lymphoproliferatív

Egészséges

betegségben

betegségben

kontroll egyének

szenvedők

szenvedők

(n=91)

(n=24)

(n=23) medián (25.-75. percentilis)

AntiHsp60IgA

9.27 (3.47-16.4)

4.85 (1.47-14.43)*

12.23 (5.02-23.23)

4.57 (1.46-10.33)

4.16 (0.93-9.07)*

7.14 (4.26-12.64)

1.29 (1-2.23)

1.42 (0.82-2.07)

1.69 (1.25-2.22)

(AU/ml) AntiHsp65IgA (AU/ml) Össz IgA, g/l

A p-értékeket egy szempontos ANOVA teszttel, majd a Dunn post hoc teszttel számítottam ki. Csillaggal jelöltem a lymphoproliferatív betegségben szenvedők és a kontroll egyének közötti szignifikáns különbséget az anti-Hsp60 és anti-Hsp65 szintek tekintetében (p=0.016, illetve p=0.013).

7.8. A Hsp60/65 elleni IgA szintek alakulása hemopoetikus őssejttranszplantációt követően A követéses vizsgálat során 33 perifériás őssejttranszplantáción átesett betegnél mértük meg az anti-Hsp60/65, valamint a teljes IgA szintek alakulását. A HSCT és az antitest szint mérés között eltelt idő mediánja 25,5 (12,25-45,5) hónap volt. Az össz IgA szintek szignifikánsan alacsonyabbak voltak a transzplantáción átesett betegeknél a transzplantáció előtt mért szintekhez képest. Ezzel szemben az anti-Hsp60 és antiHsp65 antitest szintek tekintetében nem volt szignifikáns különbség a két csoport között (11.Táblázat).

50

Ugyanakkor az egészséges kontroll egyénekben mért antitest szintekhez képest mind az össz IgA szint, mind a hősokkfehérjék elleni antitest szintek szignifikánsan alacsonyabbak voltak 25,5 (12,25-45,5) hónappal a HSCT után (11.Táblázat). 11. Táblázat Az anti-Hsp60 és anti-Hsp65 antitestek, valamint az össz IgA szintek összehasonlítása a betegekben a hemopoeticus őssejttranszplantáció előtt és azt követően, valamint az egészséges kontroll egyénekben. HSCT előtt

HSCT után Egészséges

P-érték a

P-érték a

(n=52)

(n=33)

kontroll

HSCT előtt

HSCT után

egyének

versus után

versus

(n=91) AntiHsp60IgA

7.90 (3.08-

2.46 (0.37-

12.0 (5.44-

(AU/ml)

16.27)

13.18)

21.14)

AntiHsp65IgA

4.49 (1.17-

2.62 (1.13-

7.14 (4.26-

(AU/ml)

9.24)

4.77)

12.64)

Össz IgA, g/l

1.44 (1.04-

0.81 (0.52-

1.69 (1.25-

2.16)

1.28)

2.12)

kontroll ns

<0.001

ns

<0.001

<0.001

<0.001

A p-értékeket egyszempontos ANOVA teszttel, majd a Dunn post hoc teszttel számítottam ki.

A transzplantáció után eltelt idő és a Hsp60 és Hsp65 elleni antitest szintek, valamint az össz IgA szint között nem találtunk korrelációt (r=0,0729, p=0,691; r=0,2634, p=0,145; valamint r=-0,068, p=0,717). A recipiens életkora és az antitest szintek között sem találtunk korrelációt (r=0,361, 0,061 és –0,236). A 33 beteg közül, akik a posttranszplantáció csoportot alkották, 25 esetben allogén őssejt transzplantáció történt. A teljes betegcsoporthoz hasonlóan itt is szignifikánsan alacsonyabb volt mindhárom vizsgált antitest szint a kontroll csoporthoz képest (8. Ábra).

51

A C 4

100

10

1000

A szérum össz IgA szintek (mg/dl)

A szérum anti-Hsp65 IgA szintek, Au/ml (logaritmikus skála)

A szérum anti-Hsp60 IgA szintek, AU/ml (logaritmikus skála)

B 1000

100

10

3

2

1

1

1 Allogén

Allogén

Kontroll egyének

Kontroll egyének

0 Allogén

Kontroll egyének

8. Ábra. Az anti-humán Hsp60 (A), anti-mycobacterialis Hsp65 (B) antitestek, valamint az össz IgA koncentráció (C) azon betegeknél, akik 25,5 (12,25-45,5) hónappal korábban allogén hemopoetikus őssejt transzplantáción estek át, valamint az egészséges kontroll egyénekben. A Mann-Whitney teszttel számított p-értékek a következők voltak: p=0,0023; p=0,0001 és p<0,0001.

7.9. Az anti-Hsp60/65 és anti-Hsp70 antitestek összehasonlítása hisztidin dekarboxiláz knock-out és vad-típusú egerekben Két egértörzsben vizsgáltuk kollaborációs munka keretében az anti-Hsp60/65 és az antiHsp70 IgG és IgM szinteket. A két egértörzs genetikai háttere megegyező volt, kivéve a hisztidin dekarboxiláz gént, mely a HDC-KO egértörzsben nem funkcionált, így ezek az egerek endogén hisztamin hiányosnak tekinthetők. A két egértörzs között az össz IgM és IgG antitest szintek tekintetében, továbbá az IgG/IgM arány tekintetében nem volt szignifikáns különbség, tehát az endogén hisztamin szint nem befolyásolta az ELISA módszerrel mért össz IgG és IgM szintet. A HDC-KO egerekben ezzel szemben szignifikánsan magasabb IgM típusú antitest szinteket lehetett detektálni néhány autoantitest esetében, többek között a Hsp60 esetében (átlag OD: 2,584 versus 0,794; p<0,0001 ábra), a vad típusú egértörzzsel szemben. A Hsp60 mellett szignifikánsan magasabb volt az I-es, II-es és V-ös típusú kollagén, az aldoláz, a kataláz, peroxidáz, az egy és kétszálú DNS, az inzulin, és a spketrin elleni IgM autoantitest szint a hisztamin hiányos egerekben. Az anti-Hsp70 IgM szintet mindkét törzsben igen alacsonynak találtuk, sem itt, sem a Hsp65 elleni antitestek esetében nem volt szignifikáns különbség

52

a két csoport között. Összességében tehát az IgM típusú autoantitestek többségének mennyisége szignifikánsan nagyobb volt a HDC-KO egerekben. Az IgG típusú anti-Hsp60 és anti-Hsp70 antitestek esetében nem volt szignifikáns különbség a két egértörzs között (12. Táblázat), ugyanakkor a mycobacterialis Hsp65 elleni IgG antitest szint szignifikánsan magasabbnak bizonyult a HDC-KO egerekben (átlag OD: 0,873, szórás: 0,048) mint a vad törzsben (OD: O, szórás: 0,220, p<0,0001). Emellett még egy olyan antigén volt, a glutaminsav dekarboxiláz, amely ellen szignifikánsan magasabb IgG antitest szintet mértünk a hisztamin hiányos egerekben (OD: 1,06 versus 0,39, p=0,0003). Egy másik autoantitest, az annexin 33 esetében pedig ellenkezőleg, a vad genotípusú egerek szérumában volt magasabb az antitest szint (OD: 0,45 versus 0, p=0,004). 12. Táblázat. Az anti-Hsp60 IgM szint és az anti-Hsp60/65, illetve anti-Hsp70 IgG szintek összehasonlítása a HDC knock-out és normál egerek szérumában.

WT

HDC-KO

P-érték

Anti-hsp60 IgM

0,79 ± 0,53

2,58 ± 0,05

<0,0001

Anti-Hsp60 IgG

0,254 ± 0,167

0,332 ±0,294

n.s.

Anti-Hsp65 IgG

0

0,88 ± 0,05

<0,0001

Anti-Hsp70 IgG

0,073 ± 0,02

0,065 ± 0,05

n.s.

WT: vad típusú egér törzs, HDC-KO: hisztidin dekarboxiláz knock-out egértörzs. A táblázatban szereplő értékek átlagos optikai denzitást jelentenek ± szórás. A p-értékeket Mann-Whitney teszttel számoltuk ki. N.s. = nem szignifikáns.

53

8. MEGBESZÉLÉS 8.1. A Hsp70 elleni IgG antitest szintek egészséges egyénekben Az irodalomból ismert korábbi vizsgálatok nagy részében –az alkalmazott mérési metodikától függően-általában a mintáknak csak egy kis részében tudtak anti-Hsp70 antitesteket kimutatni az egyes beteg-, illetve kontroll-csoportokban (64, 71). A laboratóriumban sikerült beállítanom egy olyan szilárd fázisú ELISA módszert, mellyel megbízhatóan, jól reprodukálható módon lehet detektálni a humán Hsp70 indukálható formája (Hsp72) ellen termelődő antitestek szintjét. Ezzel a módszerrel vizsgálataink során gyakorlatilag valamennyi vizsgált szérumban ki tudtunk mutatni anti-Hsp70 antitestek jelenlétét, mind a különféle betegcsoportokban, mind az egészséges felnőtt szérumokban. Ez megerősíti azt a feltételezést, hogy a Hsp70 elleni antitestek– legalábbis részben–szintén a természetes autoantitest repertoár részét képezik. A mért antitest szintek log-normális eloszlást követnek, vizsgálataimban az életkorral és a nemmel nem mutattak összefüggést. 8.2. A Hsp70 elleni IgG antitest szintek koszorúér-betegségben Vizsgálatainkkal kimutattuk, hogy a Hsp70 humán, indukálható formája ellen termelődő IgG antitestek szintje nem emelkedett súlyos koszorúér-betegségben szenvedőkben, szemben a 60kDa-os hősokkfehérjék elleni antitestek szintjével. Az anti-Hsp70 elleni antitestek tekintetében nem volt szignifikáns különbség a coronaria-betegek és az egészséges kontrollok között, míg az anti-Hsp60/65 antitestek szintje –korábbi eredményeinket megerősítve (116)-szignifikánsan magasabb volt a betegek között. Az anti-Hsp70 antitestek szintje nem korrelál az életkorral, nemmel, valamint a koszorúérbetegség egyéb ismert (szérum koleszterin-, triglicerid-, CRP-szintek, BMI, dohányzás, diabetes, dohányzás) és újabb (anti-Hsp60/65 antitest szint) rizikófaktoraival. Az irodalomban ez az első olyan vizsgálat, amely coronaria-betegek nagy csoportjában elemezi a Hsp70 elleni humorális immunitást. Korábban Portig és munkatársai (77) azt találták, hogy ezen antitestek előfordulása mind egészséges, mind coronaria-betegek között alacsony (3%, illetve 2%), a két csoport között ők sem találtak szignifikáns

54

különbséget. Vizsgálataikban egy- és két dimenziós immunoblot módszert alkalmaztak, ez magyarázhatja, hogy a különféle hősokkfehérjék ellen alacsony arányban tudtak antitesteket detektálni. Eredményünk

összhangban

van

Pockley-ék

munkacsoportjának

korábbi

megfigyeléseivel (75, 93), ők sem találtak különbséget az anti-Hsp70 antitest szintek tekintetében perifériás és renalis érbetegségben, valamint borderline hipertóniában szenvedő betegek, illetve egészséges felnőttek között, ugyanakkor perifériás érbetegek körében emelkedettnek találták a keringő Hsp70 antigén szintet. Ezek az eredményeink arra utalnak, hogy a Hsp70 elleni immunválasz–legalábbis a humorális immunválasz–a Hsp60/65 elleni humorális immunitással ellentétben nem játszik

szerepet

atherosclerosisban

az és

a

coronaria-atherosclerosis az

ezzel

összefüggő,

kialakulásában. vagy

egyéb

Ismert,

eredetű

hogy

krónikus

szívbetegségekben tartósan fokozott a Hsp70 expressziója. Számos korábbi megfigyelés utal arra, hogy a Hsp70 cardioprotektív hatást fejt ki a szívizomzatot érő különféle káros behatások, elsősorban ischaemia fellépésekor (84, 89, 117). A fokozott Hsp70 expresszió ellenállóvá teszi a myocardiumot a hypoxiával szemben. Érdekes eredményt tett közzé nemrég Zhu és munkacsoportja (78), ők nagy esetszámú vizsgálatukban azt találták, hogy a keringő Hsp70 szint szignifikánsan alacsonyabb volt a koszorúér-betegségben szenvedőknél, mint egészséges egyéneknél (medián: 0,34 versus 0,72 ng/ml, p=0,001). A többszörös logisztikus regressziós analízis szerint a magasabb Hsp70 szinttel rendelkező egyéneknél fele akkora volt a koszorúér-betegség (CAD; coronary artery disease) esélye, mint azoknál, akiknél alacsony tartományban volt a Hsp70 szint (OR: 0,52 95%-os CI: 0,32-0,86). A Hsp70 szint és a CAD közötti összefüggés független volt a CAD hagyományos kockázati tényezőitől, emellett a Hsp70 szint a CAD súlyosságával is fordított összefüggést mutatott. Ugyanakkor a mi eredményeinket megerősítve, a Hsp70-ellenes IgG típusú antitest szintek és a koszorúér-betegség között ők sem találtak összefüggést (p=0,264), a betegek és egészségesek körében megközelítően ugyanolyan arányban találtak antitesteket (34,2% versus 33,71%, p=0,916). Ők sem találtak összefüggést a Hsp70-ellenes antitest szintek és a hagyományos CAD rizikófaktorok között. Megjegyzendő, hogy Zhu vizsgálatában a minták csak kb. egyharmadában mutattak ki Hsp70-ellenes antitesteket.

55

A fenti eredmények alapján úgy tűnik, a Hsp70 valóban cardioprotektív hatású, és ha feltételezzük, hogy a szérumból kimutatható Hsp70 szint az intracelluláris szintet tükrözi, akkor a koszorúér-betegeknél található csökkent Hsp70 szint utalhat a Hsp70 elégtelen expressziójára és csökkent védőhatásra ezeknél a betegeknél, vagy fordítva, koronária-betegségben nem szenvedő egyéneknél tükrözheti a Hsp70 myocardiumot védő, illetve esetleges gyulladásgátló hatásait (78, 92). Nem ismert, hogy a Hsp70ellenes antitesteknek pontosan milyen szerepük lehet ebben a folyamatban. Komplexet képezhetnek a Hsp70 molekulával, ami befolyásolhatta vizsgálatunk eredményét, illetve Zhu és munkatársainak eredményét is. A jövőben azt tervezzük, hogy az anti-Hsp70 antitestmérésekkel párhuzamosan beállítjuk a szabad Hsp70, és a Hsp70-IgG immunkomplexek mérését is. 8.3. A Hsp-elleni IgG szintek alakulása HIV pozitív egyénekben Az irodalomban elsőként leírtuk, hogy szignifikánsan emelkedett az anti-Hsp70 antitestek szintje egy olyan betegcsoportban, ahol az immunrendszer a Hsp70 fokozott expressziójának, tartós jelenlétének van kitéve. HIV szeropozitív betegek körében az anti-Hsp70 IgG antitestek jelentős, szignifikáns emelkedését tudtuk kimutatni. Már korábban kimutatták számos vírusról, hogy azok a megfertőzött sejtekben fokozott hősokkfehérje expressziót indukálnak (118). A különféle RNS és DNS vírusok életciklusában fontos szerepet töltenek be a hősokkfehérjék (94), így a HIV-1 vírus replikációjában is. Több munkacsoport is kimutatott HIV-1 fertőzött sejtek felszínén fokozott Hsp70 és más hősokkfehérje expressziót (95, 119-120). Wainberg és munkacsoportja (95) akut HIV fertőzés során a 27- és 70 kDa-os hősokkfehérje mRNS szint és protein szint 8-20-szoros emelkedését mutatta ki. A fokozott expresszió vírusdózis-függő volt és HIV-1 neutralizáló antitestekkel, valamint anti-CD4 antitestekkel gátolható volt (121). Kimutatták, hogy a Hsp70 a HIV-1 preintegárciós komplexek nukleáris transzportjában játszik szerepet (96), továbbá, hogy a fertőzés hatására fokozottan expresszálódó és megváltozott intracelluláris elrendeződést mutató Hsp70 befolyásolja a fertőzés későbbi lépéseit is, valamint gátolja az apoptózist (122). A Hsp70 interakcióban lép a HIV-1 gag proteinekkel a HIV-1 virionok képződése és sejtből való kiszabadulása során, sőt a Hsp70 más hősokkfehérjékkel (Hsp27, Hsp40,

56

Hsp60, Hsc70) együtt be is épül a HIV virionok burkába. Gurer és munkatársai (98) azt találták, hogy a hősokkfehérjék közül legnagyobb mennyiségben a Hsp70 fordul elő a HIV virionok membránjában. A Hsp70 ugyanakkor nemcsak a HIV vírus replikációját, a fertőzött sejtből való kijutását és az újabb sejtbe való behatolást képes segíteni, hanem előnyös is lehet a gazdaszervezet immunrendszere számára. Egy munkacsoport nemrég kimutatta például, hogy a hősokkfehérjék expresszió fokozódása mellett az egyik korábban említett hősokkfehérje receptor, a CD91 expressziója is fokozódik a fertőzés során a fertőzöttek egy csoportjában, ezeknél az egyéneknél a régóta (több mint 10 éve) fennálló HIV fertőzés ellenére nem következik be progresszió, feltehetően a hatékonyabb felsimerés és antivirális CD8+ immunválasz következtében (123). A Hsp70 immunológiai felismerésben betöltött fontos szerepe, valamint a hősokkfehérje-alapú daganatellenes vakkcinák megjelenése vezetett a Hsp-HIV protein komplexből álló HIV ellenes vakcina kifejlesztéséhez (124). Az irodalomban elsőként általunk kimutatott anti-Hsp70 antitest szint emelkedés feltételezésünk szerint annak a következménye, hogy a 70 kDa-os hősokkfehérje fokozott mértékben expresszálódik a HIV fertőzött sejtekben. Erről a hősokkfehérjéről mutatták ki (98), hogy a Hsp-k közül legnagyobb mennyiségben épül be a HIV virionok membránjába, ahol különféle mechanizmsok révén segíti a vírus újabb sejtekbe való bekerülését és replikációját. Ezt támasztja alá indirekt módon az a megfigyelésünk is, miszerint hatékony, aktív antiretroviralis kezelés bevezetését követőn (mely blokkolja a HIV replikációt, következésképp gátolja a fokozott Hsp70 expressziót és jelentősen csökkenti a vírus számot) szignifikáns mértékben csökken az anti-Hsp70 antitest titer, ahogy az immunrendszer krónikus Hsp70 expozíciója csökken. Nem zárható ki az sem, hogy a magas anti-Hsp70 titer a szervezetet ért általános stressz, illetve a poliklonalis B sejt aktiváció következménye. Akárcsak koszorúér-betegség esetében, HIV fertőzött egyének esetében is azt találtuk, hogy a két legismertebb és legszélesebb körben vizsgált hősokkfehérje, a Hsp60 és a Hsp70 eltérő humorális immunválaszt váltanak ki. Coronaria-betegség esetében szignifikánsan magasabb anti-Hsp60 és anti-Hsp65 IgG szintet mutattunk ki több más munkacsoporttal együtt, s ezen antitest szintek a CAD független kockázati tényezőjének bizonyultak (55, 125), ugyanakkor az anti-Hsp70 IgG szint vizsgálatunk alapján nem

57

tért el az egészséges egyénekétől. HIV fertőzésben ezzel ellenkező eredményt kaptunk, egy korábbi vizsgálatunkban (126) az anti-Hsp60 IgG szint nem különbözött a HIV szeronegatív egyénekétől, ugyanakkor az anti-Hsp70 szint igen jelenetős emelkedést mutatott. A Hsp60 és Hsp70 ellenes antitestek eltérő alakulását HIV fertőzés esetén magyarázhatja az a tény, hogy a hősokkfehérjék közül a Hsp70 mutatható ki legnagyobb mennyiségben a fertőzött sejtekben, valamint a HIV virionok burkában, és igaz, hogy a Hsp60 is megtalálható, de kisebb mennyiségben (98) és talán ezért nem indukál kimutatható mértékű antitesttermelést. Ezzel áll összhangban az az újabb megfigyelés is, miszerint a sejtek membránjában lévő úgynevezett lipid raftokban (ezek a sejtmembránban úszó speciális mikrodomének) a hősokkfehérjék közül a Hsp70 van jelen nagy mennyiségben (127). A HIV virionok bimbózása is ezeken a lipid raftokon keresztül történik, feltehetően ekkor kerülnek a burokba a hősokkfehérjék (vagy egy részük). Az is ismert, hogy a HIV fertőzés poliklonális B sejt aktivációt idéz elő, ennek eredményeként HIV pozitív egyéneknél magasabb IgG és IgA szintet lehet mérni. Ha ez okozza a magasabb anti-Hsp70 autoantitest szintet, akkor elképzelhető, hogy a Hsp60 és Hsp70

elleni

autoantitestek

termelődése

eltérő

mechanizmusokon

keresztül

szabályozódik, mivel a Hsp60-elleni antitest szintek és a HIV fertőzés között nincs összefüggés. E mellett szól munkacsoportunk azon korábbi megfigyelése is, miszerint SLE-ben, ahol szintén poliklonális B-sejt aktiváció áll fenn nem találtunk magasabb anti-Hsp60 antitest szinteket (128), ugyanakkor emelkedett Hsp70-elleni antitest szintet több munkacsoport is kimutatott SLE-ben (57-58). 8.4. A 60 kDa-os hősokkfehérjék elleni IgA szint hematológiai malignus betegségekben és perifériás őssejttranszplantációt követően A malignus hematológiai betegcsoportban végzett mérések azt mutatták, hogy a lymphoproliferatív lymphoid

megbetegedésben

leukémia)

szenvedő

(lymphoma,

egyének

myeloma

anti-Hsp60

és

multiplex,

anti-Hsp65

akut szintje

szignifikánsan alacsonyabb, mint az egészséges egyéneké. Az irodalomban eddig

58

nem közöltek ilyen jellegű adatokat hematológiai betegségekben. Solid daganatok kapcsán egy osztrák munkacsoport elemezte és találta magasabbnak a 60 kDa-os hősokkfehérjék elleni antitest szinteket osteosarcomás betegeknél (129), ugyanakkor az antitest szint nem mutatott összefüggést egyetlen vizsgált klinikai paraméterrel sem. Nemrég pedig egy munkacsoport arról számolt be, hogy nem kissejtes tüdőtumoros betegekben emelkedett volt a 70 kDa-os hősokkfehérjék elleni antitest szint (82). A mi eredményünk új eredménynek mondható, és részben azzal lehetne magyarázni, hogy a fenti lymphoproliferatív betegségekben a természetes antitesteket termelő CD5+B1-sejtek funkciója nagyobb mértékben károsodhat, mint az egyéb antitesteket termelő plazmasejteké, mivel az össz IgA szint tekintetében nem volt szignifikáns különbség az egészségesekhez képest. Ezt a feltételezést az is alátámasztja, hogy a myeloproliferatív betegségben szenvedők körében mért antiHsp antitest szintek nem különböztek az egsészgégesekétől. Az őssejttranszplantációt követő antitest szint mérés alapján úgy tűnik, az anti-Hsp60 és anti-Hsp65 elleni IgA típusú antitestek rekonstitúciója gyorsabban történik, mint a teljes IgA szint rekonstitúció, bár egyik hősokkfehérje elleni antitest szint sem érte el az egészségesekben mérhető normál szintet több mint 2 évvel a transzplantáció után. Ez összhangban van az irodalmi adatokkal, melyek szerint az immunoglobulin alosztályok közül az IgA rekonstitúciója történik meg legkésőbb (130). Itt jegyezném meg, hogy ennek a vizsgálatunknak volt egy korlátozó tényezője, ami a betegpopuláció sajátosságaiból is adódott. Ugyanis a szérumok gyűjtési nehézségei miatt a minták egy részét retrospektív módon kaptuk meg. Részben ennek köszönhető, hogy a csontvelőtranszplantáció utáni betegpopuláció nem ugyanabból a csoportból kerül ki, ahol a transzplantáció előtti antitest szinteket mértük. Összesen 10 olyan beteg volt, akik mind a keresztmetszeti, mind a hosszanti vizsgálatban szerepeltek. Ezért a longitudinális vizsgálat eredménye korlátozott értékű. Továbbá, szerettük volna elemezni a hősokkfehérje elleni antitest szinteket közvetlenül a transzplantáció utáni időszakban, a korai immun rekonstitúció alatt is, azonban nem sikerült megfelelő számú mintát összegyűjtenünk a transzplantáció utáni azonos időpontokban. A jövőben célszerű lenne a vizsgálatot íly módon megismételni.

59

8.5. A hősokkfehérje elleni IgG antitestek szintje hisztamin hiányos egerekben A hisztamin hiányos egértörzs vizsgálata során megállapítottuk, hogy az endogén hisztamin nem befolyásolja az össz IgG és IgM szintet, ugyanakkor kifejezett hatást gyakorol a természetes autoantitest repertoárra, elsősorban az IgM típusú természetes autoantitest szintekre. A hisztamin hiányos egerekben szignifikánsan magasabb volt az IgM típusú autoantitestek, így az anti-Hsp60 elleni antitestek szintje, a normál egerekhez képest. Az IgG típusú autoantitestek esetében csak három antitest szintet befolyásolt a hiszamin jelenléte illetve hiánya, ezek közé tartozott az anti-Hsp65 IgG. Az anti-Hsp70 IgG és IgM antitestek esetében nem volt különbség a két egértörzs között. Ez adódhat abból, hogy eleve nagyon alacsony szinteket mértünk, de az sem zárható ki, hogy a hisztamin jelenléte vagy hiánya a Hsp70 ellenes antitest termlést nem befolyásolja, szemben a 60 kDa-os hősokkfehérjék elleni antitesttermeléssel. 8.6. A hősokkfehérjék elleni antitestek szintjének szabályozása eredményeim tükrében A hősokkfehérje elleni antitest szinteket az eddigi irodalmi adatok alapján számos tényező befolyásolhatja, amint azt a bevezetőben részletesen kifejtettem. Ezek közé tartozik pl. a microbialis és saját hősokkfehérjékkel történő expozíció, az életkor és bizonyos genetikai faktorok. Az életkor egyik vizsgálatomban sem mutatott összefüggést a Hsp70 ellenes IgG, vagy a Hsp60/65 ellenes IgA szintekkel. A saját vagy mikrobialis hősokkfehérjékkel való fokozott expozició szerepét eredményeim egy része alátámasztani látszik. Egyfelől a HIV pozitív egyénekben mért magas anti-Hsp70 szint feltételezéseink szerint a HIV burokban lévő magas Hsp70 expozíció eredménye, amely viszont (mivel a vírus Hsp70et nem kódol), a HIV-vel fertőzött sysejteken történő fokozott Hsp70 expresszió következménye. Másfelől, a perifériás őssejttranszplantáción átesett betegknél a hősokkfehérje elleni IgA szintek rekonstitúciója gyorsabb volt, mint a teljes IgA szint, ami lehet annak a következménye, hogy a transzplantációt követő periódusban a károsodott bélmucosa barrier következtében tartós microbialis (és saját) hősokkfehérje expozíció éri a szervezetet.

60

Ahhoz, hogy további, részletesebb képet kajunk a hősokkfehérje ellenes autoantitestek és

egyéb

természetes

antitestek

termelődésének

szabályozásáról,

a

csontve-

lőtranszplantáción átesett betegek körében végzett további, jól tervezett longitudinális vizsgálatokra lenne szükség. A hisztamin hiányos egerekben tett megfigyelésünk arra utal, hogy a hősokkfehérje ellenes antitest termelés szabályozásában még nem tisztázott módon az endogén hisztaminnak is szerepe van. Munkám során arra is fény derült, hogy a 60- és 70 kDa-os hősokkfehérjék elleni antitestek szintje egymástól eltérő módon szabályozódik. Erre utal a két hősokkfehérje család elleni antitest szintek különböző alakulása coronaria-betegekben, valamint HIV fertőzött egyénekben, továbbá az is, hogy az állatvizsgálatban az endogén hisztamin csak a 60 kDa-os hősokkfehérjék elleni antitest szintet befolyásolta, az anti-Hsp70 szintet nem. Szintén erre utal munkacsoportunknak az az eddig még nem közölt új megfigyelése (Jánoskuti és mtsai), miszerint súlyos, NYHA III-IV-es stádiumban lévő szívelégtelen betegek szérumában szignifikánsan alacsonyabb az anti-Hsp60 IgG antitestek szintje, ugyanakkor az anti-Hsp70 antitest szint emelkedet volt. A két hősokkfehérje, a Hsp70 és a Hsp60 tehát eltérő módon vált ki humorális immunválaszt a szervezet részéről különféle krónikus kóros állapotokban, ugyanakkor a természetes immunitással való kapcsolatuk is mutat különbözőséget. Így például munkacsoportunk írta le először, hogy a Hsp60 és a Hsp70 in vitro körülmények között aktiválni képesek a komplement kaszkádot. Míg a hsp60 ezt antitest jelenlétében teszi (54, 131), addig a Hsp70 antitest jelenléte nélkül, feltehetően a C1q komplement komponens direkt kötése révén indítja el a klasszikus komplement aktivációs utat (132).

61

8.7 Az értekezésben leírt legfontosabb eredmények összefoglalása 1. Sikerült egy olyan szilárd fázisú ELISA módszert beállítanom, melynek segítségével jól reprodukálható módon mérhető a szérum anti-Hsp70 immunglobulin szint. 2. Megállapítottuk az irodalomban elsőként, hogy a szívkoszorúér-betegségben szenvedőkben –az anti-Hsp60 antitest szinttel ellenkezőleg- nem emelkedett az anti-Hsp70 elleni antitestek szintje. 3. Az irodalomban elsőként írtuk le, hogy HIV fertőzött betegekben jelentősen emelkedett a Hsp70 elleni IgG típusú antitestek szintje és ez a magas antitest szint hatékony antiretroviralis kezelés hatására lecsökken. 4. Megállapítottuk, hogy limphoproliferatív betegségben szenvedő egyéneknél az anti-Hsp60 és anti-hsp65 IgA szint szignifikánsan alacsonyabb, mint egészséges egyénekben, továbbá, hogy perifériás őssejttranszplantációt követően ezen antitestek rekonstitúciója gyorsabb, mint a teljes IgA szint helyreállása. 5. Hisztamin hiányos egerek természetes autoantitest szintjeinek elemzése során azt találtuk, hogy az endogén hisztamin befolyásolja a Hsp60 ellenes antitest termelődését, míg a Hsp70 elleni antitest termelődést nem. 6. Eredményeink alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a 60 és 70 kDa-os hősokkfehérjékkel reagáló antitestek keletkezéséhez eltérő folyamatok vezetnek és szérumszintjük szabályozása különböző a humán szervezeteben patológiás körülmények között.

62

9. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

AIH:

autoimmun hepatitis

ACE:

angiotenzin-konvertáló enzim

ALL:

akut lymphoid leukémia

AML:

akut myeloid leukémia

AU/ml:

önkényes egység/ml (Arbitrary Unit/ml)

ATP:

adenozin trifoszfát

BMI:

testtömeg index (Body Mass Index)

BPRS

skála: Brief Psychiatric Rating Scale

CAD:

koszorúér-betegség

CML:

krónikus myeloid leukémia

CMV:

cytomegalovírus

CRP:

C-reaktív protein

DM:

diabetes mellitus

ELISA:

enzim linked immunosorbent assay

G-CSF:

granulocyta-colonia stimuláló faktor

Grp:

glucose regulated protein

GVHD:

graft-versus-host disease

HAART:

highly active antiretroviral therapy

HD:

Hodgkin kór

HDC-KO:

Hisztamin dekarboxiláz knock out

HIV:

humán immundeficiencia vírus

HSE:

hősokkelem (heat shock element)

HSF:

hősokktranszkripciós faktor (heat shock transcription factor)

HSE-BF:

hősokk-elemhez kötődő faktort (HSE binding factor)

HSCT:

hemopoetikus őssejt transzplamntáció (hemopoietic stem cell transplantation)

Hsp:

hősokkfehérje

IBD:

gyulladásos bélbetegség (inflammatory bowel disease)

IκBα:

Inhibitory κBα

63

IMIED:

immun-mediált

belső-fül

betegség

(immune-mediated

inner-ear

disease) IVIG:

intravénás immunglobulin

MCTD:

kevert kötőszöveti betegség

MI:

myocardialis infarktus

MM :

myeloma multiplex

NF-κB:

nukleáris faktor-κB

NYHA stádium: New York Heart Association stádium NHL:

non-Hodgkin lymphoma

NMDA:

N-methyl-D-aszpartámsav

NSCLC:

nem kissejtes tüdőrák

OD:

optikai denzitás

PBC:

primer biliáris cirrózis,

PBS:

phosphate buffered saline, foszfát puffer oldat

PBSCT:

perifériás őssejtátültetés (peripheral blood stem cell transplantation)

SAA:

súlyos aplasztikus anémia

SLE:

szisztémás lupus erythematosus

sIL-2R:

solubilis interleukin-2 receptor.

TNF:

tumor nekrózis faktor

64

10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Elsősorban Füst György professzor úrnak szeretnék köszönetet mondani azért, mert lehetőséget biztosított, hogy az általa vezetett kutató laboratórium munkájába bekapcsolódhassak. Önálló témát jelöl ki számomra és minden tőle telhető lehetőséget és segítséget megadott ahhoz, hogy ezt a munkát eredményesen végezhessem. A kezdeti sikertelen méréssorozatok után is mindig biztatott, optimista volt, ez rengeteget segített abban, hogy folytatni tudjam a vizsgálatokat. Hatalmas szakmai tapasztalata igen nagy segítséget

jelentett

a

vizsgálatok

során

kapott

eredmények

értékelésében,

interpretálásában. Hálásan köszönöm Romics László professzor úrnak és Karádi István professzor úrnak, amiért lehetővé tették, hogy a klinikai munka mellett a tudományos labor munkájába is bekapcsolódhassak, hogy felkeltették érdeklődésemet a tudományos munka iránt és hogy munkám során végig biztattak, támogattak. Szintén nagyon sok hálával és köszönettel tartozom témavezetőmnek, dr Prohászka Zoltánnak, aki sokszor saját munkáját félretéve és szabadidejét sem kímélve türelmesen tanított, magyarázott, ellenőrizte és ismételtette újra meg újra az ELISA méréseket, értékeléseket. Ő tanított meg a statisztikai programok használatára, az eredmények értékelésére, és a cikkírásra. És nem utolsó sorban ő volt az, aki megtanított arra, hogy csak precíz, jól tervezett és kivitelezett kísérletekből lehet értékelhető tudományos következtetéseket levonni és publikálni. Nagyon hálásan köszönöm azt a rengeteg időt, amit rám szánt. Nagyon köszönöm dr Veres Amarillának, hogy megtanította számomra az ELISA technikát, és hogy a későbbiekben is mindig figyelemmel, biztatással és optimiznussal kísérte munkámat. Külön köszönet illeti Szigeti Antalnét, Ilikét, aki az ELISA mérések során végig segített nekem, és ő volt az akitől a legtöbb biztatást és vígasztalást kaptam egy-egy rosszul sikerül kísérlet során, de vele örültünk legjobban a jó méréseknek és eredményeknek is. Köszönet azon kollégáimnak, akik bevettek kollaborációs munkáikba, és egy-egy kísérletsorozattal hozzájárulva társszerzőként szerepelhettem cikkeikben. Hálával tartozom a III. Belklinika Kutatólaboratóriumának minden dolgozójának, PhD hallgatóknak és a többi asszisztenseknek (Nagyné Vers Marika, Kovács Margit),

65

könyvtárosoknak (Ani, Margó) egyaránt, hogy bármilyen problémám volt, mindig szívesen segítettek és jó hangulatú „munkahelyet” teremtettek. Külön köszönöm Cervenak Lászlónak a kísérletek során nyújtott hasznos tanácsait, valamint az immunológiai kurzusokon tartott továbbképzéseit. Köszönöm dr. Bánhegyi Dénesnek, hogy a HIV pozitív szérum mintákat és adatokat rendelkezésemre bocsátotta. A III. sz Belgyógyászati Klinika minden orvosának köszönöm, hogy segítettek, sokszor helyettesítettek a klinikai munkában, e nélkül nem jöhetett volna létre a doktori munka. Különösen sok segítséget kaptam dr Benedek Szabolcstól és dr Tóth Éva Katalintól, köszönöm. Nem utolsósorban köszönettel tartozom családomnak, férjemnek dr Bártfai Zoltánnak és szüleimnek, amiért végig mellettem álltak, segítettek és biztattak. Az ő összefogásuk nélkül nem jötthetett volna létre ez a munka.

66

11. IRODALOMJEGYZÉK 1. Velazquez JM, Sonoda S, Bugaisky G, Lindquist S. Is the major Drosophila heat shock protein present in cells that have not been heat shocked? The Journal of Cell Biology. 1983. 96: 286-290. 2. Craig EA, Gambill BD, Nelson RJ: Heat-Shock Proteins: Molecular Chaperones of Protein Biogenesis. Microbiol. Rev. 1993;57, 402-414. 3.

Csermely

Péter:

Stresszfehérjék.

Sejtjeink

ősi

védekező

mechanizmusa.

Vince Kiadó, 2001. 4. Xu Q, Schett G, Perschinka H, Mayr M, Egger G, Oberhollenzer F, Willeit J, Kiechl S, Wick G: Serum soluble heat shock protein 60 is elevated in subjects with atherosclerosis in a general population. Circulation. 2000;102:14-20. 5. Wick G, Perschinka H, Millonig G: Atherosclerosis as an autoimmune disease: an update. Trends in Immunology 2001;22:685-669. 6. Lindquist S: The heat-shock response. Ann. Rev. Biochem. 1986;55, 151-1191. 7. Dubois P: Heat shock proteins and immunity. Res. Immunol. 1989;140, 653-659. 8. Omar R: Heat shock proteins in autoimmun disease. J Clin Immunoassay. 1994; 17, 129-132. 9. Prohászka Z és Füst Gy: A hősokkfehérjék és a természetes immunitás sokrétű kapcsolata. Magyar Immunológia 2003;2 (4):25-32. 10. Kiang JG, Tsokos G. Heat Shock protein 70 kDa: Molecular biology, biochemistry and physiology. 1998 Pharmacol. Ther. 80:183-201.

67

11. Pirkkala L, Nykanen P, Sistonen L. Roles of heat shock transcription factors in regulation of the heat shock response and beyond. FASEB J 2001;15:1118-31. 12. Favatier F, Bornman L, Hightower LE, Günther E, Polla BS. Variation in Hsp gene expression and Hsp polymorphism: do they contribute to differential disease susceptibility and stress tolerance? Cell Stress Chap 1997;2:141-155. 13. Boshoff T, Lombard F, Eiselen R, Bornman JJ, Bachelet M, Polla BS, Bornman L. Differential basal synthesis of Hsp70/Hsc70 contributes to interindivdual variation in Hsp70/Hsc70 inducibility. Cell Mol Life Sci 2000;57:1317-325. 14. Aron Y, Busson M, Polla BS, Dusser D, Lockhart A, Swierczewski E, Favatier F. Analysis of Hsp70 gene polymorphism in allergic asthma. Allergy 1999;54:165-170. 15. Favatier F, Jacquier-Sarlin MR, Swierczewski E, Polla BS. Polymorphism in the regulatory sequence of the human Hsp70-1 gene does not affect heat shock factor binding or heat shock protein synthesis. Cell Mol Life Sci 1999;56:701-708. 16. Schroeder S, Reck M, Lehmann LE, Book M, Hoeft A, Stuber F. The PstI polymorphism of the endotoxin-inducible heat-shock protein gene does not affect messenger RNA level in human whole-blood culture. Intensive Care Med 2000;26:1139-43. 17. Rajalingam R, Mehra NK, Singal DP. Polymorphism in heat shock protein 70-1 gene promoter region and susceptibility to tuberculoid leprosy and pulmonary tuberculosis in Asian Indians. Indian J Exp Biol 2000;38:658-662. 18. Ramos-Arroyo MA, Feijoo E, Sanchez-Valverde F, Aranburu E, Irisarri N, Olivera JE, Valiente A. Heat shock protein 70-1 and HLA class II gene polymorphisms associated with celiac disease susceptibility in Navarra (Spain). Hum Immunol 2001;62:821-825.

68

19. Partanen J, Milner C, Campbell RD, Maki M, Lipsanen V, Koskimies S. HLA-linked heat shock protein 70 (HSP70-2) gene polymorphism and celiac disease. Tissue Antigens 1993;41:15-19. 20. Bolla MK, Miller GJ, Yellon DM, Evans A, Luc G, Cambou JP, Arveiler D, Cambien F, Latchman DS, Humphries SE, Day INM. Analysis of the association of a heat shock protein 70-1 gene promoter polymorphism with myocardial infarction and coronary risk traits. Dis Mark 1998;13:227-235. 21. Pablos JL, Carreira PE, Martin Villa JM, Montalvo G, Arnaiz-Villena A, Gomez-Reino JJ. Polymorphism of the heat shock protein gene HSP70-2 in systemic lupus erythematosus. Br J Rheumatol 1995;34:721-723. 22. Vargas-Alarcon G, Granados J, Martinez-Laso J, Gomez-Casado E, Zuniga J, Salgado N, Hernandez-Pacheco G, Hesiquito R, Rodrigez-Reyna TS, Gamboa R, Alcocer-Varela J, Arnaliz-Villena A. Lack of association between the polymorphism at the heat shock protein (HSP70-2) gene and systemic lupus erythematosus (SLE) in the Mexican mestizo population. Genes Immun 2000;1:367-370. 23. Jarjour W, Reed AM, Gauthier J, Hunt S, Winfield JB. The 8.5-kb PstI allele of the stress protein gene, Hsp70-2. An independent risk factor for systemic lupus erythematosus in African Americans? Hum Immunol 1996;45:59-63. 24. Vargas-Alarcon G, Londono JD, Hernandez-Pacheco G, Gamboa R, Castillo E, PachecoTena C, Cardiel MH, Grandos J, Burgos-Vargas R. Heat shock protein 70 gene polymorphisms in Mexican patients with spondyloarthropathies. Ann Rheum Dis 2002;61:48-51. 25. Vinasco J, Beraun Y, Nieto A, Fraile A, Paeja E, Mataran L, Martin J. Heat shock protein 70 gene polymorphisms in rheumatoid arthritis. Tissue Antigens 1997;50:71-73.

69

26. Ratanachaiyavong S, Demaine AG, Campbell RD, McGregor AM. Heat shock protein 70 (HSP70) and complement C4 genotypes in patients with hyperthyroid Graves disease. Clin Exp Immunol 1991;84:48-52. 27. Schulte CM, Dignass AU, Goebell H, Rocher HD, Schulte KM. Genetic factors determine extent of bone loss in inflammatory bowel disease. Gastroenterology 2000;119:909-20. 28. Schroeder S, Reck M, Höft A, Stuber F. Analysis of two human leukocyte antigen-linked polymorphic heat shock protein 70 genes in patients with severe sepsis. Crit Care Med 1999;27:1265-70. 29. Esaki M, Furuse M, Matsumoto T, Aoyagi K, Jo Y, Yamataga H, Nakano H, Fujishima M. Polymorphysm of heat shock protein gene HSP70-2 in Crohn disease: possible genetic marker for two forms of Crohn disease. Scand J Gastroenterol 1999;34: 703-707. 30. Pugliese A, Awdeh ZL, Galluzzo A, Yunis EJ, Alper CA, Eisenbarth GS. No independent association between HSP70 gene polymorphism and IDDM. Diabetes 1992; 41:788-91. 31. Kawaguchi Y, Ikegami H, Fukuda M, Fujioka Y, Shima K, Ogihara T. Polymorphism of HSP70 gene is not associated with type 1 (insulin-dependent) diabetes mellitus in Japanese. Diab Res Clin Pract 1993;21:103-107. 32. Pociot F, Ronningen KS, Nerup J. Polymorphic analysis of the human MHC-linked heat shock protein 70 (HSP70-2) and HSP-Hom genes in insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM). Scand J Immunol 1993;38:491-495. 33. Chuang LM, Jou TS, Wu HP, Tai TY, Lin BJ. A rapid method to study heat shock protein 70-2 gene polymorphism in insulin-dependent diabetes mellitus. Pancreas 1996;13:268-72.

70

34. Chouchane L, Danguir J, Beji C, Boussida K, Camoin L, Sfar H, Gabbouj S, Strosberg AD. Genteic variation in the stress protein Hsp70-2 gene is highly associated with obesity. Int J Relat Metab Disord 2001;25:462-466. 35. Mestiri S, Bouaouina N, Ahmed SB, Khedhaier A, Jrad BB, Remadi S, Chouchane L. Genetic variation in the tumor necrosis factor-alpha promóter region and in the stress protein Hsp70-2: susceptibility and prognostic implications in brest carcinoma. Cancer 2001;91:672-678. 36. Westman P, Partanen J, Leirisalo-Repo M, Koskimies S. HSP70-HOM NcoI polymorphysm and HLA-associations in the Finnish population and in patients with ankylosing spondylitis or reactive arthritis. Eur J Immunogenet 1994;21:81-90. 37. Marber MS, Mestiril R, Chi SH, Sayen MR, Yellon DM, Dillmann WH. Overexpression of the rat inducible 70-kD heat shock protein in a transgenic mouse 38, increases the resistance of the heart to ischemic injury. J Clin Invest 1995;95:1446-56. 38. Latchman DS Heat shock proteins and cardiac protection. Cardiovasc Res 2001;51:637-46. 39. Bruemmer-Smith S, Stüber F, Schroeder S. Protective functions of intacellular heat shock protein (HSP) 70-expression in patients with severe sepsis. Int Care Med 2001,27:1835-41. 40. Munk ME, Schoel B, Modrow S, Karr RW. Young RA, Kaufmann SHE: T lymphocytes from healthy individuals with specificity to self epitopes shared by the mycobacterial and human 65-kilodalton heat shock protein. J Immunol 1989;143:2844-2849. 41. Lacroix-Desmazes S, Kaveri S. V, Mouthon L, Ayoba A, Malanchére E, Coutinho A, Kazatchkine MD: Self-reactive antibodies (natural autoantibodies) in healthy individuals. J Immunol Methods 1998:216:117-137.

71

42. Coutinho A, Kazatchkine MD, Avrameas S: Natural antobodies. Curr Opinion in Immunology 1995:7:812-818. 43. Thornton BP, Vetvicka V, Ross GD: Natural antibody and complement-mediated antigen processing and presentation by B lymphocytes. J. Immunol. 1994;152:1727. 44. Cohen IR.: The self, the world and autoimmunity. Sci Am 1988;258, 52. 45. Cohen IR, Young DB: Autoimmunity, microbial immunitiy and the immunological homunculus. Immunol. Today 1991;12:105. 46. Pockley, A. G.; Shepherd, J.; Corton, J. M. Detection of Heat Shock Protein 70 (HSP70) and Anti-HSP70 Antibodies in the Serum of Normal Individuals. Immunological Investigation 1998, 27 (6), 367-377. 47. Wick G et al: The multi-factorial pathogenesis of autoimmune disease. Immunol. Lett. 1987;16:249-257. 48. Wick G, Schett G, Amberger A, Xu Q: Is atherosclerosis an immunologically mediated disease? Immunol. Today 1995;16:27-33. 49. Wick G, Kleindienst R, Schett G, Amberger A, Xu Q: Role of Heat Shock Protein 65/60 in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Int Arch Allergy Immunol 1995;170, 130-131 50. Wick G, Perschinka H, Millonig G: Atherosclerosis as an autoimmune disease: an update. Trends in Immunology 2001;22:685-669. 51. Mayr M et al: Endothelial cytotoxicity mediated by serum antibodies to heat-shock proteins of Escherichia coli and Chlamydia pneumoniae: immune reactions to heatshock proteins as a possible link between infection and atherosclerosis. Circulation 1999:99:1560-1566

72

52. Pockley A, de Faire U, Kiessling R, Lemne C, Thulin T and Frostegard J. Circulating heat shock protein antibody levels in established hypertension. Journal of Hypertension 2002;20:1-6. 53. Rea, I.M; McNerlan, S.; Pockley, A.G. Serum Heat Shock Proein and Anti-heat Shock Protein Antibody Levels in Aging. Experimantal Gerontology 2001, 36, 341-352 54. Prohászka Z, Duba J, Lakos G, et al. Antibodies against human Hsp60 and mycobacterial Hsp65 differ in their antigen specificity and complement activating ability. Internat Immunol 1999; 11:1363-70. 55. Prohaszka, Z.; Duba, J.; Horvath, L.; Csaszar, A.; Karadi, I.; Szebeni, A.; Singh, M.; Fekete, B.; Romics, L.; Füst, G. Comparative Study on Antibodies to Human and bacterial 60 kDa Heat Shock Proteins in a Large Cohort of Patients with Coronary heart Disease and Healthy Subjects. Eur. J. Clin. Invest. 2001, 31 (4), 285-292. 56. Bene L, Füst Gy, Huszti Z, Hernádi Z, Fekete B, Mészáros M, Veres A, Kovács A, Miklós K, Singh M, Romics L, Prohászka Z: Impaired humoral immune response against mycobacterial 65-kDa heat shock protein (HSP65) in patients with inflammatory bowel disease. Dig Dis Sci 2002:47:1432-7. IF: 1,516 57. Minota S, Cameron B, Welch W J and Winfield J B. Autoantibodies to the constitutive 73-kD member of the hsp70 family of heat shock proteins in systemic lupus erythematosus. J Exp Med 1988;168: 1475-80. 58. Hayem G, Bandt M, Palazzo E, Roux S, Eliaou J F, Sany J, Kahn M F. Anti-heat shock protein 70 kDa and 90 kDa antibodies in serum of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 1999;58:291-296.

73

59. Conroy S E, Faulds G B, Williams W, Latchman D S and Isenberg D A. Detection of autoantibodies to the 90 kDa heat shock protein in systemic lupus erythematosus and other autoimmun diseases. British Journal of Rheumatology 1994;33:923-926. 60. Arora S K, Singh G and Sehgal S. Comparativeevaluation of anti-heat shock protein antibodies in SLE and healthy controls. Scan J Rheumatol 1995;24:160-163. 61. Prummel M F, van Pareren Y, Bakker O, and Wiersinga W M. Anti-heat shock protein (hsp)72 antibodies are present in patients with Graves’ disease (GD) and in smoking control subjects. Clin Exp Immunol 1997;110:292-295. 62. Shingai R, Maeda T, Onishi S and Yamamoto Y. Autoantibody against 70 kD heat shock protein in patients with autoimmune liver diseases. J Hepatol 1995;23:382-390. 63. De Smet, Ramadan A. Circulating antibodies to inducible heat shock protein 70 in patients with uveitis. Ocul Immunol Inflamm. 2001 9(2):85-92. 64. Schwarz M J, Riedel M, Gruber R, Ackenheil M, Müller N. Antibodies to heat shock proteins in schizophrenic patients: implications for rhe mechanism of the disease. Am J Psychiatry 1999;156:1103-04. 65. Kim JJ, Lee SJ, Toh KY, et al. Identification of antibodies to heat shock proteins 90 kDa and 70 kDa in patients with schizophrenia. Schizophrenia research 2001. 52:127-135. 66. Bates PR, Hawkins A, mahadik SP, McGrath JJ. 1996. Heat stress lipids and schizophrenia. Prostaglandins Leukotrienes Essent. Fatty Acids 55 (1/2), 101-107. 67. Olney JW, Farber NB. 1995. Glutamate receptor dysfunction and schizophrenia. Arch. Gen. Psychiatry 52, 998-1007. 68. Rauch S D, Zurakowski D, Bloch D B and Bloch K J. Anti-heat shock protein 70 antibodies in Meniere’s disease. The Laryngoscope 2000;110:1516-21.

74

69. Munari L, Charchat S, Rodrigues L et al. An ELISA serum assay for autoantibodies to Hsp70 in immune-mediated hearing loss. J Immunol Methods. 2003. 283(1-2):15561. 70. Stone JH, Francis HW. 2000. Immune-mediated inner ear-disease. Curr. Opin. Rheumatol., 32-40. 71. Hrycaj P, Wurm K, Mennet P, Muller W. Antibodies to heat shock protein in patients with pulmonary sarcoidosis. Sarcoidosis 1995 12(2):124-30. 72. Ludwig D, Stahl M, Ibraham M, Wenzel B, Drabicki D, Wecke A, Fellermann K and Stange E. Enhanced intestinal expression of heat shock protein 70 in patients with inflammatory bowel diseases. Dig Dis Sci 1999;44:1440-47. 73. Figueredo A, Ibarra J L, Rodroguez A, Molino A M, Gomez-de la Concha E, FernandezCruz A abd Patino R. Increased levels of IgA antibodies to hsp70 protien in patients with diabetes mellitus: the relationship with vascular complications. Ciln Immunol Immunopathol 1996;79(3):252-255. 74. Wu T, Ma J, Chen S, Sun Y, et al. Association of plasma antibodies against the inducible Hsp70 with hypertension and harsh working conditions. Cell Stress Chaperones. 2001 6(4):394-401. 75. Wright B, H, Corton J M, El-Nahas A M, Wood R F M, Pockley A G. Elevated levels of circulating heat shock protein 70 (Hsp70) in peripheral and renal vascular disease. Heart and Vessels 2000;15:18-22. 76. Chan Y C, Shukla N, Abdus-Samee M, Berwanger CS, Stanford J, Singh M, MAnsfield AO and Stansby G. Anti-heat-shock protein 70 kDa antibodies in vascular patients. Eur J Vasc Endovasc. 1999;18:381-385.

75

77. Portig I, Pankuweit S and Maisch B. Antibodies against stress proteins in sera of patients with dilated cardiomyopathy. J Mol Cell Cardiol 1997;29:2245-51. 78. Zhu J, Quyyumi A.A, Wu Hongsheng, Csako Gy, Rott D, Zalles-Ganley A, Ogunmakinwa J, Halcox J, Epstein S.E. Increased serum levels of Heat Shock proetin 70 are associated with low risk of coronary artery disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003; 23:1055-1059. 79. Rea I M, McNerlan S, Pockley A G. Serum heat shoch protein and anti-heat shock protein antibody levels in aging. Experimental Gerontology 2001;36: 341-352. 80. Goral J, Shenoy S, Mohanakumar T and Clancy J. Antibodies to 70 kD and 90 kD heat shock proteins are associated with graft-versus-host disease in peripheral blood stem cell transplant recipients. Clin Exp Immunol 2002;127 83): 553-559. 81. Trieb K, Gerth R, Berger P, Margreiter R. 2000. Serum antibodies to heat-shock proteins are of no diagnostic value for human kidney allograft rejection. Transpl. Imt 13:46-48. 82. Zhong L, Peng X et al. Antibodies to Hsp70 and hsp90 in serum in non-small cell lung cancer patients. Cancer Detection and Prevention 2003. 27: 285-290. 83. Pockley AG, Georgiades A, Thulin T, Faire U, Frostegard J. Serum heat-shock protein 70 levels predict developement of atherosclerosis in subjects with established hypertension. Hypertesion 2003; 235-238. 84. Suzuki K, Murtuza B, Sammut IA et al. A heat shock protein 72 enhances manganase superoxid dismutase activity during myocardial ischaemia-reperfusion injury, associated with mitochondrial protection and apoptosis reduction. Circulation. 2002; 106(suppl I):I-270-I-276.

76

85. Zhu J, Quyyumi AA et al. Anibodies to human heat-shock protein 60 are associated with the presence and severity of coronary artery disease: evidence for autoimmune component of atherosclerosis. Circulation. 2000;103:1071-10775. 86. Dillmann WH, Mehta HB et al. Ischaemia of the dog heart induces the appearance of a cardiac mRNA coding for a protein with migration characteristics similar to heatshock/stress protein 71. Circ. Res. 1986;59:110-114. 87. Currie RW. Effects of ischaemia and perfusion temperative ont he synthesis of stressinduced (heat shock) protein in isolated and perfused rat hearts. J Mol Cell Cardiol. 1987;19:795-808. 88. Hutter MM, Sievers RE, Barbosa V, Wolfe C. Heat shock protein induction in rat hearts: a direct correlation between the amount of heat shock protein induced and the degree of myocardial protein. Circulation. 1994;89:353-360. 89. Marber MS, Mestril R et al. Overexpression of the rat inducible 70-kD heart stress protein in a transgenic mouse increases the resistance of the heart to ischaemic injury. J Clin Invest. 1995;95:1446-1456. 90. Cumming DV, Heads RJ et al. Differential protection of primary rat cardiocytes by transfection of specific heat shock stress proteins. J Mol Cell Cardiol. 1996; 28:2343-2349. 91. Cumming DV, Heads RJ et al. Pharmacological preconditioning of primary rat cardiac myocytes by FK506. Basic Res Cardiol. 1996;91:367-373. 92. Shimizu M, Tamamori-Adachi M et al. Lipopolysaccharide pretreatment attenuate myocardial infarct size: a possible mechanism involving heat shock protein 70-ininhibitory kappaBalphy complex and attenuation of nuclear factor kappaB. J Thorac Cardiovasc Surg. 2002;124:933-941.

77

93. Vayssier, M.; Banzet, N.; Francois, D.; Bellmann, K.; Polla, BS: Tobacco Smoke Induces both Apoptosis and Necrosis in Mammalian Cells: Differential Effects of Hsp70. Am. J. Physiol. 1998, 275 (4 Pt 1), 771-9. 93. Pockley, AG.; Wu, R.; Lemne, C.; Kiessling, R.; de Faire, U. Frostegard, J. Circulating Heat Shock protein 60 is Associated with Early Cardiovascular Disease. Hypertension 2000, 36, 303-307. 94. Santoro MG. 1994. Heat shock proteins and viral replication: Hsp70s as mediators of antiviral effects of prostaglandins. Experientia 50:1039-1047. 95. Wainberg Z, Oliveira M, Lerber S, Tao Y, Brenner BG. 1997. Modulation of stress protein (Hsp27 and Hsp70) expression in CD4+ lymphocytic cells following acute infection with human immunodeficiency virus Type 1. Virology 233:364-373. 96. Agostini I, Popov S, Li J, Dobrovsky L, Hao T, Bukrinsky M. 2000. Heat-shock protein 70 can replace viral protein R of HIV-1 during nuclear import of the viral preintegration complex. Experimental Cell Research 259:398-403 97. Lingappa JR, Hill RL, Wong ML,Hedge RS. 1997 A multistep, ATP-dependent pathway for assembly of human immunodeficiency virus caosids in a cell-free system. J.Cell Biol. 136:567-581. 98. Gurer C, Cimarelli A, Luban J. 2002. Specific incorporation of heat shock protein 70 family members into primate lentiviral virions. Journal of Virology 76: 4666-4670. 99. Moliterno R, Woan M, Bentlejewski C, Quian J et al. 1995. Heat shock proteins-induced T-lymphocyte propagation from endomyocardial biosies in heart transplantation. J heart Lung Transplant 14:329-336.

78

100. Latif N, Yacoub MH, Dunn MJ. 1997 Association of pretransplant anti-heart antibodies against human heat shock protein 60 with clinical course following cardiac transplantation. Transplant Proc 29:1039-1040. 101. Chan EY, Lawton JW, Lie AK, Lau CS. Autoantibody formation after allogeneic bone marrow transplantation: correlation with the reconstitution of CD5+ B cells and occurence of graft-versus-host disease. Pathology 1997 29(2):184-8. 102. Srivastava PK, Das MR. The serologically unique cell surface antigen of Zajdela ascitic hepatoma is also its tumor-associated transplantation antigen. Int J Cancer 1984:33:417-22. 103. Srivastava PK, Menoret A, Basu S, Binder RJ, McQuade KL. Heat shock proteins come of age: primitive functions acquire new roles in an adaptive world. Immunity 1998;8:657-65. 104. Vabulas RM, Braedel S, Hilf N, Singh-Jasuja H, Herter S, Ahmad-Nejad P, Kirschning CJ, Da Costa C, Rammensee HG, Wagner H, Schild H. The endoplasmic reticulumresident heat shock protein Gp96 activates dendritic cells via the Toll-like receptor 2/4 pathway. J Biol Chem Jun 2002;7;277(23):20847-53. 105. Blachere NE, Li Z, Chandawarkar RY, Suto R, Jaikaria NS, Basu S, Udono H, Srivastava PK. Heat shock protein-peptide complexes, reconstituted in vitro, elicit peptide-specific cytotoxic T lymphocyte response and tumor immunity. J Exp Med 1997;168:1315-22. 106. Multhoff G, Botzler C, Wiesnet M, Müller E, Meier T, Wilmanns W and Issels RD. A stress-inducible 72-kDa heat-shock protein (HSP72) is expressed on the surface of human tumor cells, but not on normal cells. Int J Cancer 1995;61:272-279.

79

107. Multhoff G, Mizzen L, Winchester CC, Milner CM, Wenk S, Kampinga HH, Laumbacher B and Johnson J. Heat shock protein 70 (Hsp70) stimulates proliferation and cytolytic activity of NK cells. Exp hematol 1999;27:1627-36. 108. Clark PR and Ménoret A. The inducible hsp70 as a marker of tumor immunogenicity. Cell Stress & Chaperones 2001;6(2):121-125. 109. Hosoi N, Itoh H, Koyama K, Tashima Y. Overexpression of the heat shock protein 70 confers protection against oxidative injury in HEPG2 cells. Transplant Proc 2002;Nov;34(7):2647-9. 110. Wang JH, Yao MZ, Gu JF, Sun LY, Shen YF and Liu XY. Blocking HSF1 by dominant-negative mutant to senzitise tumor cells to hypertermia. Biochem Biophys Res Commun 2002;290(5):1454-61 111. Marja Jaattela. Overexpression of major heat shock protein hsp70 inhibits tumor necrosis factor-induced activation of phospholipase A2. The Journal of Immunology 1993.151: 4286-94. 112. Judkins, MP. Selective Coronary Arteriography. I. A Percutaneous Transfemoral Technic. Radiology 1967, 89 (5), 815-24. 113. Ohtsu H, Tanaka S, Terui T, Yoshio H, Makabe-Kobayashi Y, Pejler G, et al. 2001. Mice lacking histidine decarboxylase exhibit abnormal mast cells. FEBS Letters 502:53-56. 114. Francisco J. Quintana, Buzás E, Prohászka Z, Bíró A, Kocsis J, Füst Gy, Falus A, Irun R. Cohen. Knock-out of the histidine decarboxylase gene modifies the repertoire of natural autoantibodies. Journal of Autoimmunity 22 (2004) 297–305. 115. Prohaszka, Z.; Duba, J.; Lakos, G.; Kiss. E.; Varga, L.; Janoskuti, L.; Csaszar, A.; Karadi, I.; Nagy, K.; Singh, M.; Romics, L.; Fust, G. Antibodies Against Human

80

Heat-shock Protein (hsp) 60 and Mycobacterial hsp65 Differin their Antigen Specificity and Complement-Activating Ability. Int. Immunol. 1999, 11 (9), 1363-70. 116. Prohászka Z, Duba J, Horváth L, Császár A, Karádi I, Szebeni A, Singh M, Fekete B, Romics L, Füst G. Comparative study on antibodies to human and bacterial 60 kDa heat shock proteins in a large cohort of patients with coronary heart disease and healthy subjects. Eur J Clin Invest. 2001 Apr;31(4):285-92. 117. Xu Q, Wick G. The role of heat shock protein in protection and pathophysiology of the arterial wall. Mol Med Today, 1996;2:372-379. 118. Young RA 1990. Stress proteins and immunology. Annu. Rev. Immunol. 8:401-20. 119. Brenner BG, Wainberg MA. 1999. Heat-shock protein-based strategies against human immunodeficiency type 1 infection. Infectious Diseases in Obstetrics and Gynecology 7:80-90. 120. Dicesare S, Poccia F, Mastino A, Collizi V. 1992. Surface-expressed heat-shock proteins by stressed or human immunodeficiency virus (HIV)-infected lymphoid cells represent the target for antibody-dependent cellular cytotoxicity. Immunology 76:341-343. 121. Furlini G, Vignoli M, Re MC, Gibellini M, Ramazotti E, Zauli G, La Placa. 1994. Human immunodeficiency virus type 1 interaction with the membrane of CD4+ cells induces the synthesis and nuclear translocation of 70kD heat shock protein. Journal of General Virology 75:193-199. 122. Mosser DD, Caron AW, Bourget L, Denis-Larose C, Massie B. 1997. Role of the human heat shock protein 70 in protection aganst stress-induced apoptosis. Molecular and Cellular Biochemistry 7: 5317-5327.

81

123. Stebbing J et al 2003. The heat-shock protein receptor CD91 is upregulated on monocytes of HIV-1-infected „true” long-term nonprogressors. Blood 101:4000-4. 124. Brenner BG, Wainberg Z. 2001. Heat shock proteins: novel therapeutic tools for HIVinfection? Expert Opinion on Biological Therapy 1:1-11. 125. Burián K, Kis Z, Virok D, Endresz V, Prohászka Z, Duba J, Berencsi K, Boda K, Horváth L, Romics L, Füst G, Gonczol E. Independent and joint effects of antibodies to human heat-shock protein 60 and Chlamydia pneumoniae infection in the development of coronary atherosclerosis. Circulation. 2001 Mar 20;103(11):1503-8. 126. Prohászka Z, Bánhegyi D, Ujhelyi E, Karádi I, Füst G: Antibodies against 60kD heat shock proteins in human immundeficiency virus infection. In: Stress of Life from molecules to man 8ed: P. Csermely) Ann N. Y. Acad. Sci. 1998;851:94–98. 127. Broquet A, Thomas G, Masliah J, Trugnan G and Bachelet M. Expression of the molecular chaperone Hsp70 in detergent-resistant microdomains correlates with its membrane delivery and release. The Journal of Biological Chemistry. 2003; 278:21601-21606. 128. Horváth Laura et al 2001. levels of antibodies against C1q and 60 kDa family of heat shock protein sin the sera of patients with various autoimmune diseases. Immunology Letters 75: 103-9. 129. Trieb K, Gerth R, Windhager R, Grohs JG et al. Serum antibodies against the heat shock protein 60 are elevated in patients with osteosarcoma. Immunobiology. 2000 Jan;201(3-4): 368-76. 130. Abedi MR, Backman L, Bostrom L, Lindbone B, Ringden O. Markedly increased serum erythropoetin levels following conditioning for allogeneic bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplantation. 1990 Aug;6(2):121-6.

82

131. Prohászka Z, Shingh M, Nagy K et al. Heat-shock protein 70 is a potent activator of the human complement system. Cel Stress and Chaperones 2002; 7(1):17-22. 132. Kocsis J, Füst Gy, Prohászka Z. A 70 kDa-oshősokkfehérje molekuláris biológiája és szerepe egyes immunológiai folyamatokban. Magyar Immunológia 2003; 2(2):5-15. 133. Prohászka Z, Toth FD, Bánhegyi D, Füst Gy. Role of complement and antibodies int he control and faciitation of HIV disease. Pathol Oncol Res. 1997;3(4):296-302.

83

12. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE A doktori értekezésben összefoglalt saját közlemények: J. Kocsis, A. Veres, Á. Vatay, J. Duba, I. Karádi, G. Füst and Z. Prohászka: Antibodies against the human heat shock protein hsp70 in patients with severe coronary artery disease. 2002 Immunological Investigations.Vol: 31 (3-4):219-231. Kocsis J, Prohászka Z, Biro A, Füst Gy, Bánhegyi D: Elevated levels of antibodies against 70 kDa heat shock proteins in the sera of patients with HIV infection. J Med Virol, 2003 dec; 71(4): 480-2. Francisco J. Quintana, Buzás E, Prohászka Z, Bíró A, Kocsis J, Füst Gy, Falus A, Irun R. Cohen. Knock-out of the histidine decarboxylase gene modifies the repertoire of natural autoantibodies. Journal of Autoimmunity 22 (2004) 297–305 Fust G, Beck Z, Banhegyi D, Kocsis J, Biro A, Prohaszka Z Antibodies against heat shock proteins and cholesterol in HIV infection. Mol Immunol. 2005 Jan;42(1):79-85.

Az értekezés témájában megjelent egyéb közlemények: Kocsis J, Füst Gy., Prohászka Z: A 70 kDa-os hősokkfehérje molekuláris biológiája és egyes immunológiai folyamatokban játszott szerepe. Magyar Immunológia 2003; 2(2): 5-15.

Más témában megjelent közlemények: Kocsis J., Bártfai Z.: Milyen orvosi tanácsokat adjunk utazás előtt álló pácienseinknek? Családorvosi Fórum, 2000 június: 52-56

84

Kocsis Judit, Tóth É. Katalin: Daganatos betegségek endokrin kezelése. Családorvosi Fórum. 2002/7, 20-23. Bohács A, Kocsis J, Somoskövi Á, Mészáros Zs, Sápi Z, Tamási L, Bártfai Z: Krónikus nekrotizáló aspergillosis csökkent immunitású betegben. Orvosi Hetilap 2004 Aug. 29;145(35):1811-5. Vatay Ágnes, Tóth É. Katalin, Kocsis Judit: A tumoros cachexia-asthenia szindróma. Családorvosi Fórum. 2002/7. 26-28 Bártfai Z., Muraközy G., Kocsis J., Sömöskövi Á., Magyar P.: A Wegenergranulomatosis definíciója és klasszifikációja, Medicina Thoracalis, 2001, 54: 138-143 Bártfai Z., Kocsis J., Somoskovi Á., Vastagh E.: Tüdőembólia, Családorvosi Fórum, 2001. december, 10-14 Bártfai Z, Somoskovi Á., Kocsis J., Zsiray M.: A sarcoidosis, Családorvosi Fórum, 2001. december, 20-24 Bártfai Z., Somoskövi Á, Kocsis J.: A lokális glükokortikoszteroidok sejtszintű hatásai légúti allergiás megbetegedésekben, Allergológia és Klinikai Immunológia, 2000, 3: 1822

Nemzetközi folyóiratokban megjelent absztrakt: J. Kocsis, Z Bártfai, I Szilvási: The use of 99Tc-MIBI scintigraphy in patients with lung cancer, Nuclear Medicine, Volume 19, Number 4, April, 1998 Z.Bártfai, J.Kocsis,I.Szilvási, M.Orosz: The use of 99Tcm-MIBI scintigrapy in patients with lung cancer, Lung cancer, S 22, Supplement 1 to VOL. 25, september 1999

85

Nemzetközi kongresszusok absztrakt füzetében megjelent absztrakt: Z. Bártfai, J. Kocsis, I. Szilvási, M. Orosz: The use of 99Tcm-MIBI scintigraphy in patients with lung cancer, 1st Congress of the IUATLD, Europe Region in association with the 51st Congress of the Hungarian Respiratory Society, Budapest, Hungary, April 12-15, 2000, Final Programme and Abstract Book Z. Bártfai, J. Kocsis, I. Szilvási, M. Zsiray, M. Orosz.: The investigation of lung cancer with Technetium-99m SestaMIBI (Cardiospect). Finn-Észt-Magyar Nemzetközi Kongresszus, Hanasaari, Finnország, 1997, Program Füzet

Magyar nyelvű folyóiratban megjelent abstract: Kocsis J, Duba J, Prohászka Z, Füst Gy: Hsp70 ellenes antitestek vizsgálata súlyos koszorúér-betegségben. Allergológia és Klinikai Immunológia2002 június (2). 52. o. Kocsis J, Prohászka Z, Füst Gy: A 70kDa-os hősokkfehérje komplementaktiváló képességének jellemzése. Magyar Immunológia 2002/3, 23.o Bártfai Z. Szilvási I., Kocsis J., Zsiray M.: Tüdõtumorban szenvedõ betegek Technetium-99m SestaMIBI (Cardiospect) izotóp vizsgálata, Medicina Thoracalis XLIX évf. Supplementum, 1996, 43 Kocsis J, Prohászka Z, Bíró A, Bánhegyi D, Füst Gy: A 70 kD-os hősokkfehérjék elleni antitestek titere lényegesemagasabb a HIVfertőzöttek, mint a HIV-szeronegatívok szérumában (E38)-MIT XXXIII. Vándorgyűlése, Győr 2003 október 15-17. Magyar Immunológia 2003 okt. Suppl. Vatay Á, Tóth É.K, Laki J, Kocsis J, Prohászka Z, Karádi I, Füst Gy: A TNF-alfa polimorfizmus vizsgálata tumoros betegeink között. (E19) MIT XXXIII. Vándorgyűlése, Győr 2003 október 15-17. Magyar Immunológia 2003 okt. Suppl.

86

Bohács A, Kocsis J, Somoskövi Á, Mészáros Zs, Sápi Z, Tamási L, Bártfai Z: Krónikus nekrotizáló aspergillosis. Medicina Thoracalis Suppl.p-6 2004.

Kongresszuson elhangzott előadások/poszterek: Kocsis J, Prohászka Z, Bíró A, Bánhegyi D, Füst Gy: A 70 kD-os hősokkfehérjék elleni antitestek titere lényegesemagasabb a HIVfertőzöttek, mint a HIV-szeronegatívok szérumában (E38)-MIT XXXIII. Vándorgyűlése, Győr 2003 október 15-17. Kocsis J, Prohászka Z. Füst Gy: Hsp70-nel kapcsolatos immunológiai vizsgálatok koszorúér-betegségben. Magyar Atherosclerosis Társaság XIV. Kongresszusa, 2002 nov 7-9, Sopron-előadás Kocsis J, Duba J, Prohászka Z, Füst Gy: Hsp70 ellenes antitestek vizsgálata súlyos koszorúér-betegségben. MAKIT XXX. Kongresszusa, 2002 június 12-15, Sopronelőadás Kocsis J, Prohászka Z, Füst Gy: A 70kDa-os hősokkfehérje komplementaktiváló képességének jellemzése. MIT XXXII. Vándorgyűlés, 2002 szept 30-okt.2, Kaposvárelőadás Kocsis J., Bártfai Z., Szilvási I.: The use of Tc-99-MIBI scintigraphy in patients with lung cancer, British Nuclear Medicine Society, 26th Annual Meeting, 1998 április 2830, Brighton, Anglia-előadás Kocsis J., Benedek Sz., Tarkovács G., Nebeführer Zs., Nagy Á., Szilvási I: The use of Tc-99m sestamibi in the assesment of lymphomas-Magyar Radiológus Társaság 18. Kongresszusa, 1996. május, Tihany-poszter

87

Bohács A, Kocsis J, Somoskövi Á, Mészáros Zs, Sápi Z, Tamási L, Bártfai Z: Krónikus nekrotizáló aspergillosis. Magyar Tüdőgyógyász Társaság 53. Nagygyűlése Debrecen 2004 jún 3-6. Poszter. Vatay Á, Tóth É.K, Laki J, Kocsis J, Prohászka Z, Karádi I, Füst Gy: A TNF-alfa polimorfizmus vizsgálata tumoros betegeink között. (E19) MIT XXXIII. Vándorgyűlése, Győr 2003 október 15-17. Tóth É. K, Kocsis J, Vatay Á, Laki J, Füst Gy, Karádi I: TNF-alfa polimorfizmus vizsgálata tumoros beteganyagunkban. MOT XXV. Kongresszusa 2003 Szeged Nov. 12-15 P40. Nebenführer Zs., Pálos G., Kocsis J., Nagy Á., Szilvási I: Xenon-133 clearance of muscle in patients with hyperlipoproteinaemia-Magyar Radiológus Társaság 18. Kongresszusa, 1996. május, Tihany-poszter Kocsis J., Nebenführer Zs., Nagy Á., Benedek Sz., Szilvási I.: Limfómás betegek Tc99m sestamibi vizsgálata-Magyar Belgyógyász Társaság Nagygyűlése, 1996. november-előadás Kocsis J., Bártfai Z., Nebenführer Zs., Szilvási I: Tüdőtumorban szenvedő betegek Cardiospect vizsgálata-Magyar Orvostudományi Nukleáris Társaság X: Kongresszusa, Bük-fürdő, 1997 szeptember-poszter Bártfai Z., Kocsis J., Szilvási I., Zsiray M., Orosz M.: The investigation of Lung cancer with Technetium-99m SestaMIBI (Cardiospect), Finn-Észt-Magyar Nemzetközi Kongresszus, 1997. jún. 11-13, Hanasaari, Finnország-előadás Z. Bártfai, J.Kocsis,I.Szilvási, M.Orosz: The use of 99Tcm-MIBI scintigrapy in patients with lung cancer, 6th Central European Lung Cancer Conference, september 1-4, 1999 Budapest-előadás

88

Bártfai Z. Szilvási I., Kocsis J., Zsiray M.: Tüdõtumorban szenvedõ betegek Technetium-99m SestaMIBI (Cardiospect) izotóp vizsgálata, Magyar Tüdõgyógyász Társaság 49. Nagygyûlése 1996. máj. 9-12, Balatonfüred-előadás Temesszentandrási Gy., Radich K, Herjavecz I., Kocsis J., Prohászka Z., Kalabay L., Pozsonyi T., Jakab L. Fekete B: Haemorrhagiás renopulmonalis szindrómával induló, később polymyositis-szel és neuropathiával szövődött Churg-Strauss szindróma differenciáldiagnosztikus problémái és kezelése-Magyar Belgyógyász Társaság Nagygyűlés, 2000 nov. 16-18,-poszter

89