Hoofdstuk
3
Resultaten en Discussie
3.1 Inleiding Het onderzoek naar resistentieontwikkeling bij bacteriën in functie van conserveringsstress is nog vrij jong. Er zijn slechts weinig publicaties te vinden die het verschijnsel behandelen, en vaak is de moleculaire basis van de resistentie niet bekend (Davidson and Harrison, 2002, Lou and Yousef, 1997). Dit onderzoek behandelt twee onderdelen van dit nieuwe domein. Het eerste deel is gefocust op de indentificatie van conserveringsstressen die mogelijk transiënte mutagenese kunnen teweegbrengen, en resistentieontwikkeling bij gekende mutatorstammen tegenover deze stressen. Het onderzoek deelt zich op in onderzoek naar het effect van milde, langdurige conserveringsstressen, zoals waterstofperoxide, triclosan of galzouten (de zogenaamde bewaarstressen), en anderzijds in onderzoek naar het effect van cyclisch toegepaste lethale, kortstondige behandelingen zoals hoge druk, UV-bestraling, en verhitting (de inactivatiestressen). In het geval van de bewaarstressen wordt hierbij enerzijds de invloed nagekeken van de behandelingen naar inductie van de SOS-respons toe, wat een aanzet is voor eventuele adaptieve mutagenese, en anderzijds naar het vermogen van de mutatorstammen om resistentie te ontwikkelen. Verder wordt gekeken in welke mate de stessfactoren of de aanwezigheid van mutatorstammen, de verspreiding van virulentiekenmerken beïnvloeden. Hiertoe wordt de activatie van drie bacteriofagen (H-19B, 933W en λ) gevolgd na behandeling. Vermits voor de inactivatiestressen de inductie van de SOS-respons reeds is aangetoond, zal de nadruk hier liggen op de resistentie-ontwikkeling bij mutatorstammen. Een tweede luik in dit onderzoek wijkt af van het voorgaande, doordat de begeleiding van het project halfweg gewisseld is. Het verdere onderzoek is meer gericht op het ophelderen van de pathway die de schakel vormt tussen hoge druk, het mrr-genproduct, en de SOS-respons. Er wordt gekeken naar de de invloed van een verlaagde temperatuur op dit proces, en naar het tijdskader waarin het mrr-genproduct stabiel is. Tevens wordt er gescreend op enkele proteasen of zij een invloed uitoefenen op werking van het mrr-genproduct. Ook wordt er onderzocht of mrr een invloed heeft op de transformatie-efficiëntie van E. coli, door stammen met verschillende mrr-expressieniveaus te transformeren met eenerzijds plasmide dat het eigen methylatiepatroon draagt, en anderzijds een plasmide uit Salmonella enterica serovar thyphimurium LT2. Tot slot wordt er gestart met onderzoek naar de methylatiespecificiteit van een hogedrukbehandeling. Er wordt gekeken of er een bepaald patroon in de gevormde mutaties te vinden is, en of de mutaties samenhangen met de expressie mrr. Vermits het project halfweg onder nieuwe begeleiding is gekomen, en het onderzoek in het geheel zich nog op vrij onbekend terrein bevindt, is er in de resultaten geen uitgesproken sequentiële opbouw te vinden. Het is eerder een verzameling gegevens die probeert een algemeen beeld te scheppen van het eventuele optreden van resistentieontwikkeling door conserveringsstressen in het algemeen, en het mechanisme waarop dit mogelijk gebeurt in het specifieke geval van hoge hydrostatische druk. Doordat op verschillende vlakken gezocht is naar fenotypes, is er meestal ook geen herhaling geweest van resultaten die op het eerse zicht niet echt overtuigend waren. Het is bij vele experimenten dan ook niet van toepassing van significantie te spreken, tenzij anders vermeld, maar wordt er eerder over interpretatie, en mogelijke implicaties gesproken.
3.2 Resistentieontwikkeling door cyclische toepassing van inactivatiestressen 3.2.1 Behandeling van bacteriële culturen met HHP 3.2.1.1 Opbouw van het experiment Vermits mutatorstammen een constitutief verhoogde mutatiefrequentie hebben, bezitten zij de
potentie om relatief snel resistentie verwerven tegen een lethale hogedrukbehandeling. Er werd in dit onderzoek gestart met vier stammen, die cyclisch werden onderworpen aan een behandeling van 15 minuten op 2700bar, volgens het op pagina Error! Bookmark not defined. beschreven protocol. Via viabiliteitstellingen werd de resistentie van de populatie dan na elke behandeling gestest. Hierbij fungeerde de wildtype stam, E. coli K12 MG1655, als referentie. Na elke behandeling werden de culturen 1/100 overgeënt in vers LB en overnacht opgegroeid tot stationaire cultuur voor de volgende behandeling. Daarnaast werd 30µl van elke stam overgebracht in een 96 well-microtiterplaat voor de bepaling van de viabiliteit, zoals beschreven op pagina Error! Bookmark not defined.. De drie gebruikte mutatorstammen zijn representatief voor drie soorten mutatorallelen. mutH is betrokken in dam-gestuurd mismatch herstel, mutY is betrokken bij het herstel van geoxideerde guanineresidues, en ung codeert voor een uracil glycosylase, dat ervoor zorgt dat er geen uracil wordt ingebouwd in DNA. De mutatiekracht van deze drie mutatorstammen verschilt, en algemeen geeft een defect mutH-allel de hoogste mutatiefrequentie, gevolgd door mutY en tenslotte ung die slechts een zwakke mutator is (Miller, 1996). Als controle van de betrouwbaarheid van E. coli MG1655 als referentie van een stam met standaardmutatiefrequentie werd er tevens na elke cyclys 100µl van het behandelde E. coli MG1655 uitgeplaat op rifampicine. Vermits resistentie tegen rifampicine kan optreden via verschillende eenvoudige mutaties, is resistentieontwikkeling tegen dit product een goede maat voor de mutatiefrequentie. 3.2.1.2 Resultaten Na telling van de viabiliteitstesten werd de verhouding genomen tussen de viabiliteit van het controlestaal en het behandelde staal. Hiervan werd vervolgens het logaritme genomen. Deze waarde, de reductiefactor, kan grafisch uitgezet worden, zoals in figuur 3.1. We zien dat de grafiek een grote variatie vertoont per dag, wat mogelijk te wijten is aan een verschil in optische densiteit voor de drukbehandeling tussen de verschillende dagen. Vermits de gevoeligheid voor groeistressen groter is in de exponentiële fase, kan een te hoge OD een kleinere afdoding veroorzaken. De viabiliteiten van de controlestalen vertoonden inderdaad een matige variatie tussen de opeenvolgende dagen, wat wijst op een verschil in de hoeveelheid cellen voor druk.
Figure 3.1: Resistentieontwikkeling tegen cyclische hogedrukbehandeling, uitgedrukt in reductiefactoren 3.2.1.3 Discussie Zoals vermeld zien we een sterke wisseling in gevoeligheid van dag tot dag. Wel kan gezegd worden dat alle stammen ongeveer deze slingerbeweging volgen, wat de gegevens toch nog, voorzichtig, interpreteerbaar houdt. Wanneer de afdoding van MutH en Ung vergeleken wordt met deze van de wildtype MG1655 stam, zien we dat de RF stelselmatig daalt, en op dag zes zijn de stammen beduidend minder gevoelig. MutY daarentegen blijft gedurende de opeenvolgende cycli ongeveer even gevoelig voor druk dan de wildtypestam. Opvallend hierbij is dat Ung, die volgens de literatuur een zwakkere mutator is dan MutY, toch de bovenhand neemt in dit experiment. Vermits zowel MutH als Ung dezelfde specificiteit delen voor G:CA:T transities, terwijl MutY een voorkeur heeft voor G:CT:A transversies, kan dit er misschien op wijzen dat de G:CA:T een cruciale wijziging in een proteïne aanbrengt dat betrokken is bij de drukgevoeligheidsrespons. Het is echter noodzakelijk een protocol op te stellen waarbij de cyclische behandelingen uitgevoerd kunnen worden met een minimale
variatie in variabelen zoals temperatuur, tijdsstippen en OD. Verder is de extra overnacht groeifase zonder selectie een schakel die geëlimineerd zou moeten worden om de resultaten verder te normaliseren. Het is namelijk aannemelijk dat een mutatie die drukresistentie bevordert, negatief is onder niet selectieve omstandigheden, en daardoor opnieuw verloren gaat in de overnacht groeifase door verdunning tegenover andere phenotypes.
3.2.2 Behandeling van bacteriële culturen met hoge temperatuur Hetzelfde principe als de cyclische drukbehandeling werd tevens opgelegd aan dezelfde vier stammen, maar in plaats van te drukken op 2700bar werden de stammen gedurende 15 minuten op 57°C gebracht. Daarna werd er opnieuw 1/100 overgeënt tot een stationaire cultuur voor de volgende cyclus, en werd eveneens de viabiliteit getest. Dit experiment is na drie dagen stopgezet, vermits er één van de vier stammen verloren gegaan was. Gedurende deze drie dagen is geen noemenswaardige wijziging in resistentie waar te nemen, zoals te zien is in figuur 3.2.
Figure 3.2: Resistentieontwikkeling tegen cyclische temperatuursbehandeling, uitgedrukt in reductiefactoren
3.2.3 Besluit Mutatorstammen vertonen de mogelijkheid tot resistentie-ontwikkeling tegenover HHP. het mechanisme waarop dit gebeurt is uit dit onderzoek niet op te maken. Vermits de gebruikte druk te hoog ligt om de SOS-respons nog invloed toe te wijzen, zal de oorzaak elders te vinden zijn. De resultaten zijn in het licht van de voedingsindustrie, belangrijk vermits HHP als een aantrekkelijk alternatief voor temperatuursbehandeling wordt beschouwd, wanneer het gecombineerd wordt met andere behandelingen. Het is van belang regelmatig te screenen op de vorming van mutatorstammen, en indien nodig, de behandelingswijze zo bij te sturen dat ontwikkeling van mutatorstammen geminimaliseerd wordt. Dit kan bijvoorbeeld door de behandeling te intensiveren. Op deze wijze kan vermeden worden dat bederfflora, of zelfs pathogene bacteriën de behandeling overleven en de qualiteit van het levensmiddel in gedrang brengen.
3.3 Resistentieontwikkeling in aanwezigheid van bewaarstressen 3.3.1 Oriëntering van het experiment Naast korte cyli van inactivatiebehandelingen wordt in de voedingsindustrie ook veel gebruikt gemaakt van bacteriostatische condities. Deze bewaartechnieken zorgen ervoor dat eventueel aanwezige bacteriën niet uit kunnen groeien, maar doden ze niet noodzakelijk af. We proberen hier te kijken of er een verschil is in de snelheid waarmee verschillende mutatorstammen deze barrière weten te overwinnen, en of bepaalde stammen een bepaalde stress wel kunnen overwinnen, terwijl ze geïnhibeerd blijven door een andere. Dit kan een beeld geven over de robuustheid van een bepaalde behandeling, en de grootte van de kans op resistentieontwikkeling in de voedselketen. In eerste instantie werd voor de gebruikte conserveringsmiddelen een inhibitorische concentratie bepaald voor E. coli MG1655. Daarna werd het experiment uitgebreid met vijf mutatorstammen, en werd voor enkele concentraties rond de eerder bepaalde inhibitorische concentratie de groei gevolgd.
3.3.2 Bepaling van de groei-inhibitorische concentraties De gebruikte conserveringsmiddelen zijn waterstofperoxide, di-tert-butylperoxide, javel, triclosan en een mengsel van galzouten. Om een eerste algemeen beeld te krijgen, werd een overnacht opgegroeide stationaire cultuur van E. coli MG1655 1/100 overgeënt in 300µl LB, in elk van de 92 welletjes van een microtiterplaat. Aan de eerste kolom van de plaat werd, telkens in drievoud, de stockoplossing van de conserveringsmiddelen 1/4 toegevoegd. De concentraties van de stockoplossing zijn gegeven in tabel 3.1. Vervolgens werden per rij de concentraties steeds 1/4 verdund door na mengen, 100µl over te brengen in het volgende welletje. Hierdoor bekomt men een verdunningsreeks van de stockoplossing tot (1/4)12. De platen werden vervolgens al schuddend geïncubeerd op 37°C en gedurende zes uur werd elk uur de optische densiteit gemeten. De eeste poging bracht naar voor dat onze initiële stockoplossing van galzouten niet sterk genoeg was (0,2g/ml), en dat de concentratie van triclosan nog te hoog was, zodat er nergens groei op te merken viel. Na enkele rondes fijnregeling, waarbij een steeds nauwere concentratiespreiding werd ingesteld, kunnen de waarden in tabel 3.1 als inhibitorische concentraties beschouwd worden (zie ook figuur 3.3), die in verdere experimenten gebruikt zullen worden. De bekomen resultaten vertonen een goede overeenkomst met de in de literatuur gevonden waarden voor javel en triclosan, respectievelijk M (Penna et al., 2001) en 0,8µg/ml (McMurry et al., 1998). Voor diTertbutylperoxide en galzouten zijn er geen minimale inhibitorische concentraties terug te vinden in de literatuur voor E. coli. Voor waterstofperoxide lopen de waarden uiteen van 10mM (Imlay and Linn, 1987) tot 70mM (Penna et al., 2001). Tevens is geweten dat HO in metabolisch actieve cellen twee effecten heeft, waarbij het eerste effect optreedt bij lage concentraties (1 tot 3mM) in cellen met een deficiënt SOS-systeem, terwijl het tweede optreedt vanaf 10mM, en er een grote resistentievariatie voor bestaat (Imlay and Linn, 1987). Dit verklaart het bekomen resultaat als een inhibitie door het type twee effect van HO, waarbij E. coli K12 MG1655 relatief gevoelig is.
Table 3.1: Richtconcentraties voor inhibitie van de gebruikte conserveringsmiddelen Product HO TBP Triclosan Galzouten Javel
Conc. Stockoplossing Min. inhibitorische concentratie 11,08M M 7,3M M 50 mg/ml 1 µg/ml 32% (m/V) > 8% 2,096M M
Figure 3.3: Minimale Inhibitorische Condities voor E. coli van de gebruikte conserveringsmiddelen. Per middel is de groeicurve voor de MIC en 1 sterkere verdunning gegeven. Galzouten vormt hierop een uitzondering vermits de getoonde concentratie de sterkst haalbare verdunning is
3.3.3 Bepaling resistentieontwikkeling bij mutatorstammen Eenmaal de groei-inhibitorische concentratie van de verschillende conserveringsmiddelen bepaald was, werden er drie waarden gekozen, een eerste iets sterker geconcentreerd, één minder sterk, en één tussen deze twee waarden in. Deze concentraties werden aangemaakt in 295µl LB-medium, en in de welletjes van een 98 wells microtiterplaat gebracht. Hieraan werd 5µl stationair opgegroeide celcultuur toegevoegd, tot een totaal van 300µl. De groei werd gedurende 6 uur gevolgd, waarna de plaat verder geïncubeerd werd op 37°C. Na 24 uur werd er opnieuw 5µl overgebracht in een verse plaat met dezelfde concentraties, zodat een overname door resistente bacteriën kan opgemerkt worden door een snellere groei de volgende dag. Bij de eerste uitvoering van deze opstelling was er geen duidelijke lijn in het geheel te trekken. Er waren stammen die iets sneller leken te groeien, terwijl er andere waren die trager groeiden in de opeenvolgende dagen (data niet weergegeven). Bij herhaling met een striktere controle op de incubatietemperatuur tussen de metingen en overnacht werden wel twee tendensen waargenomen. Ten eerste was er bevestiging van de stijgende gevoeligheid van de stammen voor javel, wat waargenomen was in de eerste uitvoering (zie figuur 3.4). De oorzaak van deze stijgende gevoeligheid is onduidelijk. In de literatuur kan men vinden dat javel op pH7 (zoals in standaard LB-medium heerst) werkt via de geprotoneerde vorm (HOCl) die de cel binnendringt, dissociëert, en vervolgens de vetzuren van het celmembraan verzeept, proteïnen neutraliseert en aminozoren chloramineert (Estrela et al., 2002). Vermits javel hierbij verbruikt wordt door binding met de organische componenten, is een verhoging van de concentratie over de verschillende dagen uit te sluiten. Een mogelijkheid is dat de cellen, die overnacht opgegroeid worden in aanwezigheid van javel, reeds een basale belasting hebben, en de plotse verhoging van de concentratie in het vers medium een verdere aanrijking van gechlorineerde aminozuren veroorzaken die de groei extra belasten. Vermits javel niet op een specifiek cellulair doelwit inwerkt, is het bovendien zeer moeilijk om resistentie te verwerven (een enkele mutatie zal niet volstaan in het geval van aspecifieke bacteriociden).
Figure 3.4: De geteste stammen vertonen een toenemende gevoeligheid tegenover javel, naarmate ze meerdere groeicycli in aanwezigheid van M javel doormaken
Naast de toenemende gevoeligheid voor javel werd een resistentieontwikkeling van MutH, MutS, Ung en UvrD tegenover triclosan waargenomen (zie figuur 3.5). Deze resistentieontwikkeling vertoonde wel fluctuatie over de verschillende dagen. Zo zien we bijvoorbeeld dat MutS op dag twee duidelijk resistentie ontwikkelde, maar op dag drie opnieuw minder sterke groei vertoonde. Als extra controle hebben we daarom de groei van MutS, MutH en MG1655 in aanwezigheid van de inhibitorische concentratie aan triclosan nauwkeurig gevolgd met de bioscreen (zie figuur 3.6). Deze controle gaf bevestiging van de relatief snelle resistentie-ontwikkeling door de mutatorstammen, enkel Ung wist geen resistentie te ontwikkelen tegen 1,25µg/ml triclosan, wat net boven de opgestelde MIC ligt. MG1655 slaagde er niet in te groeien op deze concentratie. De fluctuatie over de verschillende dagen in het oorspronkelijke experiment kan te wijten zijn aan mogelijke negatieve, secundaire mutaties in de mutatorstammen, die groei opnieuw bemoeilijken. Voor galzouten, waterstofperoxide en dTBP tenslotte was er geen resistentievorming waar te nemen.
Figure 3.5: De geteste stammen vertonen een resistentie-ontwikkeling over 3 dagen tegenover 0,8µl/mg triclosan
Figure 3.6: Bevestiging van de snelle overwinning van groei-inhibitie door triclosan, bij vijf mutatorstammen, waarvan vier een positief resultaat geven
3.4 SOS-inductie door conserveringsmiddelen Naast de resistentievorming op zichzelf is het ook interessant om na te gaan of, en in welke mate, conserveringsmiddelen de SOS-respons induceren, vermits deze in rechtstreeks verband staat met adaptieve mutagenese. Vermits RecA een voorname rol speelt in de opstarting van de SOS-respons, werd nagekeken in welke mate RecA-transciptie afhankelijk is van aanwezige bewaarmiddelen. Daarnaast is ook de inductie van lysogene fagen een indicatie van de SOS-respons. Ook voor deze inductie werd de invloed van bewaarmiddelen
onderzocht.
3.4.1 RecA-inductie Om de inductie van RecA door bewaarmiddelen te volgen, maakten we gebruik van het RecA-GFP construct in de pFPV25 vector. Dit construct was reeds beschikbaar in het labo, en moest dus niet zelf geconstrueerd worden. De pFPV25 vector bevat naast een chloramphenicol resistentiemerker een promotorloos gen voor het Green Fluorescent Protein (GFP). Stroomopwaarts van dit gen bevindt zich een insertiecasette, die het mogelijk maakt om een promotor in te brengen voor het gfp-gen. Wanneer deze promotor geactiveerd wordt, zal GFP gevormd worden. Dit kan opgevolgd worden met een fluorescentiemeter, zoals uiteengezet in paragraaf Error! Reference source not found..
Figure 3.7: Inductie van de recA-gfp-probe in MG1655 wildtype door behandeling met bewaarmiddelen De resultaten van dit experiment zijn verdeeld. De postieve resultaten voor dTBP, galzouten en HO zijn weergegeven in in figuur 3.7, waarbij enkel de resultaten weergegeven zijn voor de concentraties die een positief resultaat gaven. Resultaten waarbij geen groei was, wegens een te hoge concentratie van het bewaarmiddel, of geen inductie wegens een te lage concentratie, zijn niet weergegeven. De andere bewaarmiddelen, javel en triclosan, gaven geen SOS-inductie (data niet weergegeven).
3.4.2 Bacteriofaaginductie 3.4.2.1 Inductie onder invloed van bewaarstressen Volgens het protocol beschreven op pagina Error! Bookmark not defined. werd MG1655 Stx1 behandeld met RecA inducerende concentraties van galzouten en di-tert-butylperoxide. Ook triclosan en javel werden in dit experiment meegenomen. De resultaten, weegegeven in figuur 3.8, tonen een verschil met RecA-gfp-inductie. Enkel TBP geeft een duidelijk positief resultaat, terwijl galzouten geen extra inductie geven. Om na te gaan of er wel degelijk een SOS-respons werd geïnduceerd, werd de lysogeeninductie nog voor twee andere virussen getest, Stx2 en de λ-lysogeen. De gezamelijke resultaten voor deze drie lysogene virussen geven een verschillend beeld, wat erop kan wijzen dat er andere factoren een rol spelen in de respons op de bewaarstressen, vermits de resultaten niet unaniem typisch voor een SOSrespons zijn. De peroxiden geven een positief resultaat bij alle lysogenen, wat een bevestiging is van de in de literatuur vermelde SOS-inductie door deze producten. Galzouten veroorzaken geen inductie van de lytische cyclus, terwijl ze wel degelijk positief waren voor de inductie van RecA, en ze een gekende potentie bezitten tot DNA-beschadiging (Prieto et al., 2004).
Figure 3.8: Inductie van bacteriofaag H-19B onder invloed van bewaarstress
Figure 3.9: Inductie van bacteriofaag 933W (stx2, bovenaan) en bactiofaag λ (onderaan) onder invloed van bewaarstress
3.4.3 Inductie in mutatorstammen Als extra aspect van het onderzoek naar bacteriofaaginductie werd gekeken naar de potentie van mutatorstammen tot inductie van lysogene bacteriofagen. Dit is van belang vermits aangetoond is dat mutatorstammen ontstaan in stressrijke omgevingen. Indien dit gebeurt in lysogene bacteriën, houdt dit een groot veiligheidsrisico in, vermits bacteriofagen vaak ziekte kunnen veroorzaken bij de consument. We hebben bacteriofaag H-19B binnengebracht in 5 mutatorstammen (dnaQ, recG, nei, mutM en mutL), door de stammen te infecteren met faaglysaat, en vervolgens uit de plaques culturen op te zuiven op selectief medium. Na opzuivering werd via PCR getest of het stx1-fragment aanwezig was. Vervolgens werden de de culturen opgegroeid in vloeibaar medium en werd de basale inductie gevolgd door op drie tijdstippen de inductie te meten volgens het protocol op pagina Error! Bookmark not defined., in acht genomen dat de stalen niet extra behandeld worden, en dat E. coli K12 MG1655 met profaag H-19B als controle fungeert. De resultaten zijn weergegeven in figuur 3.10. Drie van de vijf geteste stammen vertonen een matige tot sterke inductie van de lytische cyclus. MutM en mutL vertoonden geen verhoogde inductie tenopzichte van de wildtypestam (niet weergegeven).
Figure 3.10: Basale inductie van lambdoïde bacteriofagen in mutatorstammen
3.4.4 Besluit We hebben in dit onderdeel aangetoond dat bewaarstressen met enige voorzichtigheid moeten gebruikt worden. De huidige tendens in de levensmiddelenindustrie is om met een combinatie van lichte behandelingen, en een mininmum aan bewaarmiddelen, een ze “vers” mogelijk product af te leveren. Wanneer echter te lage concentraties gebruikt worden, kan de SOSrespons geïnduceerd worden, met mogelijke resistentievorming en verhoogde verspreiding van virulentiefactoren tot gevolg. Daarnaast zijn mutatorstammen in staat te ontwikkelen onder dergelijke niet lethale omstandigheden, en net zoals tegenover HHP, tegenover triclosan, en mogelijk tegenover andere bewaarmiddelen met een specifiek cellulair doelwit, snel resistentie te ontwikkelen. Dit specifiek cellulair doelwit is voor triclosan de lipidensynthese, en een mutatie in het FabI-gen kan snel resistentie veroorzaken. Deze trend blijkt echter niet algemeen geldend te zijn, zoals McBain, Ledder, Sreenivasan, and Gilbert (2004) aantoonden. Zij brachten als mogelijke verklaring aan dat andere bacteriële stammen meerdere genen bevatten die coderen voor een homoloog aan FabI. Hierdoor bevatten deze stammen meerdere doelwitten waarop triclosan inwerkt, en verwerven ze minder eenvoudig resistentie. Dit gegeven maakt duidelijk dat een goede keuze gemaakt moet, gebaseerd op uitgebreid onderzoek naar resistentievorming, bij de keuze van bewaarmiddelen en indicatororganismen. Ten slotte hebben we nog vastgesteld dat, vermoedelijk afhankelijk van het cellulair defect, sommige mutatorstammen een verhoogde inductie van profagen vertonen. In combinatie met hun verhoogde potentie tot vorming van stressresistente varianten kan dit een aanzienlijk veiligheidsrisico vormen. Het is dus, zoals reeds eerder vermeld van het grootste belang de ontwikkeling van mutatorstammen op te volgen in een industriële omgeving. Daartegenover hebben we een verhoging van de gevoeligheid tegenover javel vastgesteld, wanneer bacteriën gedurende enkele dagen worden opgegroeid in aanwezigheid van een constante javelconcentratie. De oorzaak hiervan is nog onbekend. Wel is geweten dat het op een aspecifieke manier inwerkt op het celmembraan, en de werking van verschillende proteïnen kan verstoren via chloraminering. Deze aspecifieke werking, gecombineerd met het gebrek aan inductie van de SOS-respons, maakt van javel een betrouwbaar en relatief veilig product voor antimicrobieel reinigingswerk.
3.5 Betrokkenheid van Mrr in de drukgeïnduceerde SOS-respons Het tweede luik van het onderzoek richt zich op het mechanisme waarop hoge druk de SOSrespons induceert. Hierbij werd gekeken naar het verschil van drukgevoeligheid op 10°C en 20°C, het tijdsspanne waarin Mrr functioneel blijft nadat de productie wordt stopgezet, de gevoeligheid van Mrr voor enkele proteasen, de eigenschappen van de overlevende fractie, en de mutatiespecificiteit van HHP.
3.5.1 Drukrespons op 10°C en 20°C 3.5.1.1 Inleiding De SOS-respons na milde drukbehandeling wordt typisch aangetoond op 3 fronten. Enerzijds is er RecA-expressie, aangetoond via een recA-GFP contruct, andezijds is er de lysogeeninductie, en tenslotte is er hyperfilamentatie in lon-negatieve mutanten. In de volgende experimenten wordt aangetoond dat de HP-respons op 10°C niet, of sterk verminderd, optreedt ten opzichte van eenzelfde behandeling op 20°C. Om aan te tonen dat Mrr hierin een centrale rol speelt, wordt een Mrr-overexpressor behandeld op de twee temperaturen. Tevens worden de resultaten steeds vergeleken met een controle, en een UVbehandeling, vermits reeds aangetoond is dat Mrr vebonden is aan een typisch drukgerelateerde respons, en niet aan de UV-respons (Aertsen and Michiels, 2005)
3.5.1.2 RecA-inductie MG1655 met het recA-gfp-construct werd opgegroeid tot een OD van 0,3 en gehersuspendeerd in medium van respectievelijk 10°C en 20°C. Vervolgens werden de stalen aan de stressen weergegeven in tabel 3.2 onderworpen, waarna ze in de fluorescentiemeter gebracht werden en de fluorescentie gedurende 3 uur opgemeten werd volgens het protocol op pagina Error! Bookmark not defined.. Tijdens de drukbehandeling werd de gewenste temperatuur bewaard via de watermantel van het druktoestel, terwijl voor de UV-behandeling gepoogd werd om de behandeling zo snel mogelijk te geven, terwijl het medium zich nog op de juiste temperatuur bevond. De controles, eveneens gesealed zoals de drukbehandelde stalen, werden gedurende vijftien minuten bewaard op de gewenste temperatuur in het waterbad van het druktoestel.
Table 3.2: Opgelegde condities in het RecA-GFP inductie-experiment Stressfactor HP UV mitoC Controle
Intensiteit 15 minuten, 1000bar 0,01 J/cm2 1/100 (stock? ) 15 minuten, sealed
Het experiment is driemaal uitgevoerd, en de resultaten zijn weergegeven in figuur 3.11. Er werd een sterke terugval van inductie waargenomen voor hogedrukbehandeling op 10°C, terwijl de inductie voor UV en MitoC op een gelijkaardig niveau bleef. Tevens werd op beide temperaturen de inductie door hogedrukbehandeling quasi volledig teniet gedaan door uitschakeling van het mrr-gen, terwijl UV en MitoC hun inducerende werking behouden in de knockout, welliswaar met een kleinere intensiteit.
Figure 3.11: RecA-inductie op 10°C en 20°C onder invloed van hoge druk, UV-bestraling en Mitomycine C, voor wildtype MG1655 en MG1655 Mrr-knockout 3.5.1.3 Lysogeeninductie Volgens het protocol op pagina Error! Bookmark not defined. wordt een MG1655 λlysogeencultuur behandeld met hoge druk en UV op 10°C en 20°C, en met de intensiteiten uit tabel 3.2. De resultaten, weergegeven in figuur 3.12, tonen een tienvoudige reductie van inductie voor HHP bij 10°C, terwijl de inductie voor de controlestalen en UV ongeveer op hetzelfde niveau blijven.
Figure 3.12: Lysogeeninductie onder invloed van HHP en UV bij 10°C en 20°C 3.5.1.4 Hyperfilamentatie in lon-achtergrond Zoals vermeld in paragraaf Error! Reference source not found. treedt in lon-deficiënte cellen hyperfilamentatie op wanneer ze onderworpen worden aan HHP. Deze hyperfilamentatie is het gevolg van de inductie van een SOS-respons, en de daaraan verbonden inhibitie van FtsZ-ringvorming door SulA, die niet langer onder controle wordt gehouden door het Lon-protease (Aertsen and Michiels, 2004). In het experiment werden twee culturen meegenomen, namelijk MG1655 lon en de MG1655 lon sulA dubbelmutant, en werd onderstaand protocol gevolgd. • De stammen worden geënt in 4ml LB-medium, eventueel voorzien van antibiotica en overnacht opgegroeid tot een stationaire cultuur bij 37°C. • De stationaire cultuur wordt 1/100 overgeënt in 4ml vers LB-medium, opnieuw voorzien van eventuele selectiemerkers. • De culturen worden schuddend opgegroeid tot een OD van 0,2. • De culturen worden 5 minuten gecentrifugeerd (5000RPM bij kamertemperatuur) en gehersuspendeerd in 4ml vers LB-medium van respectievelijk 10°C en 20°C. • 1ml van deze cultuur wordt op zijn respectievelijke temperatuur onderworpen aan UV en HHP volgens de intensiteit in tabel 3.2. • Na behandeling wordt het staal in een lege, steriele proefbuis gebracht, gedurende 3 uur schuddend geïncubeerd op 37°C en ten slotte microscopisch onderzocht. Bij microscopische controle van de stalen na 3 uur incubatie was een verschil in filamentatie waar te nemen, in overeenstemming met de resultaten uit de bovenstaande experimenten. Op 20°C was in de lon-mutant een sterke hyperfilamentatie te zien na drukbehandeling, die op 10°C niet sterker optrad dan in de controlestalen. UV-behandeling veroorzaakte zowel op 20°C als op 10°C een sterke vorm van hyperfilamentatie. Een bijkomende knock-out van SulA verhinderde filamentatie onder alle condities (zie figuur 3.13). Om te verzekeren dat het gebrek aan fenotype niet te wijten was aan een te hoge afdoding, werd tevens de viabiliteit getest. Er werd in geen enkele conditie een reductiefactor gehaald groter dan twee logeenheden (data niet weergegeven).
Figure 3.13: Hyperfilamentatie onder invloed van HP en UV bij 10°C en 20°C 3.5.1.5 Afdoding van E. coli K12 MG1655 pAA810 bij 10°C en 20°C Tenslotte werd de afdoding vergeleken van een mrr-overexpressor bij 10°C en 20°C. mrroverexpressie (via het pAA810-plasmide) veroorzaakt een verhoogde drukgevoeligheid (Aertsen and Michiels, 2005), en dit expermiment onderzoekt of een verlaagde temperatuur in staat is deze verhoogde gevoeligheid te neutraliseren. De culturen werd gedrukt volgens het protocol op pagina Error! Bookmark not defined., waarbij het verse medium op de gewenste temperatuur was gebracht, en de controles eveneens gedurende 15 minuten gesealed op respectievelijk 10°C en 20°C gebracht werden. Het experiment is tweemaal herhaald, en uit de resultaten was te besluiten dat een verlaging van de temperatuur de afdoding door HP verlaagt van 3 logeenheden tot 1,5 logeenheden, wat overeenkomt met de afdoding op 20°C voor de wildtype MG1655 (zoals bepaald in andere experimenten en door Aertsen and Michiels, (2005)). Gevoeligheid voor UV-behandeling lijkt echter geen invloed te ondervinden van de verhoogde mrr-expressie, en evenmin van het verschil in temperatuur (zie figuur 3.14).
Figure 3.14: Reductiefactoren van MG1655 pAA810 onder invloed van behanding met HP en UV bij 10°C en 20°C 3.5.1.6 Besluit De bovenstaande experimenten wijzen op een verschil in drukrespons tussen 10°C en 20°C, dat vermoedeljk terug te brengen is op de mrr-gerelateerde SOS-respons. De temperatuurafhankelijkheid oefent zijn invloed in de cascade waarschijnlijk uit stroomopwaarts van de RecA-inductie, vermits UV-behandeling geen, of een veel beperkter invloed onderindt van het verschil in temperatuur, of van het al dan niet aanwezig zijn van functioneel Mrr. Vermits de enige tot nu toe gekende schakel stroomopwaarts van RecA, Mrr zelf is, is het aannemelijk dat de functie van dit nuclease verhinderd wordt bij lage temperatuur. Inhibitie van Mrr kan via verschillende wegen tot stand komen. Koude induceert, net zoals hitte, een specifieke groep proteïnen, de “cold-shock” proteïnen (Thieringer et al., 1998). Het zou mogelijk kunnen zijn dat een van deze eiwitten de werking van Mrr inhibeert, door binding met, of afbraak van het nuclease. Het feit dat typisch een lag-periode van een klein uur nodig is om de cold-shock proteïnen tot expressie te brengen, terwijl de inhibitie van de drukgevoeligheid zich in enkele minuten voltrekt maakt dit echter onwaarschijnlijk. Een tweede mogelijkheid is een inhibitie van de signaaltransductieweg ter hoogte van het celmembraan. Plotse verlaging van de temperatuur heeft namelijk een aangetoond effect op de activiteit van enkele Fab-proteïnen, die instaan voor de productie van onverzadigde vetzuren (Carty et al., 1999). Vermits activiteit sneller bij te sturen is dan transcriptie, is deze mogelijkheid waarschijnlijker dan de invloed van echte cold-shock proteïnen. Deze piste kan verder uitgediept worden om te onderzoeken of de structuur van het celmembraan inderdaad een rol speelt in de drukrespons. Indien na uitschakeling van de Fab-genen het verschil in drukrespons bij de twee temperaturen wijzigt, kan dit wijzen op betrokkenheid van de membraanstructuur bij de receptie van druk. Als derde mogelijkheid is er de toestand van het DNA zelf. Mmr is een nuclease, en start de SOS-cascade via enzymatische knipping van het DNA. Koudestress heeft echter een effect op de superheliciteit van het DNA (Mizushima et al., 1997), waardoor misschien de toegang van Mrr tot zijn, nog onbekende, doelwitsequentie onmogelijk wordt gemaakt. Deze piste kan verder onderzocht worden door
de culturen gedurende lange tijd op 10°C te houden, zodat de cold-shock proteïnen tot expressie kunnen komen. Hier zit namelijk een gyrase bij, dat het DNA opnieuw in een toegankelijke vorm brengt voor hernieuwde celgroei (Thieringer et al., 1998). Indien de drukgevoeligheid opnieuw toeneemt na langere incubatie op 10°C, speelt superheliciteit van het DNA vermoedelijk een rol. Tenslotte kan het echter ook gaan om een zuiver fysiologisch verschijnsel, waarbij door de afkoeling van de cellen de flexibiliteit, en zo de werking van de betrokken eiwitten wijzigt. Hierdoor zou de invloed van de drukbehandeling sterk wijzigen. Er kan in dit verband nagekeken worden of de drukrespons opnieuw op het normale niveau gebracht kan worden door de intensiteit van de behandeling te wijzigen (langere behandeling of hogere druk).
3.5.2 Stabiliteit van Mrr 3.5.2.1 Tijdskader van Mrr-stabiliteit We willen in dit experiment de stabiliteit van Mrr onderzoeken. Hiervoor maakten we gebruik van het pBAD18-plasmide, waarop mrr onder invloed van de pBAD-promoter aanwezig is. Hierdoor wordt het mogelijk de productie van Mrr uit te schakelen door het medium arabinose-vrij te maken. Om de achtergrondexpressie van mrr zo laag mogelijk te houden, werd het pBAD18-plasmide ingebracht in een MG1655-stam met een genomische mrr-knockout In een eerste fase van het experiment werd de inductie van mrr door toevoeging van arabinose geoptimaliseerd. Na enkele pogingen werd de werkwijze vastgelegd zoals hierna beschreven. De cellen worden gedrukt volgens het op pagina Error! Bookmark not defined. beschreven protocol, met enkele verschillen. De cellen worden opgegroeid tot een OD van 0,2, waarna aan het medium 0,2% arabinose wordt toegevoegd, zodat Mrr geproduceerd wordt. Na 60 minuten incubatie in aanwezigheid van arabinose wordt 100µl van het staal gedrukt (t=0). Het resterend staal wordt gecentrifugeerd en gehersuspendeerd, waarna het staal in twee gedeeld wordt. Aan één helft wordt opnieuw 0,2% arabinose toegevoegd, zodat de Mrr-productie op peil blijft, aan de andere helft wordt 0,2% glucose toegevoegd, wat een inhibitor van het pBAD stysteem is, zodat de productie van Mrr volledig stilvalt. Vanaf dan wordt elke 30 minuten 100µl staal gedrukt zoals het protocol beschrijft, en wordt de viabiliteit getest. Door vergelijking van de reductiefactor in het staal met glucose en met arabinose, kon het tijdsspanne van mrr-stabiliteit bepaald worden. De drukgevoeligheid hangt namelijk samen met de aanwezigheid van functioneel Mrr, zodat de daling in drukgevoeligheid gecorreleerd is met de afbraak van Mrr. Dit is grafisch weergegeven in figuur 3.15. De stabiliteit van Mrr lijkt beperkt tot ongeveer 60 minuten. Op dat moment heeft de drukrespons een basale afdoding bereikt die gedurende het verder verloop van het experiment nog slechts licht fluctureert.
Figure 3.15: Tijdsspanne van de gevoeligheid voor druk, in cellen met regelbare mrrexpressie, visualiseert de stabiliteit van het Mrr-proteïne 3.5.2.2 Mrr-gevoeligheid voor enkele proteasen Nu de stabiliteit van Mrr onder normale omstandigheden bekend was, konden we onderzoeken of het nuclease wordt afgebroken door één van de proteasen waarvan het labo knockouts bezit (beschreven op pagina Error! Bookmark not defined.). In elk van deze stammen is één gen uitgeschakeld dat codeert voor een protease. Daarnaast bevatten ze ook
het pBAD18-plasmide met het regelbare mrr-gen. Vermits de inductie in de knockouts lager was dan verwacht, werd het protocol uit het optimalisatie-experiment aangepast. De culturen werden vanaf overenting tot de gewenste OD opgegroeid in aanezigheid van arabinose. Na verversing van het medium (t=0) werd glucose toegevoegd, waarna opnieuw elke 30 minuten gedrukt werd en de viabiliteit bepaald werd. Als negatieve controle werd het lege pACYC184-plasmide gebruikt, dat geen mrr-gen bevat. De resultaten, weergegeven in figuur 3.16, tonen dat geen van de gebruikte proteasen instaat voor de afbraak van Mrr. De stabiliteit van Mrr (gevisualiseerd door de drukgevoeligheid van de stam) daalt in alle stammen ongeveer gelijk met het wildtype. Wel hebben we gemerkt dat de mrr::Cm knockout een sterk negatieve invloed had op de kolonievorming van de clpX mutant. We bekwamen een verspreide groei, onafhankelijk van de verdunningsreeks, bij het uitplaten van de viabiliteitstest, en dit zowel in het drukbehandelde als in het controlestaal. Bij herhaling vanop een nieuwe stockplaat verdween dit phenotype.
Figure 3.16: Gevoeligheid van Mrr voor enkele proteasen, gevisualiseerd door de drukgevoeligheid in de respectievelijke protease knockouts, na stopzetting van de mrrtranscriptie
3.5.3 Karakterisatie van de overlevende fractie Algemeen wordt aangenomen dat cellen in hun laat exponentiële groeifase een grote drukgevoeligheid hebben. Deze gevoeligheid wordt nog verhoogd in de aanwezigheid van het pAA810-plasmide. Toch blijken enkele cellen de drukbehandeling te overleven. We proberen via twee benaderingen te kijken of hun overleving te danken is aan een inherente resistentie door toevallige mutaties, of door een verschil in groeifase. 3.5.3.1 Verhoging van de exponentiële fractie In een eeste benadering maximaliseerden we de fractie van de MG1655 pAA810 cultuur die zich in de laat exponentiële groeifase bevindt. Dit deden we door de cultuur, wanneer die een OD van 0,3 bereikt, opnieuw 1/100 te verdunnen en op te groeien tot dezelfde optische densiteit. Cellen die reeds in hun exponentiële groeifase zaten behouden deze groeisnelheid, terwijl de fractie die nog niet exponentieel groeide, de kans kreeg de exponentiële groeifase te betreden. Wanneer de cultuur opnieuw een OD van 0,3 bereikte, werd verder het standaard drukprotocol gevolgd en de viabiliteit getest. Figuur 3.17 toont dat de overleving niet te wijten is aan een verschil in groeifase, vermits met een grotere exponentiële fractie in de cultuur, de afdoding niet significant stijgt, maar eerder daalt.
Figure 3.17: Afdoding, weergeven als reductiefactor, in functie van de exponentiële fractie in de cultuur. ’1x exp’ is uit een stationaire cultuur opgegroeid tot de laat exponentiële fase, ’2x exp’ is uit deze cultuur opnieuw verdund en nogmaals opgegroeid tot de laat exponentiële fase 3.5.3.2 Drukresistentie van de overlevende fractie Hier wordt gekeken of de overlevende cellen mutaties bezitten die resistentie leveren tegenover drukbehandeling. Indien dit zou zijn, zou deze bacteriën een veel lagere RF moeten
vertonen wanneer ze opnieuw gedrukt worden. Er wordt hiervoor een MG1655 pAA810 cultuur opgegroeid tot een OD van 0,3 en gedrukt volgens het standaardprotocol. Daarna wordt het staal uitgeplaat op LB-medium en overnacht geïncubeerd op 37°C. Vervolgens worden 5 kolonies aangestipt als start voor een nieuwe drukbehandeling volgens het standaardprotocol. Als zesde staal wordt MG1655 pAA810 geënt uit een onbehandelde cultuur. Het experiment is twee maal uitgevoerd, en de gemiddeldes van de overlevers en de controlestalen zijn weergegeven in figuur 3.18. We zien een verlaging van de drukgevoeligheid bij de initieel overlevende fractie, maar deze is niet groot genoeg om significant te zijn binnen het aantal herhalingen.
Figure 3.18: Afdoding, weergegeven als reductiefactor, na één en twee drukcycli
3.5.4 Invloed van mrr-expressie op transformatie-efficiëntie Mrr is een nuclease van het vierde type. Dit betekent dat het afhankelijk is van een bepaald methylatiepatroon om zijn restrictieactiviteit uit te oefenen. Het exacte methylatiepatroon is echter nog niet bepaald, net zoals de in vivo functie onder standaardomstandigheden. We proberen hier na te gaan of de methylatieachtergrond van een plasmide een grote rol speelt in de transformatie-efficiëntie van dit plasmide, en het ontbreken van Mrr eventueel deze invloed kan opheffen. Om dit na te gaan hebben we drie acceptorstammen (MG1655 mrr-knockout, wildtype en overexpressor) getransformeerd met een plasmide mengsel van twee plasmiden. Enerzijds het pACYC-plasmide met een E. coli methylatieachtergrond, en anderzijds een para-GFP-plasmide. Dit tweede plasmide werd zowel verzameld uit E. coli als uit Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2, waardoor de invloed van het methylatiepatroon bestudeerd kan worden. Het pACYC-plasmide werd in deze opstelling meegenomen als referentie van de algemene transformatie-efficiëntie. De resultaten van het experiment zijn weergegeven in figuur 3.19.
Figure 3.19: Plasmidetransformatie-efficiëntie in functie van methylatieachtergrond en Mrrgehalte in de cel. Op de X-as zijn de drie acceptorstammen uitgezet, die een stijgende mrrexpressie vertonen van links naar rechts. Op de Y-as links is de transformatie-efficiëntie van het controleplasmide (pACYC-MG1655-methylatiepatroon) over het Salmonella gemethyleerd para-BAD-plasmide uitgezet. Op de rechtse Y-as de verhouding van efficiëntie van beide plasmiden wanneer ze beide het MG1655 methylatiepatroon bezitten We zien dat de verhouding conrole over testplasmide daalt met toenemende Mrr-concentratie in de cellen, wat tegenstrijdig is met het verwachtte resultaat indien de efficiëntie af zou hangen van het methylatiepatroon, en restrictie door Mrr. Indien Mrr het plasmide met Salmonellamethylatie selectief zou knippen, zou de verhouding moeten stijgen met toenemende Mrr-concentratie. De efficiëntie van transformatie zou immers moeten dalen voor het para-GFP-plasmide uit Salmonella, terwijl de efficiëntie voor het pACYC-plasmide quasi gelijk blijft. We hebben echter opgemerkt dat de efficiëntie van de plasmiden met E. coli methylatiepatroon ook een sterke invloed ondervinden van de toenemende Mrr-concentratie. Dit doet vermoeden dat er andere factoren zijn die de transformatie-efficiëntie beïnvloeden.
3.5.5 Onderzoek naar mutatiespecificiteit van Mrr-afhankelijke SOS-respons Zoals gekend heeft de werking van sommige proteïnen een inherente aanleg tot het veroorzaken van één of enkele afgelijnde muatietypes, zoals -1 frameshifts in het geval van polIV (Kobayashi et al., 2002). Onderzoek naar deze specificiteit kan gebeuren met behulp van de E. coli CC-stammen, zoals beschreven door Josephy (2000). In eerste instantie moesten de stammen getest worden op de aanwezigheid van een functioneel mrr-gen. Van de 10 gebruikte stammen (CC109 wordt niet in meegenomen, wegens niet beschikbaar) werd een PCR uitgevoerd op het mrr-gebied. De stalen werden daarna op gel geladen en gecontroleerd op de aanwezigheid van het correcte fragment. Alle stammen bezitten het mrr-gen (data niet weergegeven), zodat enkel de functionaliteit nog getest moest worden. Vier stammen werden als steekproef opgegroeid en gedrukt volgens het standaard protocol. Na druk werd 1ml staal geïncubeerd op 37°C gedurende 3 uur waarna de filamentatiegraad onderzocht werd in vergelijking met de respectievelijke controlestalen. Alle stalen vertoonden filamentatie is een sterkere mate dan de controles, dus kan ervan uit gegaan worden dat ze een functioneel mrrproduct aanmaken. Vervolgens werden alle stammen volgens onderstaand protocol behandeld: • De stammen worden vanaf plaat geënt in 4ml LB-medium en al schuddend geïncubeerd tot = 0,3. • Bij de gewenste OD wordt de stalen gecentrifugeerd (5 minuten, 5000RPM bij kamertemperatuur) en gehersuspendeerd in 4ml voorverwarmd (37°C) LB-medium. • 1,06ml van het staal wordt in een polyethyleenzakje gebracht, gesealed en gedurende 15 minuten gedrukt op 1000bar bij 20°C. • 30µ van het gedrukte en ongedrukte staal wordt gebruikt voor een standaard viabiliteitstest. • Het gedrukte staal, en 1,03ml controlestaal wordt in een lege steriele proefbuis gebracht en gedurende 3 uur schuddend geïncubeerd op 37°C. • 30µl van beide stalen wordt in 270µ KP-buffer gebracht en verdund tot 10. Van deze verdunning wordt 100µ uitgeplaat op M9-glucosemedium. • De resterende 1ml van de stalen wordt geconcentreerd in 100µl door centrifugatie en verwijdering van het supernatans, en wordt vervolgens uitgeplaat op M9lactosemedium. • De platen worden gedurende 48 uur geïncubeerd op 37°C en de kolonies worden geteld. Wanneer de kolonies geteld waren, werd hun aantal omgerekend naar het aantal kolonies per milliliter onverdund staal, en vervolgens werd de verhouding genomen tussen het aantal kolonies op lactose en glucose. Dit werd grafisch voorgesteld in figuur 3.20. Hierop kan men zien dat de stammen CC101, CC102, CC106, CC108 en CC110 duidelijk een hogere mutatiefrequentie te hebben als hun controles, terwijl CC104 er als negatief resultaat uitschiet. Enige voorzichtigheid bij deze interpretatie is wel geboden, vermits de drukbehandeling voor afdoding zorgt, wat voor vertekening van de gegevens kan zorgen. Het is zeker aangeraden om enkele herhalingen uit te voeren, zodat er een betrouwbaarder resultaat bekomen wordt. Als opvallendste aanwijzing voor specificiteit is de verhouding CC101 tegenover CC104 zeker belangrijk. CC101 wordt lac-positief door een A:TC:G. CC104 daarentegen heeft net de omgekeerde mutatie nodig, namelijk G:CT:A. Dit zou een nauwe specificiteit betekenen, aangezien de transversie slechts in één richting optreedt, en de andere transversies (CC103 en CC105) geen uitgesproken resultaten gaven.
Figure 3.20: LacZ reversietest bij drukbehandeling. De resultaten zijn uitgedrukt als de verhouding tussen het aantal kolonies op M9-lactosemedium over het aantal kolonies op M9glucosemedium, beide na drie uur incubatie volgend op de drukbehandeling. Voor de duidelijkeid zijn de resulaten vermenigvuldigd met 10 en is vervolgens het logaritme genomen. Als tweede fase van het experiment werden vier stammen gekozen uit de resultaten van het initiële experiment: CC101 en CC108 als postief, CC104 als negatief, en CC111 als twijfelgeval wegens tegenstrijdige resultaten bij herhaling. In deze stammen werd via elektroporatie het pKD46 plasmide ingebracht (beschreven op pagina Error! Bookmark not defined.). Na aanmaak van de genomische mrr-knockoutfragmenten via PCR, werd na inductie van de recombinatiegenen op het plasmide, een genomische knockout bewerkstelligd. Vermits er een vermoeden was dat de mrr::Cm knockout neveneffecten vertoont (zie experiment met protease knockouts), worden drie verschillende knockouts aangemaakt van de vier stammen, met Tetracycline, Kanamycine en Chloramphenicol als selectiemerker. Van deze elektroporaties mislukten echter alle Chloramphenicol-stalen, en het Tetracyclinestaal van CC108. De gelukte stammen werden opgegroeid en volgens het hiervoor beschreven protocol gedrukt en uitgeplaat op M9-medium. MG1655 CC104 mrr::Km vertoonde echter een te trage groei, waardoor er voor deze stam geen resultaten zijn. In het experiment met de mrr::Tc-knockouts (zie figuur 3.21), valt op dat de verschillen tussen controle en behandeld staal worden uitgevlakt in de mrr-knockouts, wat een aanwijzing is voor de betrokkenheid van de Mrr-afhankelijke drukrespons in de mutageniciteit van druk. Interpretatie van de gegevens moet echter met de nodige voorzichtigheid gebeuren, vermits het experiment nog niet voldoende herhaald is. Zo zien we dat de resultaten voor de mrr::Km stammen (figuur 3.22) niet in overeenstemming zijn met deze van het mrr::Tc experiment, en met het initiële experiment voor CC101.
Figure 3.21: Invloed van mrr::Tc knockout op mutagenese na drukbehandeling
Figure 3.22: Invloed van mrr::Km knockout op mutagenese na drukbehandeling
3.5.6 Besluit De bovenstaande resultaten bevatten een aantal interessante bevindingen, die de mogelijkheid openen naar nieuwe onderzoekssporen. Zo hebben we aangetoond dat de SOS-respons die optreedt bij milde drukken, niet optreedt wanneer het medium op 10°C wordt gebracht. Hoewel de resultaten significant zijn, is er nog geen verklaring voor het fenomeen. Zoals hoger vermeld kan de oorzaak van velerlei aard zijn, maar een verdere uitwerking van het experiment, naar wijziging van drukintensiteit, geïnactiveerde “cold-shock”-proteïnen of langere incubatie op 10°C reiken de mogelijkheid aan bijkomende stappen in de drukrespons op het spoor te komen. Als tweede belangrijk gegeven is een aanzet gemaakt naar de bepaling van de mutagene specificiteit van de milde hogedrukbehandeling, met een beperkt gereproduceerd positief resultaat. Indien de mutatiespecificiteit juister bepaald kan worden, kan het misschien
mogelijk worden deze te vergelijken met de gekende eigenschappen van allerlei mutagene agentia en hieruit mogelijke betrokken factoren identificeren.
Bibliography A. Aertsen and C.W. Michiels. Sula-dependent hypersensitivity to high pressure and hyperfilamentation after high-pressure treatment of Escherichia coli lon mutants. Research in Microbiology, 156:233–237, 2004. A. Aertsen and C.W. Michiels. Mrr instigates the sos response after high pressure in Escherichia coli. Molecular Microbiology, 58:1381–1391, 2005. A. Aertsen, P. De Spiegeleer, K. Vanoirbeek, M. Lavilla, and C.W. Michiels. Induction of oxidative stress by high hydrostatic pressure in Escherichia coli. Applied And Environmental Microbiology, 71: 2226–2231, 2005. A. Aertsen, K. Vanoirbeek, P. De Spiegeleer, J. Sermon, K. Hauben, A. Farewell, T. Nyström, and C.W. Michiels. Heat shock protein-mediated resistance to high hydrostatic pressure in Escherichia coli. Applied And Environmental Microbiology, 70: 2660–2666, 2004a. Abram Aertsen, Rob Van Houdt, Kristof Vanoirbeek, and Chris W. Michiels. An sos respons induced by high pressure in Eschericia coli. Journal of Bacteriology, 186:6133–6141, 2004b. T.G. Aldsworth, R.L. Sharman, and C.E.R. Dodd. Bacterial suicide through stress. Cellular and Molecular Life Sciences, 56:378–383, 1999. D.H. Bartlett. Pressure effects on in vivo microbial processes. Biochimica et Biophysica Acta, 1595:367–381, 2002. M.I. Bazhal, M.O. Ngadi, G.S.V. Raghavan, and J.P. Smith. Minimal processing of foods using hurdle technologies. Paper presented at the 2003 annual meeting of the CSAE. July 6 - 9, Ste-Anne-de-Bellevue, Quebec. A. Beletskii and Ashok S. Bhagwat. Transcription-induced mutation: Increase in c to t mutations in the nontranscribed strand during transcription in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93:13919–13924, 1996. S.Y. Berdes, M.D. Scholle, J.W. Campbell, G. Balazsi, E. Ravasz, M.D. Daugherty, A.L. Somera, N.C. Kyrpides, I. Anderson, M.S. Gelfand, A. Bhattacharya, V. Kapatral, M. D’Souza, M.V. Baev, Y Grechkin, F. Mseeh, M.Y. Fonstein, R. Overbeek, A.-L. Barabasi, N. Oltvai, and A.L. Osterman. Experimental determination and system level analysis of essential genes in Escherichia coli mg1655. Journal of Bacteriology, 185:5673–5684, 2003. Thomas A. Bickle and Detlev H. Krüger. Biology of dna restricton. Microbiological Reviews, 57:434–450, 1993. H.C. Birnboim and J. Doly. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid dna. Nucleid Acids Research, 7:1513–1523, 1979. F.R. Blattner, G. 3 Plukett, C.A. Bloch, N.T. Perna, V. Burland, M. Riley, J. ColladoVides, J.D. Glasner, C.K. Rode, G.F. Mayhew, J. Gregor, N.W. David, H.A. Kirkpatrick, M.A. Goeden, D.J. Rose, B. Mau, and Y. Shao. The complete genome sequence of escherichia coli k-12. Science, 277:1453–1474, 1997. Braithwaite, D.K., and Ito. Compilation, alignment and phylogenetic relationships of dna polymerases. Nucleic Acids Res., 21:787–802, 1993. John Cairns, Julie Overbaugh, and Stephan Miller. The origin of mutants. Nature, 335:142–145, 1988. Sherry M. Carty, Kodangattil R. Sreekumar, and Christian R.H. Raetz. Effect of cold shock on lipid a biosynthesis in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry, 274:9677–9685, 1999.
M.A. Castellini, J.M. Castellini, and P.M. Rivera. Adaptations to pressure in the rbc metabolism of diving mammals. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular & Integrative Physiology, 129:751–757, 2001. MM Cox, MF Goodman, KN Kreuzer, DJ Sherratt, SJ Sandler, and KJ Marians. The importance of repairing stalled replication forks. Nature, 404(3):37–41, 2000. Claire G. Cupples, Mila Cabrera, Chris Cruz, and Jeffrey H. Miller. A set of lacZ mutations in Escherichia coli that allow rapid detection of specific frameshift mutations. Genetics, 125:275–280, 1990. Claire G. Cupples and Jeffrey H. Miller. A set of lacZ mutations in Escherichia coli that allow rapid detection of each of the six base substitutions. Proceedings of the National Academy of Sciences, 86: 5345–5349, 1989. Kirill A. Datsenko and Barry L. Wanner. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli k-12 using pcr products. Proceedings of the National Academy of Sciences, 97: 6640–6645, 2000. P. Michael Davidson and Mark A. Harrison. Resistance and adaptation to food antimicrobials, sanitizers, and other process controls. Food Technology, 56:69–78, 2002. Leonardo Erijman and Robert M. Clegg. Reversible stalling of transcription elongation complexes by high pressure. Biophysical Journal, 75:453–462, 1998. Carlos Estrela, Cyntia R.A. Estrela, Eduardo Luis Barbin, Julio Cesar E. Spano, Melissa A. Marchesan, and Jesus D. Pecora. Mechanism of action of sodium hypochlorite. Brazilian Dental Journal, 13:113–117, 2002. Patricia L. Foster. Adaptive mutation in escherichia coli. Journal of Bacteriology, 186:4846–4852, 2004. Patricia L. Foster. Stress responses and genetic variation in bacteria. Mutation Research, 569:3–11, 2005. Myron F. Goodman. Error-prone repair dna polymerases in prokaryotes and eukaryotes. Annual Review of Biochemistry, 71:17–50, 2002. Anthony J.F. Griffiths, Jeffrey H. Miller, David T. Suzuki, Richard C. Lewontin, and M. Gelbart, William. An Introduction to Genetic Analysis. W. H. Freeman and Company, seventh edition, 2000. L.M. Guzman, D. Belin, M.J. Carson, and J. Beckwith. Tight regulation, modulation and high-level expression by vectors containing the arabinose pbad promoter. Journal of Bacteriology, 177:4121–4130, 1995. Takahito Hara, Jin Kouno, Kazuyo Nakamura, Kusaka Masami, and Masuo Yamaoka. Possible role of adaptive mutation in resistance to antiandrogen in prostate cancer cells. The Prostate, 65:268–275, 2005. Kristel J. A. Hauben, Douglas H. Bartlett, Carine C. F. Soontjens, Kris Cornelis, Elke Y. Wuytack, and Chris W. Michiels. Escherichia coli mutants resistant to inactivation by high hydrostatic pressure. Applied an Environmental Microbiolgy, 63:945–950, 1997. H. Hendrickson, E.S. Slechta, U. Bergthorsson, D.I. Andersson, and J.R. Roth. Amplifiaction-mutagenesis: evidence that "directed" adaptive mutation and general hypermutability result from growth with a selected gene amplification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 99:2164–2169, 2002. Megan N. Hersh, Rebecca G. Ponder, P.J. Hastings, and Susan M. Rosenberg. Adaptive mutation and amplification in Esherichia coli: two pathways of genome adaption under stress. Reseach in Microbiology, 155:352–359, 2004.
Jens-Peter Horst, Te hui Wu, and Martin G. Marinus. Escherichia coli mutator genes. Trends in Microbiology, 7:29–36, 1999. James A. Imlay and Stuart Linn. Mutagenesis and stress responses induced in Escherichia coli by hydrogen peroxide. Journal of Bacteriology, 169:2967–2976, 1987. P. David Josephy. The Escherichia coli lacZ reversion mutagenicity assay. Mutation Research, 455:71–80, 2000. Sheryl S. Justice, Jorge Garcia-Lara, and Lawrence I. Rothfield. Cell dividion inhibitors sula and minc/mind block septum formation at different steps in the assembly of the Escherichia coli division machinery. Molecular Microbiology, 37:410–423, 2000. C. Kato, H. Tamegai, A. Ikegami, R. Usami, and K. Horikoshi. Open reading frame 3 of the barotolerant bacterium strain dss12 is complementary with cydd in escherichia coli: cydd functions are required for cell stability at high pressure. Journal of Biochemistry (Tokyo), 120:301–305, 1996. T. Kawarai, M. Wachi, H. Ogino, S. Furukawa, K. Suzuki, H. Ogihara, and M. Yamasaki. Sula-independent filamentation of Escherichia coli during growth after release from high hydrostatic pressure treatment. Applied Microbiology and Biotechnology, 64:255–262, 2004. Sawami Kobayashi, Michael R. Valentine, Phuong Pham, Mike O’Donnell, and Myron F. Goodman. Fidelity of Escherichia coli dna polymerase iv. The Journal of Biological Chemistry, 227: 34198–34207, 2002. Lothar Leistner and Leon G.M. Gorris. Food preservation by hurdle technology. Trends in Food Science & Technology, 6:41–46, 1995. Mary-Jane Lombardo, Ildiko Aponyi, and Susan M. Rosenberg. General stress respnse regulator rpos in adaptive mutation and amplification in Escherichia coli. Genetics, 166:669–680, 2004. Yuqian Lou and Ahmed E. Yousef. Adaptation to sublethal environmental stresses protects Listeria monocytogenes against lethal preservation factors. Applied and Environmental Microbiology, 63: 1252–1255, 1997. Susan T. Lovett. Encoded errors: mutations and rearrangements mediated by misalignment at repetitive dna sequences. Molecular Microbiology, 52:1243–1253, 2004. Shelley L. Lusetti and Michael M. Cox. The bacterial reca protein and the recombinational dna repair of stalled replication forks. Annual Review of Biochemistry, 71:71–100, 2002. Shelley L. Lusetti, Oleg N. Voloshin, Ross B. Inman, and R. Daniel Camerini-Otero. The dini protein stabilizes reca protein filaments. The Journal of Biological Chemistry, 279: 30037–30046, 2004. Michael T. Madigan, John M. Martinko, and Jack Parker. Brock Biology of Microorganisms. Pearson Education, Inc, tenth edition, 2003. Andrew J. McBain, Ruth G. Ledder, Prem Sreenivasan, and Peter Gilbert. Selection for high-level resistance by chronic triclosan exposure is not universal. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 53:772–777, 2004. Michael McClelland, Kenneth E. Sanderson, John Spieth, Sandra W. Clifton, Phil Latreille, Laura Courtney, Steffen Porwollik, Johar Ali, Mike Dante, Feiyu Du, Shunfang Hou, Dan Layman, Shawn Leonard, Christine Nguyen, Kelsi Scott, Andrea Holmes, Neenu Grewal, Elizabeth Mulvaney, Ellen Ryan, Hui Sun, Liliana Florea, Webb Miller, Tamberlyn Stoneking, Michael Nhan, Robert Waterston, and Richard K. Wilson. Complete genome sequence of Salmonella enterica serovar
typhimurium lt2. Nature, 413:852–856, 2001. Gregory J. McKenzie, Reuben S. Harris, Peter L. Lee, and Susan M. Rosenberg. The sos response regulates adaptive mutation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 97:6646–6651, 2000. Gregory J. McKenzie, Peter L. Lee, Mary-Jane Lombardo, P.J. Hastings, and Susan M. Rosenberg. Sos mutator dna polymerase iv functions in adaptive mutation and not adaptive amplification. Molecular Cell, 7:571–579, 2001. Laura M. McMurry, Margret Oethinger, and Stuart B. Levy. Triclosan targets lipid synthesis. Nature, 394:531–532, 1998. Jeffrey H. Miller. Spontaneous mutators in bacteria. Annual Reviews in Microbiology, 50:625–643, 1996. Tohru Mizushima, Kazuhiro Kataoka, Yasuyuki Ogata, Ryu-ichi Inoue, and Kazuhisa Sekimizu. Increase in negative supercoiling of plasmid dna in Escherichia coli exposed to cold shock. Molecular Microbiology, 23:381–386, 1997. Noreen E. Murray. Immigration control of dna in bacteria: self versus non-self. Microbiology, 148:3–20, 2002. P. Man nas and R. Pagàn. Microbial inactivation by new technologies of food preservation. Journal of Applied Microbiology, 98:1377–1399, 2005. Haruo Ohmori, Errol C. Friedberg, Robert P.P. Fuchs, Myron F. Goodman, Fumio Hanaoka, David Hinkle, Thomas A. Kunkel, Christopher W. Lawrence, Zvi Livneh, Takehiko Nohmi, Louise Prakash, Satya Prakash, Takeshi Todo, Graham C. Walker, Zhigang Wang, and Roger Woodgate. The y-family of dna polymerases. Molecular Cell, 8, 2001. Antonio Oliver, Bruce R. Levin, Carlos Juan, Fernando Baquero, and Jesus Blazquez. Hypermutation and the preexistence of antibiotic-resistant Pseudomonas aeruginosa mutants: Implications for susceptibility testing and treatment of chronic infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 48:4226–4233, 2004. Thereza Christina Vessoni Penna, Priscila Gava Mazzola, and Alzira Maria Silva Martins. The efficacy of chemical agents in cleaning and disinfection programs. BMC Infectious Deseases, pages 1–16, 2001. Mats E. Pettersson, Dan I. Andersson, John R. Roth, and Otto G. Berg. The amplification model for adaptive mutation: Simulations and analysis. genetics, 169:1105–1115, 2005. Phuong Pham, Savithri Rangarajan, Roger Woodgate, and Myron F. Goodman. Roles of dna polymerases v and ii in sos-induced error-prone and error-free repair in Eschericia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 98:8350–8354, 2001. Sandra C. Powell and Roger M. Wartell. Different characteristics distinguish early versus late arising adaptive mutations in Eschericicha coli fc40. Mutation Research, 473:219–228, 2001. I. Prieto, Ana, Francisco Ramos-Morales, and Josep Casadesus. Bile-induced dna damage in Salmonella enterica. Genetics, 168:1787–1794, 2004. S.B. Primrose, R.M. Twyman, and R.W. Old. Principles of Gene Manipulation. Blackwell Science Ltd., sixth edition, 2001. Bai-Lin Qin, Gustavo V. Barbosa-Canovas, Barry G. Swanson, Patrick D. Pedrow, and Robert G. Olson. Inactivating microorganisms using a pulsed electric field conitnuous treatment system. IEEE Transactions on Industry Applications, 34: 43– 50, 1998. Javier Raso and Gustavo V. Barbosa-Canovas. Nonthermal preservation of foods using
combined processing techniques. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 43: 265–285, 2003. William A. Rosche, Patricia L. Foster, and John Cairns. The role of transient hypermutators in adaptive mutation in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 96:6862–6867, 1999. M.F. San Martin, G. V. Barbosa-Canovas, and B. G. Swanson. Food processing by high hydrostatic pressure. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 42: 627–645, 2002. E. Susan Slechta, Kim L. Bunny, Elisabeth Kugelberg, Eric Kofoid, Dan I. Andersson, and R. Roth, John. Adaptive mutation: General mutagenesis is not a programmed response to stress but results from rara coamplification of dinB with lac. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 100:12847–12852, 2003. E.S. Slechta, J. Harold, D.I. Andersson, and J.R. Roth. The effect of genomic position on reversion of a lac frameshift mutation (lacIZ33) during non-lethal selection (adaptive mutation). Molecular Biology, 44(4):1017–1032, 2002. Heather A. Thieringer, Pamela G. Jones, and Masayori Inouye. Cold shock and adaptation. BioEssays, 20:49–57, 1998. Brigette Tippin, Phuong Pham, and Myron F. Goodman. Error-prone replication for better or worse. Trends in Microbiology, 12:288–294, 2004. Joshua D. Tompkins, Jennifer L. Nelson, Jull C. Hazel, Stacy L. Leugers, Jeffrey D. Stumpf, and Patricia L. Foster. Error-prone polymerase, dna polymerase iv, is responsible for transient hypermutation during adaptive mutation. 2003. R.H. Valdivia and S. Falkow. Bacterial genetics by flow cytometry: rapid isolation of Salmonella typhimurium acid-inducible promotors by differential fluorescence induction. Molecular Microbiology, 22:367–378, 1996. J.L. van de Vossenberg, T. Ubbink-Kok, M.G. Elferink, A.J. Driessen, and W.N. Konings. Ion permeability of the cytoplasmic membrane limits the maximum growth temperature of bacteria and archae. Molecular Microbiology, 18:923–932, 1995. Phyllis A. Waite-Rees, Carole J. Keating, Laurie S. Moran, Barton E. Slatko, Linda J. Hornstra, and Jack S. Benner. Characterization and expression of the Escherichia coli mrr restriction system. Journal of Bacteriology, 173:5207–5219, 1991. Timothy J. Welch, Anne Farewell, Frederick C. Neidhardt, and Douglas H. Bartlett. Stress response of Escherichia coli to elevated hydrostatic pressure. Journal of Bacteriology, 175:7170–7177, 1993. Alan Williams. New technologies in food preservation and processing: Part ii. Nutrition & Food Science, 1:20–23, 1994.
