Hodnocení účinku cytostatik a inhibitorů histondeacetylázy na nádorové buňky in vitro T.Groh1,2, J.Hraběta1, T.Eckschlager1 1Klinika
dětské hematologie a onkologie, 2.LF UK a FN Motol a 2Katedra biochemie PřF UK, Praha
Nádory jsou velkým problémem současných rozvinutých zemí a jejich incidence stálé přibývá a mortalita příliš neklesá- úspěch tedy je. Proto se hledají stále nové léčebné postupy. Hitem sezóny je cílená (biologická léčba).
900 800
Incidence a mortalita na ZN v ČR
700 600 500 400 300 200 100
19 77 19 80 19 83 19 86 19 89 19 92 19 95 19 98 20 01 20 04 20 07 20 10
0
Možnosti léčby nádorů Operační pouze u
Chemoterapie
lokalizovaných
pouze chemosensitivní, mnoho nežádoucích účinků
optimum
Funguje omezeně
Hormonální pouze hormonálně dependentní
Radioterapie pouze
inky.
u lokalizovaných a radiosenzitivních
Cílená (biologická) Zatím příliš nefunguje. Moc drahá.
Pouzradiosenzitivní.
Cílená léčba • Cytostatika zabíjejí rychle rostoucí buňky, cílená léčba je zaměřená proti specifické struktuře nádorové buňky (nemusí být vždy specifická jen pro nádorové b.). • Detekce cíle této terapie je pilířem personalizované medicíny
HDACi • HDACi mají protinádorové a antiangiogenní účinky • HDACi potencují účinky cytostatikkterých? • Jaký je nejvhodnější protokol- před, spolu, po? • Pokusit se určit mechanismus.
HDACi
Valproát (VPA)
•
konvenčně používaný lék
•
antiepileptikum
•
stabilizér nálady
•
nízké dávky, dobře snášen
Valproát (VPA)
•
v posledních letech studován pro inhibici histondeacetyláz
•
indukuje diferenciaci a apoptózu nádorových buněk
VPA
http://www.rikenresearch.riken.jp/eng/frontline/5568 (22.3.2013)
Cisplatina (CDDP)
•
konvenčně používané cytostatikum
•
kovalentně se váže na DNA
•
inhibice replikace a trankripce
•
vede k neopravitelným změnám a následně k apotóze buněk
Etoposid (ETO)
•
konvenční cytostatikum
•
rostlinný alkaloid
•
derivát podophylotoxinu
•
Podophyllum peltatum
inhibitor topoisomerasy II –> dvouřetězcové zlomy ->apoptóza
Vinkristin (VCR)
• • •
konvenční cytostatikum rostlinný alkaloid váže se na dimery tubulinů -> brání tvorbě mikrotubulů dělicího vřeténka •„kontrolní cytostatikum“ neovlivňuje DNA
Metody • Buněčné linie odvozené od vysoce rizikového NBL • Testované látky: 1/ inhibitory histondeacetylázy valproáta (VPA) a trichostatinA (TSA); 2/ konvenční cytostatika cisplatina, etoposid, vinkristin • Detekce apoptózy cytometricky: 1/ vazba anexinuV a vstup PI; 2/ vazba značeného inhibitoru casp-3 • Dvouřetěžcové zlomy- detekce ϒH2AX- specifická protilátka • Buněčný cyklus- PI+ RNAza po permeabilizaci • Viabilita- MTT test (kolorimetrický průkaz redukce MTT na formazan)
Výsledky I •
nalezení vhodných koncentrací valproátu, etoposidu a cisplatiny
•
zjištění IC50
• •
za klasických kultivačních podmínek (normoxie, 21% O2)
za hypoxický kultivačních podmínek (1% O2) IC50 valproát (mM)
IC50 cisplatina (µM)
IC50 etoposid (µM)
Normoxie
Hypoxie
Normoxie
Hypoxie
Normoxie
Hypoxie
Exp. I
1,7
1,1
10,6
16,8
1,8
3,0
Exp. II
1,6
1,4
8,5
14,9
3,1
3,7
Exp. III
1,3
1,1
4,6
9,1
2,1
3,0
průměr
1,53
1,20
7,86
13,60
2,33
3,23
směr. odch.
0,17
0,14
2,50
3,28
0,56
0,33
Výsledky II •
testování 48h kokultivace 1mM VPA a 20µM CDDP či 8µM ETO
•
potenciace účinku cytostatik
100
100
90
90
80
80
viabilita %
viabilita %
0,2+1=3
70
60
70
60
50
50
40
40
K
VPA
CDDP
VPA+CDDP
K
VPA
ETO
VPA+ETO
Výsledky III •
testování 48h kokultivace 40nM TSA a 20µM CDDP či 8µM ETO
•
Indukce apoptózy trichostatinem A (TSA)
TSA je pan-HDAC inhibitor viabilita (%)
100
•
50 25 0 0
nedochází k potenciaci
25
50
100
200
koncentrace (nM)
100
100
90
90
viabilita (%)
viabilita (%)
75
80 70 60
80 70 60
50
50
40
40
K
TSA
CDDP
TSA+CDDP
K
TSA
ETO
TSA+ETO
Výsledky IV •
1mM VPA potencuje po 48h kokultivaci i téměř netoxickou
koncentraci 4µM CDDP 100
80
25 70
60
50
40
K
VPA
CDDP
VPA+CDDP
aktivita caspasy-3
viabilita (%)
90
20
15
10
5
0
K
VPA
CDDP
VPA+CDDP
Výsledky V různé sekvence kultivací 1mM valproátu a různých koncentrací etoposidu (MTT test IC50)
4
IC 50 (µM)
•
Potenciace
Inhibice
3
2
1
0 ETO/VPA+ETO VPA/VPA+ETO
ETO/VPA
0/VPA+ETO
0/ETO
VPA/ETO
Výsledky VI •
sledování viability buněk vystavených 24/48h kultivaci sekvencí 1mM VPA a 8µM ETO 100
viabilita (%)
80
60
40
20
0
K
ETO/ETO
0/VPA
ETO/0
ETO/VPA
VPA/0
0/ETO
VPA/ETO
Výsledky VII •
sledování viability buněk vystavených 24/48h kultivaci sekvencí 1mM VPA a 20µM CDDP 100
viabilita (%)
80
60
40
20
0
K
CDDP/CCDP
0/VPA
CDDP/0
CDDP/VPA
VPA/0
0/CDDP
VPA/CDDP
Výsledky VIII Kombinace CDDP, 1mM VPA, N, H, 24/48, viabilita 100
80
60 normoxia hypoxia
40
20
0 K
C/C
0/V
C/0
C/V
V/0
0/C
V/C
Výsledky IX
•
Dvouřetězcové zlomy DNA- hodnoceno průkazem
ϒH2AX, UV jako kontrola, VP-16 inhibitor topoizomerázy II
0,2 + 1 = 0,9
VPA potencuje jak účinek VP-16 tak částečně i UV
100 90 80
70 60 50 40 30 20 10 0 kont.
UV
VPA
UV+VPA
VP-16
VP-16+VPA
Výsledky X
• otestování valromidu (VPM) •
• •
analog VPA, účinkuje jako antiepileptikum neinhibije HDAC nalezení vhodné koncentrace VPM ~ 1mM VPA • 4mM VPM (popsáno i v literatuře) 120
100
80
60
40
20
0 K
1mM
3 mM
5 mM
8 mM
12 mM
Výsledky XI
•
testování 48h kokultivace 4mM VPM a 20µM CDDP • nedochází k ovlivění účinku • k potenciaci nutná inhibice HDAC 100
lehce protektivní efekt!
viabilita (%)
90
80
70
60
50
40
K
VPM
CDDP
VPM+CDDP
Diskuze •
• • • •
Neuroblastomová buňky jsou sensitivní vůči všem testovaným látkám (ETO, CDDP, VCR,VPA, VPM)
Jako nejefektivnější kombinace kultivací valproátu a etoposidu či cisplatiny se ukazuje kokultivace buněk VPA ovlivňuje děje v buňce po vazbě cytostatik (DNA reparační mechanismy, proapoptotické signály…?) Je mechanismus potenciace závislý na aktivitě HDAC (nefunguje s valpromidem, ale TSA nepotencuje)?
Mechanismus potenciace je spojený s DNA cíleným poškozením (nepotencuje VCR).
Závěr •
všechny použité látky jsou konvenčně používané v klinické praxi
•
klinicky relevantní koncentrace látek v experimentech, VPA lze dávat dlouhodobě
•
získané výsledky mohou pomoci vytvořit efektivnější protokoly léčby (nejen) neuroblastomů
. VPA potencuje účinky některých cytostatik
