10.Molekulární biofyzika mutagenů, kancerogenů a cytostatik Mutace – dědičná změna genotypu, jejíž molekulární podstatou je nukleotidová substituce, delece nebo inzerce. Nukleotidová substituce – výměna nukleotidů v nukleových kyselinách jednořetězcových nebo nukleotidových párů v nukleových kyselinách dvouřetězcových. Probíhá : a) transicí (Pu®Pu; Py®Py) b) transverzí (Pu®Py; Py®Pu). Substituce vede ke změně smyslu kodonu (např. TGG(Trp)®CGG(Arg.) nebo ke vzniku terminačního kodonu. Delece – ztráta jednoho nebo více nukleotidů z nukleotidové sekvence. Inzerce - vložení jednoho nebo více nukleotidů do nukleotidové sekvence. Mutace způsobená delecemi nebo inzercemi, které nejsou násobkem tří nukleotidů, mění čtecí rámec a oznečuje se jako posunová. Mutace mohou vznikat: • spontánně • působením vnějších faktorů, t.j. mutagenů (indukované mutace) Mutageny – fyzikální faktory (radiace, UV-záření) chemické látky (chemomutageny) Mutageny bývají též příčinami neoplastické transformace, např. jestliže se jimi aktivují protoonkogeny. Obecně se fyzikální a chemické faktory indukující kancerogenezi se označují jako kancerogeny.
Určení sekvence DNA
(sekvenační techniky a strategie) • enzymatická metoda (Sanger, 1977) • chemická degradace (Maxam and Gilbert, 1977) Enzymatická metoda-založena na syntéze DNA = enzymová terminační metoda • biochemický postup, založený na tvorbě fragmentů kontrolovaným přerušením biosyntézy jednoho z vláken analyzované DNA • využívá se k tomu schopnosti DNA-polymerázy I komplementárně kopírovat vlákno DNA • jde o napodobeninu procesu replikace s použitím deoxyribonukleozidtrifosfátů jako stavebního materiálu, z nichž jeden (obvykle ATP) obsahuje radioaktivní 32P v poloze α • současně se pridávají inhibitory polymerace, které kompetitivně inhibují inkorporaci vždy jednoho typu prekurzoru • užívají se analoga nukleotidů, nejčastěji arabinofostfáty a 3'-O-metyl-2'-deoxyribosylfosfáty • terminátory nemají vhodně umístěnou 3'-hydroxylovou skupinu pro připojení dalšího nukleotidu • v místě jejich inkorporace dojde proto k ukončení syntezy vlákna DNA • jsou-li inhibitory přidávány v dostatečně nízké koncentraci, dojde každé reakční směsi ke vzniku různě dlouhých fragmentů radioaktivní DNA se stejným počátkem (primerem) a končící stejný nukleotidem (ve skutečnosti jeho analogem – použitým terminátorem) • směsi se pak analyzují polyakrylamidovou elektroforezou s autoradiografickým vyhodnocením
Chemická degradace (Maxam – Gilbert) •
• • • • • • • • •
založena na radioaktivním znační fragmentů DNA a selektivním štěpením tohoto označeného štěpu sledem chemických reakcí fragment DNA se značí na 5'-konci v podmínkách in vitro používá se k tomu nejčastěji polynukleozidkinaza, která katalyzuje přenos radioaktivně značené γ-fosforylové skupiny z ATP na koncový 5'-hydroxyl jednonebo dvojvláknové DNA. označené vlákno se pak podrobí selektivnímu chemickému štěpení: modifikace báze, která tuto bázi labializuje, odstránení modifikované báze a posléze i zbylé roboty tím dojde k vypadnutí celého nukleotidu a k přerušení polydeoxyribonukleotidového řetězce. podmínky jsou voleny tak, aby nahodile jen na několika místech v celém řetězci DNA – používá se modifikace purinů dimetylsulfátem a pyrimidinů hydrazinem jednotlivými reakcemi se získávají fragmenty DNA končící v místech, kde byla v původním řetězci modifikovaná baze fragmenty se pak podrobí elektroforéze na polyakrylovém gelu, která se pak vyhodnotí autoradiografií k rozdělení dojde podle délky fragmentů z délky fragmentů a znalosti, u které báze štěpení nastalo, lze pak odvodit pořadí nukleotidů
Reakce mutagenů, kancerogenů a cytostatik Mutageny a kancerogeny: Podle reaktivity :
a) reagující s DNA přímo b) reagující s DNA až po metabolické aktivaci
Podle typu reakce s DNA:
a) váží se na DNA (kovalentně nebo interkalací) b) alkylují DNA c) ovlivňují párování basí deaminací nebo posunem v tautomerní rovnováze d) substituují alkylový zbytek za proton
Jednoduchá nealkylační činidla: -mohou přímo substituovat exocyklickou aminoskupinu nukleosidů budˇoxidativním mechanismem nebo přímým elektrofilním atakem. Také může dojít k adici na 5,6 dvojnou vazbu cytosinu nebo uracilu ( např.bisulfit, hydroxylamin, hydrazin). Hlavní působení: změna párování bází deaminací nebo posunem tautomerní rovnováhy.
Monofunkční alkylační činidla: -působením těchto látek dochází k alkylaci basí nukleových kyselin. Nejčastějším místem modifikace je N7 quaninu.
V některých případech může po reakci dojít i přerušení fosfodiesterové vazby a fragmentaci řetězce DNA. Do této skupiny se řadí také nitrosaminy, které pro své mutagenní působení vyžadují jednoduchou metabolickou aktivaci- vznikají reakcí sekundárních aminů s dusitany v kyselém prostředí (např. v žaludku):
Jsou považovány za jedny z nejvýznamnějších chemických karcinogenů pro člověka a uvedená reakce představuje mechanismus toxického působení dusitanů, které se dostávají do životního prostředí především nesprávným používáním průmyslových hnojiv.
Bifunkční alkylační činidla: - vytvářejí v DNA můstky mezi komplementárními řetězci. Další reakce těchto látek s DNA mohou vést také k depurinaci a k fragmentaci řetězce. Některé z těchto látek, halonitrosomočoviny (viz obr.), se používají také v terapii určitých nádorových onemocnění (Hodkinsova choroba, lymfomy a některé pevné nádory). Předpokládá se, že cytotoxické působení v nádorových buňkách je spojeno právě s tvorbou meziřetězcových můstků.
Cyklické alkylační sloučeniny: - do této skupiny patří řada mutagenů a kancrogenů, jejichž alkylační působení je spojeno s nestabilitou reaktivního cyklu v jejich struktuře. Některé z těchto látek se, zatím experimentálně, využívají také terapeuticky, např. cyklofosfamid, který je účinný proti řadě novotvarů) a 1,2 : 5,6-dianhydrogalaktitol, používaný k léčbě sarkomů.
Vinylhalidy a alkylkarbamáty: - nejvýznamnějším představitelem této skupiny je vinylchlorid, který je kancerogenní jak pro experimentální zvířata, tak pro člověka. Působení vinylchloridu vede ke vzniku nádorů jater, v menší míře také mozku a plic. Biologický efekt této látky souvisí s metabolickou aktivací mikrosomální P-450 monooxygenasou. Takto vznikají velmi reaktivní metabolity – chlorethylenoxid a chloracetaldehyd, které jsou oba mutagenní a kancerogenní (viz obr.).
Produkty, které vznikají při reakci těchto metabolitů s DNA:
Ethylkarbamát a vinylkarbamát mohou být metabolicky aktivovány na epoxidy, které reagují s adenosinem nebo cytidinem a poškozují tak RNA i DNA
Metabolické aktivace mutagenů a kancerogenů Některé kancerogenní a mutagenní látky působí takzvaně nepřímo, tj. samy o sobě nejsou kancerogenní, ale v organismu podléhají metabolickým procesům, jejichž meziprodukty a produkty se vyznačují vysokou kancerogenní účinností. Nejvýznamnější enzymatické dráhy, které jsou nejčastěji zodpovědné za metabolické aktivace kancerogenů, jsou reakce oxygenační. Tyto reakce jsou katalyzovány tzv. oxygenasami se smíšenou funkcí, které jsou označovány jako MFO systém ( z anglického názvu Mixed Function Oxygenases). Jejich název je odvozen od skutečnosti, že jeden z atomů molekuly kyslíku slouží jako akceptor elektronů (oxidázová funkce) a druhý se zabudovává do molekuly substrátu (oxygenázová funkce). Jako redukční činidlo slouží nejčastěji NADPH, odkud se přenášejí elektrony flavoproteinovým enzymem (FAD) na feredoxin a odtud na vlastní oxygenasu, kterou tvoří cytochrom P-450. Cytochrom P-450 je součástí oxygenas, katalyzující jak hydrolaci eobiotik (např. steroidů), tak cizorodých látek (detoxikace). Xenobiotické oxygenázy jsou obsaženy převážně v endoplasmatickém retikulu jaterních buněk. Typy reakcí katalyzovaných jaterními oxygenasami :
Vznikající meziprodukty (epoxidy, acetaldehydy) jsou často reaktivnější než výchozí látky a mohou reagovat nekontrolovaně s nukleofilními skupinami bílkovin nebo nukleových kyselin. V tomto případě biotransformační reakce nevedou k detoxikaci, ale naopak ke zvýšení toxicity. Takto se vysvětluje např. karcinogenita polycyklických aromatických uhlovodíků, viz. obr., které jsou sami o sobě málo reaktivní. Další enzymy, které se podílejí na metabolické aktivaci, jsou hydrolasy, např. epoxidhydrolasa, konjugační enzymy, např. glutation–S-transferasa, sulfontranferasa, aj.
Reakce metabolicky aktivovaných kancerogenů s nukleovými kyselinami: Metabolickou aktivací polycyklických aromatických uhlovodíků vznikají vysoce reaktivní epoxidy, peroxidy a aldehydy, které se váží na báze nukleových kyselin a vytváří tak na DNA i RNA adukty. Příklady některých takovýchto aduktů: :
Přirozeně se vyskytující kancerogeny Kromě látek, které se vyskytují v životním prostředí uměle, jako důsledek lidské činnosti (průmysl, zemědělsví), existují i některé přírodní látky, které mají prokazatelný mutagenní, popř. kancerogenní účinek. Jsou to především produkty metabolismu hub a v některých případech i rostlin. Do této skupiny látek patří zejména aflatoxiny, které jsou produkovány některými druhy plísní, zvláště Aspergillus flavus. Také aflatoxiny vyžadují pro své kancerogenní působení metabolickou aktivaci jaterním mikrosomálním MFO systémem.Další příklady přirozeně se vyskytujících kancerogenů : sterigmatocystin produkovaný zástupci rodu Aspergillus, Penicillium a Bipolaris, a safrol a estragol, které jsou rostlinného původu.
Experimentální přístupy ke studiu mutageneze / kancerogeneze: •in vivo -testy na zvířatech (myši, potkani) • in vitro – v bakteriální kultuře nebo v lidských tkáňových kulturách •Amesův test ( Bruce Ames, 1975) - bakterie Salmonela – test mutagenicity
savčí buňky deficience enzymů hypoxantinfosforybosyltransferasy nebo thimidinkinasy (přídavek 6-thioguaninu nebo 8-azaguaninu do media)
• •
do skumavky – jaterní extrakt + testovaná chemická látka + 105 bakterii salmonela pertriho miska s agarom- vyočkování, inkubace (37°C, 2-3 dny), vznikají kolonie s mutací (i bez živné půdy) → mutagenicita látky – čím víc kolonii tím kancerogennější látka
Cytostatika: Metody léčby nádorových onemocnění
•chirurgie • radioterapie • chemoterapie Moderní chemoterapie začala zavedením metylchloraminu při léčbě Hodgkinsonovy nemoci a stilboestrolu a dalších steroidů při léčbě nádorů prostaty. Úspěchy nastartovaly mohutný vývoj nových látek, používaných k léčbě různých typů nádorů. V současnosti předchází zavedení léčiva do klinické praxe rozsáhlé testování uspořádané do několika fází, zahrnující sledování toxicity a vlivu na různé orgány u laboratorních zvířat, podmínek dávkování, charakterizace reakcí na chemoterapeutika podávaná pacientům s různými typy onemocnění, zjištění spektra nádorů, citlivých na léčbu daným chemoterapeutikem a konečně porovnání účinků nového preparátu s dosud nejúspěšnějším způsobem léčby konkrétního nádoru. Klasifikace chemoterapeutik: Během posledních dvaceti let bylo vyvinuto široké spektrum klinicky účinných léčiv. Některá chemoterapeutika působí přímo na nádorové buňky, některá musí být nejprve metabolicky aktivována, budˇ přímo v buňkách nádoru, nebo v orgánech jako jsou např. játra. •alkylační činidla ( cyklofosfamid, melphalan, chlorambucil,..) • antimetabolity ( methotrexat, 6-merkaptopurin, thiogunin, 5-fluoruracil,....) • rostlinné alkaloidy ( vinblastin, vinkristin,...) • antibiotika (actinomycin D, doxorubicin, bleomycin, daunorubicin, mitomicin C,..) • nitrosomočoviny (carmustin, lomustin, semustin,...) • enzymy (L-asparaginasa) • další látky ( cisplatina, hydroxyurea, dakarbazin, dibrommanitol,...) Dnes známá chemoterapeutika tvoří velice rozsáhlou a heterogenní skupinu látek. Chemoterapeutika je možno rozdělit do dvou základních tříd podle toho, zda působí na dělící se nebo nedělící se buňky. Ty z nich, které působí na dělící se buňky rozdělujeme dále podle schopnosti ovlivňovat budˇ jen jednu, specifickou fázi buněčného cyklu, a nebo zda působí na celý cyklus nebo většinu jeho fází. S množstvím vědomostí o dělení buněk rostlo také množství látek, schopných do těchto procesů zasáhnout. Poznávání mechanismů působení chemoterapeutik vede k jejich stálému zdokonalování. Klasifikace cytostatik, založená na principu jejich působení
Farmakologie hlavních skupin chemoterapeutik: Alkylační činidla Základní látkou této skupiny látek je dusíkatý yperit („nitrogen mustard“) obsahující vysoce reaktivní etylaminovou skupinu, která atakuje nukleofilní skupiny biomakromolekul, zvláště DNA. Interaguje s N7 guaninu, čímž mění strukturu dvojšroubovice DNA. Tvoří také meziřetězcovémůstky, které zabraňují replikaci DNA a mitose. Různými chemickými modifikacemi této látky se získává řada účinných látek s nižšími toxickými účinky. Do této skupiny patří také cyklofosfamid, zmíněný v kapitole o alkylačních reakcích mutagenních látek. Antimetabolity Jeden z nejúspěšnějších zástupců této skupiny, metotrexát, se nevratně váže na enzym dihydrofolát reduktázu a ve svém důsledku způsobuje zpomalení syntézy DNA, nezbytné pro buněčné dělení. Dalším vysoce rozšířeným antimetabolickým terapeutikem je cytosin arabinosid, používaný, podobně jako methotrexát, v případech akutní leukémie. K léčbě pevných nádorů byl syntetizován 5-fluorouracil, účinný zejména proti nádorům žaludku a tlustého střeva. Léčiva odvozená od přírodních látek Řada účinných látek byla izolována z přírodních zdrojů: z bakterií (doxorubicin, aktinomycin D, atd.) a také z rostlin (vinkristin, etoposid, taxol, atd). Doxorubicin a daunorubucin jsou antracykliny působící zejména proti topoizomeráze II. Vinca alkaloidy, vinkristin a vinblastin, negativně působí na dělící vřeténko během mitózy. Všechny tyto typy látek jsou účinné proti hematologickým nádorům, ale také proti nádorům varlat a malobuněčným nádorům plic. Další látky Nejznámějším zástupcem této skupiny je cisplatina (cis-diammindichloroplatntý komplex, obr.) používaná převážně při léčbě nádorů varlat a vaječníků. Vývoj chemoterapeutik na bázi platiny začíná Rosenbergovým objevem, kdy byl v elektrolytu s platinovými elektrodami inhibován růst bakterií. Později se ukázalo, že se podobný efekt projevuje také u savčích buněk a platinové komplexy se začaly používat při léčbě některých nádorových onemocnění člověka.
Cisplatina The story of the invention of the anticancer drug cisplatin is a story of chemistry hidden in the science of biology. The story begins in 1961 with an experiment designed to elucidate the effect of electric fields on the bacterial growth of E. coli. A young physics professor named Barnett Rosenberg had long been intrigued by microphotographs depicting the process of cell division, called mitosis. These photographs reminded him of a natural physical phenomenon: the magnetic dipole field created when one places iron filings over a bar magnet. The field lines created by magnets have the same shape as those created by electricity between two equal and opposite point charges Normal and elongated E. coli: (a) scanning electron microphotograph of (normal E. coli Gram-negative rods); (b) scanning electron microphotograph of E. coli grown in medium containing a few parts per million of cisdiamminedichloroplatinum(II). Same magnification in both pictures. The platinum drug has inhibited cell division, but not growth, leading to long filaments. (Courtesy of D. Beck) Reprinted with permission. The serendipitous result of this experiment was that it was not the electric fields that inhibited bacterial growth but rather a platinum containing complex that later came to be known as cisplatin (OBR.) A group of researchers at Michigan State University subsequently found that cisplatin could also be used to inhibit the growth of cancer cells. For the past twenty years, cisplatin has proven to be highly effective for the treatment of various cancers, particularly testicular cancer. Time sequence photographs of two mice with solid Sarcoma 180 tumors. The mouse at the top was an untreated negative control. She died on day 21 when the tumor weighed about 3g. The bottom mouse was in the group treated on day 8 with an intraperitoneal injection of cis-diamminedichloroplatinum(II). Her tumor was completely regressed six days after treatment, and she died of age-related causes almost 3 years later.
Klinické studie Veškeré přírodní i syntetické látky, které mají předpoklady k využití v protinádorové terapii, musejí být nejdříve podrobeny pečlivému testování, zpravidla na laboratorních zvířatech. Testovací studie rozdělujeme do tří fází: Fáze I - zkoumá se nejvhodnější použití, farmakokinetika - cesty a rychlost exkrece látky, toxicita a vedlejší efekty. U pacientů, kteří již prodělali všechny běžné procedury, můžeme přistoupit do fáze II k dalšímu testování nové látky. Fáze II - je zaměřena na klinické vlastnosti a spektra působnosti testované látky, která je podávána na základě zjištění z fáze I pacientům s různými typy onemocnění. Fáze III - předchází zavedení látky do klinické praxe. Porovnává se účinek nové látky s dosud nejúčinnější používanou metodou. Stanovuje se celkový přínos a efektivita léčby vzhledem k počtu sledovaných pacientů a doby potřebné k uzdravení.
DNA as a target The target may be defined as a site within the cell which is altered by the drug and whose modification leads to cell death. Platinum complexes are electrophilic and may react with many cellular components. Only a few of these lesions, those which lead to cell death, can be considered the target. Examples of experimental criteria showing that the fixation of cisplatin on DNA is responsible for the cytotoxicity of this drug: 1. The drug is bound to the target at pharmacological doses. It has been shown that among major biomacromolecules (DNA, RMA, proteins) only DNA contains at least one Pt atom when cultured cells are exposed to a dose of cisplatin which produced one mean lethal event per cell. 2. The function of the target and no other is preferentially inhibited. For instance, cisplatin treatment causes selective and irreversible inhibition of DNA synthesis. 3. Mutants which alter the nature or function of the target have altered sensitivity of the drug. For instance, cells which are deficient in DNA repair are more sensitive to cisplatin. 4. Pharmacological structure-activity relations is observed at the level of the target. For instance, when bacteria are treated with drugs at concentrations which produce equal numbers of DNA lesions, cisplatin inhibits DNA synthesis to a greater extent than the inactive trans isomer or dienPt. 5. Synergism and antagonism of the effect of the drug by other agents may be observed at the level of the target. For example, pretreatment of DNA with cisplatin increases the effect of a synergistic agent, ionizing radiation, on the conformation of DNA in vitro. An antagonist, thiourea, inhibits cytotoxicity, restores DNA replication and blocks the formation of bifunctional Pt-DNA lesions.
Selective and irreversible inhibition of DNA synthesis
ohyb: rozvinutí:
32-34° 16-20°
45° 79°
Cisplatina-mechanismus působení
Analoga cisplatiny
OBRÁZKY (jen) Activace trans-geometrie v platinových komplexch Polynukleární protinádorově účinné platinové komplexy Protinádorově účinné komplexy ruthenia Cílené působení cytostatik
Oprava poškození DNA v savčích buňkách Jako hlavní obranný mechanismus buňky proti poškození DNA slouží opravné mechanismy DNA. Tyto procesy probíhají ve všech organismech, včetně bakterií. Cílem opravných mechanismů je minimalizovat poškození DNA v buňce, ke kterému dochází vlivem spontánních mutací, chyb při replikaci i vlivem působení vnějšího prostředí a zachovat tak stabilitu genomu. Téměř každé poškození DNA je pro buňku škodlivé. Je tedy nezbytné zredukovat tyto defekty na co možná nejnižší, tolerovatelnou mez. Význam oprav DNA je zřejmý z následujících faktů: • DNA je jediná biomolekula která je v případě poškození opravována. Všechny ostatní jsou nahrazovány, tj. poškozené molekuly jsou degradovány a jsou nahrazeny jinými, nově syntetizovanými molekulami• oprav DNA se účastní více než 100 genů, dokonce i v organismech s velmi malými genomy • Cancer is caused by mutations. In most cases, "genetic instability" (elevated mutation rate) is required to permit accumulation of sufficient mutations to generate cancer during a human lifetime. DNA repair mechanisms promote genomic stability and prevent cancer. Many, perhaps most, cancers are at least partially attributable to defects in DNA repair. Molekula DNA, podobně jako všechny ostatní biomolekuly, může být poškozena různými způsoby. Spontánní poškození díky replikačním chybám, deaminaci, depurinaci a oxidaci je v reálném světě doplněna vlivem radiace a chemikálií přítomných v životním prostředí. Možností, jakým způsobem může být DNA poškozena, je celá řada. Protože opravný systém musí být schopen rozpoznat a odstranit velký počet rozdílných poškození, není překvapivé, že také existuje řada rozdílných typů opravných systémů. Typy oprav DNA Ačkoli buňky disponují širokým počtem rozličných typů opravných systémů, z nichž každý je relativně specifický pro určitý typ poškození DNA, tyto reparační systémy mohou být rozděleny do čtyř širších kategorií: • Úplné opravy, tj. přímé odstranění poškození a oprava poškozeného místa na původní stav. Uskutečňují se např. fotoreaktivací nebo dealkylací. • Excisní opravy, tj. vyštěpení poškozené oblasti v DNA. Do této skupiny patří např.: bázová excisní oprava nukleotidová excisní oprava oprava chybného párování • Opravy dvouřetězcových zlomů • Tolerantní opravy, které spočívají v obnově funkce DNA, aniž by z ní bylo odstraněno původní poškození. Při této opravě se poškození v matrici obchází replikací nebo rekombinací.
Přímé odstranění poškození Nejlépe prostudovaným mechanismem z této skupiny oprav je fotoreaktivace cyklobutanpyrimidinových dimerů (CPD) enzymem, nazývaným CPD fotolyáza . CPD fotolyáza obsahuje dva chromofory, které absorbují světelnou energii. Ve všech takovýchto fotolyázách je jedním z chromoforů FADH- a druhým je buď methenyltetrahydrofolát (MTHF) nebo 8-hydroxy-5deazaflavin (8-HDF). MTHF a 8-HDF působí jako primární absorbér světelné energie (na obrázku označený zeleně), který předává energii FADH- (označený žlutě). Energie z FADHje poté využita k rozštěpení dimeru. CPD fotolyázy byly nalezeny u bakterií, hub, rostlin a mnoha obratlovců, ale nikoliv u placentálních savců. Naopak 6-4 fotolyáza (která opravuje 6-4 fotoprodukty) byla nalezena u hmyzu, plazů a obojživelníků, ale ne u E. coli, kvasinek nebo savců. Dalším příkladem přímých oprav je oprava O6-methyl guaninu eliminací methylové skupiny z DNA a její přesunem na cystein v enzymu nazývaném O6-methylguanin-DNA methyltransferáza. Tento protein je zřejmě přítomen ve všech živých organismech. Jakmile dojde k přenosu methylu na enzym, je tento protein trvale deaktivován (neboť methylcystein je velmi stabilní) a další oprava tedy vyžaduje syntézu nových molekul proteinu. Protože každá molekula O6-methylguanin-DNA methyltransferázy je takto použita jen jednou a je spotřebována při reakci, nejedná se o skutečnou katalýzu a o pravý enzym. Třetí příklad přímé opravy je zprostředkován proteinem AlkB, což je bílkovina, která byla nalezena ve většině, možná ve všech živých organismech, včetně lidí. Tento protein patří do skupiny enzymů nazývaných α-ketoglutarát-dependentní a Fe(II)-dependentní oxygenázy („αKG-Fe(II)-oxygenases“), které využívají Fe2+a jeho oxo-meziproduktů k oxidaci chemicky inertních sloučenin. V tomto procesu je α-ketoglutarát přeměněn na sukcinát a CO2, což je krok totožný s jedním stupněm Krebsova cyklu. AlkB je schopen provést reverzní methylaci v pozici N1 u adeninu a pozici N3 u cytosinu
Reakce katalyzovaná AlkB je tedy oxidativní dekarboxylace α-ketoglutarové kyseliny spřažená s hydroxylací methylové skupiny. Methylová skupina se pak spontánně rozkládá na formaldehyd a tím se obnoví původní báze v DNA Poslední příkladem přímé opravy je uzavření zlomů v DNA pomocí DNA ligázy. DNA ligáza může uzavřít pouze ty zlomy, které mají 5´- fosfát a 3´- hydroxyl. Zlomy s jinými konci nebo zlomy doprovázené dalším poškozením, aťˇuž cukr-fosfátové kostry DNA nebo báze vyžadují mnohem komplikovanější excisní opravný mechanismus.
Excisní opravy Hlavní opravný mechanismus využívá skutečnosti, že DNA je dvouřetězcová molekula a stejná informace je uložena v obou řetězcích. Díky tomu v případech, kdy poškození je přítomno pouze v jednom řetězci, může být poškozený řetězec správně opraven vystřižením (excizí) poškozeného místa a nahrazením novou DNA, syntetizovanou s využitím komplementárního řetězce jako templátu. Všechny organismy, eukaryota i prokaryota, využívají nejméně tří excisních mechanismů: oprava chybného párování, bázová excisní oprava a nukleotidová excisní oprava. Oprava chybného párování („mismatch repair“ (MMR)) - Korekce nepárových nukleotidů a malých smyček Mechanizmus tohoto typu opravy by nejdůkladněji prostudován u bakterií E.coli. proteiny, které iniciují opravný proces jsou proteiny MutS, MutL, a MutH: Většina nepárových míst v DNA vzniká díky replikačním chybám, avšak tato poškození mohou být způsobeny jinou příčinou, např. deaminací 5´-methylcytosinu za vzniku thyminu nesprávně párovaným s G. Bez ohledu na mechanismus vzniku jsou tato poškození opravována jen jedním opravným mechanismem. v některých případech mohou být špatně spárovaná místa v DNA opravena také pomocí DNA-N-glykosylázy, tj. bázovou excisní opravou.
Špatně spárované místo vyvolává v DNA strukturní distorzi. MutS rozpoznává tyto místa (a také inzerce/delece do 4 nukleotidů) a váže se na ně. Komplex DNA-MutS Je stabilizován vazbou proteinu MutL. DNA E.coli je normálně methylovaná v sekvencích GATC, ale nově syntetizovaná DNA není ihned methylována. Skutečnost, že původní „starý“ řetězec se v blízkosti replikační vidličky od nově nasyntetizovaného liší právě methylací, umožňuje E.colirozlišit mezi „starým“ (pravděpodobně správným) a nově syntetizovaným řetězcem (pravděpodobně nesprávným díky replikačním chybám). Komplex MutS-MutL aktivuje protein MutH, který najde nejbližší methylovou skupinu a rozštěpí nově syntetizovaný řetězec naproti této methylové skupině. Excise je dokončena díky kooperaci dvou dalších proteinů, UvrD (helikáza II) – rozvíjí DNA od místa rozštěpení ve směru k nepárovému –a exonukleázy specifické pro jednořetězcovou DNA. Následuje resyntéza (nová syntéza pomocí DNA- polymerázyIII a ligace DNA ligázou). Ačkoli eukaryontní organismy postrádají proteiny homologní proteinům MutH and uvrD, disponují celou řadou bílkovin homologních MutS a MutL:
V lidských buňkách byly nalezeny dva heterodimery proteinů homologních k MutS. Jeden z těchto dimerů, MSH2/MSH6, se nazývá MutSα a druhý, MSH2/MSH3, je označován jako MutSβ. První z těchto heterodimerních proteinů přednostně rozpoznává chybně spárovaná místa v DNA, druhý primárně rozpoznává smyčky o rozsahu 1-40 basí. Jsou známy také tři dimerní proteiny homologní k MutL. Jeden z nich je složen z MLH1 a PMS1(kvasinky)/PMS2(lidské buňky) a nazývá se MutLα. Druhý dimer se skládá z molekul proteinů MLH1 a PMS1 a je označován jako MutLβ. Třetí z těchto opravných proteinů obsahuje proteiny MLH1 a MLH3. MutLα může spolupracovat s MutSα a s MutSβ. Role dalších dvou dimerů homologních k MutL není doposud zcela známa. K opravě chybného párování přispívají nejméně dvě nukleázy, exonukleáza 1 (5' → 3') a Flap Endonucleáza (FEN-1 nebo DNáza IV; Rad27 u S. cerevisiae). Přesná role exonukleáz nebyla dosud plně objasněna.
V eukaryotických buňkách hrají důležitou roli v procesu opravy chybného párování také některé replikační proteiny. Protein označovaný jako PCNA, kofaktor mnoha DNA polymeráz, je nezbytný pro stabilizaci MutS a MutL v místech poškození a také se účastní syntetického kroku opravy. Pro tuto syntézu je také nezbytný protein RPA, který hraje důležitou roli také v nukleotidové excisní opravě, replikační faktor C a DNA polymeráza delta. Bázová excisní oprava Dráha, která se nejčastěji využívá k odstranění nesprávných bází (jako např. uracil) nebo poškozených bází (např. 3-methyladenin) se nazývá bázová excisní oprava, ačkoli existuje celá řada variací tohoto procesu, každá specifická pro odlišný typ nesprávné báze. Všechny tyto procesy mají však některé společné obecné rysy a každý může být rozdělen do tří kroků, z nichž kroky 2 a3 jsou stejné pro všechny varianty bázové excisní opravy. 1. Odstranění chybné báze příslušnou DNA N-glykozylázou a vytvoření apurinového/apirimidimového místa (AP-místo). 2. Rozštěpení poškozeného řetězce pomocí AP- endonukleázy tak, že vznikne zlom s 3'-OH koncem a 5´-fosfátovým koncovým zbytkem. 5´-fosfátový koncový zbytek je pak vyštěpen DNA-deoxyribofosfodiesterázou (dRpáza) 3. Zaplnění výsledné jednonukleotidové mezery od 3'-OH konce, což je realizováno DNA-polymerázou a následně ligázou. Specificita rozličných opravných drah souvisí s DNA N-glykosylázami. Tyto enzymy katalyzují hydrolýzu N-glykosydické vazby mezi bazí a deoxyribosou, jak je ukázáno na tomto obrázku na příkladu funkce uracil-N-glykozylázy: .
Vzniklé AP –místo je identické jako místo v DNA vzniklé spontánní depurinací nebo depyrimidinací
Doposud bylo nalezeno velké množství DNA N-glykosyláz. Významná je abundance glykozyláz specializovaných na odstranění U. Ačkoli pár U:A není mutagenní, přítomnost U namísto T mění afinity proteinů vázajících se na DNA. Z toho důvodu je odstranění U párovaného s A důležité pro správnou funkci buněčných procesů. Obdobné glykosylázy byly nalezeny také u dalších organismů. C-koncová oblast eukaryotických glykosyláz je obvykle velmi podobná glykosylázám prokaryotickým, ale eukaryotické glykosylázy mají často navíc sekvenci aminokyselin na N-konci, která je důležitá pro určení intracelulární lokace a pro interakci s dalšími proteiny.
Glykosylázy jsou většinou monomerní enzymy, některé z nich vyžadují pro svou funkci bivalentní kation jako kofaktor. Velká většina těchto enzymů je úzce specifická pro daný typ pozměněné báze. V současné době je známa přesná krystalová struktura mnoha glykosyláz. Všechny jsou si vzájemně velmi podobné, což ukazuje na obdobný způsob, jakým uskutečňují svoji aktivitu. Ukazuje se, že DNA-glykosylázy svírají ( skřípnou) DNA, což vede ke vzniku ohybu v místě nestability DNA vyvolané nesprávným párováním. Tento ostrý ohyb v DNA spolu s dalším tlakem enzymu způsobí, že příslušná báze se vytočí z dvoušroubovice DNA a dostane se do kontaktu s vazebným místem. Jestliže konformace vazebného místa odpovídá struktuře dané báze, zůstává tato báze v kontaktu v vazebným místem dostatečně dlouho, aby mohlo dojít k vyštěpení. Kromě toho některé glykosylázy mají také AP lyázovou aktivitu , která umožňuje štěpení na 3‘ konci apurinovaného místa. Štěpení probíhá na vazbě mezi uhlíkem a kyslíkem, nikoli mezi kyslíkem a fosforem, se tato aktivita označuje jako lyázová, nikoli endonukleázová. Bez ohledu na to, zda příslušná glykosyláza je schopna i lyázové aktivity, dalším krokem v bázové excisní opravě je katalyzován AP endonukleázou, která štěpí cukrfosfátovou kostru DNA na 5‘ straně AP místa. Nejlépe charakterizovaná AP endonukleáza je enzym izolovaný z E. coli nazývaná „exonukleáza III.“ Po mnoho let se předpokládalo, že hlavní funkcí toho enzymu in vivo je 3‘®5‘ exonukleázová a fosfatázová aktivita. Nyní je však jasné, že AP endonukleázová aktivita exonukleázy III je neméně důležitá a ve skutečnosti je odpovědná za 90% všech AP endonukleázových štěpení, které v buňce probíhají. Zbývajících 10% je katalyzováno dalším enzymem, endonukleázou IV. Podobné enzymy byly také nalezeny v eukaryotních organismech. V kvasinkách S. cerevisiae je hlavní AP endonukleáza podobná endonukleáze IV, v lidských buňkách jsou však více zastoupeny endonukleázy podobné exonukleáze III Následující diagram shrnuje počáteční děje bázové excisní opravy, od vzniku poškození po působení AP endonukleázy. Jako příklad glykosylázy postrádající AP lyázovou aktivitu je použita DNA N-glykosyláza, příkladem pro enzym s kombinovanou glykosylázovou a lyázovou aktivitou je NTH1 enzym. V tomto druhém případě je poškozenou bazí thyminový glykol, který je zobrazen jako T se dvěma OH skupinami. Lyázová aktivita umožní otevření deoxyribózového cyklu v AP místě, za vzniku aldehydického ukončení uhlíkového řetězce.
V obou těchto případech po štěpení AP endonukleázou je horní řetězec na levé straně od štěpného místa ukončen 3‘-OH skupinou a tak může být vzniklý zlom spojen polymerázou. V druhém případě kombinace funkcí lyázy a AP endonukleázy vyštěpila abasickou deoxyribózu za vzniku mezery, který může být snadno vyplněn polymerázou a ligázou. Obrázek ukazuje tento proces s využitím b-polymerázy, která je hlavní polymerázou účastnící se bázové excisní opravy v savčích buňkách.
DNA polymeráza b má v savčích buňkách dvě odlišné enzymatické funkce. Polymerázová aktivita slouží k vložení správného nukleotidu do AP místa, poté dojde, s využitím nedávno objevené deoxyribózafosfatázové aktivity (dRPáza) k odštěpení 2'deoxyribóza-5'-fosfátu, jak je znázorněno na obrázku. Závěrečný krok bázové excisní opravy, tj. ligace, je pak v savčích buňkách uskutečněna s pomocí DNA ligázy III ve spolupráci s proteinem ERCC1. Tyto metabolické dráhy jsou využívány v případě, že poškození je omezeno pouze na jeden nukleotid. V savčích buňkách, ale také v kvasinkách, je možná také alternativní dráha, která je znázorněna na obrázku a která zahrnuje syntézu úseků DNA o délce několika nukleotidů pomocí polymeráz d a e za spoluúčasti dalších proteinů.
Nukleotidová excisní oprava Ačkoli bázová excisní oprava, která byla popsána v předchozí kapitole, je pro buňku zcela zřejmě velmi důležitá, je není tento opravný mechanismus dostatečný k odstranění všech typů poškození DNA. Aby dané poškození mohlo být opraveno bázovou excisní opravou, musí existovat specifické glykosyláza schopná rozpoznat právě tento typ poškození. Široké pole DNA-reaktivních chemických sloučenin, které se nacházejí v našem životním prostředí spolu s radioaktivním zářením a oxidativním poškozením DNA mohou vyvolat tak mnoho různých typů poškození DNA, že evoluční vývoj tolika typů glykosyláz, z nichž každá by byla specifická pro daný typ poškození, by byl velmi obtížný, ne-li nemožný. Naštěstí se v živých organismech vyvinul jiný, mnohem flexibilnější opravný mechanismus, nazývaný nukleotidová excisní oprava („nucleotide excision repair“, NER), který rozpoznává poškozené oblasti v DNA na základě jejich pozměněné struktury Ve všech organismech zahrnuje NER následující kroky: 1.rozlišení poškození 2.navázání multiproteinového komplexu na poškozené místo 3.Dvojnásobné štěpení poškozeného řetězce (na 5’ä 3‘ straně) v místě vzdáleném několik nukleotidů od poškození 4.Odstranění vyštěpeného oligonukletidu obsahující poškozené místo 5.Zaplnění vzniklé mezery pomocí DNA polymerázy 6.Ligace Mechanismus, kterým je oligonukleotid obsahující poškození odstraněn, není dosud znám. Pravděpodobně v této funkci pomáhají helikázy XPB/XPD. V každém případě, po odstranění vyštěpeného oligonukletidu je výsledná mezera zaplněna DNA polymerázou epsilon nebo delta, za pomocí PCNA, a oba konce DNA jsou spojeny DNA ligázou I
NER a lidské genetické choroby Geny kódující mnoho lidských NER proteinů byly poprvé identifikovány díky genetickým studiím lidské choroby související s chybnou opravou DNA, označované názvem Xeroderma pigmentosum (XP). Ukázalo se, že ke vzniku této choroby vede mutace jednoho ze sedmi genů (XPA-XPG). Kromě XP byly identifikovány ještě další dvě choroby, způsobené defektem v genech souvisejících s opravnými procesy DNA. Jsou to Cockayne's syndrome (CS) a trichothiodystrofie (TTD). Ačkoli všechny tyto 3 choroby jsou způsobeny chybou v opravě DNA, mají velmi rozdílné klinické projevy. Pacienti s XP mají: •vysokou citlivost na světlo •značné poruchy pigmentace •časté neurologické poruchy •ve vysoké míře se velmi časně vyvíjí rakovina kůže •zvýšená frekvence jiných forem rakoviny Cockayne's syndrom se projevuje: •v některých případech citlivost na světlo •neurologické abnormality •časná smrt v důsledkem neurodegenerace
Pacienti s trichothiodystrofií vykazují: •křehké vlasy deficientní na síru •obličejové abnormality •malý vzrůst •ichthyóza (šupiny na kůži podobné rybím) •asi v 50% případů vysokou citlivostí na světlo Za povšimnutí stojí, že příznaky jednotlivých chorob se téměř nepřekrývají. Pacienti s CS a TTD nemají vyvinuty nádory kůže, a jejich pokožka se jeví relativně normální ve srovnání s rudou, jakoby opařenou kůží s pigmentovými skvrnami pacientů s XP. Jak je možné, že všichni tito pacienti mající defekty v NER přesto vykazují tak rozdílné symptomy? Oprava dvouřetězcových zlomů Dvouřetězcové zlomy jsou opravovány přinejmenším dvěma rozdílnými mechanismy. Jeden mechanismus využívá proteinů, které se účastní homologní rekombinace a informace ze sesterských nebo homologních chromosomů pro správnou opravu zlomů. Další mechanismus umožňuje spojení konců i v případě, že je mezi nimi jen omezená sekvenční podobnost. Tento druhý proces se nazývá nehomologní spojování konců (non-homologous end joining, NHEJ) Oprava dvouřetězcových zlomů homologní rekombinací Mechanismus opravy zlomů v obou řetězcích dosud není ještě zcela prostudován. Je však známo, že pro tento proces jsou důležité proteiny kódované geny z epistatické skupiny RAD52 u S. cerevisiae nebo jejich homology u jiných eukaryontních organismů. Jsou to především proteiny RAD51, RAD52, RAD54, RAD55, RAD57 a RAD59. Klíčovým pro celý proces je protein RAD51. Tento protein obsahuje centrální doménu která se poněkud podobá RecA proteinu z E.coli. RecA tvoří nukleoproteinový komplex s jednořetězcovou DNA. Když tento RecA-ss DNA komplex interaguje s homologní dvouřetězcovou DNA, může dojít k výměně řetězců: jednořetězec DNA navázaný na RecA se spáruje s komplementárním místem v dvouřetězcové DNA a vytěsní tak původní řetězec.
Ačkoli, jak bylo uvedeno výše, podrobnosti mechanismu, který využívá homologní rekombinace k opravě dvouřetězcových zlomů nejsou dosud známy, je zřejmé, že existují dva hlavní typy této dráhy: synthesis-dependent strand annealing (SDSA) and single-strand annealing (SSA):
Oprava dvouřetězcových zlomů mechanismem nehomologního spojování konců (nonhomologous end joining, NHEJ) Ačkoli by se mohlo zdát, že nehomologní spojení konců by mohlo vést k náhodnému spojení jakýchkoli dvou konců, zdá se, že tomu tak není. Myší buňky postrádající ligázu IV (jeden z proteinů potřebných pro NHEJ-viz. níže) prochází řadou chromozomálních translokací po poškození DNA ionizujícím zářením, zatímco divoký typ buněk nikoli. To naznačuje, že funkční NHEJ v divokém typu buněk musí přednostně spojovat správné konce dvouřetězcových zlomů. Ačkoli příčina schopnosti NHEJ spojit správné konce není dosud známa, lze si představit, že jeden z přispívajících faktorů může být koheze sesterských chromatid. Je známo, že všechny sesterské chromatidy jsou v relativně častých intervalech (přibližně každých 10 kb) vzájemně k sobě připojeny kohezními proteiny. Důsledek je ten, že v případě buněk v pozdní S nebo G2 fázi sesterské chromatidy přispívají k udržení konců zlomených chromatid u sebe a ty tak mohou být účinně spojeny náhodným procesem jako je NHEJ. Na obrázku zcela nahoře je DNA po naštěpení enzymem StuI. Odstraněním několika oligonukleotidů 3´-5´exonukleázovou aktivitou MRE11 vzniknou konce, znázorněné v druhé části obrázku, které se mohou vzájemně párovat s využitím dvounukleotidové homologie (vyznačeno fialově), jak je ukázáno v třetí části obrázku. Přebývající nespárované nukleotidy (CCT a C) jsou odstraněny strukturně specifickou endonukleázou. Kandidátem na takou nukleázu je např. DNázaIV/FEN-1. V konečném kroku jsou konce spojeny DNA ligázou, čímž vznikne molekula DNA zobrazená v poslední části obrázku. Tato sekvence byly skutečně experimentálně prokázána jako produkt NHEJ in vivo, zatímco dosud není zcela plně objasněno, zda zjednodušené schéma, tak, jak je zobrazeno, skutečně plně vystihuje mechanismu jejího vzniku. Je třeba provést ještě mnoho dalších experimentů pro bližší objasnění role MRE11 a dalších NHEJ proteinů (XRCC4, ligázy IV, DNAPK, RAD50 aNBS1) v tomto procesu.
Tolerantní opravy DNA („DNA damage bypass“) Všechny organismy jsou nuceny řešit problémy, které vyvstanou, když pohybující se replikační vidlička narazí na poškození DNA v templátovém řetězci. Obvykle nejlepší způsob, jak řešit tuto situaci, je opravit takové poškození jedním z excisních mechanismů, popsaných výše. V některých případech však poškození nemusí být opravitelné, nebo díky postupující replikaci už došlo k odvinutí rodičovských řetězců, což znemožňuje excisní mechanismus pro nemožnost využít komplementární řetězec jako templát pro opravu, nebo excisní oprava neměla příležitost k opravě poškození. Ve skutečnosti by neměla být toleranční oprava považována za druh opravy DNA, protože poškození zůstává na DNA zachováno, alespoň dočasně. Přesto však experimenty na kvasinkových buňkách ukazují, že překlenutí poškození je důležitou součástí celkové buněčné odpovědi na poškození DNA. Tento proces přispívá k přežití buňky po radiačním poškození ve stejném rozsahu jako nukleotidová excisní oprava a oprava homologní rekombinací.
Ubiquitinace je důležitá pro překlenutí poškození. Klonování a sekvenční analýza genů ze skupiny RAD6, kombinovaná s in vivo a in vitro biochemickými studiemi interakcí mezi produkty genů, vedla k překvapujícím závěrům že ubiquitinace hraje základní roli v regulaci dráhy RAD6:
Rekombinační překlenutí poškození („Recombinational damage bypass“) Translézová syntéza
1. DNA binding studies, polarography, FAAS, absorption spectrophotometry. 2. Sequence specificity of DNA binding. a) Binding to DNA with different G+C content. b) Binding to synthetic polynucleotide complexes. c) HPLC analysis of DNA enzymatically hydrolyzed to nucleosides. d) Replication and transcription mapping. 3. Ethidium bromide, fluorescent probe for crosslinking. 4. Interstrand crosslinking assays. 5. Conformational analysis of DNA modified by metal complexes. a) Melting curves by absorption spectrophotometry and microcalorimetry. b) CD spectroscopy. c) Differential pulse polarography d) Raman spectrophotometry. e) Supercoiled plasmid DNA unwinding by gel electrophoresis. f) Chemical probes of DNA conformation. g) DNA bending and unwinding by single, site-specific metal adducts. 6. Translesion DNA synthesis and replication bypass. 7. Recognition of DNA modified by metal complexes by specific proteins. 8. Hydroxyl radical footprinting 9. Nucleotide excision repair of DNA modified by metal complexes.
The methods of molecular biology and biophysics for research of nucleic acids and their interactions• DNA binding of drugs. DNA interstrand cross-linking. Global conformational changes induced in DNA by drugs. Conformational analysis of site-specific DNA adducts. Recognition of drug-DNA complexes by specific proteins. Nucleotide excision repair. Applications.
DNA binding studies • Flameless atomic absorption spectrophotometry • Absorption spectrophotometry • Differential pulse polarography
Sequence specificity of DNA binding I • Binding to DNA with different G+C content. • Binding to synthetic homopolynucleotide complexes. • HPLC analysis of DNA enzymatically hydrolyzed to nucleosides (DNAseI, nuclease P1, alkaline phosphatase).
5´-
CTTCTCTTCTGGTCTTCTCT-3´
5´- CTTCTCTTCTGGTCTTCTCT-3´ 3´- AAGAGAAGACCAGAAGAGAG-5´
Sequence specificity of DNA binding. II • Replication and transcription mapping
Interstrand crosslinking assays Denaturation/renaturation of DNA by absorption spectrophotometry
• Gel electrophoresis under denaturing conditions
Conformational analysis of DNA modified by metal complexes. • Unwinding of supercoiled plasmid DNA – gel electrophoresis. L = T+W
Φ = 18σ/rb(c) Conformational analysis of DNA modified by metal complexes. VII • Chemical probes of DNA conformation
Conformational analysis of DNA modified by metal complexes. VIII • DNA bending and unwinding by single, site-specific metal adducts
1. To convert the interadduct distance in bp corresponding to the curve maximum into a duplex unwinding angle in degrees the value is compared with that of the helical repeat of BDNA (10.5 bp). The difference between the helical repeat of B-DNA and DNA containing adduct is Y bp. There are 360°/10.5 bp, so the DNA unwinding due to one adduct is Y x 360/10.5. 2. The quantitation of the band angle of the adduct can be performed utilizing the empirical equation : K - 1 = (9.6 x 10-5 L2 – 0.47)(RC)2, where L represents the length of a particular oligomer with relative mobility K, and RC the curvature relative to a DNA bending induced at the A tract.
Translesion DNA synthesis and replication bypass
Recognition of DNA modified by metal complexes by damaged-DNA binding proteins.
Hydroxyl radical footprinting
Nucleotide excision repair of DNA modified by metal complexes.
Příklady využití popsaných metod při studiu protinádorově aktivních komplexů kovů
