Detekce glykomických tumorových markerů a cílený transport cytostatik Jarmila Králová ÚMG AVČR
Co jsou glykany ? ● polysacharidy, oligosacharidy nebo karbohydrátová část glykokonjugátů ● glykoproteiny – karbohydrát je připojen na protein během ko-translačních nebo postranslačních modifikací procesem glykosylace
● glykolipidy – poskytují energii a slouží jako markery buněčného rozpoznávání ● proteoglycany – silně glykosylované glykoproteiny. Proteinové jádro má kovalentně připojený jeden nebo více řetězců glykosaminoglykanů (GAGs). Lineární karbohydrátové polymery jsou negativně nabité díky sulfátům a uronové kyselině. Jsou to hlavní složky extracellularní matrix. GAGs řetězce mohou být: chondroitin sulfát a dermatan sulfát heparin a heparan sulfát keratan sulfát Aggrecan
Důležité glykany spojené s nádorovou progresí a) N-vázané glykany – kovaletní vazba s Asn b) O-vázané glykany – kovalentní vazba s Ser /Thr c) Glykosphingolipids – ceramid vázaný s ≥ 1 cukry d) Glykosylfosfatidyl-inositol (GPI)-vázané proteiny – glykan kovaletně vázaný k fosfatidylinositolu
Glykosaminoglykany GAGs
● volné řetězce (hyaluronan) ● kovalentní komplexy s proteoglykanovými proteinovými jádry (heparan sulfát, chondroitin sulfát and dermatan sulfát)
Stádia nádorové progrese: a) Nádorová proliferace b) Invaze – nádorové buňky získávají schopnost degradovat a migrovat skrz bazální membránu a extracelulární matrix
c) Rozsev – nádorové buňky jsou šířeny
krevním řečištěm, agregují s hostitelskými krevními destičkami a lymfocyty a nakonec se usídlí v malých cévách vzdálených orgánů
d) Angiogeneze – je nutná pro jak pro
patologický růst primárních nádorů tak jejich metastáz
Glykany hrají roli ve všech těchto stádiích nádorového vývoje .
Glykany se účastní hlavních patofysiologických dějů během nádorové progrese a) Glykany modulují receptory pro růstové faktory b) Invaze je asociována s expresí sialovaných glykanů, které zvyšují disociaci nádor. buněk c) Selektiny jsou důležité adhezní receptory aktivovaných destiček (P-selektin), leukocytů (L-selektin) a endoteliálních buněk (E-selektin) které se váží na specifické glykanové receptory exprimované na příslušných nádorových ligandech (Lewis X (SLeX) or SLeA) d) Angiogeneze je rašení cévních endoteliálních buněk jako odpověď na proangiogenní factory (VEGF, FGF) uvolňované z nádor. buněk a stromatu Heparan sulfát usnadňuje vazbu GF a aktivaci endotheliálních receptorových tyrosin kináz .
SOUHRN ► Nádory anomálně exprimují různé glykany, které regulují různé aspekty nádorové progrese včetně proliferace, invaze, angiogeneze a metastáz ► Proliferace nádorových buněk je potencována schopností glykoproteinů a glykosfingolipidů přímo aktivovat receptory pro růstové faktory s tyrosin kinázovou aktivitou a schopností proteoglykanů fungovat jako ko-receproty pro solubilní nádorové růstové faktory ► Nadexprese specifických glykosyltransferáz nádorovými buňkami podporuje tvorbu nádorových glykanů → usnadnění invaze ► Karcinomy často nadexprimují O-vázané glykany ve formě mucinů (povrchové a sekretované), což jsou ligandy pro ahezní receptory=selektiny, které podporují schopnost nádor. buněk interagovat s krevními destičkami,leukocyty a endoteliálními buňkami → usnadnění metastáz ► Glykosfigolipidy ve formě gangliosidů jsou nadexprimovány řadou nádorů, jejich uvolňování do krevního řečiště může zhoršit imunitu vůči některým nádorům ► Heparan sulfát-proteoglykany (HSPGs) na povrchu nádor. buněk fungují jako koreceptory stabilizující signální komplex GF– receptor. Sekretované HSPGs přítomné v extracellularní matrix uchovávají GF mobilizovatelné nádorovými heparanázami ► Některé glykany lze měřit v krvi a využít je jako markery pro zjišťování specifických nádorů a ke sledování odpovědi na terapii
Strategie pro odhalení nádorových glykobiomarkerů
FEBS Journal 277 (2010) 95–105
Glykomické profilování Analytické nástroje 1) hmotnostní spektroskopie izolovaných glykanů
2) expresní profilování genů funkčně zúčastněných v syntéze, degradaci N-vázaných and O-vázaných glykanů, Lewis antigenů, glykosaminoglykanů a glykosfingolipidů
Cílené protinádorové strategie založené na glykanech A: změna exprese glykanů na povrchu nádorových buněk ● peracetylované disacharidy (GlcNAcβ1,3Galβ) kovalentně vázané na hydrofobní nekarbohydrátovou část umožňující vstup do buňky. V nádor. buňce jsou disacharidy deacetylovány a upraveny glykosyltransferázami → odlákání a odklon glykosylace pryč od endogenních glykoproteinů→ snížená exprese specifických glykanů na buněčném povrchu
Redukce exprese sialyl Lewis X→ blokace nádorového rozsevu
Některé cukerné analogy obsahující F místo -OH skupiny přímo inhibují glykosylaci
Cílené protinádorové strategie založené na glykanech ● metabolická inkorporace nepřirozených prekurzorů kyseliny sialové - vede ke vzniku nepřirozených epitopů (manosamin analog je konvertován v nádor. buňkách na derivát kys. sialové → produkce nových povrchových glykokonjugátů obsahujících derivát kys. silaové) zvýšení protinádorové imunity
Cílené protinádorové strategie založené na glykanech B: specifické chemické sondy s vlastním terapeutickým potenciálem pro rozpoznání glykanů na povrchu nádorových buněk – konjugáty porfyrinů se žlučovými kyselinami – polymethiniové sole jako senzory pro polysulfátové sacharidy
C: modifikace chemických sond pro kombinovanou cílenou terapii umožňující cílenou přepravu cytostatik -cyklodextrinové konjugáty porfyrinů a jejich inkluzní komplexy s léčivy
Konjugáty porfyrinů se žlučovými kyselinami pro rozpoznávaní sacharidových tumorových markerů testované konjugáty
testované tumorové markery Sialová kyselina Hyaluronová kyselina Heparan sulfát
Titrační křivka konjugátu 1 s heparan sulfátem
Vazebné konstanty Analyt
Komplex
1
5
Log(Ks) Glukosa
1:1
5,7
2,0
Sialiová kyselina
1:1
5,7
4,3
1:1
5,4
5,7
2:1
7,0
12
2:3
26
-
1:2
13
13
1:1
7,0
6,0
Hyaluronová kyselina
Heparan sulfát
Konjugáty porfyrinů se žlučovými kyselinami pro rozpoznávaní sacharidových tumorových markerů • rozpoznání nádorových buněk
• fotodynamický účinek porfyrinů → cílená zabíjení buněk s nádorovým fenotypem
Králová J, Koivukorpi J, Kejík Z, Poučková P, Sievänen E, Kolehmainen E, Král V. Org. Biomol. Chem., 2008, 6, 1548 – 1552
Polymethiniové sole (PMS) jako senzory pro polysulfátové sacharidy – heparin Vazebné konstanty Analyt Heparin Polygalakturonová kyselina Pektin
Log(Ks) Komplex 11 18 4,8 3,9
1:2 1:3 1:1 1:1
● kolorimetrická sonda rozpoznávající s velkou selektivitou a učinností sulfonované sacharidy ● lokalizace uvnitř buňky otvírá možnost pro zobrazování silně sulfonovaných částí buněk (lysosomy nádorových buněk) ● značná toxicita PMS pro nádorové buňky
Titrace s heparinem
Bříza T, Kejík Z, Císařová I, Králová J, Martásek P, Král V. Chem Commun (Camb). 2008, 16, 1901-1903.
Supramolekulární cyklodextrin-porfyrinový systém pro cílený transport a kombinovanou terapii HOCH2 O O
OH
O
O H COH 2 O OH H O HO O OH
HOCH2 OH OH O HOH2C
HO O HO
OH
O HO
OH
HO
O O CH2OH
F
H2COH F
HO O
F
O
HOCH2 O O
F O F
CH2O
F
O F
O OH HO
OH
H2COH O HO
O H2COH
HO
OH HO O OH HO F FO O CH2O OH OH O CH2OH HO N F F O O CH O OH
N
N H H N
F
OH HO
HOCH2
F
O
2
F F F
F
Imatinib
F
Bis beta − cyklodextrin porfyrinový konjugát
0,57 A
0,60
A
0,50 0,40
0,55 0,53
0,30
0,51
0,20 0,10
0,49
0,00 350
0,47 370
390
410
λ/nm
430
450
0
10 20 C(imatinib)/c(2)
30
40
Princip kombinovaného terapeutického účinku rozpoznání a akumulace v nádoru umožňuje kombinaci fotodynamická terapie a chemoterapie → synergistický účinek F
R
hν
F
F
F F
F
F NH
R F HOCH2 O O OH O OH HO HO OH
N
F F
N
F
F
F R
F
F
Drug
CH2O F O O HO O OH O HOCH2 HO OH CH2OH O HO OH O OH HO O O HO HOCH2 O CH2OH O
F
F NH
R F
N
F F
O HOCH2
F
HN
F
R
F
F
Široká škála možných účinků Snadná optimalizace podle potřeb terapie ●inhibice mikrotubulů (paclitaxel, docetaxel) ●inhibice kináz (imatinib, lapatinib, sunitinib) ●cílení na DNA (fluoruracil, doxorubicin, lomustine) ●inhibice folátového metabolismu (aminopterin)
Králová J., Kejík Z., Bříza T., Poučková P., Král A., Martásek P., Král V. J. Med. Chem. (2010), 53, 128-138
F HOCH2 O O O HOCH2 F OH O CH O OH 2 HO F O O HO OH HO O OH O HOCH2 HO OH CH2OH O HO OH O OH HO O O HO HOCH2 O CH2OH O
Drug
N
F
F R
HN F
F
Vazebné konstanty porfyrinových konjugátů s léčivem → při kyselém pH uvolnění léčiva Porphyrin-CD–drug complex
pH 7.34
Log (Ks) 2–paclitaxel 2–docetaxel 2–imatinib 2–lapatinib 2–lomustine 2–fluorouracil 2–aminopterin 2–methotrexate 3–doxorubicin 3–sunitinib 4–paclitaxel 4–imatinib
5.3 6.3 14.0 11.0 7.2 4.8 6.0 4.5 9.6 4.8 9.3 10.1 11.0 9.0 13.0 10.7
Complex stoichiomentry carrier/drug 1:1 1:1 2:1 1:2 1:1 1:1 1:1 1:1 2:1 1:1 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2
pH 5.50
Log (Ks) n.d. 5.1 8.8 9.9 4.2 n.d. 4.4 3.2 6.5 n.d. n.d. n.d. 5.8 n.d. 12.5 10.3
l V. J Med Chem 2010, 53(1), 128-138.
Complex stoichiometry carrier/drug n.d. 1:1 2:1 1:2 1:1 n.d. 1:1 1:1 2:1 n.d. n.d. n.d. 1:1 n.d. 1:2 1:2
Uvolnění doxorubicinu z komplexu s porfyrinovým konjugátem
Vliv kombinované terapie (chemoterapie a fotodynamické terapie) - komplexy cystatika (paclitaxel, doxorubicin) s CD konjugáty porfyrinu na myším nádorovém modelu
Amelanotický melanom C32 bez léčby
Nekróza vyvolaná po aplikaci komplexu cytostatika/CDporfyrinu a ozáření (PDT) Foceno 7. den po léčbě
30 dnů po terapii – vymizení nádoru
Publikace l V. Porphyrin-cyclodextrin conjugates as a nanosystem for versatile drug delivery and multimodal cancer therapy. J Med Chem 2010, 53(1), 128-138. Bříza T., Kejík Z., Králová J., Martásek P., Král V. Synthesis of unsymmetric cyanine dye via merocyanine and their interaction with DNA. Collect Czech Chem Commun 2009, 74(7-8), 1081-1090. Králová J, Bříza T, Moserová I, Dolenský B, Vašek P, Poučková P, Kejík Z, Kaplánek R , Martásek P, Dvořák M and Král V. Glycol-porphyrin derivatives as potent photodynamic inducers of apoptosis in tumor cells. J Med Chem 2008, 51, 5964-5973 Bříza T, Kejík Z, Císařová I, Králová J, Martásek P, Král V. Optical sensing of sulfate by polymethinium salt receptors: colorimetric sensor for heparin. Chem Commun (Camb). 2008, 16, 1901-1903. Králová J, Koivukorpi J, Kejík Z, Poučková P, Sievänen E, Kolehmainen E, Král V. Porphyrin – bile acid conjugates: from saccharide recognition in the solution to the selective cancer cell fluorescence detection. Org. Biomol. Chem., 2008, 6, 1548 – 1552 Kralova J, Dvorak M, Koc M, Kral V. p38 MAPK plays an essential role in apoptosis induced by photoactivation of a novel ethylene glycol porphyrin derivative. Oncogene, 2008, 27: 3010-3020. Bříza T., Kejík Z., Vašek P., Králová J., Martásek P., Císařová I., and Král V. Chromophoric binaphthyl derivatives. Org. Lett. 2005, 7(17):3661-3664
Spolupracovníci: ÚMG AVČR, v.v.i. Irena Moserová RNDr. Michal Dvořák
1.LF UK, Praha Doc. Pavla Poučková RNDr. Marie Zadinová
VŠCHT, Praha Prof. Vladimír Král Tomáš Bříza Zdeněk Kejík
