UJI MUTAGEN (AMES TEST)

UJI MUTAGEN (AMES TEST) Marlia Singgih Wibowo School of Pharmacy ITB

Pendahuluan  Lingkungan di sekitar kita banyak mengandung senyawa karsinogen (cancer-causing agents) misalnya sinar UV, polutan industri, pestisida, food additives dan produk tobacco  Analisis terhadap berbagai senyawa kimia yang makin hari semakin banyak digunakan, menjadi perhatian utama peneliti toksikologi, karena kecurigaan terhadap kemungkinan bahaya kanker yang mungkin diakibatkan oleh senyawa tersebut.  Senyawa karsinogen ini dapat menginduksi kanker karena mereka bersifat mutagen (dapat menyebabkan mutasi, yang dapat mengubah susunan DNA

MUTAGEN  Mutagen adalah zat atau senyawa yang dapat meningkatkan laju perubahan di dalam gen. Mutasi (perubahan) dapat mempengaruhi reproduksi sel, bahkan kadangkala menyebabkan kerusakan sel atau pertumbuhan sel yang tidak terkendali  Beberapa contoh mutagen, antara lain senyawa kimia mustard, etil metil sulfonat, sinar uv, radiasi sinar x, dll.  Mutagenesis adalah proses pembentukan mutasi

Beda MUTAGEN dan KARSINOGEN

Karsinogen

menyebabkan KANKER

Mutagen menyebabkan MUTASI, tidak selalu menyebabkan KANKER

Uji senyawa karsinogen 

 

Uji jangka pendek (short-term test) : dikembangkan untuk mengidentifikasi senyawa karsinogenik yang berpotensi atas dasar kapasitasnya untuk menginduksi mutasi pada DNA di dalam sel secara in-vitro atau invivo. Contoh test : Ames test. Pada Ames test, digunakan mikroba Salmonella typhimurium. Selain uji mutasi bakteri, ada pula uji mutasi sel mamalia secara in-vitro, uji mutasi gen secara in-vivo menggunakan mencit, uji kerusakan DNA secara in-vitro. Uji jangka menengah : uji kronis 1 tahun : Uji menggunakan 50 ekor tikus Uji jangka panjang : uji kronis 2 tahun : Multi stage models pada perkembangan neoplasti

AMES Test • Ames test adalah uji untuk menentukan apakah suatu senyawa adalah mutagen. Nama test ini diambil dari nama penemunya yaitu Bruce Ames. Bruce Ames dkk pada tahun 1970an menemukan suatu metode uji dengan menggunakan bakteri khusus yang sangat sensitif terhadap senyawa2 mutagen • Penggunaan Ames test adalah berdasarkan asumsi bahwa setiap senyawa yang bersifat mutagenik terhadap bakteri yang digunakan, dapat berubah menjadi karsinogen yang dapat menyebabkan kanker

• The Food and Drug Administration (FDA) USA saat ini menggunakan metode yg dikembangkan Ames untuk menapis senyawa2 kimia secara cepat dan murah • Walaupun demikian, pada kenyataannya, beberapa senyawa yang menyebabkan kanker pada hewan percobaan (misalnya dioksin) tidak menunjukkan positif pada Ames test (atau kebalikannya) Mikroba uji yang digunakan dalam Ames test adalah Salmonella typhimurium galur MUTANT

Mengapa menggunakan galur mutan?  Biakan induk (Wild-type) dari Salmonella typhimurium dapat tumbuh dalam media tanpa penambahan asam amino. Hal ini dimungkinkan karena mereka membuat asam amino mereka sendiri dengan jalur biosintesis yang berbeda2  Pada mutan Salmonella typhimurium , tidak dapat tumbuh tanpa asam amino histidin karena mutasi ditujukan pada gen yang mengkode salah satu dari 9 enzim yang digunakan pada jalur biosintesis histidin

.

Oleh karena itu, mutan Ames hanya akan tumbuh bila ada histidin di dalam medium pertumbuhan karena mutan tersebut tidak dapat mensintesis sendiri histidin tersebut. Mutan ini adalah mutan auxotroph yang disebut mutan histidine-dependent or his (baca : hiss-minus)

Mutan auxotroph  Mutan auxotroph adalah mutan yang tidak dapat mensintesis salah satu molekul organik yang diperlukan untuk pertumbuhannya.  Dalam uji ames, bila mutan auxotroph ini berinteraksi dengan senyawa sample , lalu berubah menjadi prototroph  Mutan prototroph kembali memiliki kemampuan mensintesis histidin, sehingga dapat tumbuh baik dalam media tanpa histidin

Contoh Ames test untuk uji kualitatif  Suatu suspensi biakan Salmonella typhimurium galur histidinerequiring (his−) ditumbuhkan dalam pelat agar yang mengandung campuran rat liver enzymes yang tidak mengandung histidin  Sebuah filter paper di impregnasi dengan 10µg 2-aminofluorene, suatu karsinogen. Efek mutagenik senyawa ini dapat menyebabkan bakteri tersebut memperoleh kembali kemampuannya untuk tumbuh walaupun di dalam media tidak ada histidinnya. Hal ini menyebabkan tumbuhnya koloni bakteri disekitar disk filter paper.

Mengapa medium untuk Ames test ditambahkan ekstrak hati (liver extract = S9)?  Banyak senyawa kimia tidak bersifat mutagen atau karsinogen, tetapi dapat berubah menjadi mutagen atau karsinogen setelah dimetabolisme di dalam tubuh (hati)  Bakteri uji adalah mikroba prokaryot, sedangkan manusia adalah eukaryot, oleh karena itu perlu ditambahkan campuran enzim2 hati organisme eukaryot (dalam hal ini hati tikus)

Bagaimana menghitung hasil Ames test ?  Jumlah koloni bakteri yang tumbuh merupakan ukuran aktivitas mutagenik (potensi) dari senyawa yang digunakan  Angka ini biasanya merepresentasikan jumlah revertants (bakteri yang termutasi) per mikrogram of mutagen atau per gram sampel yang mengandung mutagen

Koreksi terhadap hasil Ames test  Pada umumnya mutasi spontan terjadi pada awal pembiakan bakteri dalam medium yang tidak mengandung histidin  Hal ini perlu diperhitungkan sebelum menguji senyawa kimia yang dianalisis.  Pada awal pengujian ditumbuhkan 108 sel bakteri, maka setelah beberapa waktu dihitung jumlah bakteri yang tumbuh, dan angka ini digunakan untuk pengurangan jumlah bakteri yang memang termutasi oleh senyawa kimia.  Dengan cawan petri terpisah, baru dilakukan uji mutagen dengan menggunakan senyawa kimia yang diuji di dalam media yang ditambahkan campuran enzim hati tikus

 Biakan selanjutnya diinkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam di tempat gelap  Jumlah koloni yang terbentuk menunjukkan revertans yang terbentuk yang sebanding dengan potensi senyawa mutagen

Galur mutan Salmonella typhimurium  Galur mutan dari Salmonella typhimurium yang digunakan dalam Ames test memiliki sensitivitas yang berbeda-beda  Galur TA 1535 memiliki satu substitusi basa yang menyebabkan missense mutation di dalam gen yang mengkode enzim pertama dalam sintesis histidin. Enzim yang dimiliki mutan mengandung proline sementara biakan induk mengandung leucine  Galur TA 100 mirip dengan 1535, tetapi dapat mendeteksi jenis-jenis mutagen yang berbeda

 Galur lain yang digunakan misalnya galur yang mengalami mutasi yang berbeda-beda ( bisa frameshift, missense atau nonsense), pada operon histidin  Beberapa galur yang digunakan juga termutasi pada uvrB, rfa , yang berakibat meningkatkan permeabilitas sel terhadap senyawa kimia tertentu

PROSEDUR Ekstrak homogenate rat liver (S9) dicampur dengan strain dari bakteri his-. Dengan tidak adanya histidin, bakteri tidak dapat tumbuh di dalam medium minimum (control). Pada saat bakteri dicampur dengan bahan yang diduga mutagen (X), terbentuknya revertant colonies menunjukkan bahwa beberapa his- bacteria telah termutasi (reverted) menjadi his+ dan dapat disimpulkan bahwa senyawa X adalah suatu mutagen.

Gambar uji mutagen

 Jumlah koloni yang dihasilkan setara dengan besarnya efisiensi mutagen mengembalikan sifat mutan ke asalnya  Suatu mutagen A menghasilkan jumlah revertans yang lebih tinggi dari kontrol, berarti mutagen A adalah betul-betul mutagen dan mungkin suatu karsinogen.  Suatu mutagen B tidak menghasilkan jumlah revetans lebih banyak dari kontrol, maka dapat dikatakan bahwa senyawa B bukanlah suatu mutagen.

Interpretasi hasil  A mutagenic potential of a test item is assumed if the mutant frequency is 2.0 or higher. A dose effect relationship could underline this conclusion.  A possible mutagenic potential is assumed if the quotient ranges between 1.7 to 1.9 in combination with a dose effect relationship.  No mutagenic potential is assumed if all quotients range between 1.0 (or lower) to 1.6.  A nonexistent dose effect relationship could underline this conclusion

Mutagenicity Test based on National Toxicology Program - USA Marlia Singgih Wibowo School of Pharmacy ITB

Salmonella or E.coli test  Menguji chemicals akan kemampuan mutagenicity pada Salmonella typhimurium atau Escherichia coli dilakukan berdasarkan anggapan bahwa senyawa yang bersifat mutagenic pada bacteri tersebut, berpeluang menjadi carcinogen pada hewan, dan selanjutnya kemungkinan berpotensi pula menjadi penyebab kanker pada manusia  Walaupun kira-kira ¾ senyawa kimia yang beredar saat ini di dunia, menunjukkan reaksi positive pada Ames test dan merupakan rodent carcinogens, namun tidak semuanya menyebabkan kanker pada manusia  Namun metode Ames test penting dilakukan untuk skrining awal senyawa-senyawa yang akan digunakan dalam pengobatan manusia.

Galur mikroba yang digunakan  Beberapa strain S. typhimurium dapat digunakan antara lain : TA97, TA98, TA100, TA102, TA104, TA1535, TA1537, and TA1538.  Escherichia coli strain WP2 uvrA pKM101 . This E. coli strain is similar in mutagen detection to S. typhimurium strain TA102

Mikroba uji (Prof.Lynn Ferguson, Univ.Auckland)  This test can capture frame-shift mutagens (through S. typhimurium strain TA98 and TA1537), base-pair-substitution mutagens (through strain S. typhimurium TA100) or mutagens which act through the production of oxygen radicals (through strain S. typhimurium TA102). We maintain different strains of Salmonella typhimurium for this assay and the test is carried out according to the OECD guidelines for Testing of Chemicals No.471 (adopted since 21st July 1997).

 Seluruh bakteri yang digunakan dalam Ames test membawa defective (mutant) gene yang membuat nya tidak mampu mensintesis essential amino acid histidine jadi mereka hanya survive dan tumbuh pada medium yang mengandung excess histidine.  Dengan adanya mutagenic chemical, defective histidine gene mampu termutasi balik sehingga mampu mensintesis histidinnya kembali

 Efek ini, yang memperoleh kemampuannya kembali (regaining of normal activity or function), disebut "reverse" mutations dan process nya disebut "reversion."  Mutant colonies nya,disebut "revertants."  Ada mutagenicity assay lain yang menggunakan sel type yang lain yang mengukur "forward" mutations, yaitu mutation yang memperbaiki fungsi gene nya, yang tadinya tidak mampu dilakukan (causes a loss, rather than a gain, of function.)

Standard Procedure (National Toxicology Program)  In the Ames assay, a test tube containing a suspension of one strain of Salmonella typhimurium (or E. coli) plus S9 mix or plain buffer without S9, is incubated for 20 minutes at 37º C with the test chemical.  Control cultures, with all the same ingredients except the test chemical, are also incubated.  In addition, positive control cultures are prepared; these contain the particular bacterial tester strain under investigation, the various culture ingredients, and a known potent mutagen*.  After 20 minutes, agar is added to the cultures and the contents of the tubes are thoroughly mixed and poured onto the surface of petri dishes containing standard bacterial culture medium.

 The plates are incubated, and bacterial colonies that do not require an excess of supplemental histidine appear and grow. These colonies are comprised of bacteria that have undergone reverse mutation to restore function of the histidine-manufacturing gene. The number of colonies is usually counted after 2 days.

Mutasi spontan  Spontaneous mutations (those that occur by chance, not by chemical treatment) will appear as colonies on the control petri dishes.  If the test chemical was mutagenic to any particular strain of bacterium, the number of histidine-independent colonies arising on those plates will be significantly greater than the corresponding control plates for that strain of bacteria.  The positive control plates are also counted, and the number of mutant colonies appearing on them must be significantly increased over the spontaneous control number for the test to be considered valid.  Failure of the positive control chemical to induce mutation is reason to discard the experiment.

Interpretasi hasil  Several doses (usually at least 5) of each test chemical and multiple strains of bacteria are used in each experiment.  In addition, cultures are set up with and without added liver S9 enzymes at varying concentrations.  Therefore, a variety of culture conditions are employed to maximize the opportunity to detect a mutagenic chemical.  In analyzing the data, the pattern and the strength of the mutant response are taken into account in determining the mutagenicity of a chemical.  All observed responses are verified in repeat tests. If no increase in mutant colonies is seen after testing several strains under several different culture conditions, the test chemical is considered to be nonmutagenic in the Ames test.

Kontrol positif For strains tested in the absence of S9       

TA98, 2-nitrofluorene or alternatively, TA98 and TA1538, 4-nitro-o-phenylenediamine TA100 and TA1535, sodium azide TA97 and TA1537, 9-aminoacridine TA102, mitomycin C TA104, methyl methanesulfonate E.coli WP2 uvrA pKM101, methyl methanesulfonate

For strains tested with S9  All strains, 2-aminoanthracene (or occasionally, sterigmatocystin)

Reference Mortelmans K, Zeiger E. The Ames Salmonella/microsome mutagenicity assay. Mutat Res. 2000 Nov 20;455 (1-2):29-60.

 Cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) is a heme monooxygenase that is involved in the metabolic activation of nitrosamines to electrophilic species that can react with DNA, resulting in DNA damage and mutation.1 CYP2E1 is also responsible for the oxidation of many small lipophilic compounds, including many solvents and environmental contaminants.2 This enzyme is one of many cytochromes P450 found primarily in the liver, but also in other tissues including the lungs and kidneys. The enzyme is found on the endoplasmic reticulum of the cell along with cytochrome P450 reductase, its obligate electron donor protein.

 Nitrosamines have long been recognized as carcinogens in mammals, but they have been unexpectedly poor mutagens in bacterial mutagenicity assays, such as the Ames test.3 A variety of explanations have been put forward over the years to explain this lack of correlation between mutagenicity and carcinogenicity,  In a standard Ames assay a rat liver homogenate is used to provide the cytochromes P450 necessary for activation of mutagens to their reactive forms.

 The suspected mutagen is mixed with the homogenate, where it is metabolized to its reactive form, and then an appropriate tester strain of Salmonella typhimurium is added to the mix. The activated mutagen enters the bacterium and reacts with DNA to cause mutations; mutations in the operon for histidine biosynthesis that restore function ("reversions") allow the bacterium to grow on histidine-deficient medium, and result in visible colonies on the assay plate. The greater the number of colonies, the more mutagenic the chemical.

Table 1. Ames test result for Coral Numbers of revertants Samples Without S9

With S9

Negative control (spontaneous reversion)

259

332

Positive control (Sodium Azide 1 ppm)

857

949

Coral

170

243